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ARTIGO DE REVISÃO

Agonistas adrenérgicos ß2 e produção animal:III - Efeitos zootécnicos e qualidade da carne a

ß2 - Adrenergic agonists and animal production:III – Zootechnical effects and meat quality a

Fernando Ramos* e Maria Irene Noronha da Silveira

Centro de Estudos Farmacêuticos da FCT - Laboratório de Bromatologia, Hidrologia e Nutrição Faculdade de FarmáciaUniversidade de Coimbra, 3000-295 Coimbra

Resumo: O presente trabalho constitui a terceira e última parte de uma revisão sobre agonistas adrenérgicos ß

2 e produção

animal e nele são abordados os efeitos zootécnicos e a qualidade da carne. São apresentados os resultados da acção dos agonistas adrenérgicos ß

2 sobre o ganho médio de peso diário de ratos,

frangos, suínos, ovinos e bovinos, dando-se particular destaque ao aumento da massa muscular e ao decréscimo da gordura corporal dos citados animais. A dose de fármaco administrada, a duração do tratamento e a idade e o sexo dos animais são, também, analisados. A qualidade da carne produzida, nomeadamente o aspecto, tenrura e paladar, constituem outro dos assuntos estudados, bem como se destacam algumas das características desta carne importantes para a sua transformação industrial. A revisão conclui com a avaliação da segurança/toxicidade dos agonistas adrenérgicos ß

2 no animal, no meio

ambiente e no Homem, neste caso quer como manipulador, quer, sobretudo, como consumidor. As intoxicações resultantes da ingestão de carne e fígado contendo clembuterol, com especial destaque para o caso português, encerram o artigo.

Summary: Zootechnical effects and meat quality are the subject of the third part of the review on β

2-adrenergic agonists and

animal production. Anabolic results of the referred drugs in rats, chickens, swines, ovines and bovines are presented, particularly their special action in increasing protein and decreasing fat. Considerations about animal age and sex, β-agonist intake dosage and treatment period are also related. Meat quality including general appearance, colour, tenderness or taste is stu-died, as well as other important characteristics for meat industry transformation. Man, animal and environmental β-agonists toxicity evaluation is studied on the last chapter of the paper. Foods intoxication’s following consumption of liver and meat from clenbuterol treated animals are reviewed. A special note is done of Portuguese situation.

Introdução

A população dos chamados países do primeiro mundo está cada vez mais preocupada com os aspectos da sua saúde, sobretudo ligada ao que come. A

gordura é, hoje em dia, considerada pela maioria dos consumidores como um nutriente desnecessário ou, pelo menos, a evitar, sendo que a sua produção envolverá, então, custos desnecessários. Nesse sentido, os agricultores, particularmente os ligados à pecuária, tentam melhorar o rendimento das suas explorações através da produção de mais e melhor carne magra e no mais curto espaço de tempo. A utilização de agonistas adrenérgicos ß

2 pode facilitar esta acção (Ramos e

Silveira 2000 e 2001), embora as consequências daí resultantes nem sempre sejam as melhores, como a seguir se pode constatar ao analisarmos os seus efeitos a nível zootécnico, sobre a qualidade da carne e, também, sobre a segurança/toxicidade que evidenciam, enquanto promotores do crescimento animal.

Efeitos zootécnicos

Os quadros 1, 2, 3, 4 e 5 revelam-nos os resultados de agonistas adrenérgicos ß

2 sobre o ganho médio de

peso diário (G.M.P.D.), o músculo e a gordura de ratos, frangos, suínos, ovinos e bovinos, tomando-se o valor 100 (cem por cento) como relativo aos controlos efectuados paralelamente.

A observação do quadro 1 permite verificar que os agonistas adrenérgicos ß

2, em ratos, são capazes

de desenvolver o aumento da massa muscular em percentagens que variam entre 6 e 18%, ao mesmo tempo que promovem a diminuição da gordura em teores que oscilam entre 6 e 33%.

Cardoso e Stock (1996) e Carter et al. (1991) explicam que a diminuição da gordura no peso da carcaça é acompanhada por um aumento do teor em água que andará associado ao correspondente incremento da proteína.

Os estudos com ratos demonstraram ainda que as fêmeas eram mais sensíveis ao efeito de promotor de crescimento do salbutamol do que os ratos jovens ou machos (Correia et al., 1992) e que o clembuterol era capaz de estimular o crescimento dos músculos

* Correspondente: e-mail: [email protected] Os artigos anteriores que fazem parte deste trabalho foram:Agonistas adrenérgicos ß

2 e produção animal: I – Mecanismo

de acção. RPCV, (2000) 95: 99 – 110Agonistas adrenérgicos ß

2 e produção animal: II – Relação

estrutura-actividade e farmacocinética. RPCV, (2001) 96: 167-175

R E V I S T A P O R T U G U E S ADE

CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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RPCV (2002) 97 (542) 51-62Ramos, F. e Silveira, M.

esqueléticos e do conteúdo proteico da carcaça inde-pendentemente da idade dos animais (Carter et al., 1991).

Quadro 1 - Resultados de agonistas adrenérgicos ß2 como promotores de

crescimento em ratos

Fármaco G.M.P.D. Músculo Gordura BibliografiaSalbutamol 138 113 - (Correia et al., 1992)

Clembuterol 110 106 94 (Bates e Pell, 1991)

Clembuterol 126 108 67 (Cardoso e Stock, 1996)

Clembuterol 101 116 68 (Carter et al., 1991)

Clembuterol 161 118 91 (Orcutt et al., 1989)

Em frangos, quadro 2, a utilização de agonistas adrenérgicos ß

2 é traduzida por um pequeno aumento

do G.M.P.D. com o conteúdo proteico a ser também minimamente afectado, sendo a gordura o parâmetro onde mais consistentemente se verifica a acção dos fármacos em análise.

