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Materiais funcionais baseados em péptidos Auto-agragaçao molecular  Há limitações praticas à abordagem “top-down”  “bottom-up” permite controle especifico das arquitecturas através do ajuste de form, e da química da superfície pela engenharia da apenas uma molécula Péptidos usados como “building blocks”  Biocompatibilidade e biodegradabilidade inerentes  Versatilidade de aa’s que ocorrem naturalmente Auto-agregaçao peptídica  Ghadiri foi capaz de formar agregados tubulares a partir de D,L-alfa-peptidos  D,L-péptidos cíclicos nanotúbulos permitem as propriedades superficiais e ao diâmetro interno do agregado tubular alteração a partir da escolha das cadeias laterais apropriadas e do tamanho do anel peptídico  Em 1994 foi reportada a primeira auto-agregacao dos canais inicos transmembranares que mostravam actividade transportadora para o K+ e o Na+, baseada na “framework” dos nanotubulos do D-L-péptido cíclico Auto-agregação dipeptidica Dipeptidos com resíduos hidrofóbico podem cristalizar formando materiais microporosos cristalizam (com poros entre os 3-10 A). Formação de nanotúbulos por dipeptidos  O diâmetro dos canais pode ser regulado  O ambiente do núcleo do poro pode ser hidrofílico ou hidrofóbico Cristais LS (leucina-serin a)  Tem a habilidade de suster e trocar m oléculas “guest” (menos os de ureia)   Estabilidade térmica e mecânica (analise termo gravimétrica)  Poro vazio, com I2 ou acetonitrilo a sua estrutura mantêm-se Cristais nanoporosos baseados em péptidos Propriedades dos materiais:  ƒ  Elevada densidade de poros

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    Apenas um tamanho de poros (o dimetro pode ser regulado por ambienteshidrofbicos ou hidroflicos)

    rea superficial muito grande Habilidade de troca de molculas guest Estabilidade trmica e mecnica

    Aplicaes

    1. Absoro2. Separao de membranas3. Transporte de massa atravs dos nanotbulos4. Scaffold para sntese de nanotbulos5. Nanoreactores

    1. Absorode CO2, CH4 e H2. Dimetros: 5,0 L-A-L-V; 4,7 L-Val-A; 3,9 L-I-L-V; 3,7 L-Val-L-Isso

    a temperatura embiente VA absorve 30

    litros de CO2 por litro de host o que

    excede a fantstica performance do

    recentemente proposto ZIF-100(28L/L)

    selectividade de 3.5-5, retida at pressoa atmosfrica

    IV absorve tantas moles de H+ como de metano (0.5

    mol/mol a 195 K e 1 atm) indicando uma grande afinidade

    por este gs leve.

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    2. Separao de membranas (permiseletividade)Tortuosidade porosa baixareas de densidade porosas elevadasUniforme e regulvel tamanho porosoPoros funcionalizadosSelectividade quiral

    a) Cristais dipeptidicos como materiais selectivamente permeveisCristalizao de dipeptidos

    Cristais AA: crescem por evaporao do solvente numa soluo aquosa

    Cristais VI: crescem usando os dois procedimentos (dp=3,7 A)

    Cristais LS: crescem por inverso de fase de uma soluo aquosa por

    acetonitrilo (dp=4,9 A)

    b) Experiencias de permeabilidade de single-crystals elaboradoscontra atmosfera usando uma cmara pressurizada

    alimentada com gs na qual a presso era monitorizada

    A-monitorizao da presso da camara de gs

    B- medio do tempo e distancia de um liquido emmovimento (Als Oil) em frente a um tubo de vidro

    colado sada da camara de gs

    c) Absoro isotrmica foi medida a temperatura ambiente usando omtodo volumtrico que se baseia na expanso de gs de uma

    camara alimentada (Vfeed) para uma camara de adsoro(Vsample), onde e colocada a amostra.

    As amostras de dipeptidos foram regeneradas ao longo da noite a 60

    C sobre vcuo

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    ->Foi mostrado que a aplicao de cristais dipeptdicos como materiais

    selectivos a membranas bem sucedida

    -> mostrou-se que os dipeptidos single-cristals podem atuar como

    membranas permeveis capazes de distinguir entre Argon, N e O2 um processo de

    separao industrial ambicioso.

