Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

Imunologia1. Introduo ao Sistema ImunitrioResumo da aula terica: 12 de Fevereiro de 2008 A importncia do sistema imunitrio clara. Em pacientes com um sindroma chamado Severe Combined Immunodeficiency Disease SCID acontece que, devido a uma ausncia de linfcitos T e B, esta criana (normalmente ocorre em crianas), no est protegida contra infeces, e precisa de estar envolvida nestas estruturas. So muitas vezes designados meninos ou crianas da bolha: tm de estar guardados numa bolha, em meio estril, protegidos do meio externo. So estruturas que possuem luvas e passagens para fornecer tudo, e tudo o que entra tem de ser esterilizado porque a ausncia de um sistema imunitrio eficiente, faz com que esta criana no consiga resistir a qualquer tipo de infeco, que seria travada por um sistema imunitrio eficaz sem problema.

Portanto, a inutilidade do sistema imunitrio est fora de questo. Na realidade, um dos grandes avanos da imunologia foi tratar esta situao. possvel tratar esta criana desde que se encontre uma medula ssea compatvel. Ela recebe uma medula ssea de uma pessoa normal, um dador, por exemplo, um familiar, que tenha mais compatibilidade em termos de transplante de tecidos. E, recebendo medula ssea, por exemplo, de um irmo, que tem uma medula ssea normal, essa medula ssea coloniza o sistema imunitrio desta criana e ela passa a ter um sistema imunitrio saudvel do irmo. Isto muito fcil de fazer na situao muito rara de a pessoa ter um gmeo, porque os gmeos so uma situao privilegiada de haplocompatibilidade, ou de histocompatibilidade neste caso. Quem no tem gmeos, que a maior parte de ns, ser mais complicado, mas para isso faz-se genotipagem ao nvel familiar para saber qual ser o parente mais prximo de ns nesse aspecto.

A imunologia como uma cinciaA imunologia o estudo do sistema imunitrio. Hoje em dia, depara-se com alguns problemas ainda por resolver: Vacinas contra infeces crnicas Diagnstico e tratamento de doenas autoimunes Preveno e tratamento de alergia Imunoterapia eficaz contra o cancro Tolerncia a transplantes (clulas estaminais)

So estas as grandes reas em que a investigao tem de progredir para que consigamos melhores respostas, nomeadamente ao nvel da clnica.

Clulas Hematopoiticas

Do origem s clulas do nosso sangue, mas nem todas elas pertencem ao sistema imunitrio: eritrcitos e megacaricitos no tm funo imunitria. As restantes vo reagir a agentes infecciosos.

Linfcitos e especificidadeDentro das clulas do sistema imunitrio, os linfcitos adquirem uma importncia especial graas sua especificidade: possuem receptores com uma conformao especfica que reconhece apenas uma molcula especfico para essa molcula, no reconhece outras. Um linfcito T especfico para um pptido de salmonela no consegue reconhecer mais nada a no ser o pptido de salmonela. O que especial acerca dos linfcitos so os seus receptores. Os receptores dos linfcitos T e dos linfcitos B designam-se molculas de regio varivel (variable region molecules VRM). Esta uma designao global para BCR receptor de clulas B e TCR receptor de clulas T.

O que que torna estas molculas, que so protenas, especiais? a poro representada a vermelho:

Estas molculas tm, como diz o seu nome, regies variveis. Todas as protenas que um neurnio expressa so iguais entre todos os neurnios num indivduo. Um neurnio pode expressar diferentes protenas, mas a partir do momento em que expressa um tipo de protena, esta vai ser igual de todos os outros que a expressam. Isto porque as protenas so produzidas a partir da transcrio e traduo do DNA dogma central da biologia. Ainda assim, o mRNA resultante de um gene pode sofrer splicing alternativo e dar origem a diferentes protenas. Mas, de qualquer forma, o gene est como uma sequncia de DNA sagrada, impossvel de modificar. Se tal acontecer, podem ocorrer mutaes causadoras de cancro, etc. As clulas tm por essa razo inmeros mecanismos de proteco do DNA. Assim, uma protena normal no tem regies variveis, j que so obtidas a partir de uma sequncia de DNA fixa, que no sofre modificaes em condies normais. Todas as suas regies so constantes em termos de sequncia de aminocidos, porque, se assim no fosse, j no seria a mesma protena nem teria a mesma funo. Esta situao no se aplica de todo s VRMs. Estas protenas tm a poro azul, que uma protena montona, com sequncia de uma metionina inicial, etc, mas em relao s pores vermelhas, cada VRM diferente. Ns conseguimos produzir anticorpos diferentes porque cada anticorpo vai ser diferente na zona vermelha. Eles vo ter as regies azuis sempre iguais - regies constantes - que so as regies que o fazem ser um anticorpo, so a base estrutural. Mas as pores vermelhas, as regies variveis, so os locais de ligao ao antignio, so os locais de reconhecimento daquilo para o qual estas molculas vo ser especficas. No caso deste anticorpo, ele vai possuir duas regies vermelhas que vo permitir a ligao a duas molculas de antignio tem ento dois locais de ligao. Portanto, uma molcula de VRM especial porque consegue ter regies variveis a sua especificidade para diferentes antignios deve-se s diferentes sequncias da regio varivel, o que se traduz em diferente afinidade, conformao, ligao. A nica forma de termos anticorpos contra todas as protenas diferentes que todos os anticorpos tenham, em geral, sequncias diferentes.

Surgimento das VRMs

O surgimento das VRMs na linha evolutiva tido como o Big Bang evolutivo do sistema imunitrio, h cerca de 400 milhes de anos atrs, exactamente na transio entre vertebrados sem mandbula e os peixes cartilaginosos como o tubaro, que so vertebrados com mandbula.

Linfcitos T e BH dois grandes tipos de linfcitos, os B e os T. A grande diferena entre estes dois tipos de clulas est no facto de os linfcitos B estarem direccionados para a produo de anticorpos e os linfcitos T para o reconhecimento de clulas e as molculas que elas expressam. Os primeiros, os linfcitos B, esto na base da imunidade humoral, mediada pelos humores, os fluidos em circulao. Os segundos, os linfcitos T, esto na base da imunidade clula, contra clulas - o tipo celular que reconhece uma clula cancergena, uma clula infectada por um vrus, e a tenta destruir; o linfcito B a clula que vai secretar protenas que vo ficar em circulao os anticorpos que se vo ligar a outras protenas, tambm elas em circulao. Os linfcitos B tm uma interaco protena-protena enquanto os linfcitos T interagem clula a clula.

Com estes dois tipos de clulas, o sistema imunitrio, neste caso, linfocitrio, vai conseguir ver tanto as molculas que estejam fora das clulas, como os anticorpos, que andam caa, como as molculas que esto dentro das clulas, neste caso os linfcitos T que andam caa. Como que isto se processa?

Por um lado, os anticorpos que esto em circulao vo reconhecer a parte de fora das molculas em circulao (as protenas tm uma estrutura tridimensional em que existem domnios que no esto expostos e outros que esto superfcie da molcula estes sero reconhecidos pelos anticorpos) Por outro lado, os linfcitos T vo reconhecer sequncias no interior das protenas, que por sua vez esto no interior das clulas. Os linfcitos T reconhecem o que est dentro das clulas graas a um sistema das clulas que fragmenta as protenas, o proteossoma organelo celular que consiste num complexo, com vrias subunidades que cliva as protenas intracelulares, as da prpria clula e as estranhas, em pequenos pptidos que vo ser apresentados superfcie. Essas protenas podem ser protenas virais que ao serem fragmentadas e apresentadas aos linfcitos T vo sinalizar a infeco. Existe portanto um complexo que, ao apresentar os fragmentos peptdicos, vai permitir aos linfcitos T ver o que est no interior das clulas: o que apresentado superfcie das clulas a marca do que est dentro destas. Note-se que uma clula T apresenta sua superfcie tudo o que est dentro dela prpria mas tambm tudo o que nela entrou, vindo de fora, estranho. assim que ela distingue a clula infectada da normal.

Paradoxo de LandsteinerLandsteiner foi um qumico do incio do sculo XX que ps o problema: a que que o sistema imunitrio capaz de reagir? Realizando experincias com coelhos, verificou que o organismo era capaz de produzir anticorpos contra todos os microrganismos que os infectavam O organismo capaz de produzir anticorpos contra qualquer molcula, at mesmo contra as suas prprias molculas. No entanto, as clulas auto-imunes so seleccionadas e suprimidas sob pena de, se tal no acontecer, se verificarem doenas auto-imunes. Landsteiner verificou ainda que os coelhos eram capazes de produzir anticorpos mesmo contra molculas artificiais, que o prprio criou em laboratrio e que no existiam na natureza.

Paradoxo de Landsteiner como que um organismo finito, limitado, consegue reconhecer qualquer molcula? Ao contrrio dos outros sistemas biolgicos, o domnio, a competncia molecular do sistema imunitrio universal/completo/open-ended. Em termos de potencial de produo de anticorpos, no h nenhum limite. H sempre uma resposta imunitria. Muitos de ns no conseguem fazer respostas imunitrias eficazes, tanto que sofremos doenas infecciosas. Contudo, isto no significa que no esteja a haver uma resposta imunitria esta ocorre sempre, mesmo que no seja completamente eficaz e hajam sintomas da infeco.

Vantagem evolutiva do Paradoxo de LandsteinerExiste uma grande diferena nas possibilidades de variao gentica entre micrbios e vertebrados. Se a variabilidade fosse apenas introduzida pela reproduo, as bactrias, ao dividirem-se em ciclos de 20 minutos, teriam a capacidade de introduzir muito mais variabilidade do que o ser humano que se reproduz aproximadamente de 20 em 20 anos. Se a resposta imunitria fosse produzida perante o tempo 0, isto , propositadamente para o patognio no momento da infeco, esta no seria eficaz isto impossvel. Mesmo que o organismo j tenha sofrido uma infeco por um micrbio, o seu tempo de reproduo to reduzido que possivelmente j ter ocorrido uma mutao que torna ineficaz a resposta imune que j tinha sido produzida, como o caso das vacinas que deixam de funcionar. A nica forma de equilibrar esta luta prever, ou seja, ns conseguimos esculpir todas as possibilidades. No no momento da infeco que se produzem anticorpos e clulas especficos para o patognio estas j existem e esto prontas a actuar. Portanto, a estratgia tem de ser a transferncia para o tempo somtico e individual: dentro do tempo somtico de cada um de ns, precisamos de ter a capacidade de gerar variao e seleco, conseguirmos variar a sequncia dos nossos anticorpos e seleccionar as que forem mais teis para aquele momento. necessrio haver a maior diversidade possvel para que se possa seleccionar, como explica o Darwinismo, para se tornar o organismo mais apto para resistir infeco.

O grande trunfo da natureza que a diversidade no finalista essa a soluo para o desconhecido. Se no sabemos o que nos vai infectar amanh, no podemos determinar hoje o que nos ser mais til amanh. Portanto, no podemos ter nos nossos genes sequncias prprias para anticorpos contra antignios especficos. O sistema tem de ter uma diversidade no finalista, que no dirigida a nenhuma infeco, a nenhum antignio, a nenhum micrbio, mas sim, a tudo. H uma diversidade aleatria os processos moleculares pelos quais se consegue a especificidade, dada pela grande variedade de anticorpos, so aleatrios. Fazem-se as combinaes possveis e cada combinao ser especfica para uma coisa diferente.