A avaliação dos efeitos do cimaterol em frangos no período de horas, máximo 48 horas, não permite encontrar grandes diferenças entre o grupo de controlo e o grupo alimentado com suplemento do agonista adrenérgico ß

2 referido. No entanto, quando o tra-

tamento é por um período de dias, máximo 14, verifica-se que o cimaterol já consegue fazer notar os seus efeitos como promotor de crescimento (Gwartney et al., 1992).

Muramatsu et al. (1991) estudaram o efeito promo-tor de crescimento do clembuterol em frangas com uma dose na ração de 0,25 ppm desde as 3 até às 6 semanas de vida. Os resultados obtidos não evidencia-ram nenhum aumento da síntese proteica, confirmado através da injecção endovenosa de fenilalanina titriada [3H], nem nenhum ganho de peso extra, quando com-parados com o grupo de controlo. No entanto, a gordura apareceu significativamente reduzida quer no fígado quer no músculo do peito.


crescimento em frangos

Fármaco G.M.P.D. Músculo Gordura BibliografiaCimaterol 104 106 93 (Gwartney et al., 1991)

Clembuterol 102 - 94 (Buyse et al., 1991)

Clembuterol 105 101 92 (Dalrympe et al., 1984)

Clembuterol 98 96 83 (Muramatsu et al., 1991)

Os outros dois estudos consultados sobre a utiliza-ção de clembuterol em frangos (Buyse et al., 1991; Dalrympe et al., 1984) provam o ganho de peso das aves acompanhado de um aumento da proteína e da redução na deposição de gordura, continuando, no entanto, a ser este o efeito mais evidente.

A diminuição da gordura verifica-se mais nos adipó-citos situados ao nível subcutâneo abdominal e nas fêmeas (Williams, 1987), já que estas acumulam, no geral, mais gordura que os machos, tendo Dalrympe et al. (1984) verificado que o aumento da proteína da carcaça é mais evidente também nas fêmeas, o que pressupõe uma melhor resposta ao clembuterol das fêmeas destas aves do que os machos respectivos.

Buyse et al. (1991) demonstraram ainda que a redução da gordura é mais visível se o tratamento for efectuado apenas no período final antes do abate e que a administração prolongada de clembuterol não apresenta qualquer vantagem acrescida, notando-se mesmo uma diminuição no peso se tal se verificar, quando comparado com o grupo de controlo.

A importância dos ovos na alimentação humana conduziu à pesquisa de eventuais efeitos dos agonistas adrenérgicos ß

2 sobre a postura. Contudo, tal não

se mostrou significativamente feliz. Apenas se conse-guiu identificar um estudo realizado por Merkley e Garwood (1989) com codornizes, cujos resultados não foram conclusivos quanto aos efeitos anabolizantes do cimaterol. No entanto, os resultados foram inequívocos num ponto: a idade do primeiro ovo das aves foi retardada, entre 6 e 7 dias com 0,5 ppm de cimaterol na dieta, quando comparadas com o lote testemunha. Dado que os resultados do cimaterol sobre o teor de gordura das carcaças de codorniz não apontam para a sua redução, julgamos que tal efeito pode ser atribuído a um atraso na maturação sexual das codornizes, uma vez que a quantidade de lípidos disponível é mais que suficiente para o desenvolvimento da gema do ovo.

No quadro 3 apresentam-se os resultados de treze estudos diferentes efectuados em suínos com agonis-tas adrenérgicos ß

2, verificando-se que na maioria

dos estudos o ganho médio diário de peso não é significativamente aumentado com a administração de agonistas adrenérgicos ß

2, o que vai ao encontro do que

foi também verificado por Moloney e Allen (1992). A acção a nível muscular é traduzida por um aumento médio de cerca de 10%, em relação aos grupos de controlo, com oscilações que vão de um máximo de 30% a um mínimo de 1%, enquanto em relação à gordura se constata uma diminuição média do seu teor a rondar os 9%, com o intervalo maior de variação a situar-se entre 1 e 16%, sendo que o seu efeito é mais pronunciado na gordura subcutânea e inter-muscular do que na intra-muscular (Engeseth et al., 1992).


crescimento em suínos

Fármaco G.M.P.D. Músculo Gordura BibliografiaRactopamina 110 114 91 (Bark et al., 1992)

Ractopamina 111 130 84 (Crome et al., 1996)

Ractopamina 142 126 86 (Engeseth et al., 1992)

Ractopamina 103 106 96 (Gu et al., 1991a)

Ractopamina 105 101 99 (Mills et al., 1990)

Ractopamina 98 103 94 (Mitchell et al., 1991)

Ractopamina 109 106 93 (Stites et al., 1991)

Ractopamina 112 105 96 (Yen et al., 1991)

L-644,969 102 107 85 (Wallace et al., 1987)

Salbutamol 109 107 86 (Cole et al., 1987)

Salbutamol 105 106 84 (Warris et al., 1990)

Cimaterol 103 110 90 (Jones et al., 1985)

Cimaterol 106 103 97 (Walker et al., 1989)

Wallace et al. (1987) compararam a utilização do agonista adrenérgico ß

2 L-644,969 (6-amino-a-

{[(1-metil-3-fenilpropil)amino]metil}-3-piridina-meta-

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nol) na ração de suínos em concentrações de 0; 0,25; 1 e 4 ppm durante um período de 7 semanas. A dose de 1 ppm foi a que produziu melhores resultados, par-ticularmente no período inicial do tratamento. A partir das 7 semanas parece não haver qualquer benefício acrescido sendo que esse tempo é reduzido para 5 semanas no caso de 4 ppm. A dose de 0,25 ppm, tirando a primeira semana onde se verificou cerca de 5% de ganho de peso, apresentou resultados idênticos aos do grupo controlo.