    3. Transporte de massa atravs de nanotubulos

    Difuso em cristais L-S

    Estudo sistemtico das propriedades macroscpicas : largura, temperatura,

    concentrao, tamanho da molcula guest

    Os cristais cresceram pela inverso de fases de uma soluo aquosa por difuso doacetonitrilo

    ->isotrmicos de adsoro mediram-se via volumtrica

    ->pela difuso de single-cristal obtiveram-se taxas de difuso de 293.15K (pela

    camara alimentada com gs)

    o Difuso de pequenas molculas nos cristais dipeptidicos rpida;o O bloqueamento dos poros pode ser significante dentro de certas

    condies experimentias

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    o A grande flexibilidade das frameworks do cristal juntas comdimenses semelhantes do por e dos diffusants provavelmente

    contribuem para a propenso de bloqueamento

    4. Scaffolds para a sntese de nanowires

    Tubos peptdicos cheios de nanowires de prata( que foram obtidos pela adio

    da enzima proteinase K)

    5. NanoreactoresPeptidos baseados em MOFs (metal orgnica framework) temos diferentes

    geometrias metlicas possveis e ligandos. A estabilidade aumentada em

    materiais porosos baseados em pptidos.

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    Fibras de amilide

    Propriedades:

    Uma condiao medica resultante da agregaao de depositosextracelulares de protenas anormais designadas fibras de amilide que

    causam estragos em rgos e tecidos

    Estas fibras so insolveis, lineares, rgidas e medem aprox. 7.5-10 mmem largura;

    Fibras de amilide surgem de protenas com misfolding. De alfa-helicesa folhas beta pregueadas;

    Proteinas so depositas extracelularmente Proteinas agregam-se e formam fibrilas (fibras de amilide) Proteinas com misfolding podem resultar de mutaes pontuais Depositadas assim que localizadas vs sistemaitcas Doenas associadas: neurodegenerativas, hereditrias, espinocerebrais Amilide funcional: estrutura de amilide encontrada que tem

    beneficios funcionais em sistemas vivos

    Nano-filamentos condutores construidos por auto-agregaao de fibrasamiloidas de TTR e deposiao de metal seletiva

    A estrutura das fibras

    NMR

    Cristalografia de raios-X

    Microscopia crio-eletronica (EM)-estrutura protofilamentosa das fibrilas de amiloide

    So nanotubulos cheios de agua

    A fibra amiloide da TTR e uma folha beta continua

    STEM- quantitative scanning transmition

    Cintica

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    Toxicidade

    Os intermedirio podemexercer efeitos significativos na

    viabilidade e no metabolismode celulas neuronais cultivadas

    Fragmentaao fisica de fibrilaspr-formadas em fragmentos

    de pequeno tamanho

    exacerbaods os efeitos das fibrilas nas celulas

    Data sugere um mecanismo generico pelo qual os oligomeros podemser efeitvos, isto , um que resulta de propriedades conformacionais

    comuns de oligomeros em vez de sequencias especificas de cadeias

    polipeptidicas subjacentes Um mecanismo tao generico pode ter as bases moleculares na

    interaao de intermediarios com membranas celulares, agregados

    especificos mostraram ter perturbaoes na integridade das membranas.

    Inibio

    Estudos estruturais em Inibidores

    1.TTR: iodoflunisal crystal stucture

    Carateristicas nicas quando comparada com outras estabilizadores de TTRcomo diflunisal, acido flufenamico e dicoflenac

    Efeito de estabilizao evidente em TTR tetrmeros no plasma em condiessemi-desnaturantes

    O iodine est altamente ancorado ao bolso de ligao da protena

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    A ligao do ligando induz uma rotao da cadeia lateral de Ser117 permitindoa formao de novas ligaes intermonomeras de H

    Pequeno colapso dos locais de ligao de TTR2. Concluses

    As propriedades protectoras do iodoflunisal reflectem o facto de que todos ossubstituintes aromticos esto envolvidos nas interaoes de estabilizao de

    tetrmeros.