Como que possvel obter diversidade a partir de um genoma finito?No genoma humano existem cerca de 25.000 genes sequncias de DNA com promotores, enhancers, etc, que conseguem se transcritas e traduzidas para originar protenas. No entanto, para responder diversidade de antignios existentes na natureza, temos a capacidade de produzir mais de 1012 molculas de genes variveis, de anticorpos ou TCRs. Como ento possvel termos esta diversidade em apenas dois tipos de protenas quando o nmero de genes no ultrapassa 105? Nem o processo de splicing conseguiria assegurar tal nmero de protenas diferentes a partir apenas de 25.000 genes, dado que o gene mais spliced descrito origina, no mximo, aproximadamente 100 isoformas

Inconvenientes da variabilidade Sendo a variabilidade aleatria, possvel produzir anticorpos e linfcitos contra agentes infecciosos, mas tambm contra clulas e protenas do prprio organismo. Isto pode dar origem a doenas autoimunes. necessrio distinguir o que pertence ao organismo do que estranho. Se h uma to grande diversidade, um to grande nmero de clulas diferentes e necessrias a uma resposta eficaz, onde que estas se vo encontrar armazenadas? Num estado basal no infectado, os linfcitos sobrevivem a um nvel mnimo, numa frequncia baixa. Mas, se reconhecerem um antignio, vo proliferar, multiplicar-se e diferenciar-se. Por exemplo, um linfcito B, aps diferenciao capaz de produzir cerca de 10.000 molculas por segundo, passando a designar-se plasmcito.

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Imunologia2. Gerao da diversidade nos linfcitos T e BResumo da aula terica: 14 de Fevereiro de 2008

Como que possvel obter uma diversidade em termos de protenas que excede em muitas ordens de grandeza o nmero de genes do genoma humano?

Trata-se de um processo que est na base da produo de molculas que, alm de terem uma sequncia constante de aminocidos, tem zonas variveis, isto , um anticorpo A e um anticorpo B tm regies constantes, que so iguais, e regies variveis, diferentes entre si, o que permite que reajam contra antignios diferentes.

As molculas formadas por este processo so os receptores dos linfcitos, das clulas B e das clulas T o processo conservado em duas linhagens e, na ausncia deste processo no existe nem uma nem outra. Seres humanos com mutaes nos componentes essenciais para catalisar este processo, no tm linfcitos.

A primeira coisa a ter em ateno que estas protenas so sempre heterodmeros duas cadeias diferentes que tm de heterodimerizar. No caso do TCR, h duas hipteses: ou . No h outro tipo de combinaes. Com base no genoma, h produo de 4 cadeias, mas cada uma delas s tem capacidade de heterodimerizar com outra, associando-se por ligaes dissulfito para formar as combinaes ou . Os homodmeros no so funcionais, no so estveis e no chegam superfcie da clula. Do mesmo modo, o BCR tambm constitudo por duas cadeias diferentes: cadeias pesadas e cadeias leves.

TCR T cell receptorPodem ser ou . No caso da linhagem , que a dominante, tanto nos humanos como em modelos animais, o TCR tem uma cadeia e outra , estabilizadas por uma ponte dissulfito. Existe um local de ligao ao antignio, mais distal em relao membrana onde o receptor se encontra, mais exposto poro vermelha, que a varivel, capaz de reconhecer um antignio especfico. Tem tambm uma parte constante, com uma sequncia normal de aminocidos, sem caractersticas especiais.

BCR B cell receptorQuando secretado, designa-se anticorpo. Tem duas cadeias, a pesada, com 4 domnios globulares, e a leve, com apenas 2. H um eixo de simetria e a estrutura duplicada. Na realidade esto presentes 4 cadeias, mas elas so exactamente iguais duas a duas, continuando a designar-se heterodmero. Quando ocorre transcrio e traduo, as cadeias esto prontas para serem emparelhadas: duas protenas iguais de cadeia pesada homodimerizam e depois as duas cadeias leves dimerizam na parte mais exterior da molcula. O anticorpo muitas vezes representado com uma forma de Y pois a forma tridimensional que a molcula tem, de facto.

Uma distino entre o receptor das clulas T e B, que neste caso h 2 locais de ligao ao antignio cada brao do Y permite ligar-se ao antignio. De resto o mesmo tipo de molcula, com uma poro normal, constante, e outra mais especial, a varivel.

O que acontece com a zona varivel que, se analisando a sua sequncia de aminocidos, existem pontos de grande variabilidade que so exactamente os locais de ligao ao antignio. Toda a restante estrutura o que d forma molcula e no to necessrio introduzir variabilidade nessas regies. Estas zonas especiais de ligao chamam-se CDRs complementary determining regions.

Gerao da diversidade nos linfcitos T e BSe o nmero de genes menor que 105, como que possvel obter 10 12 VRMs para reconhecer toda a diversidade de molculas antignicas se o splicing insuficiente? O problema que se debatia era: o nosso genoma, que finito, no tem a capacidade de conter uma quantidade suficiente de DNA correspondente a mais de 1012 genesso necessrias zonas intergnicas, de regulao, etc. Em vez de ter cada anticorpo diferente estar codificado no genoma como um gene singular, e nesse caso, o genoma teria de ter 1012 genes, existem pedaos de DNA, segmento gnicos num locus gentico. Em ltima anlise, h fragmentos contidos num gene que do origem a uma protena, um anticorpo, mas no organizados num gene normal com enhancer, promotores, etc. O exemplo a cadeia pesada do anticorpo, ou do BCR. Em vez de se ter todos os genes para todos os anticorpos diferentes, tem-se pedaos de informao, que no so lidos como tal porque no tm estrutura de gene - no h um promotor que indique onde se deve iniciar a leitura, etc, isto , no tem uma estrutura que permita a transcrio pela RNA polimerase e originar um mRNA que esteja capaz de exercer a sua funo. Alm disso, esta informao est espalhada por mais de 100 kbp - um gene, mesmo com grandes segmentos intrnicos nunca chega tal espaamento entre exes. Portanto, no genoma da linha germinativa, espermatozides e vulos, no h genes funcionais para BCR nem TCR no herdamos dos nossos pais e mes a sequncia dos nossos anticorpos. Ns temos a mesmo sequncia de genes normais,

fundamentais, mas no a dos BCRs e TCRs porque no temos a capacidade de herdar da nossa me ou pai sequncias codificantes de 1012 anticorpos diferentes. O que herdado o mecanismo que vai permitir formar as tais 1012 molculas diferentes, porque este um mecanismo enzimtico, cujas enzimas esto codificadas em genes normais, esses sim, iguais aos dos nossos pais. O que especial nos linfcitos no so os genes que do origem aos receptores mas o mecanismos que permite construir esses mesmos genes. O vulo e o espermatozide tm genes para os BCR e TCR partidos aos pedaos que no originam nenhuma protena funcional, at porque as nicas clulas que expressam BCR so as clulas B e as que expressam TCR so as T, porque so as nicas a possuir estes genes funcionais, que tm o mecanismo necessrio para os tornar funcionais.

A questo que se pe : como combinar estes segmentos gnicos?O gene funcional ser, por exemplo, para um anticorpo, um segmento cor-derosa, combinado com um o azul do meio, e com o amarelo. Quando estes 3 pedaos se juntarem, ento a especificidade vai ser para um antignio de salmonela, por exemplo. Se em vez do cor-de-rosa, for o preto a juntar-se aos mesmos 2, como a sequncia de aminocidos diferente, o anticorpo vai interagir com um outro antignio, e assim por diante. Portanto, estas diferentes sequncias de DNA vo combinar-se e dar origem um gene o gene a unio dos pedaos certos, com uma estrutura de gene tpica, que pode ser transcrito e traduzido numa certa sequncia peptdica com especificidade par um antignio. Esta a zona varivel.

Sabendo que existem zonas variveis e zonas constantes, fizeram-se experincias usando 2 sondas de DNA para fazer um Southern blot: Digesto do DNA com enzimas de restrio Electroforese com migrao dependente de tamanho e carga Hibridao com sonda Uma sonda hibridava na zona constante e outra na zona varivel. Sendo que as sequncias constante e varivel eram as mesmas na clula B e na germinativa, colocava-se a questo de como que estas se juntavam, se justapunham.

No DNA da germline, ou de outras que derivam directamente dela, a sonda para a regio constante, igual em todos os anticorpos, hibridava com uma zona do gel e a sonda para a regio varivel, a especfica para cada tipo de anticorpo estava noutra zona do gel. Isto significa que cada sonda hbrida com diferentes fragmentos de DNA as regies varivel e constante esto separadas por vrios bp. No DNA retirado de um linfcito B (um dos tipos de clula especial em que ocorre este processo), as sondas passavam a hibridar com um mesmo fragmento. As zonas constante e varivel esto ento num mesmo fragmento, estando justapostas no genoma. Em clulas B e T, as zonas que se sabiam estar muito distantes uma da outra, esto agora no mesmo fragmento. O que aconteceu entre a clula normal e o linfcito B que a estrutura do DNA modificou-se de modo a que dois fragmentos distintos, da zona constante e a varivel, se encontrem agora justapostas. A nica forma de elas estarem no mesmo fragmento ter que o DNA tenha sido alterado. As clulas B e as T tm a uma capacidade que outras clulas no tm: conseguem juntar duas regies de DNA RECOMBINAO SOMTICA/REARRANJO VDJ. Noutras quaisquer clulas, o DNA sempre igual, estvel, h mecanismos de proteco do DNA para que este seja imutvel. As clulas B e T tm a necessidade de modificar o seu DNA, para passar a expressar o seu receptor especfico e assim se diferenciarem. O nico modo de o fazerem alterar o seu DNA com corte e costura para que fragmentos que esto distncia fiquem justapostos formando-se assim um gene funcional codificante do receptor. O que acontece que vo ser juntos segmentos gnicos distribudos ao longo do genoma. Os pedaos esto organizados ao longo de 3 grandes zonas: V de varivel, a zona mais varivel do gene D de diversidade, uma diversidade adicional J de juno, so os segmentos que juntam aquele bloco com a zona constante Os fragmentos so juntos por uma ordem: primeiro juntam-se D e J e s depois vem D. H ento, basicamente, 3 blocos que um gene funcional tem de conter tem de haver um representante de cada um dos blocos. S assim se obtm uma protena com uma forma que lhe permita

ser um anticorpo. Na ausncia de algum destes componentes, j no se obtm um anticorpo, a molcula colapsa e no exerce a sua funo. Para ter uma sequncia final, necessrio ter os elementos que constituem um gene. Os locus so altamente instveis enquanto se faz o rearranjo mas, terminado este processo, o locus fecha. Este ento um processo irreversvel que marca a aquisio de especificidade pela clula, para um antignio, e esta est pronta para ser uma clula B ou uma clula T. Todos os mecanismos que protegem o DNA da clula vo tambm actuar sobre este gene uma vez formado e funcional.