Numa experiência levada a cabo com salbutamol em suínos, fêmeas e machos castrados, verificou-se que as fêmeas apresentavam uma redução maior na espessura da gordura dos presuntos do que os machos castrados, embora quanto à eficácia da ração, a expressão dos resultados fosse mais visível nos machos castrados, se bem que moderadamente (Cole et al., 1987).

Os resultados obtidos por Bark et al. (1992) e Engeseth et al. (1992) indicam que a adição de ractopamina à dieta de suínos numa concentração de 20 ppm na ração alimentar melhora o rácio e a eficácia do crescimento bem como as características da carcaça, especialmente se os suínos forem geneti-camente seleccionados para produção de carne magra e se o seu abate for efectuado até aos 114 kg de peso (Gu et al., 1991a,b). Com o aumento de peso, para além do referido, o crescimento em carne magra vai diminuindo, o que reduz a eficiência da ração alimentar que os suínos comem, aumentando, portanto, os custos de manutenção e enfraquecendo o rendi-mento da produção (Gu et al., 1991b)

O aumento de peso diário é mais conseguido numa fase inicial, primeiros catorze dias, diminuindo com o tempo até às 4 semanas, sendo o efeito da ractopamina, a partir deste período, praticamente sem significado, quando comparado com o grupo controlo (Bark et al., 1992; Engeseth et al., 1992). Por outro lado, a ractopamina demonstrou ser mais eficaz quando a sua administração é feita a animais mais pesados (Crome et al., 1996) o que vem corroborar a ideia geral de que a administração de agonistas adrenérgicos ß

2 é mais

rentável quando é feita no período final de engorda.Mitchel et al. (1991), por sua vez, concluíram que

o efeito da ractopamina nos metabolismos proteico e lipídico dos suínos estava associado com a disponibi-lidade energética da ração e que o impacto da restrição de energia no crescimento animal era muito maior do que a restrição proteica.

Nos estudos com cimaterol em suínos, verificou-se que intervalos de segurança de cinco dias (Walker et al., 1989) ou sete (Witkamp e van Miert, 1992) parecem ser suficientes para que os animais recuperem a gordura perdida durante o tratamento. No que diz respeito aos músculos constatou-se que, apesar de haver uma redução do peso ganho durante o trata-mento, o efeito do cimaterol ainda se mantinha visível, ao fim de sete dias de retirada (Jones et al., 1985). Já o teor de água avaliado na carcaça dos suínos tratados

era superior ao existente na dos animais controlo, embora em pequena percentagem (± 2%) (Walker et al., 1989; Witkamp e van Miert, 1992).

No que concerne às lesões nos cascos de suínos, Jones et al. (1985) encontraram uma relação directa entre estas e a dose administrada no caso do cimaterol, que Walker et al. (1989) e Hill e Dalrymple (1987), curiosamente com doses idênticas do mesmo agonista adrenérgico ß

2, não referem, afirmando inclusive que

não existem quaisquer outras alterações significativas nas capacidades de locomoção quando se comparam os animais tratados com os do grupo controlo. Já Wallace et al. (1987) e Biolatti et al. (1994) utilizando, respectivamente, L-644,969 e clembuterol concluíram pela presença de um maior número de lesões nos cascos caracterizadas por um aumento da erosão e ulceração dos mesmos acompanhados de uma vermelhidão das partes que contactavam directamente o solo.

O quadro 4 mostra os dados de onze estudos efec-tuados com ovinos, sendo de referir que a acção dos agonistas adrenérgicos ß

2 se manifesta por um

aumento muscular médio de 20%, com um máximo de 41% e um mínimo de 4%, e uma diminuição média de gordura a rondar os 25%, com 8 e 48% a cotarem-se como os valores de menor e maior redução do teor de gordura.

Rikhardsson et al. (1991) estudaram a acção do cimaterol enquanto promotor do crescimento na dieta de ovinos, tendo verificado que o aumento da retenção de azoto pelos animais ocorria principalmente nas pri-meiras três semanas de tratamento, sobretudo quando comparado com seis e mais semanas. Tal constatação poderá levar à conclusão que a acção sobre a síntese proteica dos agonistas adrenérgicos ß

2 só se desenvolve

durante um curto período de tempo. Kim et al. (1987) verificaram que os animais tratados apresentavam uma maior área do músculo dorsal bem como uma confor-mação das ancas muito superior quando comparados com o grupo não tratado, o que proporciona um maior rendimento, já que as partes referidas são as mais nobres da carcaça.