    A ligao de ligando induz a rotao da cadeia lateral de Ser117 permitindo quea formao das novas ligaes hidrognio intermonomericas

    Todas estas novas onteraes so responsveis por uma estrutura maiscompacta, o que resulta num ligeiro colapso do canal de ligao que

    ocorre(atravessa) pela molecula

    Separaao e purificaao de protenasTodas as tcnicas de purificaao utilizam diferentes propriedades de protenas:

    ->solubilidade (funo do sal, pH, T)

    ->carga

    ->tamanho

    ->Locais de ligao (ligandos)

    Cromatografia: refere-se a um grupo de tcnicas de separao que envolvem uma

    retardao de molculas com respeito frente de solvente que progride atravs do

    material. O nome (cromos+grafia) significa o desenho as cores e foi

    originalmente usado para descrever a separao de pigmentos naturais em papeis de

    filtro por retardao diferencial.

    Cinco tipos:

    1.troca inica;

    2. de hidrofobicidade;

    3. por afinidade;

    4. por metais imobilizados;

    5.exclusao de tamanho

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    1.1Propriedades de carga Protenas so complexos ampholytes que tem quer carga positiva(arginina,

    lisinas, histidinas) quer carga negativa(aspartato,glutamato); O ponto isoelctrico (pI) de uma protena (pH no qual a carga total de rede

    zero);

    Para obter boa adsoro o pH do tampo escolhido dever ser pelo menos umaunidade de pH acima ou abaixo dos pI dos analytes a

    ser separados;

    O pH do microambiente de um iao exchanger no exactamente igual ao do aplicado no tampo (Donnan

    effect);

    Se uma protena adsorbida num catio exchanger a pH5, vai ser exposto a pH 4, e se tiver pouca estabilidade a

    esse pH, pode ser desnaturado;

    A maioria das protenas so carregadas negativamente avalores de pH fisiolgicos (pH 6-8);

    A interaao entre uma protena e um trocador inicodepende no s da carga da rede e da fora inica mas

    tambm na distribuio de carga superficial da protena

    Se h regies superficiais com alta concentrao degrupos carregados na protena, a ligao pode ocorrer mesmo quando a carga

    total da protena zero.

    1.2. Fase estacionria

    Fortes trocadores de ies tem grupos funcionais, e.g sulfonato e amnioquaternrio, com valores de pKa fora do alcance de pH no qual normal o

    trabalho de protenas (i.e. pH4-10)

    Ao contrario, fraco trocadores inicos tem grupos inicos funcionaise.g.carboxilato e dietil amonio, com um alcance de pH limitado;

    Fracos trocadores inicos: reduzem a tendncia para a desnaturao daamostra, inabilidade de se ligar impueza fracamente carregadas e resoluo de

    eluio aumentada

    1.3. Fase mvel

    A baixa condutividade e pH do a protena uma carga ptima para ser escolhida A escolha do tampo tambm influencia a separao. Por exemplo, a atraao

    electroesttica entre dois grupos de carga oposa mais alt num ambiente

    hidrofbico

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    Este tampo tambm tem a vantagem de ser voltil e assim pode serfacilmente removido por liofilizao

    1.3.1. estratgias de eluio

    Eluio Isocrtica: componentes da amostra so apenas diferencialmente

    retardadas e assim separados sob composio de solvente constante; no sonecessrias alteraes na composio do tampo.

    Apenas volumes de amostras muito mais pequenos do que o volume total do

    bed podem ser aplicados e a resoluo aumenta com a raiz quadrada do

    comprimento da coluna.

    Frequentemente um decrscimo em afinidade e mediado no tampo.

    Dois mtodos gerais: mudar o pH do tampo do eluente; aumentar a fora

    inica por adio de NaCl.

    Mudanas de tampo requeridas para eluio podem ser adicionadas em

    qualquer estadio, por eluio por fases ou continua, por eluio de gradiente.Diminuir o declive do gradiente levar a uma separao maior dos solutos,

    contudo, medida que o declive diminui, as protenas estaro mais diludas.