RAG Recombination activated geneA recombinao somtica necessita que hajam cortes no DNA, sendo estas reaces catalisadas por enzimas. As clulas humanas no possuem enzimas de restrio estas apenas existem nas bactrias como um modo de defesa contra os patognios, mas possuem uma endonuclease capaz de cortar DNA para este processo em particular. Essa endonuclease a RAG recombination activated gene. Na realidade, existem duas enzimas RAG 1 e RAG 2, que funcionam como um complexo, que catalisa a recombinao somtica. Ratinhos gerados sem RAG no conseguem formar clulas B nem T. Da mesma forma, humanos com mutaes em RAG so desprovidos de clulas B e T. A nica forma de garantir que este processo seja especfico dos linfcitos fazer com que esta enzima seja expressa apenas nas clulas B e T: as RAG so, portanto, especficas dos linfcitos T e B, ou dos seus precursores na medula ssea apenas. Nas outras clulas, o locus da RAG est completamente fechado sobre si prprio, sem qualquer acessibilidade, no expresso de todo.

A expresso da RAG modulada muito precisamente, at mesmo nas clulas B e T, onde s est activo durante a formao dos receptores. Se continuasse activa, haveria retrocesso da recombinao e danos no DNA. Uma vez o receptor formado, a RAG desaparece: o receptor formado, quando chega superfcie, envia um sinal para o ncleo para indicar que est funcional e esta deixa de ser expressa assim que os linfcitos esto formados. Tem uma vida curta mas essencial para a formao de linfcitos funcionais, com especificidade. Antes da aco da RAG, no existem genes funcionais, isto porque no h uma estrutura organizada com promotor, enhancer, sequncia sinal que indique o destino da protena, etc. Estes elementos esto separados por sequncias de muitos bp. Tem de haver uma estrutura que permita que todos os cofactores necessrios transcrio eficaz sejam recrutados e se localizem de forma a realizar a sua aco, e esta estrutura conseguida com a recombinao somtica. Mesmo se houver uma transcrio basal dos segmentos no reorganizados, o transcrito no tem significado, no pode ser traduzido numa protena funcional. A protena final, funcional, s se obtm com este rearranjo que torna segmentos gnicos no funcionais num gene funcional. Cada clula B e T utiliza este processo para criar um receptor que a caracteriza pela especificidade para um qualquer antignio da diversidade que exista na natureza. Pode-se dizer que cada linfcito tem um genoma modificado o que mudou foi o seu locus gentico para o receptor, graas aco da RAG que o tornou um gene funcional.

Quais as implicaes deste processo? um processo necessrio para gerar clulas B e T. A RAG, como qualquer enzima, reconhece sequncias especficas, apenas cliva o genoma nos locais do V, D e J, onde a sua actividade til para seleccionar os segmentos teis para formar o anticorpo, por exemplo. Tem de haver uma proteco do genoma em geral e uma susceptibilidade apenas dos genes em que a RAG tem de actuar: BCR se a clula for uma clula B em potncia ou TCR se a clula for uma clula T em potncia. Portanto, o que acontece que, nesses locus genticos, nos receptores das clulas B e T, os fragmentos vo ser sinalizados com sequncias especficas que indicam os locais de aco da RAG. Estas sequncias especficas para a RAG designam-se RSS recombinational signal sequences. Nada deixado ao acaso neste processo: A recombinao apenas ocorrer nos genes em que suposto ocorrer.

Sndrome de OmennQuando os genes RAG esto ausentes ou mutados, surge a Sndroma de Omenn. Esta sindroma caracterizada pela ausncia de RAG funcional: as enzimas no esto funcionais e por isso no catalisam a recombinao somtica e originam linfcitos.

Caso Clnico: A criana foi internada porque ao 1 ms de idade, exibindo sintomas de inflamao e de infeco: tinha pus muito abundante nos olhos, nos ouvidos, que foi analisado e que mostrou haver uma infeco por Candida albicans e Staphylococcus aureus, infeces essas que no sero muito graves se o sistema imunitrio estiver eficaz, mas, naquele caso, estavam a causar complicaes muito graves como dificuldade em respirar, etc. A criana era filha de primos direitos, e isto importante dado que a doena recessiva, s se manifesta em homozigotia - a probabilidade de a doena se manifestar aumenta quando os projenitores tm laos familiares. Fizeram-se anlises sanguneas e estas mostraram que, dos seus glbulos brancos, apenas 6% eram linfcitos, tratando-se linfcitos T, em oposio aos normais 50%. Os nveis de anticorpos, principalmente os IgG, essenciais a uma boa resposta imunitria, estavam muitssimo baixos. Visto que os linfcitos B estavam praticamente ausentes, os anticorpos em circulao teriam sido herdados da me. Portanto, a criana no teria imunidade celular e humoral eficaz. Estando ambas as linhagens B e T afectadas, pode suspeitar-se que a deficincia seja num processo comum a ambas as linhagens, como o da recombinao somtica. Fez-se ento um ensaio enzimtico para a RAG (in vitro, adiciona-se DNA com RSS enzima RAG retirada de clulas da criana e regista-se a actividade enzimtica) que indicou que a actividade desta enzima era apenas de 20%. A sequenciao do gene RAG revelou uma mutao missense na sequncia da RAG 1, que provocava a destabilizao do complexo e diminuio da funo. Esta doena rapidamente fatal, pois a criana fica incapaz de resistir a infeces mais graves. O nico tratamento disponvel o transplante de medula ssea, desde que se encontre um dador compatvel. Um transplante de medula ssea permite transferir clulas estaminais hematopoiticas que vo repovoar a medula ssea. As clulas estaminais transferidas do dador tero a enzima RAG funcional, podendo assim originar-se linfcitos B e T normais.

Outros mecanismos de gerao de diversidadeCom a recombinao somtica, formam-se muitas combinaes diferentes que conferem a diversidade resposta imunitria, mas os fragmentos gnicos nos locus dos receptores das clulas B e T so apenas suficientes para assegurar 106 molculas diferentes. O mecanismo que permite amplificar esta diversidade reside na insero aleatria de nucletidos nos locais de juno dos segmentos gnicos recombinados somaticamente, nos locais

de ligao ao antignio. Assim, a afinidade do anticorpo para um antignio vai ser diferente. Novamente, para que este processo seja especfico das clulas B e T, apenas estas clulas vo expressar a enzima TdT terminal deoxynucleotide transferase cuja funo inserir nucletidos aleatoriamente entre os fragmentos recombinados no rearranjo VDJ.

A gerao de diversidade destas molculas resulta da recombinao dos fragmentos que esto espalhados nos locus genticos (que permitem 106 combinaes diferentes) e ainda da multiplicidade de fragmentos que so adicionados aleatoriamente pela TdT entre os segmentos gnicos, conseguindo-se assim obter uma diversidade de 1012 diferentes combinaes, prontas a reconhecer os muitos antignios.

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Imunologia3. Imunidade InataResumo da aula terica: 19 de Fevereiro de 2008 O sistema imune dos vertebrados conta com dois tipos de imunidade: Inata e adaptativa.

Imunidade inataSistema que ajuda a combater a infeco nas fases iniciais, pouco especfico, antes da actuao mais eficaz e especfica da imunidade adaptativa. As superfcies epiteliais externas do corpo constituem uma barreira fsica eficaz contra a maior parte dos organismos. Mas elas esto tambm colonizadas por microorganismos no patognicos, residentes, que competem com os invasores por nutrientes e espao. Para alm disso, quase todos os agentes infecciosos que penetram esta barreira e iniciam uma infeco so eliminados rapidamente pelos mecanismos de resposta imunitria inata.

As barreiras fsicas e os mecanismos de imunidade inata podem ser consideradas defesas estveis, completamente determinadas pelos genes herdados dos nossos pais e prontas a actuar em qualquer momento.

Imunidade inata vs Imunidade aquiridaQuando h quebra das barreiras da primeira linha de defesa, a primeira a actuar a imunidade inata:

importante salienta a interrelao entre imunidade inata e adquirida, sendo que a primeira influencia profundamente a eficcia da segunda.

Aco da imunidade inataInclui: Barreiras entrada de micrbios Destruio de micrbios pelo complemento Destruio de micrbios por clulas fagocticas Inflamao como forma de recrutar mais defesas e impedir a disseminao Activao da imunidade adquirida (adaptive immunity)

Barreiras anatmicas Pele Mucosas Constituem superfcies epiteliais com camadas de clulas unidas por junes oclusivas, aderentes, etc.

Barreiras fisiolgicas movimento dos clios no sistema respiratrio fluxos de lquido (tosse, espirros) muco, secrees Lisozima (lgrimas, saliva) temperatura do corpo enzimas digestivas e baixo pH (sistema digestivo) defensinas (, produzidas pelos netrfilos e criptidinas clulas de Paneth no intestino e , secretadas pelos epitlios epidrmido respiratrio e gastrointestinal), que matam bactrias, fungos e vrus com envelopes por perturbao das suas membranas. No perturbam as clulas humanas pois so sintetizadas como parte de polipptidos maiores e inactivos que ficam activas em meios hipotnicos, como a saliva, o suor, etc. catelicidinas (pptidos que bloqueiam a replicao bacteriana) interferes sistema complemento (conjunto de protenas e proenzimas circulantes) Barreiras microbiolgicas flora microbiana e fngica comensal Quando as primeiras barreiras, no especficas e permanentes (no induzidas), so quebradas, a aco da imunidade inata passa pela activao do complemento e pela ingesto de partculas extracelulares, ambos mecanismos induzidos pelo antignio.

Sistema de complemento Descoberto por Jules Bordet, e assim designado por complementar a aco dos anticorpos. Trata-se de um conjunto de protenas sensveis temperatura, plasmticas ou membranares produzidas sob a forma inactiva zimognios - e activadas aps clivagem.

Esto presentes no soro de animais imunizados e no imunizados. Inclui mais de 30 glicoprotenas: Aproximadamente 20 protenas solveis Enzimas proteolticas Receptores membranares Protenas reguladoras

Nomenclatura

Funo do sistema de complemento

A activao do sistema de complemento pode dar-se por vrias vias, se bem que todas elas levam formao de C3b: Via clssica Via da lectina Via alternativa

Destas, a via clssica tem uma menor importncia na resposta imunitria inata pois tem uma aco tardia, visto que est dependente da formao do complexo antignio-anticorpo e, portanto, de uma resposta adaptativa, especfica.

A activao do sistema de complemento por esta via no se d constantemente com os anticorpos em circulao pois, alm de existirem protenas reguladoras em circulao, C1 s activado por ligao a dois anticorpos colocados num mesmo plano, como acontece quando estes esto ligados ao antignio.

Em relao via alternativa, esta sempre a ser activada, mas no h destruio das clulas graas a protenas reguladoras, com funo inibidora, que impedem a formao do complexo C3 que amplifica a activao do sistema de complemento.

O sistema de complemento est sujeito a mecanismos de regulao de modo a haver proteco do prprio organismo.

Um importante obstculo aos xenotransplantes so diferenas nessas protenas.

H doenas causadas por deficincia de algumas dessas protenas: Edema angioneurtico hereditrio (deficincia de C1inh) Deficincia de factor I

Destruio de micrbios por clulas fagocticas A fagocitose (cell eating) permite a ingesto de partculas com mais de 0,5 m, por exemplo, vrus, bactrias um Mecanismo especfico, iniciado por receptores que fecham sequencialmente a membrana celular em torno da partcula, induzindo a polimerizao de actina e formao de pseudpodes.