Quadro 4 - Resultados de agonistas adrenérgicos ß2

como promotores de

crescimento em ovinos

Fármaco G.M.P.D. Músculo Gordura BibliografiaL-644,969 116 111 72 (Koohmaraie et al., 1991)

L-644,969 109 105 92 (Koohmaraie et al., 1996)

L-644,969 108 106 71 (Koohmaraie e

Shackelford, 1991)

L-644,969 134 104 72 (Kretchmar et al., 1990)

Cimaterol 129 139 78 (Kim et al., 1987)

Cimaterol 163 111 91 (Rikhardsson et al., 1991)

Cimaterol 125 127 78 (Warris et al., 1989)

Clembuterol 124 123 63 (Baker et al., 1984)

Clembuterol 107 141 52 (Bohorov et al., 1987)

Clembuterol 101 123 67 (Sordo e Berzal, 1990)

Clembuterol 121 134 90 (Warris et al., 1989)

Baker et al. (1984) observaram que o conteúdo em água da carcaça dos animais tratados com clembu-terol aparecia aumentado, embora o rácio humidade/

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proteína se mantivesse constante, indicando, portanto, que o aumento de ambos se encontra associado. Os mesmos autores verificaram também que os cordeiros mais pesados responderam melhor que os mais leves ao tratamento o que parece induzir uma eficácia acrescida do clembuterol na fase final da engorda dos animais.

Os efeitos de “repartição” dos agonistas adrenérgi-cos ß

2 em bovinos podem ser observados no quadro 5.

O crescimento muscular varia entre um mínimo de 5% e um máximo de 18% com um valor médio da ordem dos 14%, enquanto a redução da gordura se cifra numa média de 30% com 20% e 42% como as menor e maior percentagens alcançadas para este parâmetro.


crescimento em bovinos

Fármaco G.M.P.D. Músculo Gordura BibliografiaCimaterol 118 115 67 (Quirke et al., 1988)

Cimaterol 106 117 65 (Williams, 1987)

Clembuterol 11 6118 60 (Miller et al., 1988)

Clembuterol 12 4105 58 (Parat et al., 1990)

Clembuterol 92 113 80 (Ricks et al., 1984)

Clembuterol 98 111 77 (Sordo et al., 1990)

Clembuterol 100 113 80 (Williams, 1987)

Clembuterol 107 117 74 (Williams, 1987)

O clembuterol, num estudo onde foi administrado na dose diária de 10 mg por animal durante 98 dias, mostrou que, apesar de um G.M.P.D. negativo em comparação com o controlo, mantinha as suas propriedades de diminuir a gordura e aumentar a musculatura, com o conteúdo em água da carcaça a apresentar-se também aumentado em cerca de 5% (Ricks et al., 1984).

Num estudo com cimaterol em bovinos provou-se que o tratamento era eficaz durante, pelo menos 21 dias, embora o período ideal de utilização para obtenção dos efeitos anabolizantes atinja os melhores resultados nos primeiros 14 dias de administração (Byrem et al., 1998).

Em geral, podemos então afirmar que os agonistas adrenérgicos ß

2 não parecem perder a sua actividade

metabólica no tubo digestivo, quer de ruminantes quer de monogástricos (Williams, 1989), sendo adminis-trados por via oral, misturados nos alimentos com-postos ou na água de bebida, por forma a atingir a sua acção como promotores do crescimento animal, aumentando a deposição da proteína ao mesmo tempo que se observa uma diminuição na acumulação de gordura ou seja, como “agentes de repartição”.

O tipo de tratamento (dose, sexo, duração, idade) é mais importante no rendimento final dos animais do que propriamente nos “efeitos de repartição” dos agonistas adrenérgicos ß

2, enquanto a eficácia dos dife-

rentes fármacos apresenta algumas variações, embora uma dose entre 2 e 4 ppm na ração pareça ser a indicada para ruminantes, enquanto para aves oscile entre 0,25 e 0,50 ppm (Moloney e Allen, 1992). No entanto, a ractopamina, numa dose de 20 ppm, estará

especialmente indicada no caso de suínos (Gu et al., 1991a; Mitchell et al., 1991; Stites et al., 1991).

As doses referidas são, no mínimo, 10 vezes supe-riores às utilizadas para fins terapêuticos nos mesmos animais, conforme referem Boenish e Quirke (1992) e como se pode comprovar com o clembuterol, único agonista adrenérgico ß

2 autorizado em medicina vete-

rinária. A administração para fins terapêuticos de medicamentos de uso veterinário (MUV) autorizados que contenham agonistas adrenérgicos ß

2 é permitida

em bovinos, equinos e animais de companhia como antitússico, broncodilatador ou tocolítico, neste caso só para vacas parturientes, desde que a sua utilização se faça de acordo com as especificações do fabricante (Directiva 96/22/CE; Lopes, 1999/2000; Miller et al., 1988; Ricks et al., 1984).

As fêmeas respondem melhor ao tratamento com agonistas adrenérgicos ß

2, sobretudo em ratos (Correia

et al., 1992), frangos (Muramatsu, 1991; Williams, 1987) e suínos (Cole et al., 1987), provavelmente devido à maior capacidade de mobilizar os lípidos que possuem, em quantidade superior à dos machos, e cuja diminuição é principalmente evidente no tecido adiposo subcutâneo e negligenciável no tecido adiposo intramuscular (Ferrando e Vanbelle, 1989).