    IEXC uma das tcnicas de purificiaao mais importantes acessveis e provavelmente a

    mais usada para a separao de propteinas/pptidos, cidos gordos, polinucleotidos, e

    outras biomolculas carregadas.

    Em geral, os trocadores inicos esto mais densamente substitudos que outros

    adsorventes usados na cromatografia de protenas e a sua capacidade para ligar

    protenas e muito alta. A sua ampla especificidade permite tambm a remoo de

    impurezas significativas tal como formas desaminadas, endotoxinas e glicoformes

    indesejados. Mesmo assim, interaoes no-especificas com protenas devido a

    interaoes hidrofbicas ou outras interaoes no-ionicas so baixas.As resinas de

    trocadores inicos so robustas e podem ser sanitized no lugar e usadas para centenas

    de ciclos.

    Desvantagem de IEXC: limitado em selectividade

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    2 metodos: HIC (hidrofobic interaction cromatography); RPC (reversed phase

    cromatography)

    Em ambos mtodos as protenas so retidas diferencialmente por um suporte

    hidrofbico dependendo da sua hidrofobicidade

    2.1. Hidrofobicidade

    Isoleucina, valina, leucina e fenilalanina A ordem crescente das molculas de agua leva a um decrscimo em entropia

    (deltaS)

    Adsoro hidrofbica das protenas um processo guiado pela entropia,termodinamicamente favorvel onde a fora motora a reduo da rea desuperfcie

    2.2 HIC- hidrofobic Interaction Cromatography

    Ligao de protenas aumentada por altas concentraes de sais neutros, e a eluio

    das protenas ligadas obtida pela lavagem da coluna com um tampo sem sal ou pela

    diminuio da polaridade do eluente.

    2.2.1 Fase estacionaria

    Mais usada a agarose Quando a tcnica foi aplicada a HPLC, slica e resinas de polmeros orgnicostambm tem sido usados Os ligando mais usados para HIC so alcanos de cadeia linear, a fora da

    interaao entre a protena e os ligandos hidrofbicos aumenta com o aumento

    do comprimento da cadeia de C. ligandos contendo entre 4 e 10 atomos de C

    para a separao

    Por vezes pode ser vantajoso usar ligando de aril (fenil) que tambm podemdar interaoes aromticos (pi-pi)

    Uma densidade de ligando (10-50 micromol/ml gel) vantajosa para preservara estrutura da protena devido a absorvancia multi-point

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    2.2.2. Fase Mvel

    Ies de sal assumem as molculas de agua ordenadas, e assim promoveminteraoes hidrofbicas.

    Geralmente um sal que aumenta a tenso de agua tambm ir dar umaumento na fora da interaao entre protenas e do HIC adsorvente. A fora da

    tenso molal superficial segue:

    O efeito da composio do sal na remoo de protena muito complexo Amonio sulfato (pH

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    Normalmente requere o uso de solventes orgnicos e outros aditivos paradesabsorver a protena:

    Tem um efeito desnaturante na protena. Adsoro a fase estacionaria normal/por multi-point attanchment

    2.3.1. Fase Estacionria

    A matriz de base mais comum so as contas de slica porosa com grupos Si-Ohmodificados para agarrar ao ligando. Ph>7.5 grupos silanol carregados

    negativamente expostos no suporte;

    As partculas de slica devem estar quase completamente coberta com grupoqumicos ligandos de cadeias de hidrocarbonetos que representam a fase

    hidrofbica

    Polmeros orgnicos sintticos: e.g.contas de poliestireno, tambm estodisponveis como gis de fase reversa.

    Packings de polmeros orgnicos so estveis em pH ate 12. Contudo, no sotao estveis mecanicamente e tendem a encolher quando expostos a

    diferentes solventes;

    Estas contas tem uma superfcie que por si s altamente hidrofbica, deixadapor derivatar

    Cadeias de carbono mais curtas (C2-C8) so comprimentos usados paraseparao de protenas, para poder evitar interaoes demasiado fortes que

    requerem concentraes mais altas de modificador orgnico para eluio.