As clulas fagocticas incluem: Moncitos

Macrfagos - Derivados dos moncitos Clulas fagocticas mononucleares Residentes: o Macrofagos o Clulas de Kupffer,

Neutrfilos Clulas fagocticas polimorfonucleares (PMN) Em circulao Grnulos citoplasmticos abundantes As mais importantes na destruio das bactrias

Mecanismos microbianos de invaso: Resistncia destruio aps ingesto Evaso do fagossoma (ex. Listeria monocytogenes) Modificao do fagossoma impedindo a sua fuso com outras vesculas, retardando assim a sua maturao (ex. estirpes resistentes de Mycobacterium tuberculosis) Existe assim a possibilidade de falha do mecanismo de fagocitose e infeco. No entanto, a imunidade adaptativa pode conter a infeco.

Mecanismos que facilitam a fagocitose: Opsoninas - Protenas produzidas pelo hospedeiros que se ligam e revestem a superfcie do agente invasor atravs de um receptor especfico

Integrinas - Protenas membranares que favorecem a interaco entre clulas ou com a matriz extracelular Ex.: LFA-1 (lymphocyte functionassociated antigen), VLA-4 (very late activation antigen-4)

Reconhecimento As clulas fagocticas possuem PRRs que reconhecem PAMPs superfcie dos patognios:

PAMP Pathogen associated molecular patterns

PRR Pattern recognition receptors

1. Pouca variabilidade (ao contrrio dos receptores da imunidade adquirida) 2. Capazes de reconhecer molculas comuns a vrios microorganismos diferentes 3. Localizao a) receptores de superfcie - clulas fagocticas (macrofagos, neutrfilos, clulas dendriticas,) Macrophage mannose receptors (MMR) Bact. , fungos => fagocitose Macrophage scavenger receptor (MSR) (dsRNA, LPS,) Toll like receptors (TLR) Receptor para o LPS (CD14) CR1 ligao ao C3b do complemento (opsonizao) Receptores Fc microorganismos opsonizados com Ac ( activao prvia da imunidade adquirida) b) secretados (fgado) opsonizao activao das vias do complemento c) expressos no citosol ou compartimentos intracelulares infeces intracelulares

Molculas da parede celular das bactrias: - LPS - Lipoproteinas bacterianas - cido Lipoteicico - cido Teicoico - Peptidoglicano

RNA e DNA virais DNA e protenas bacterianos Lipoprotenas microbianas

Existe uma grande variabilidade de protenas nas bactrias. Se os receptores nos fagcitos fossem especficos para protenas, o seu grau de variabilidade teria de ser equivalente ao da variabilidade adaptativa, ou seja, dos linfcitos. J as lipoprotenas so mais conservadas na evoluo. Assim, os

fagcitos no necessitam de receptores com to grande variabilidade, havendo tambm menor probabilidade de ocorrer uma mutao nas PAMP que faa com que o macrfago deixe de as reconhecer.

muito importante

Os receptores TLR (toll-like receptors) podem ser extracelulares, expressos principalmente nos fagcitos, ou intracelulares.

Activao Fagocitose Libertao de citocinas (efeito anti-microbiano e pr-inflamatrio)

TNF- e shock Acontece quando existe TNF-a sistmico Situao muito grave caracterizada por: Vasodilatao e aumento do fluxo sanguneo generalizado. Aumento da permeabilidade vascular (reduo do volume de sangue) Coagulao intravascular disseminada (insuficincia de vrios rgos)

Resposta imflamatriaCaracterizada por: Rubor Tumor (edema) Calor Dor

Mecanismos que induzem o recrutamento de leuccitos Factores quimiotcticos - produzidos pelas clulas lesadas e leuccitos que afluem regio inflamada - geram um gradiente de concentrao que induz a quimiotaxia das clulas fagocitrias (macrfagos e neutrfilos) ex.: fragmento C5a factor activador das plaquetas (PAF) quimiocinas (IL-8, factor activador dos macrofagos (MAF), MCP-1, MIP-1a, MIP-1b, RANTES, etc.)

Resposta do sistema imunitrio a vrusOs vrus so intracelulares, logo, so necessrios mecanismos diferentes: Factores solveis interfero Clulas clulas NK (natural killer)

*O dSRNA RNA de cadeira dupla pode surgir nas clulas quando est a ocorrer replicao viral. Clulas NK Numa situao normal, h constantemente uma sinalizao positiva e negativa que se anula nas clulas NK graas a ligandos expressos nas clulas do organismo. Em caso de infeco viral, as clulas reduzem a expresso de MHC I responsvel pelo sinal negativo nas clulas NK, sendo assim alvo destas clulas morte da clula infectada. Existem vrus, como o citalomegalovrus, cujo genoma codifica uma protena semelhante a MHC I, que expressam superfcie da clula quando a infectam, de modo a inibir a aco das clulas NK. Interfero Produzidos por clulas infectadas por vrus (ex. dsRNA) Funes: Resistncia replicao viral Aumento de MHC classe I e apresentao de antignio em todas as clulas Activao de clulas NK para destrurem clulas sem MHC-I Existe: Interfero produzido pelo sistema imunitrio Interfero produzido pelos restantes tecidos

Ligao entre a imunidade inata e a adaptativa feita pelas clulas dendrticas.

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Imunologia5. Diferenciao Clulas BResumo da aula terica: 26 de Fevereiro de 2008

Diferenciao Clulas BDesenvolvimento linfcitos B, baseia-se nos processos de diferenciao celular que partilham um esquema base, ou seja, tem de haver alteraes de expresso genica de uma cel, o seu perfil expresso gentica muda, havendo protenas que vo comear a ser expressas enquanto que outras deixam de o ser. Estas alteraes moleculares repercutem-se num novo fenotipo. No sistema imunitrio conseguimos seguir os estdios de maturao porque existem marcadores de superfcie identificados das cel B e T, e havendo anticorpos especficos para cada marcador, para marcar cada estdio de diferenciao.

Processos genricos de diferenciaoOs nveis de regulao de diferenciao so vrios: se h uma clula que vai diferenciar-se, ela recebe informao do exterior atravs de receptores (receptores que s so funcionais caso haja uma transduo de sinal) e por cascatas de sinalizao de cinases, permite que a nvel nuclear exista uma repercusso nos factores de transcrio activando ou reprimindo a transcrio. Alterando os mRNA e as protenas que constituem a cel.

Clulas BDerivam cel hematopoieticas estaminais, que se diferenciam na medula ssea atravs de uma serie de processos. As cel B fazem anticorpos.

Desenvolvimento cel BPara ser cl b tem de expressar uma molcula que o marcador de cel B. Uma cel B s o porque expressa um receptor cel B (Bcr), qualquer cel que n tenha o receptor superfcie de cl B, nunca pode ser uma cel B, mas poder ser o seu progenitor se seguir uma diferenciao para cel B, de modo a futuramente expressar o receptor. O receptor especfico desta linhagem de cel imunitrias, n havendo mais nenhuma cel no organismo com capacidade para o expressar.

Configurao Bcr um receptor de superfcie, com duas cadeias: Duas cadeias pesadas Duas cadeias leves

As cadeias leves e as pesadas so exactamente iguais entre si, o que caracteriza o facto do receptor ter apenas uma especificidade. Ou seja, vai reconhecer em termos preferenciais um antigenio, tendo dois locais de ligao ao antigenio. Ento o mesmo receptor reconhece o mesmo antigenio pelos dois braos que o constituem, propriedade que dada, pelo facto das duas cadeias pesadas e leves serem iguais entre si e especificas para o mesmo antigenio. Considera-se o Bcr um heterodimero, contudo tecnicamente ele um dimero, pois constitudo por 4 cadeias, iguais duas a duas, ou seja constitudo apenas por dois tipos de cadeias diferentes. O receptor deixa de o ser, quando as cel B forem activadas, transformando-se em plasmocitos (cel produtora de anticorpos). Imunoglobulina - termo geral que engloba tanto o receptor B como o anticorpo, no entanto mais associada ao termo anticorpo.

Fase inicial da vida da cel BCl B produzida na medula ssea, mas tem de deix-la para exercer a sua funo por todo o organismo (em especial migra para os rgos linfoides secundrios como o bao ou ndulos linfticos). Nesta fase mais posterior pode entrar em circulao onde pode ser activada, tornando-se num plasmcito, produtor de anticorpos.

Desenvolvimento cl B na medula sseaDivide-se o processo em fases distintas: que baseando-se nos estdios de rearranjos do Bcr. O objectivo de uma cel precursora de cel B ter o receptor BCR. Para ter o Bcr a cel vai ter de rearranjar os locus genicos (um locus para cada cadeia) que codificam esse receptor. H um locus para a cadeia pesada e outro para a cadeia leve. S com as duas cadeias rearranjadas, transcritas e traduzidas que obtm-se um Bcr. Os locus rearranjados da cadeia pesada e da cadeia leve esto em cromossomas diferentes que codificam protenas diferentes que numa fase posterior vo ter de emparelhar, heterodimerizar, e formar o receptor. Mas, ambos os locus tm de sofrer rearranjos para formar genes funcionais, dando origem s protenas do BCR. Os genes nas cel somticas esto partidos em pedaos que esto interdispersos em quilopares de bases, por isso no possvel formar RNAm e protenas funcionais sem haver primeiro o rearranjo. Os rearranjos vo juntar os pedaos de genes que no fazem sentido despedaados, para formar um gene funcional da cadeia pesada ou leve. As divises das fases relacionam-se com rearranjos VDJ: Cadeia pesada (os segmentos so V, D e J) Cadeia leve mais pequena (s tem segmentos V e J).

Os rearranjos de ambas as cadeias so assncronos. No inicio d-se o rearranjo da cadeia pesada, posteriormente que a cadeia leve rearranjada.

Problema da cl em diferenciaoInicialmente no tem rearranjos nenhuns porque uma cel estaminal (n esta comprometida com a linhagem B, logo no est a rearranjar os locus da cel B) Quando comea a rearranjar o locus da cadeia pesada a cel passa a estar comprometida com a linhagem cel B. Aquela cel j est determinada a ser uma cel B e n pode voltar atrs, pois os locus so muito especficos, e altamente controlados, para que mais nenhuma linhagem possa rearranjlos. Comeou o rearranjo da cadeia B, temos uma cel B em potncia que designada de pr-B, um prottipo de cel B, a fase mais primitiva. A cl passa de pr-B a pr-B quando j completou o rearranjo do DNA e j tem a protena corresponde quele rearranjo funcional.

que

Diferenas pr-B e pr-B Pr-B - comeou o rearranjo do DNA, mas ainda no tem nenhuma protena derivada dos rearranjos, porque os rearranjos no esto completos, e por isso no h um gene funcional. Pr-B - j terminou o rearranjo da cadeia pesada, j havendo o gene, o RNAm e a protena.

Primeiro vai haver um receptor que deriva dos rearranjos no locus da cadeia pesada. Mas ainda no uma cel B, porque falta a cadeia leve, que ainda no rearranjou. Para haver Bcr tem de haver rearranjo cadeia leve e pesada, formando assim uma cel B.

Importncia cadeia leve para a cel BOs receptores ainda no esto funcionais, pois s o so com a cadeia leve.