A duração do tratamento afecta a resposta do mesmo, sendo notório que deve ser levado a cabo no período antes do abate e em animais que já tenham atingido a maturidade, ou seja, quando a capacidade de retenção das proteínas começa a ser mais fraca, mais eficazes se tornam os agonistas adrenérgicos ß

2 e melhor é,

portanto, o resultado obtido (Moloney e Allen, 1992; Moloney e Beermann, 1996; Williams, 1989). O ana-bolismo proteico, no entanto, ocorre principalmente ao nível do músculo esquelético, enquanto ao nível dos outros músculos, vísceras, por exemplo, há mesmo uma redução da proteína. Porém, e atendendo a que é proibido o tratamento zootécnico com este tipo de fármacos, a sua utilização como MUV, em animais destinados à produção de alimentos para consumo humano, está condicionada a algumas restrições, como sejam a sua não utilização em animais em produção de leite para uso humano e ao respeito pelo intervalo de segurança no caso em que a carne e vísceras se destinam à alimentação humana (Directiva 96/22/CE; Lopes, 1999/2000).

Do ponto de vista da hipertrofia muscular, e como se observa pela análise dos quadros 1 a 5, a ordem de eficácia é superior nos bovinos e ovinos, seguindo-se, por ordem decrescente, os suínos e as aves (Mersmann, 1998; Moloney e Allen, 1992; Ribeiro, 1995; Williams, 1989).

Qualidade da carne

Independentemente dos hábitos das diferentes popu-lações, verifica-se que dois factores são importantes quando se trata do consumo de carne, tenrura e paladar,

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englobando este os conceitos de suculência, sabor e odor. Associado a estes factores, um outro se torna imprescindível: o aspecto aquando da sua aquisição, onde a cor e a gordura visível influenciam, muitas vezes, a decisão de qual carne comprar. Para além destes factores relativos à “carne verde”, importa também equacionar a qualidade da carne transformada industrialmente pelo que todos estes factores serão objecto de abordagem neste ponto, por forma a verifi-car a influência dos agonistas adrenérgicos ß

2 sobre

aqueles parâmetros.Porém, hoje em dia, é cada vez mais frequente o

consumidor, para além dos factores referidos, preocu-par-se preferencialmente com os possíveis efeitos que essa carne possa trazer à sua saúde. Nesse sentido, e dada a importância do assunto, este será desenvolvido mais à frente no ítem segurança/toxicidade.

AspectoAs carnes tratadas com agonistas adrenérgicos ß

2

apresentam-se com uma diminuição da gordura de cobertura e mais escuras do que as não tratadas, sendo possível atribuir esses factos à acção dos fármacos em estudo. Atendendo a que já foi referido a acção sobre a gordura, apenas se explica o efeito dos agonistas adrenérgicos ß

2 sobre a cor da carne.

A estimulação ante-mortem da glicogenólise, pro-movida pelos agonistas adrenérgicos ß

2 leva à redução

da concentração do glicogénio muscular, limitando a normal acidificação post-mortem (Ferreira e Bastos, 1994) em cerca de 0,3-0,4 unidades de pH (Warris et al., 1989; Williams, 1987) devido às menores concentrações de ácido láctico muscular (Fernandes, 1995) e constitui a explicação mais frequentemente apontada como responsável por esse escurecimento, apesar da menor concentração do pigmento heme (Fer-reira e Bastos, 1994; Moloney e Allen, 1992; Warris et al., 1989 e 1990) ou de uma menor quantidade de mioglobina oxigenada, como preferem chamar-lhe Sordo e Berzal (1990).

No entanto, Berge et al. (1990), num estudo com clembuterol em bovinos, referem que o fármaco não exerce qualquer efeito sobre a cor da carne, enquanto Kim et al. (1987) afirmam mesmo que o cimaterol produz carne de ovino mais clara quando comparada com a do grupo de controlo.

O aspecto DFD (dark, firm and dry) característico da carne de animais tratados com agonistas adrenérgicos ß

2 e descrito, por exemplo, por Warris et al. (1990)

não parece ser assim tão característico, tanto mais que, para além do relatado no parágrafo precedente, não podemos esquecer os dados referidos anteriormente onde se mostrou que havia um incremento da quan-tidade de água das carcaças dos animais tratados, associado ao aumento da proteína. Aliás, o mesmo grupo, num outro estudo (Warris et al., 1989), refere que a capacidade de retenção de água da carne está aumentada sendo, inclusivé, reduzida a perda por

“gotejamento” durante o armazenamento.Estas características da carne, apesar de tudo apete-

cíveis à vista, não são impeditivas de uma mais rápida deterioração da mesma, principalmente se tivermos em consideração que o pH se encontra mais elevado, o que favorece a contaminação microbiana com as resultantes consequências prejudiciais em termos de higiene alimentar (Fernandes, 1995; Ferrando e Van-belle, 1989; Ribeiro, 1995).

TenruraOs agonistas adrenérgicos ß

2 levam à obtenção de

uma carne mais dura conforme é demonstrado por vários estudos em frangos (Gwartney et al., 1991 e 1992), suínos (Jones et al., 1985; Walker et al., 1989; Warris et al., 1991), ovinos (Kim et al., 1987; Koohmaraie et al., 1996; Kretchmar et al., 1990) e bovinos (Berge et al.,1991 e 1993; Williams, 1987). Entre as propostas para explicar as acções dos agonis-tas adrenérgicos ß

2 na tenrura da carne incluem-se

os efeitos da rápida refrigeração, “cold shortening”, (Fernandes, 1995; Ferrando e Vanbelle, 1989; Ribeiro, 1995; Sordo e Berzal, 1990; Williams, 1987), o aumento da produção do tecido conjuntivo e das fibras de tipo II nos músculos (Moloney e Allen, 1992; Williams, 1989) e a redução da proteólise post-mortem (Berge et al., 1993; Correia, 1995; Gwartney et al., 1992; Koohmaraie et al., 1996; Kretchmar et al., 1990), a que se acrescentam a dependência directa da dose, sendo que quanto maior for mais dura encontra-remos a carne que resultar desse animal (Moloney e Beermann, 1996; Walker et al., 1989).