    Contudo cadeias alifticas mais longas (C8-C18) podem ser usadas para

    separao de pptidos mais pequenos

    2.3.2. Fase Mvel

    As condies de ligao iniciais so primariamente aquosas Ligao proteica muito forte e requere o uso de solventes orgnicos na

    fase mvel para eluio

    A reteno relativa de um polipptido em particular ou protena diminuicomo na seguinte serie de modificadores de solventes mesma

    percentagem volmica:

    Isopropanol: grande viscosidade Eluio de coluna tipicamente monitorizada usando detetores de UV.

    Acetonitrilo a escolha adequada para a separao de pptidos que

    no tem aas romaticos, uma vez que d uma absorvancia muito baixa a

    baixos comprimentos de onda

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    Adiao de um modificador do solvente orgnico a uma protena vai, nogeral, ter um efeito desnaturante;

    Separao em RPC pois, concordante com as diferenas nahidrofobicidade total, uma vez que todos os resduos de aas esto

    disponveis para a interaao com a fase estacionaria;

    2.3.1. Suspenso inica

    Fase mvel com cidos fortes como o cido trifluoroacetico (TFA) que reduz opH a 2-3

    pH baixo deitar o resultado da suspenso inica na eliminao dos efeitos dosmtodos de reteno misturados devido aos grupos silanol que restam na

    superfcies do gel de slica

    a um pH baixo ocorre a suspenso do grupo carboxil e os grupos amino estoessencialmente todos protonados

    por razoes ainda no esclarecidas, uma maior selectividade pode ser obtidaquando se corre num valor baixo do pI de um polipptido ou protena nos

    sistemas de fase reversa

    2.3.2. Emparelhamento inico

    TFA pode ser tambm atribudo o efeito de um agente de emparelhamentoinico

    Agentes de emparelhamentoionico ligam-se as molculas da amostra porinteraoes ionicsa, o que resulta na modificao da hidrofobicidade de rede

    A maior vantagem uma selectividade que afecta e assim aumenta a hpoteseda resoluo completa dos componentes da amostra

    A reteno dos componentes da amostra pode ser afectada quer pelo tipo querpelas concentrao do io

    2.3.2. Estratgias de Eluio

    O nico mtodo pratico para separao RPC de amostras biolgicas complexas o gradiente de eluio

    Isto feito pelo decrscimo da polaridade da fase mvel pelo aumento dapercentagem do modificador orgnico na fase mvel

    2.3.3. Carateristicas e aplicaes

    Para protenas, esta tcnica usada para verificar a purificaao e analise decontrole de qualidade, quando a recuperao da actividade e da estrutura

    terciria no so essenciais

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    Para protenas mais pequenas (Mw

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    Um numero e contas de matriz sintticas orgnicas e inorgnicas estodisponveis, e.g: cross-linked dextrans, poliestireno, celulos, vidro poros e slica

    3.1.1. Ligandos

    Ligandos bioespecificos que podem ser covalentemente ligados matrizcromatogrfica

    Podem ser extremamente selectivos. Ex: anticorpos, receptores deprotenas, esterides hormonais, vitaminas e inibidores enzimticos.

    Alguns ligandos esta ligados a um grupo de compostos relacionados(imunoglobulinas)

    O ligando ligado deve ser capaz de formar complexos reversves. Aestabilidade do complexo deve ser suficientemente grande para a

    retardao do processo. importante que seja fcil dissociar o

    complexo por uma simples alterao no mdium O ligando deve processar pelo menos um grupo qumico

    funcional(grupos comuns: aminas, tiois, carbohidroxidos e grupos

    hidroxilo) pelo qual pode ser imobilizado a matriz

    Os grupo funcionais utilizados para emparelhamento no devem seressenciais para as suas propriedade de emparelhamento para assegurar

    que o ligando retm a sua capacidade de ligao especifica para as

    molculas alvo.