Configurao dos receptores s com a cadeia pesadaDeixa de haver um receptor em Y, deixa de haver os 2 braos caractersticos do Bcr, temos um homodmero com duas cadeias paralelas. Mas, esta molcula no funcional, e nem sequer excretada para a superfcie. Homodimeros de cadeia pesada no so estveis. Como estabilizar um receptor que ainda lhe falta a cadeia leve? Produz-se um receptor intermdio: pr-Bcr, que semelhante ao Bcr, havendo uma substituio das cadeias leves, por duas protenas VpreB e 5, que ocupam o lugar da cadeia leve, enquanto ela no est presente. Vo estabilizar o receptor e

permitir que ele v para a superfcie. O pr-Bcr precisa destas protenas que so muito diferentes relativamente cadeia leve: Origem- para termos uma cadeia leve precisamos dos rearranjos, enquanto que as protenas que substituem a cadeia leve no derivam de rearranjos, derivam de genes estruturados que s precisam de ser transcritos e traduzidos. (as nicas protenas que derivam de rearranjos so protenas do BCR e TCR)

As protenas VpreB e 5 localizadas no cromossoma 22 nos humanos e no cromossoma 16 nos ratinhos, tm a caracterstica de emparelhar com a cadeia pesada, estabilizando-a para formar um complexo prematuro (pr-Bcr) com o precursor do Bcr. Tudo isto ocorre na medula ssea. Em circulao nada emparelha com a cadeia pesada, porque s saem da medula ssea para a circulao, as cel que tm Bcr funcional, com cadeia pesada e leve. Ou seja, o pr-Bcr um mecanismo que permite cel passar a fase em que j tem cadeia pesada e ainda no tem a leve.

Importncia de haver uma fase onde s existe a cadeia pesada e a leve ainda no rearranjouForma de poupar energia. Sabendo que necessrio rearranjos, se a cadeia pesada rearranjada intil, ou se o rearranjo foi mal feito, no vale a pena continuar o processo, porque j existe uma protena abortiva. Mesmo que exista uma cadeia leve perfeita o receptor no vai conseguir emparelhar com nada. Este um checkpoint, que minimiza o gasto de energia para a cel B (sabendo que produzimos milhes por dia). Cerca de 70% falham o rearranjo, e por isso nem sequer chegam a terminar o desenvolvimento Bcr, e sofrem apoptose. S 30% cel B so teis. Este um mecanismo complexo, mas o nico mecanismo que nos permite lidar com o problema da diversidade dos antignios. S possvel ter receptores to diversificados, com os genes todos partidos aos pedaos, e sendo rearranjados aleatoriamente; assim, conseguimos ter anticorpos contra tudo. Quando os rearranjos com as RAG correm mal, temos de eliminar as cel que no so teis. H um espao limitado na nossa circulao que pode ser preenchido com cel B. O objectivo que todas as cel B em circulao possam interagir com antignios. A melhor forma de controlar a formao de Bcr funcionais, saber se a cel tem cadeia pesada til, caso contrrio morre. o pr-Bcr que permite a passagem de cel pr-B para cel B. A cadeia leve vai permitir a cel, a formar o Bcr e sair da medula ssea para a periferia.

Fentipo durante o desenvolvimento da cl BEnquanto a cel B esta a passar por todos estes estdios, o seu fentipo celular extremamente dinmico. As protenas que a cel expressa superfcie e intracelularmente vo variando. Expresso de um dado receptor, tem a ver com a funcionalidade da cel na fase em que se encontra. Exemplo: Receptor da IL-7 - importante tanto para o desenvolvimento cel B como T, expresso nas fases mais prematuras de diferenciao. As cel pr e pr-B so altamente dependentes da expresso de IL-7. Caso no haja expresso de IL-7 na medula ssea, as cel atrofiam e no se desenvolvem. Depois de terem passado o checkpoint, a dependncia de IL-7 desaparece deixando de estar superfcie, porque existe um novo receptor que tem o papel de motor da diferenciao que lhe toma o lugar, que o pr-Bcr. C-kit - um receptor de cel estaminais, as cel que esto mais prximas das cel estaminais, as cel-me da cel B, ainda esto dependentes deste factor solvel, que o factor de cel estaminais. Quando as cel comeam a maturar deixam de ser dependentes do C-kit, e o receptor desaparece. E outros receptores passam a ser expressos. Ilustrando o quo dinmico o processo de diferenciao de cel B.

ResumindoPara termos uma cel pr-B precisamos de ter uma cel que j esteja a expressar RAG, sem RAG no h rearranjos nem do BCR, nem do TCR. O facto da cel pr-B ter RAG, faz com que comece a fazer os rearranjos VDJ da cadeia pesada. Se os rearranjos forem mal sucedidos a cel morre. Se forem feitos com sucesso a cel progride, passa a ter duas cadeias pesadas, emparelhadas com as duas protenas no rearranjadas acessrias, formando o pr-Bcr. 1 checkpoint, s as cel com o pr-Bcr que podero progredir e proliferar para a fase seguinte, onde vai ocorrer o rearranjo da cadeia leve. A cadeia leve vai tomar o lugar das protenas acessrias, que estavam no pr-Bcr e formando o receptor final que d origem cel B madura. Se o rearranjo da cadeia leve for abortivo aquela cel tambm morre. Porque o pr-Bcr, no consegue dar total funcionalidade cel B, no permite que a cel saia da medula ssea. Este um novo checkpoint, onde se verifica na medula ssea, qual a cel que consegue colocar sua superfcie um Bcr funcional. S as cel que recebem sinais especficos atravs do receptor Bcr maduro, que conseguem sair da medula ssea e so funcionais na periferia.

Quando todo este processo tem deficincias surgem doenas Agammaglobulinmia- ausncia de anticorpos na circulao, faz com que o doente no esteja protegido contra principalmente os organismos extracelulares, que desencadeiam uma resposta humoral forte com anticorpos especficos. Nesta doena vai ocorrer uma mutao num dos genes, bloqueando o sinal gerado no checkpoint onde temos pr-Bcr, o pr-Bcr no consegue sinalizar para dentro da cel, porque a tirosina cinase da cel B(BTK) no esta funcional. A BTK fundamental na transduo de sinal por cascatas de fosforilao da cel B. E mesmo que o receptor esteja presente no vai sinalizar, havendo um bloqueio no processo de diferenciao da cel B, no havendo desenvolvimento de cel B maduras, logo no h cel em circulao que produzem anticorpos. O indicador fisiolgico desta patologia, a ausncia de anticorpos de todas as classes no sangue. Todas as cel B esto bloqueadas em pr-B. Agammaglobulinmia uma doena ligada ao cromossoma X, porque o gene BTK se encontra cromossoma X, logo as mulheres so portadoras e os homens doentes. As mulheres raramente so doentes, porque para isso o pai tinha de ser doente, e se o pai no tem anticorpos no tem uma vida muito longa, e desaconselhada a procriao. Tratamento: transplante de medula ssea (como no sindroma de omen onde no temos RAG), temos uma medula com BTK, possibilitando as cl pr-B completarem o seu desenvolvimento. O transplante muito complexo pela histocompatibilidade. Imunossupresso e cl T reguladoras tm de ser controladas para haver maior tolerncia transplantao.

Na periferiaFora da medula ssea, vo haver mutaes no DNA que vo alterar o genoma. Isto acontece quando as cel esto prontas para serem activadas, ou seja, prontas a interagir com o seu antignio, e receber sinais especficos para proliferar, fazendo anticorpo para que o patogenio da qual aquele antigenio especfico seja eliminado. Existem dois processos para alterao DNA periferia: Hipermutao somtica Mudana de classe

Dois processos que ocorrem em cel B funcionais que j saram da medula ssea, vo para a periferia e vo mudar o tipo de receptor que tm na sua superfcie. Os receptores de clulas B no so formados na medula de uma forma estanque, s terminado o processo depois de sarem da medula ssea. Isto s acontece em cel B, no caso das cel T estes processos que ocorrem periferia no vo existir. A cel T sai do timo j com o seu receptor final e no pode alterar mais o seu receptor. A cel T quando deixa o timo j sabe o que vai reconhecer e com que afinidade vai reconhecer. A cel B sai da medula com um receptor funcional, mas pode mud-los, normalmente no muda no sentido de ir reconhecer algo totalmente diferente, mas muda a interaco especfica que tem com aquele antignio. Tem a capacidade nica de tornar-se uma cel B melhor, produzindo um anticorpo com maior afinidade para determinado antignio.

ResumindoA cel T sai do timo j com o receptor com determinada afinidade para o antignio especfico, e j no pode ser moldada. Enquanto que, a cel B vai ter a capacidade de mudar o seu receptor, a sequencia do seu receptor.

Hipermutao somtica - processo de mudana de afinidade do receptor das cel B para o antigenio. Est intimamente relacionada com a maturao da afinidade - quer dizer que a afinidade anticorpoantigenio vai poder mudar, tornar-se melhor, reagir com mais afinidade com o antignio, para que haja um reconhecimento melhor, mais eficaz. Isto devido ao processo de hipermutao somtica. A hipermutao somtica, consiste em mutaes de nucletidos isolados, na sequncia do receptor das cel B, estas mutaes acumulam-se todas na regio varivel do anticorpo, a regio do anticorpo que interage com o antignio (braos do Y), porque a parte constante serve para a funo efectora das clulas. A parte varivel que faz com que os anticorpos sejam todos diferentes e por isso reconheam antignios diferentes. No processo de hipermutao somtica h uma acumulao de mutaes na regio varivel. As mutaes acumulam-se ao longo da sequncia, mas h zonas particulares onde no h mutaes. Essas zonas com uma faixa azul, cdr1, cdr2, cdr3, so as zonas dentro da regio varivel as mais expostas, onde h o contacto directo entre o antigenio e o anticorpo. na zona mais exposta onde se acumulam as mutaes.

As zonas que esto menos expostas tm mutaes mais pontuais, no se acumulam tanto. Processo selecciona molculas que acumulam mutaes nas zonas crticas para a interaco com o antignio.

Como que as mutaes surgem?O processo da hipermutao somtica no pode ocorrer completamente ao acaso. Vo haver processos celulares que vo promover este processo, h uma enzima AID que vai ser responsvel em particular, por fazer as mutaes e acumul-las. Este processo vai poder ser rentabilizado, pois temos uma enzima que vai promover reaces de formao de mutao, ou seja, de mudana de sequncia, mudando a sequncia do anticorpo. Este processo dinmico. Cel B que saiu da medula ssea com um receptor superfcie, vo ocorrer mutaes ao nvel do DNA. Assim a AID, vai ao nvel do DNA promover reaces de mutao, mudando as bases dos nucletidos, fazendo com que a sequncia mude. Um nucletido diferente, pode levar na maior parte das vezes a uma alterao do aa (no uma mutao silenciosa), tendo uma repercusso na sequncia da protena, estabelecendo-se uma nova sequncia para aquela molcula de anticorpo. Isto acontece na periferia, nomeadamente nos ndulos linfticos ou no bao, onde as cel B se encontram e acumulam, estando espera de serem activadas pelo seu respectivo antignio. H cel B que saram da medula ssea com determinado receptor e que no mudaram o seu receptor, mas h outras que mutaram o receptor, tendo alterado a sua sequncia. O que acontece : ou a mutao levou a que se obtivesse uma sequncia melhor para reconhecer o antignio, ou a sequncia desfavoreceu a interaco com o antignio. Se desfavoreceu a ligao receptor-antignio, a cel B que foi mutada interage pior com o antignio que a cel B que j l se encontrava que veio da medula ssea e permaneceu intacta. O que faz com que essa cel B que sofreu a mutao tenha uma desvantagem competitiva, e a cel B s vai proliferar se interagir com o antignio de forma eficaz e se receber o sinal de activao. Qualquer cel B que tenha uma afinidade pior para o anitgnio, responde menos ao antignio e por isso fica menos activa. Caso contrrio, se as mutaes que o receptor sofreu nas regies variveis, fazem com que se estabeleam pontes de hidrognio com o antignio de uma forma mais eficaz, o receptor de cel B d uma sinal mais forte cel. Ela replica-se mais, tendo assim uma vantagem competitiva. Em termos dinmicos o que vai acontecer que as cel B que se vo acumular e produzir anticorpos so aquelas que vo ter os receptores que so mais afins para o antignio. As cel B seleccionadas, por maior interaco com o antignio, tornam-se a populao dominante dentro daquele rgo linfoide. Este processo d-nos ento a possibilidade de produzir anticorpos mais fortes, mais afins possveis para o antignio em circulao. Estamos condenados a respeitar a aleatoriedade de processos que ocorrem na medula ssea, mas podemos ainda mudar e optimizar este processo na periferia, no local onde vamos receber os antigenios.