O chamado efeito “cold shortening” fica a dever-se à redução da gordura da carcaça que leva a um arrefecimento mais rápido desta durante a maturação com um encurtamento das fibras musculares e o consequente aumento da dureza da carne (Sordo e Berzal, 1990; Williams, 1987).

A existência de uma carne mais dura não será alheia a uma acção mais efectiva dos agonistas adrenérgicos ß

2 sobre as fibras de contracção rápida (tipo II),

especialmente as glicolíticas, (Williams, 1987 e 1989) o que, segundo Warris et al. (1990) é traduzido na necessidade de uma força de corte mais elevada do que no grupo controlo, em carne cozinhada de suíno tratado com salbutamol. Aliás, um aumento da força para cortar a carne cozinhada é um efeito consistente atribuído ao tratamento com agonistas adrenérgicos ß

2

(Moloney e Beermann, 1996). Gwartney et al. (1991) estudaram a força de corte da carne do peito de frango tratado com cimaterol e demonstraram claramente que era superior à dos animais controlo, enquanto Warris et al. (1991) compararam os resultados de um painel de provadores com a avaliação mecânica da força de corte da carne de suíno alimentado com dieta suplementada com salbutamol. Este último estudo demonstrou que, embora a avaliação mecânica da carne mostrasse que era necessária uma força superior para o lote com

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salbutamol, tal passou praticamente despercebido ao painel de provadores. O facto terá ficado a dever-se a uma maior suculência aparente da carne tratada referida pelos provadores que consideraram a mesma média de aceitação, 4,87, para ambas as carnes numa escala de 1, detestar, a 8, extremamente gostosa.

No entanto, a diminuição da tenrura da carne que acompanha o tratamento com agonistas adrenérgicos ß

2 não resulta tanto das modificações da estrutura

do tecido conjuntivo muscular, mas mais como conse-quência dos efeitos da diminuição lipídica do músculo e das alterações das miofibrilhas musculares, como se pode constatar durante os processos de maturação da carne, particularmente os que se encontram relaciona-dos com a proteólise post-mortem (Berge et al., 1993; Jiang, 1998; Kretchmar et al., 1990). Esta é devida essencialmente a dois tipos de enzimas proteolíticos: as proteases dos lisossomas, catepsinas, activas a valo-res de pH baixos, e as proteases cálcio-dependentes que actuam a valores de pH próximos da neutralidade, calpaínas I, activada por micromoles de cálcio, e II, activada por milimoles de cálcio (Fernandes, 1995). É sobre estas últimas que, neste caso, recaem principal-mente as atenções, com todo o processo a ser associado ao sistema calpaína/calpastatina, verificando-se que a actividade da calpastatina, enzima cálcio-dependente inibidor da capacidade proteolítica, permanece ele-vada durante a armazenagem post-mortem produ-zindo, assim, uma carne mais dura (Correia, 1995; Koohmaraie et al., 1996).

Koohmaraie e Shackelford (1991), num estudo com cordeiros e utilizando o agonista adrenérgico ß

2 L-644,969, demonstraram o que se descreveu no

último parágrafo ao administrarem cloreto de cálcio, por via intravenosa, imediatamente após o abate dos animais, com os resultados a serem expressos num aumento da tenrura da carne devido à promoção/facilitação do efeito das proteases cálcio-dependentes.

Um outro processo de actuar sobre este efeito negativo consiste na introdução de um período de retirada, verificando-se que quanto maior ele for mais tenra será a carne (Moloney e Beermann, 1996). Contudo, intervalos de segurança superiores a 7 dias eliminaram as vantagens acrescidas obtidas na compo-sição da carcaça de frangos com cimaterol (Gwartney et al., 1991), enquanto um ciclo de 14 dias mostrou limitar substancialmente o endurecimento da carne sem comprometer significativamente os efeitos anabo-lizantes do clembuterol em bovinos (Berge et al., 1993; Parat et al., 1990). O decréscimo da tenrura da carne não é afectado, porém, por todas as espécies da mesma forma, sendo importante verificar que ele é menos evidente na carne de suíno do que na dos ruminantes ou de frangos (Moloney e Allen, 1992).

PaladarA diminuição da deposição da gordura em animais

tratados com agonistas adrenérgicos ß2

leva a uma

diminuição da sapidez da carne, sobretudo de bovino (Correia, 1995). Os ácidos gordos saturados são os mais afectados, aumentando a relação insaturados/saturados, com a ácido linoleico a ser particularmente importante na composição da carne resultante do tratamento com agonistas adrenérgicos ß

2 (Williams,

1989; Fernandes, 1995). A relação de ácidos gordos saturados/ácidos gordos insaturados passará segundo Carraud (1989) de 1/1,2 para 1/2,3 com o tratamento com agonistas adrenérgicos ß

2.

Porém, Engeseth et al. (1992) demonstraram que a ractopamina provocava, principalmente, esse efeito ao nível do tecido adiposo, já que ao nível muscular não encontraram alterações significativas nesse rácio, mesmo quando a dieta foi suplementada com ácidos gordos. Ferrando e Vanbelle (1989), ainda em relação à carne de suíno, afirmam que esta apresenta um défice de ácidos gordos essenciais ao nível dos principais músculos, tornando os hipotéticos benefícios para o consumidor como provavelmente ineficazes.