    3.1.2.Spacer arms

    Para prevenir a ligao do ligando a matriz interfere com a sua

    habilidade para se ligar molcula alvo, e geralmete vantajoso colocar

    um brao de separao

    3.1.3. Ligao de Ligandos

    1. matriz activada para torna-la reagente ao grupo funcional do

    ligando

    2. o ligando torna-se covalentemente igado atravs de uma reaco

    qumica

    3. grupos residuais no ligando so bloqueados por um excesso de uma

    substncia adequada de baixa massa molecular como a etanolamina

    A a tivaao normalmente consiste na introduo de um grupoeletrofilico na matriz

    Durante a ligao do ligando este grupo reage com gruposnucleoflicos, tal como amino, tiois e grupo hidroxilo no ligando.

    Alternativamente, uma matriz activada com grupos nucleofilicos,

    e.g tiol, pode ser usado para imobilizar um ligando contendo umgrupo eletrofilico

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    3.2. Fase Mvel

    As condies do tampo so optimizadas para garantir que as molculas alvo

    interagem efectivamente com o ligando e que so retidas pelo medium de

    afinidade enquanto que as interaoes no especificas so minimizadas.

    Variaes na taxa de fluxo podem exibir efeitos monumentais no sucesso da

    cromatografia de afinidade. Se a amostra bombeada demasiado rapidamente

    a ligao pode ser adequada.

    3.2.1. Estratgias de eluio

    Interaao entre o ligando e a protena baseada na combinaoelectrosttica e nas interaoes hidrofbicas e igaoes de

    hidrognio

    Considerao cautelose da importncia relativa destes 3 tipo dainteraoes para a estabilidade da protena ligada ir ajudar na

    escolha de um eluente apropriado

    O mtodo mais frequente para eluir substancias fortementeligadas no especificamente pela diminuio de pH

    Estabilidade qumica da matriz, o ligando e a substanciaadsorvida determinam quo baixos os pH podem ser

    Um aumento na fora inica do tampo pode ser til para aeluio da protenas ligadas predominantemente por interaoes

    electrostticas 1M de NaCl frequentemente usado; Quando a ligao predominada por ligaoes hidrofbicas fortes,

    so usados mtodos de eluio drsticos como reduzir a

    polaridade.

    3.3 Caratersticas

    Mesmo quando a protena de interesse um pequeno componente de umamistura complexa da cr.pr afinidade pode ser bem sucedida uma vez que o

    efeito de concentrao permite grandes volumes serem processados

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    Molculas ativas frequentemente so separadas das desnaturadas ou formasfuncionalmente diferente uma vez que a tecnina depende das propriedades

    funcionais

    3.4. Aplicaoes

    3.4.1. Imunoafinidade: a alta especificidade de anticorpo torna-os

    extremamente uteis como ligando para cr.pr.afinidade especialmente quando a

    molcula alvo no tem estruturas complementares ligantes imediatamente aparentes,

    outras que no o seu anticorpo

    3.4.2. purificao por protenas: protena A ou G como ligandos para

    purificao de imunoglobulinas de vrias espcies. Estes ligando so protenas de

    parede celular com afinidade para a regio constante de IgG. Aligaao alcanada a

    valores de pH fisiolgicos e baicxos valores de pH pra eluio.

    3.4.3. Purificao de glicoconjugados: lectinas imobilizadas so invalidas para a

    separao de glicoconjugados como glicoprotenas. Substancias ligadas lectia

    imobilizada podem ser remvidas com um competidor como o monossacardeos pelo

    qual a lectina tem afinidade

    3.4.4. Purificaao de protenas ligadas ao DNA: purificaao de afinidade

    especifica usando a heparina como ligando. Heparina um glicosaminoglicano

    altamente sulfatado. Imita a estrutura polianinica do cido nucleico e por isso,

    interage fortemente com protenas de ligao ao DNA.

    3.4.5. purificao de protenas receptoras: para isolar uma enzima, o ligando

    deve ser o substrato, ou um competidor inibidor reversvel

    3.5 Tags de afinidade

    Geneticamente fundem o gene que codifica a protena alvo com o gene que da protena com afinidade adequadas- purification tag Sistemas de fuso para purificaao de protenas podem ser baseadas em vriostipo de interaoes tal como: protei-portina, enzima-substrato.