Queremos anticorpos contra todos antignios, mas se a dada altura houver em circulao um vrus, o que queremos muitos anticorpos para aquele determinado antignio. Da a importncia deste processo, porque ele dependente do antignio. O processo s ocorre quando este receptor mutado interagir com o antignio.

ResumindoA cel B sai da medula ssea com um dado receptor de cel B, chegou ao ndulo linftico ou ao bao. Quando l chegar um dado antignio especfico para aquela cel interage com ela. A cel recebe um sinal. Esse sinal, aumenta os nveis da enzima AID que permite mudar o receptor que deu origem ao sinal. Assim, a interaco com o antignio vai permitir transmitir um sinal que leva expresso da enzima AID, que vai at ao DNA e muda a sequncia que d origem regio varivel do receptor cel B. Mediante as mutaes, os que interagem melhor com o antignio sobrevivem, os piores morrem. O que permite que se produzam anticorpos cada vez mais especficos, cada vez mais afins. O processo de mutao de afinidade, significa que o que se est a mudar a afinidade, e no a especificidade. Sendo as cel mais especificas para determinado antignio as que recebem mais sinal.

Mudana de ClasseA funo efectora dos anticorpos, dada pela poro constante do Bcr. No tem a ver com a regio varivel. Durante a diferenciao das cel vai haver um processo, que vai permitir a ocorrncia da mudana de classe. Ou seja, que os anticorpos mudem. Na medula ssea os anticorpos so produzidos nas duas classes IgD e IgM. Vai haver possibilidade de mudar o esqueleto da molcula de anticorpo, para formar anticorpos de outras classes Igg, IgA e IgE. IgE - alergias IgA - mucosas (intestino por exemplo) IgG - infeces Este processo permite-nos mudar a classe do anticorpo, passar de um IgD ou IgM para outro Ig.

Quanto s cel de memria, vamos ter cel que mudaram o seu Bcr, e cel que no mudaram o seu Bcr. Se aquelas que mudaram o Bcr so mais afins, ento teremos cel de memria mutadas mais afins e cel de memria sem mutao menos afins. O importante a sua capacidade de reagir muito depressa. Vamos ter cel de memria com diversos tipos de receptores. Fazemos cel de memria de todas as cel eficazes a lidar com determinado antignio. A cel B nunca sai da medula ssea sem os rearranjos VDJ feitos. S sai da medula ssea quando tiver o seu receptor formado. Este processo de hipermutao somtico vai ocorrer a nvel de DNA, com a diferena que este DNA j tinha sido rearranjado nos arranjos VDJ. A nica diferena que quando a cel B quando vai para a periferia contactar com o antignio pode mudar a afinidade do receptor. Mas estas mutaes so pontuais e j n tm a participao das RAGs, porque os rearranjos j acabaram. A cel B s activa a sua formao de anticorpos quando h antignio no organismo. Tornando-se um plasmocito (cel b a produzir anticorpos). A maioria das cel B est inactivada.

Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

Imunologia6. Desenvolvimento Clulas T e NKResumo da aula terica: 28 de Fevereiro de 2008

Diferenciao de clulas T no timoAo contrrio das cel B, as cel T no se diferenciam na medula ssea ma s no timo. Da que os precursores hematopoieticos estaminais e a sua descendncia cheguem at ao timo e a se diferenciem em cel T funcionais, que podem migrar para a periferia e exercer as suas funes.

Funes de cel T Matam alvos (cel infectadas ou transformadas)- cel citotxicas. Um marcador til para as identificar a molcula CD8 Ajudam outras cl do sistema imunitrio como macrfagos ou cel B. Cd4 um co-receptor, que caracteriza as cel de ajuda. A ajuda da cel T B vai ser essencial para que a cel B deixe de ter simplesmente o seu receptor superfcie, mas passe a secret-lo tornando-se num plasmocito, produtor de anticorpos. Existem duas grandes categorias de cel helper: cel TH1 e TH2. Existem outras como Th17, cel T reguladoras muito mais complexas.

Em geral podemos ver as cel T como cel que podem matar uma cel infectada, ou transformada ou como secretoras de citocinas (elementos solveis que se servem de factores de ajuda ou de crescimento ou de activao de outras cel do sistema imunitrio).

Diferenciao das linhagens de cel T e suas funesO que caracteriza uma cel T o seu receptor. O receptor o resultado dos rearranjos altamente complexos VDJ (recombinao somtica), que no caso cel T ocorre nos locus genticos para o receptor das cel T. Fala-se em locus gentico porque temos pedaos de genes espaados de muitos quilopares de bases, que tm de ser rearranjados para formar um gene funcional dando origem a uma protena - cadeia ; e noutro cromossoma no locus gentico da cadeia , dando origem respectiva cadeia. Sendo heterodimero que vai constituir o receptor da maioria das cel T. Na realidade, h 2 populaes cel T, as com o receptor , e as . E ambas fazem o mecanismo rearranjos dos segmentos genticos para produzir o gene funcional, que vai dar no fim uma protena funcional como Tcr . Apesar destes receptores estarem superfcie e serem eles que vo interagir com os antigenios, eles s transmitem sinais para dentro da clula se estiverem acoplados s protenas: Cd3 que so um elemento de transduo de sinal do complexo Tcr. Designamos este de complexo Tcr, que constitudo pelo Tcr (prprio o receptor), e pelas subunidades Cd3 que so de diversos tipos ,, este grande complexo que sinaliza intracelularmente. Esta sinalizao depende de zonas das molculas Cd3, que so designados de ITAM- imunoreceptor tyrosine-base activation motif. Relaciona-se com as tirosinas contidas nesta sequncia de aa, tirosinas que so altamente fosforilaveis, sendo que o mecanismo de transduo de sinal dentro das cel so cascatas de fosforilao. O que vai acontecer transferncia de grupos de fosfato, entre as vrias protenas que vo estar por baixo do Tcr. A informao s vai chegar ao ncleo porque as Cd3 tm tirosinas fosforilaveis e porque existem uma serie de protenas que so reponsaveis pela transduo de sinal. Tanto o receptor , como usam as molculas Cd3 para fazer transduo de sinal, o que faz com que o Cd3 seja um marcador nico das cel T. Todas as cel T so Cd3 positivas. Outros marcadores ou so partilhados com outras linhagens celulares, ou so diferentes entre os dois tipos de cel T.

Desenvolvimento do complexo Tcr

O desenvolvimento do complexo Tcr tem de ocorrer no timo, para que a partir de cel hematopoieticas estaminais, e precursores linfoides comum, estas cel se desenvolvam para depois migrar do timo para os rgos linfoides secundarios e exercer a sua funo.

O timo um rgo sobreposto ao corao. O objectivo no desenvolvimento do timo adquirir receptores de cel T que vo dar cel T capacidade de reconhecer antigenios. Sem receptor de cel T a cel no sequer uma cel T, nem sequer era capaz de interagir com o antigenio. O timo o local preferencial de diferenciao destas cel porque oferece um conjunto de sinais que outros rgos no oferecem. O timo tem uma arquitectura particular onde existem cel epiteliais diferentes no crtex e na medula. O timo composto por cel do esqueleto, e cel de origem hematopoietica como macrfagos ou cel dendriticas, que vo dar sinais especficos s cel T. Os timocitos e linfocitos em geral so extremamente redondos e regulares na sua forma. O timo uma estrutura altamente complexa em que cada timocito est a receber sinais do epitelio e de outras cel de origem hematopoietica.

A importncia do timo: Sindrome diGeorgeEm pacientes com mutao no cromossoma 22 no tm timo - sndrome de diGeorge. Neste sndrome no h desenvolvimento do timo, havendo ausncia de cel T. Ratinhos nude so utilizados para demonstrar a importncia do timo. Chamam-se nude porque no tm plo, pois tm uma mutao num gene foxn1, que um factor de transcrio essencial para que as cel epiteliais se diferenciem terminalmente. Sem este factor de transcrio no h epitelio diferenciado. A pele no atinge a diferenciao ao ponto de produzir plos, que so dependentes das cel epiteliais que os suportam. Por outro lado, o timo que precisa do epitelio, tambm vai ser um timo amorfo, e subdesenvolvido. Praticamente no possvel detectar timo nestes ratinhos, o que faz com que os ratinhos no tenham cel T.Caso clnico Santa Maria: 3 meses de idade, criana com alopecia total (ausncia de plo), e uma adenite provocada pela vacinao pela BCG. Aos 5 meses tinha falhas respiratrias graves. Havia uma disseminao de bactrias da vacina BCG. E por radiografia percebeu-se que o timo no estava presente (em crianas ele grande; com a idade precisamos menos do timo porque temos mais cel T em circulao). No havia cel T em circulao numa concentrao normal. Diagnosticada SCID, onde cel do sistema imunitrio esto deficientes (normalmente, tem a ver com mutaes em genes essenciais ao sistema imunitrio que podem afectar cel B ou T). No caso havia deficincias cel T, reforado sobretudo pela alopecia. A partir da foi estudado em detalhe o gene foxn1. Foi feito o genotipo pai e da me e ambos eram heterozigoticos para o gene foxn1, e a criana tinha herdado o gene recessivo, sendo homozigotica, manifestando SCID. Havia um TGA nesta sequncia, que um codo stop, e a criana no tinha a protena codificada pelo gene foxn1. Fez-se um transplante de timo, e no de medula porque a medula estava saudvel, o timo que no estava desenvolvido. preciso um dador, depois mergulha-se o timo numa substancia que mata as cel hematopoieticas do dador, porque o dador muito raramente ser compatvel com o receptor (tiramos cel T que esto no timo que ao chegarem ao nosso corpo o vo rejeitar, ficando s o epitelio). Mesmo que se transplante um timo de adulto j parcialmente atrofiado, ele continua a conseguir produzir bastantes cel T.

Onde colocar o timo? Na coxa, entre os msculos, que so muito irrigados. No fim verificou-se que as cel T Cd4 (helper) estavam a recuperar. As Cd8 so mais lentas na recuperao.

A partir daqui possvel ver o quo importante o timo para o desenvolvimento cel T.