Se a redução dos ácidos gordos saturados constitui um aspecto desejável, tendo em vista os conceitos médicos actuais que aconselham a diminuição da ingestão das gorduras e, especialmente, da gordura saturada, já o decréscimo da gordura intramuscular, embora pouco provável em bovinos (Sordo e Berzal, 1990), pode conduzir a uma menor qualidade da carne, especialmente ao nível do paladar, com uma suculência diminuída, após o respectivo processamento culinário (Moloney e Beermann, 1996).

Por outro lado, não existem por ora dados sobre a digestibilidade, pelos seres humanos, das proteínas da carne dos animais tratados com agonistas adrenérgicos ß

2. Mas se estes diminuem a proteólise post-mortem

nas carnes tornando-as mais duras é possível que a sua digestibilidade e, consequentemente, o seu valor nutritivo também esteja diminuído (Correia, 1995).

Também a quantidade de água mais elevada em carcaças produzidas com o auxílio de agonistas adre-nérgicos ß

2, reflecte-se, como é óbvio, na culinária e,

em definitivo, no prato, com as desvantagens não só para o sabor, mas também para a qualidade em geral, onde o bolso do consumidor sai afectado com o naco de carne cozinhado a libertar a água que possui, ficando o seu tamanho final mais reduzido (Fernandes, 1995; Ferrando e Vanbelle, 1989; Warris et al., 1989).

Transformação industrialOs lípidos da carcaça, depositados em menores

quantidades e com um rácio mais favorável aos insa-turados, como já foi referido, se podem transformar a carne num alimento mais interessante do ponto de vista dietético, convertem-no, de certeza, num produto menos vantajoso durante os processos de armazenagem, devido à maior oxidação que essa composição facilita (Fernandes, 1995; Ferrando e Vanbelle, 1989).

No entanto, Stites et al. (1991) num estudo destinado

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a avaliar a ractopamina como promotor de crescimento em suínos bem como os seus efeitos no processamento industrial da carne proveniente de porcos tratados, particularmente na obtenção de presunto e “bacon”, demonstraram que, apesar da diminuição média da espessura da pele de porco, coirato, não havia qual-quer problema durante o tratamento industrial para a obtenção de “bacon”. Também Crome et al. (1996) chegaram à conclusão que os presuntos de porcos tratados com ractopamina se tornam mais desejáveis uma vez que apresentam maior quantidade de carne magra, menos osso e menor quantidade de gordura subcutânea, quando comparados com o grupo de controlo. Logo, e neste caso, os benefícios de mais e melhor pernil e lombo em porcos tratados traduzem-se, pois, em mais e melhores benefícios económicos sem alteração do processamento industrial nem da qualidade dos produtos em causa, presunto e “bacon”.

Segurança/Toxicidade

A avaliação da segurança/toxicidade dos fármacos utilizados em zootecnia situa-se, principalmente, a três níveis diferentes: no animal, no meio ambiente e no Homem (Ramos, 1990).

No animalNos aspectos relacionados com a segurança dos

agonistas adrenérgicos ß2 em relação aos animais a

quem são administrados, verifica-se que são os efeitos secundários aqueles que se revestem de maior impor-tância. O efeito que mais se evidencia na terapêutica prolongada é a tolerância, ou seja, por exemplo, redução da relação dose/efeito em indivíduos pré-expostos. Ora, apesar da tolerância estar habitualmente ligada a uma diminuição da toxicidade, já que se necessita de maior dose para desencadear os mesmos efeitos adversos, uma posologia aumentada, como é o caso, conduz ao aparecimento de efeitos tóxicos, uma vez que os parâmetros cinéticos são característicos da molécula e não dependentes da dose. Outro fenómeno que afecta os efeitos sobre os animais tem a ver com a especificidade dos receptores que, sendo elevada, não é, no entanto, total. Doses muito elevadas de agonistas adrenérgicos ß

2 produzem estimulação dos receptores

ß1, tratando-se aqui de um efeito secundário clara-

mente de teor tóxico (Fontes, 1995).Portanto, no animal, os agonistas adrenérgicos ß

2

podem originar desde efeitos profiláticos a tóxicos, passando pelos chamados “efeitos de repartição”, consoante a dose administrada, o que nos leva a concluir que o respeito pelas normas de “Boas Práticas Veterinárias” (G.V.P.) e “Boas Práticas Agrícolas” (G.A.P.) se reveste de vital importância para a saúde dos animais e, mesmo, para a do Homem e para o próprio meio ambiente (Ramos, 1990; Ramos e Silveira, 1997).

No meio ambienteAtendendo a que não se espera que os agonistas

adrenérgicos ß2 tenham qualquer acção ao nível da

actividade antimicrobiana que possa exercer efeito quer na flora intestinal, quer nos microorganismos uti-lizados no processamento industrial ou, quer mesmo, ao nível dos microorganismos do meio ambiente, pode-se dizer que os mesmos não apresentam proble-mas de ecotoxicidade (Boenisch e Quirke, 1992).

É com agrado que registamos que, apesar dos agonistas adrenérgicos ß

2 serem eliminados sobretudo

pela urina e pelas fezes, não lhes são atribuíveis quaisquer efeitos nefastos sobre as qualidades do solo ou da água.

No homemA toxicidade dos agonistas adrenérgicos ß

2 no

homem pode manifestar-se em dois momentos distin-tos que se podem definir ao nível da saúde ocupacio-nal, enquanto manipulador dos fármacos referidos, e ao nível da sua ingestão, enquanto consumidor de alimentos (Ramos e Silveira, 1997).