    Ex: GST, MBP, FLAG tag

    Assenta na formaao de pequenas ligaes cordenadas entre ies metlicos

    imobilizados e alguns aas em protenas, principalmente e histidinas.

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    4.1. Afinidade de metais inicos

    Alguns aas so especialmente adeuados para ligar aa histidina a que demostra a

    interaao mais forte, como um dador electrnico no anel de imidazole na histidina

    forma ligaes de cordenaao com o metal de transio imobilizado.

    Cistenas tambm podem contribuir para ligar se grupos sulfidil livres estivessem

    disponveis (estados reduzido) cadeias laterais de Trp, Phe e Tyr para interaao.

    4.2. Fase Estacionaria

    beaded agarose o suporte; Um brao separador apropriado e um chelator(IDA, NTA, TED)

    adicionado matriz;

    tomos dadores de electres (N,S,O) presentes so capazes decoordenar ies metlicos e formar chelates metlicos

    O quelato pode ser bidentado,tridentado.. dependendo de

    quantas ligaes de coordenao

    que o metla inico ir ocupar

    E importante que o iao metlicono tenha todos os locais de

    coordenao ocupados pelo

    quelato. Os locais de ligao

    sobrantes so inicialmente ocupados(pobremente) por gua ou

    molculas de tampo.

    A afinidade aparente de uma protena par aum quelto metlicodepende do metal inico envolvido na coordenao. Mais usados so os

    ies divalentes dos metais de transio: Fe, Co, Ni, Zn, Cu.

    Ligandos chataling so relativamente bratos e capazes de transportargrande metais inicos, que permitem altas capacidades de ligao

    proteica. Alem disso, as matrizes podem ser reusadas tantas vezes

    quanto desejado tal como regeneradas.

    4.3. Fase Mvel

    Colunas metlicas de quelatos possuem uma carga total, uma vez que oquelato negativo, os metais so positivos e podem no se cancelar. Por isso

    os tampes de concentrao inica relativamente alta usam-se para reduzir

    adsoro inica no especifica;

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    Uma vez que a adsoro de uma protena ao suporte IMAC s possvelquando os nitrognios imidazole nos resduos de histidina no so protonados

    o tampo ligante deve ter um pH neutro ou ligeiramente alcalino

    4.3.1. Estrattigas de Eluio

    Pode alcanar-se pela protonao de histidina, pelo decrscimo de pH a4-5

    Para protenas sensveis a pH baixo, eluio competitiva com imidazole apH quase neutro mais favorvel. Contudo a adio de imidazole pode

    causar precipitao da amostra

    Aplicao de um agente chelating como o EDTA mas destri aspropriedades coligativas e a coluna devera ser carregad com ies

    metlicos.

    4.4. Caractersticas

    No podem ser consideradas como especficas mas quase. Contudo, beneficia a

    estabilidade de ligandos, grande carregamento de proteinasm condies de eluio

    leves, regeneraao simples e baixo custo.

    A matriz consiste em partculas porosas e a separao alcanada pelo tamanho e fora

    das molculas

    5.1. Clivagem molecular O processo de separao depende das diferentes

    habilidade das protenas para entrar nos canaisdas contas porosas

    Embora a separao no SEC geralmenteassumida a ser concordante com o peso

    molecular, mais correcto dizer que obtida pela

    diferente incluso ou excluso dentro das

    partculas porosas

    A facilidade de filtrao dependente do volumehidrodinmico, que o volume criado pelo movimento da molcula em

    gua;

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    Protenas tendem a ser globulares enquanto o DNA ou polissacardeosso lineares-> tem volumes hidrodinmicos bem maiores do que as

    globulares, ento um DNA de 10000 MW eluir antes.