O que acontece no timo?As cel B dividiam-se em diversas fases de diferenciao: pr-B, pr-B e B maduras. O mesmo se passa com as cel T: pr-T, pr-T e T maduras. Ambas as linhagens derivam dos progenitores pr-b, pr-t, de uma populao que se designa duplamente negativos, porque no expressam, so negativos para Cd4 e Cd8 (molculas acessrias muito importantes para activao cel T). As cel T de ajuda so Cd4+, as citotoxicas Cd8+, e os progenitores so negativos para ambas as molculas. A partir de cel duplamente negativas para se desenvolverem em cel de ajuda ou citotoxicas, passam por um estdio onde se encontram cerca de 80% dos timocitos, estdio de duplamente positivos Cd4+ e Cd8+. E so destas cel me que se geram ou cel de ajuda ou cel citotoxicas. A deciso celular em tornar-se uma cel citotoxica, ou uma cel de ajuda ocorre em cel que so fenotipicamente definidas positivamente pelos dois marcadores Cd4 e Cd8. Enquanto que a deciso para seguir a linhagem , esta ocorre nos precursores mais imaturos, nos duplamente negativos, que tm de decidir se vo para a linhagem ou .

O que que acontece com uma cel pr e pr-T?Por citometria de fluxo, temos marcadores superfcie das cel, que podemos reconhecer com anticorpos marcados fluorescentemente, e identificamos assim as vrias populaes. No timo do ratinho, existem cel Cd4 e Cd8 negativas, que chegam da medula ssea ao timo. Passam para a fase em que expressam Cd4 e Cd8 duplamente positivas (cerca de 80%). So essas cel que decidem em tornar-se citotoxicas (Cd8+ e Cd4-), ou de ajuda(Cd4+ e Cd8-). Todas elas so identificadas por anticorpos fluorescentes. Tal como nas cel B, tambm nas cel T h expresso de protenas superfcie da cel que vo variar mediante o estdio de diferenciao. Permitindo definir os estdios de duplamente negativos, duplamente positivos. C-kit - um factor que promove o crescimento de cel estaminais. No inicio da diferenciao no timo este receptor muito importante, as cel esto mais prximas das cel estaminais, e so dependentes deste factor para o seu crescimento. Depois este factor desaparece do timo porque outros receptores que se tornam mais importantes para dirigir a sua diferenciao (como a il-7). il-7- o receptor da il-7 muito impotante, porque na ausncia da il-7 as cel T no recebem sinais fundamentais de sobrevivncia, necessrios para elas progredirem at gerarem a cel maduras. Em ratinhos nockout para a il-7 ou para o seu receptor, cel T morrem durante a diferenciao. Na linhagem passam para 10% do que o normal, pois as cel duplamente positivas esto diminudas, o que faz com que o timo tenha uma dimenso menor (a populao mais abundante de timocitos fica diminuda). No caso das a reduo de cel mais dramtica,a reduo para zero, no h cel em ratinhos que no expressam il-7. Da que a il-7 indispensvel para haver cel da linhagem . (il-7 um factor de transcrio tambm importante para as cel B)

no estdio duplamente negativo, que se as cel no receberem sinais do receptor il-7, ficam fragilizadas e acabam em grande parte por morrer. As cel no se produzem, porque os rearranjos VDJ, s ocorrem se houver sinais da il-7. Enquanto que na linhagem , os rearranjos no so dependentes da il-7, mas a sua sobrevivncia dependente deste factor de crescimento, havendo uma reduo cel T .A mutao humana, origina uma SCID, ligada ao cromossoma X. Dos genes que codificam o receptor da il-7 (o receptor tem 3 cadeias), o que codifica a cadeia particularmente importante porque partilhada com outros receptores de il, se esse gene para a cadeia estiver mutado, o receptor il-7 no funcional e existe uma ausncia de cel T. Contudo, as cel B encontram-se em nveis razoavelmente nor mais, porque as cel B so menos dependentes da il-7 do que as cel T. Normalmente, esta SCID manifesta-se em crianas particularmente susceptveis a infeces, ao fazer anlises ao sangue, verifica-se uma grande diminuio cel T, mas as cel B esto dentro de valores normais, pode-se concluir que algo est a falhar na gerao das cel T. Pensa-se numa possvel mutao no receptor il-7 fundamental para que as cel T se diferenciem. Um teste possvel, analisar se as cel B presentes tm o receptor da il-7, com um anticorpo monoclonal que reconhece a cadeia da il-7. Caso as cel B no tenham o receptor, elas conseguem formar-se porque tm informao de outros receptores, mas significa que o receptor tambm no est nas cel T e por isso as cel T no esto a conseguir diferenciar-se. Tratamento: neste caso o problema dever ser resolvido com transplante de medula ssea, porque o problema tem a ver com a linhagem hematopoietica. Tem a ver com as cel do indivduo que no conseguem expressar o receptor. Se tivermos um dador de medula ssea com o receptor il-7 intacto, basta transferir-se a medula ssea para a criana e j se consegue gerar cel T com receptor intacto.

A seguir ao receptor il-7, qual o receptor mais importante na fase subsequente do desenvolvimento das cel T? um pr-receptor de cel T, tal como nas cel B.

(nas cl B os rearranjos da cadeia pesada acabam antes da cadeia leve e preciso o pr-receptor, para que as cel no fiquem estancadas s com cadeia pesada e sem a leve. Ento temos um receptor substituto onde a cadeia pesada arranja umas protenas normais dentro da clula, capazes de emparelhar com a cadeia pesada e fazer um primeiro receptor que d sinais cel para ela avanar).

Nas cel T temos uma cadeia e uma , a cadeia vai estar presente muito cedo, mas a cadeia s vai surgir no fim do desenvolvimento, nas cel Cd4+ ou Cd8+. Como os homodimeros no so estveis, e os monmeros so ainda menos estveis, a cadeia tem de emparelhar com alguma protena. No entanto, a nica cadeia com a qual a cadeia tem afinidade a cadeia , que s produzida uns dias mais tarde. Ento substituise a cadeia por uma protena normal, que no deriva de gene rearranjados. A protena chama-se pr-Tcr e forma o receptor pr-Tcr. Pt o produto de um gene normal da cel.(ns no herdamos os genes dos receptores linfocitos, herdamos o mecanismos para produzir os nossos prprios genes, por herdarmos o gene que codifica a protena RAG)

O pr-Tcr, faz o papel do Tcr em fases mais prematuras. Ou seja, em ratinhos que no tm pr-Tcr, as cel comeam a diferenciarse, recebem os sinais da il-7, mas chegam a esta fas e onde precisam de ter um pr receptor e se no tiverem morrem (grande parte das cel B e T morre), no timo 90% cel T morrem, porque no passam os checkpoints, sendo a presena do pr-Tcr o 1 checkpoint. Quando a cel no tem pr-Tcr morre. Se tiver pr-Tcr, passa para populao cel duplamente positivas, sofrendo uma expanso.

ResumindoO que preciso ter uma RAG, que faa os rearranjos, que os rearranjos sejam produtivos, e os checkpoints analisam se a cl rearranjou bem as cadeias dos receptores para poder seguir a diferenciao. Porque caso contrrio pra a sua diferenciao, porque a cel no vivel, e assim no perdemos energia a construir uma cel no vivel. (as cadeias normalmente no so bem rearranjadas quando a sua estrutura tridimensional e as interaces entre aa da mesma protena no correcta.) Se houver cadeia bem rearranjada, a cel espera pelo rearranjo cadeia para produzir uma cel T. Fases na diferenciao cel T: Inicial- em que no h nenhum receptor de cel T, que est muito dependente de outros receptores como o receptor notch ou il-7 Depois- as cel recebem um pr-receptor superfcie que vai ter um papel fundamental ate o receptor maduro surgir.

As cel s saiem do timo se tiverem o receptor maduro, todas as cl anteriores cel T madura so cel exclusivas do timo. O timo o responsvel pela diferenciao completa das cel T. S saiem do timo cel que tenham Tcr. Pr-Tcr s pode ser encontrado no timo , pr-Tcr um complexo de transio. Tcr, podemos encontrar em muitos lados, rgos linfoides secundrios, ou locais infeco.

Aps haver um Tcr maduro, o Tcr interage com o ligando MHC-complexo maior de histocompatibilidade. Os problemas de transplantao, deriva do facto de sermos polimorficos para o MHC, que so diferentes entre cada indivduo. O que est por detrs da rejeio o facto das cel MHC serem o ligando das cel T. Assim, as cel T vo patrulhar o organismo atravs das molculas MHC. Caso a cel no haja MHC a cel no consegue identificar nada. Todas as cel do nosso organismo excepto os glbulos vermelhos tm MH C- I, que a molcula que informa as cel T que o organismo est normal. s vezes os MHC deixam de estar superfcie em casos de infeces e cancros, sendo uma escapatria ao controlo das cel T.

Sem MHC o receptor Tcr no serve de nada. o MHC que apresenta o pequeno pptido especfico de determinado antigenio. Da que as cel T so diferentes das cel B, na medida em que no vem uma protena completa, como a cel B v (anticorpo reconhece uma protena completa). A cel T responsvel pela imunidade celular, o que ela reconhece so clulas, portanto tem a capacidade de interagir com celulas, no com protenas como acontece com cel B (imunidade humoral) . Se cel T reconhecessem protenas andavam em soluo, e esse o papel dos anticorpos. A funo cel T chegar cel e saber se ela esta infectada ou no, se tiver tem de ser destruda. Esta deciso s possvel porque Tcr interage com as molculas MHC-I (s a classe I que expressa pelo nosso organismo, excepto pelos eritrcitos).

Fase final diferenciao cel TDepende da interaco que o receptor cel T tem com o MHC. O MHC vai ser fornecido pelas cel que esto no timo: cel epiteliais, cel dendriticas, que vo puder apresentar MHC e pequenos pptidos s cel T que esto em diferenciao.

Destino das cl T que j tm Tcr, aps interaco com o MHCAs cel T que saiem do timo, tm de conseguir interagir com o MHC, para que consigam fazer o reconhecimento. Uma cel que passe os 1s checkpoints, tenha o Tcr e no consiga interagir com o MHC no serve para nada, por isso vai ser morta, no vai ser seleccionada, vai ser ignorada, negligenciada. No vai receber que o sinal MHC d para a cel progredir. Caso contrrio, recebe o sinal MHC e seleccionada positivamente. Caso a interaco seja extremamente intensa e a cel receba imenso sinal intracelular, a cel morre por apoptose, rejeitada, morta - designando-se o processo de seleco negativa. Na seleco negativa, o que acontece que se no momento que ela esta a ver uma molcula do prprio organismo, reage de forma to forte, essa clula tem uma grande potencialidade de ser autoimune. Os Tcr s reconhecem pptidos ligado ao MHC, que uma outra forma de garantir que as cel T no andam a reagir contra pptido do prprio. O que o MHC mostra so pptidos de todas as protenas que esto dentro da cel, mostrando se tem dentro de si pptidos normais ou infectados.

Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

Imunologia8. Clulas dendrticas e PRRsResumo da aula terica: 6 de Maro de 2008

Temas a abordar: Clulas dendrticas e imunidade Tipos de clulas dendrticas Pattern recognition receptors PRRs O paradigma das clulas dendrticas e as suas misconcepes Interferncia da funo das clulas dendrticas - utilidades e inconvenientes

Clulas dendrticas e imunidade

Porque que as clulas dendrticas so to importantes? As clulas dendrticas pertencem ao SI inato. So da mesma famlia que os moncitos e macrfagos. Este tipo de clulas tem 2 caractersticas: permitem uma resposta muito rpida aos patognios, isto porque no especfica, e em comparao aos macrfagos, tm a capacidade de migrar entre diferentes compartimentos corporais. As clulas dendrticas encontram-se nos tecidos, onde ocorre o reconhecimento dos patognios. Para alm do reconhecimento do patognio, elas adquirem a capacidade de migrar para os gnglios linfticos. nos gnglios linfticos que a activao dos linfcitos B e T ocorre. Sem a activao, nunca conseguiremos combater a infeco porque os linfcitos B e T que iro proporcionar uma resposta especfica e duradoura contra o patognio. Portanto, isto o que torna estas clulas to nicas sem elas, no seria possvel activar os linfcitos B e T e no se conseguiria ter uma resposta especfica para o patognio.

Histria das clulas dendrticas Em 1873, em laboratrios alemes, Paul Langerhans descreve um tipo muito peculiar de clula com uma morfologia estrelada. Estas clulas foram pobremente caracterizadas durante muito tempo por uma colorao histoqumica e designadas clulas de Langerhans. Apenas 100 anos depois foram isoladas de diferentes tecidos (bao, gnglio linftico cervical e placas de Peyer) clulas com uma morfologia j vista nas clulas de Langerhans na pele chamaram-lhes clulas dendrticas por causa das longas dendrites que delas se projectam. Elas pareciam claramente um novo tipo de clulas dendrticas. O estudo das clulas dendrticas comeou, portanto, apenas em 1973.

Localizao das clulas dendrticas Onde que podemos ento encontrar clulas dendrticas em rgos, in vivo? Na pele de novo, designadas clulas de Langerhans (4% das clulas da epiderme); Caracterizadas pela expresso de molculas de adeso: caderinas E que ancoram as clulas de Langerhans aos queratincitos. Tambm so muito ricas numa protena do citoesqueleto, a actina F. Expressam igualmente molculas apresentadoras de antignios. Nos rgos linfides tambm possuem a capacidade de activar os linfcitos T. Em circulao no sangue perifrico, mas em baixa representatividade, So encontradas em menos de 1%. Mas so predominantes na linfa 20% das clulas circulantes na linfa. De facto, as clulas dendrticas usam os vasos linfticos para migrarem de um tecido perifrico para o gnglio linftico.

Distino das clulas dendrticas Alm da forma em estrela, no h nenhuma caracterstica especfica das clulas dendrticas. H contudo um conjunto de caractersticas que lhes so comuns, e que so analisadas para as distinguir: Morfologia Fentipo: devem-se excluir a presena de marcadores especficos de outras clulas: CD14, CD16, CD56, CD19, CD20, CD3. Contudo, algumas expressam CD11c. H molculas de integrinas que so teis para identificar as clulas in vivo. PRRs receptores, intra ou extracelulares que so expressos de modo a estas clulas identificarem. Molculas de activao dos linfcitos, com funo de activar linfcitos nos gnglios linfticos, e molculas coestimulatrias. Molculas para migrao receptores de quimoquinas. No s expressam receptores de quimoquinas como alteram a sua expresso durante o seu tempo de vida. Os receptores de quimoquinas so protenas transmembranares que identificam um ligando, ligando este que secretado num gradiente. Deste modo, seguindo o gradiente, as concentraes crescentes, as clulas dendrticas podem migrar no tecido ou no gnglio linftico.

Tipos de clulas dendrticasOrigem das clulas dendrticas Como j sabem, as clulas do sistema imune podem ter uma origem mielide ou linfide. A origem mielide a dos moncitos, macrfagos clulas do sistema imune inato. A origem linfide a dos linfcitos T e B. Uma particularidade que as clulas dendrticas podem derivar de ambas as linhagens, linfide e mielide. A primeira evidncia de que as clulas dendrticas provm da linhagem mielide foi encontrada em 1998 usando o modelo de transmigrao. Neste modelo, constri-se uma espcie de tecido numa camada de clulas em cultura, onde uma camada de clulas endoteliais se encontra sobre uma camada de colagnio e repousa num meio de cultura de clulas normal. Uma particularidade especial que a matriz de colagnio contm partculas fagocticas que podem ser fagocitadas eventualmente por moncitos-macrfagos. O que se fez foi depositar uma amostra de clulas mononucleares de sangue perifrico, contendo linfcitos B e T, macrfagos, moncitos, na superfcie apical das clulas endoteliais

e deixar incubar durante cerca de 1,5 h. Depois de fazer a purificao, removendo as clulas que permaneciam superfcie, deixou-se encubar por mais 48h. Durante este tempo, o que aconteceu foi que os moncitos presentes no sangue perifrico atravessaram a camada epitelial e permaneceram na matriz de colagnio. Na matriz, ficaram em contacto com as partculas fagocticas e eventualmente, englobavam-nas. Aps 24h, no meio recolhido da superfcie apical das clulas apicais era possvel encontrar, alm de algum contaminante (linfcitos), clulas com uma morfologia tpica de clulas dendrticas e que continham no seu interior partculas fagocticas. Analisando as clulas que permaneceram na matriz de colagnio tinham um fentipo completamente diferente, assemelhavam-se muito mais a macrfagos. O que esta experincia permite concluir, que as clulas dendrticas podem diferenciar-se a partir de moncitos do sangue perifrico e esta diferenciao d-se na presena de partculas fagocticas patognicas.

Em relao outra classe de clulas dendrticas, provenientes de precursores linfides, elas derivam das chamadas clulas T plasmacitides. As clulas T plasmacitides tm uma morfologia como a dos plasmcitos (linfcitos B) mas no expressam Ig. Expressam tambm o correceptor CD4 mas no CD3. Depois tm um marcador de APC (clulas apresentadoras de antignios) pois expressam MHC-II. Portanto, este um tipo de leuccito que tem capacidade de migrar e que apresenta caractersticas de linfcito B, T e de APC. So clulas fracas, difceis de manter em cultura. A nica forma de as manter em cultura e de as expandir adicionando IL-3 e outros factores, sendo que o mais importante a IL-3. Se o fizermos, as clulas sobrevivem, sofrem expanso e diferenciao em clulas dendrticas.

As clulas derivadas de precursores linfides designam-se clulas dendrticas plasmacitides enquanto as clulas derivadas de precursores mielides designam-se clulas dendrticas mielides.

Desde esta primeira descoberta, houve uma srie de tentativas para gerar clulas dendrticas in vitro. O importante a reter deste slide que um moncito do sangue perifrico pode diferenciar-se nas chamadas clulas dendrticas derivadas dos moncitos se mantidos num meio de cultura com GM-CSF. Este um tipo de clula dendrtica muito comum, utilizado at em investigao laboratorial, mas tambm em imunoterapia.

Funes das clulas dendrticasCaptao de antignios Processamento de antignios Apresentao de antignios Induo de resposta pelos linfcitos T

Tudo o que est relacionado com a induo de uma resposta imunitria pelos linfcitos T: As clulas dendrticas tm uma variedade de mtodos para captar antignios, mas o mais caracterstico a macropinocitose, na qual estas clulas so muito eficientes, em especial devido sua forma: A macropinocitose a captao de grandes quantidades de soluto de uma forma no especfica. Formam-se prolongamentos da membrana plasmtica que se estendem e voltam a fundir, formando vesculas que transportam solutos para o interior da clula. Assim, as clulas dendrticas passam a ter no seu interior antignios, no apenas provenientes dos patognios, mas, eventualmente, antignios endgenos, por exemplo, provenientes de clulas mortas. Deste modo, formam-se milhares de vesculas onde pode ocorrer a formao do complexo pptidoMHC-II, de modo a que o antignio seja preparado para apresentao s clulas T. Este processo muito eficiente as clulas dendrticas podem captar o volume de uma clula numa hora apenas. So clulas muito activas metabolicamente. A macropinocitose no o nico processo de captao de antignios, existem outros, como a fagocitose, ou outro mecanismo um pouco mais especfico, como o caso da endocitose mediada por receptores, intra ou extracelulares, que reconhecem especificamente componentes dos patognios e que podem facilitar a ingesto de patognios inteiros (bactrias, vrus) ou de partculas derivadas de patognios. Estes receptores so peculiares pois so caractersticos do sistema imune inato. Por agora, chamemos-lhes receptores do sistema imune inato. Em comparao com os receptores da imunidade adquirida (BCR, TCR), possuem diferentes caractersticas: Os receptores da imunidade inata esto codificados na linha germinativa os genes que os codificam no sofrem recombinao somtica; Os receptores da imunidade inata no so expressados diferentemente nos clones em geral, cada clula dendrtica tm a capacidade de expresso do padro completo do receptor;

Os receptores da imunidade inata possuem uma especificidade pr-determinada no so seleccionados. Esto presentes, prontas para a sua funo, em caso de infeco ou no; Os receptores da imunidade inata tm uma diversidade reduzida em comparao com os receptores da imunidade adquirida, que podem existir em at 1015 formas diferentes, os receptores da imunidade inata apresentam uma diversidade que no excede os 103 Assim, todas estas caractersticas permitem-nos concluir que cada receptor do sistema imune deve reconhecer mais do que um patognio, completamente diferente do receptor da imunidade adquirida em que cada receptor reconhece apenas 1 antignio. Como que um nico receptor pode reconhecer vrios patognios? O facto que no h um reconhecimento de um patognio especfico, mas sim o reconhecimento de uma classe de molculas expressas pelos patognios. Assim, o receptor da imunidade inata liga-se a aos PAMPs pathogen associated molecular pattern. As PAMPs so classes de molculas expressas pelos patognios, podendo ser carbohidratos, lpidos, cidos nucleicos ou protenas. Cada receptor que reconhece uma PAMP designa-se PRR pattern recognition receptor, porque reconhece um padro de um patognio. Existe alguma variedade de PRR tendo sido recentemente proposta uma nova classificao. possvel dividi-los em 3 classes: Opsonizantes, fagocticos e instrutivos. Os opsonizantes so molculas solveis que podem induzir um sinal intracelular, tendo como aco opsonizar as partculas criam uma camada que torna mais fcil a captao da partcula. Os fagocticos tambm esto envolvidos na fagocitose mas so diferentes, pois podem participar na sinalizao das clulas T, mas nem todos os PRRs fagocticos tm a capacidade de gerar um sinal. Nem os PRRs opsonizantes nem os fagocticos so absolutamente essenciais para gerar um sinal nos linfcitos T estas classes de receptores no tem um papel instrutivo na activao dos linfcitos T. Contudo, a terceira classe de PRR, designada instrutiva, compreende a famlia dos Toll-like receptors e NLR, que podem estar ligados membrana ou presentes intracelularmente, podendo sinalizar usando molculas acessrias - no possuem sequncias sinalizadoras mas podem iniciar um sinal atravs destas

molculas acessrias no citoplasma. O papel principal destes receptores que a transduco de sinal essencial para dirigir a resposta imune mediada pelas clulas T. Sem a sinalizao pelo TLR, a imunidade proporcionada pelas clulas T no eficaz. Apresentam-se d