    5.2. Fase Estacionria As matrizes usadas so frequentemente compostas de polmerosnatrais como a agarose ou o dextran mas tambm podem ser

    compostas de sintticos como a poliacrilamida

    Podem ser formados gis destes polmeros por cross-linking paraformar uma rede tridimensional. Diferentes tamanhos de poros podem

    ser obtidos por quantidades de corss-linking ligeiramente diferentes

    Resinas so normalmente classificadas consoante a capacidade deseparao de uma protena globular hipottica

    O upper range o range ao qual molculas largas so completamenteexcludas dos canais

    O lower range o range ao qual pequenas molculas so capazes deentrar todos os canais e as molculas que so ainda mais pequenas no

    tero nenhum canal para aceder

    5.3. Fase Mvela amostra pode requerer uma soluo tampap com um pH bem definido e

    composio inica escolhida para preservar a estrutura e actividade

    biolgica do substrato de interesse.

    5.3.1. Estrategias de Eluio: uma vez que as molculas no so adsorvidas mas sretardadas numa coluna SEC as protenas so eludas isocraticamente

    comeando com a a maior. Um s tampo usado, o que significa que no

    necessrio nenhum sistema de bombardeamento de gradiente.

    5.4.

    Caractersticas A resoluo mais fraca com a capacidade mais baixa e a maior diluio

    da amostra com respeito as outras cromatografias;

    A sua no-interaao com a amostra permitindo alta preservao daactividade biolgica

    Mtodos para separao de multmeros que no so facilmentedistinguidos por outros mtodos

    preferencialmente usada como passo de refinamento final quando osvolumes da amostra foram reduzidos

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    5.5. Aplicaes5.5.1. Troca de tampo: Componentes de baixo peso molecularda amostra so

    trocadas por outra substancia padrao

    5.5.2. Fracionaao protica5.5.3. Determinao do tamanho:os volumes de eluio de protenas globularesso determinados pelo tamanho da molcula

    CENTRIFUGAO1. Tipos de separao centrfuga

    A separao obtida principalmente com base no tamanho das partculas na

    centrifugao diferencial.

    Fracionamento celular

    O fraccionamento celular consiste na separao, por centrifugao, das

    estruturas sub-celulares, aps rompimento das clulas.As clulas podem ser rompidas

    de vriasmaneiras, sendo a tcnica mais comum, o emprego um pilo plstico rotativo

    dentro de um tubo. O espao entre o pilo e a parede do fracionamento celular tubo

    deve ser suficiente para romper as clulas provocando um mnimo de danos nos

    organitos. Os fragmentos de retculo endoplasmtico unem-se e formam vesculas

    isolveis, os microssomas. Utilizando pores de tecido ou clulas em cultura, obtm-se uma suspenso homogeneizada. essa suspenso que ser sujeita a centrifugao

    2. Centrifugao por gradiente de densidade

    A centrifugao de gradiente de densidade o mtodo preferido para purificar

    organelas subcelulares e macromolculas. Os gradientes de densidade podem ser

    gerados ao aplicar camada aps camada do meio gradiente, tal como a sacarose. A

    separao por gradiente de densidade pode ser classificada em duas categorias.

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    2a. Separao por ndice regional (tamanho).

    Esta separao baseia-se no tamanho e massa da partcula para

    sedimentao. Uma utilizao para este tipo de centrifugao a

    separao de protenas e anticorpos, que possuem densidades

    similares, porm massas diferentes. Assim, a separao com base na

    massa separar as diferentes classes.

    2b. Separao isopcnica (densidade).

    Neste caso, vamos considerar uma partcula que possui uma

    determinada densidade e, que ser submetida ao processo

    de centrifugao. Aps o processo, a partcula irestacionar numa posio onde a densidade da soluo em

    que se encontra prxima densidade da partcula. Uma

    vez estabelecida a sua posio, o tempo total de

    centrifugao no ir alterar a migrao da partcula. Uma

    aplicao bastante utilizada para este mtodo a separao

    de cidos nuclicos em umgradiente de cloreto de csio

    (CsCl)

    Critrios para uma separao isopcnica bem sucedida:

    A densidade da partcula de amostra deve estar dentro dos limites das densidades de

    gradiente. Qualquer extenso de gradiente aceitvel. O tempo de execuo deve ser

    suficiente para atingir o equilbrio. Os tempos de execuo em excesso no causam

    efeitos adversos.

    Fracionamento por centrifugao em gradiente de densidades

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