ManipuladorOs agonistas adrenérgicos ß

2 actuam por via inala-

tória o que transforma o seu manuseamento numa actividade perigosa para os manipuladores de pré-misturas e de alimentos compostos para animais onde se incorporem esses fármacos (Ribeiro, 1995). Nesse sentido, atrevemo-nos a desaconselhar essa profissão a pessoas que sofram doenças relacionadas com o sis-tema cárdio-respiratório como, por exemplo, a asmá-ticos.

Os problemas dermatológicos e, sobretudo, pulmo-nares, surgirão mais cedo ou mais tarde nesta profissão, desde que as normas de segurança e higiene no ambiente de trabalho, como utilização de vestuário apropriado, luvas e máscara, não sejam respeitadas (Ramos e Silveira, 1997).

ConsumidorA proliferação do uso ilegal de medicamentos de uso

veterinário, em geral, e dos agonistas adrenérgicos ß2,

em particular, levanta novas preocupações com a sua segurança/toxicidade, particularmente as que dizem respeito ao consumidor.

O impacto da disponibilidade de carne magra sobre a saúde dos consumidores pode eventualmente tradu-zir-se por uma redução dos casos clínicos agudos de doenças cardiovasculares e outras doenças poten-cialmente relacionadas com a gordura da dieta. Porém, as elevadas concentrações de ácidos gordos livres já referidas podem, só por si, ser perigosas, já que possibilitam o desencadear de alterações ao nível das membranas celulares, podendo alterar o endotélio dos vasos e favorecer o desenvolvimento de situações de arteriosclerose ou, mesmo, permitir a agregação

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plaquetária com subsequente formação de um trombo, um enfarte e, até, a morte (Correia, 1995).

Ora, tudo isto tanto pode acontecer ao nível dos animais tratados com agonistas adrenérgicos ß

2 como

ao nível do consumidor dos produtos alimentares pro-venientes desses animais, onde os principais perigos, para além das hipóteses referidas anteriormente, se ficam a dever à ocorrência dos resíduos dos fármacos nos alimentos, sobejamente comprovada (Brambilla et al., 1997; Cruz, 1998; Garay et al., 1997; Maistro et al., 1995; Martinez-Navarro, 1990; Pulce et al., 1991; Ramos et al., 2001a, b).

A avaliação dos riscos que corremos quando ingeri-mos alimentos provenientes de animais tratados com agonistas adrenérgicos ß

2 depende da qualidade e da

quantidade de resíduos neles presentes no momento da ingestão. Qualidade e quantidade essas que dependem (Ferreira e Bastos, 1994): a) do tempo que mediou entre a última administração do fármaco ao animal e o abate ou aproveitamento alimentar, leite, por exemplo; b) do efeito pernicioso directo da molécula do agonista adrenérgico ß

2 como tal; c) da capacidade

de biotransformação do fármaco pelo animal em meta-bolitos porventura mais tóxicos do que a droga-mãe; d) da capacidade do fármaco e/ou dos seus metabolitos reagirem ou não irreversivelmente com as macromo-léculas tecidulares, formando resíduos ligados; e) das alterações que possam ter ocorrido durante o processamento culinário e o armazenamento a que a carne tiver sido submetida.

Acresce, ainda, a todas estas situações, o tempo de exposição do consumidor ao mesmo resíduo (Hermus e van der Kreek, 1987), uma vez que a ingestão regular de pequenas quantidades da mesma substância pode conduzir a manifestações tóxicas a longo prazo, por exemplo, de tipo canceroso (Rico, 1986).

No entanto, as situações de toxicidade identificadas como tendo origem na ingestão de alimentos contendo resíduos de agonistas adrenérgicos ß

2 foram todas de

natureza aguda e todas devidas ao clembuterol. Os efeitos nefastos sobre o consumidor daí resultantes manifestaram-se particularmente devido a dois aspec-tos: sobredosagem no animal com período de retirada não respeitado e quando o consumidor estava sujeito a terapêutica com o mesmo grupo de fármacos (Fontes, 1995).

A primeira situação a ser relatada ocorreu em Espa-nha (Martinez-Navarro, 1990) e englobou quarenta e três famílias num total de 135 pessoas afectadas. Noventa e sete por cento dos casos foram devidos à ingestão de fígado, cozinhado de diversas formas, e os sintomas apareceram 30 minutos a 6 horas após a ingestão e foram os seguintes: tremores facilmente perceptíveis, taquicardia, nervosismo, cefaleias e mial-gias que duraram entre 8 a 96 horas, não tendo nenhuma situação sido fatal nem deixado sequelas posteriores. A urina de dois dos pacientes revelou conter clembuterol nos teores de 2 e 4 µg/l e as cinco

amostras de fígado que conseguiram ser analisadas apresentaram concentrações de clembuterol entre 160 e 291 µg/kg.

Um outro caso foi também descrito em Espanha (Garay et al., 1997), afectando quinze pacientes prove-nientes de quatro famílias, após ingerirem fígado de vitela contaminado. Os sintomas apareceram logo trinta minutos a duas horas após a ingestão e consis-tiram principalmente em tremores, palpitações, ansie-dade, taquicardia, mal estar geral e cefaleias. O electro-cardiograma confirmou a taquicardia em todos os casos, as análises ao sangue dos pacientes demonstra-ram hipocaliémia em 2/3 dos casos e todas as dez amostras de urina colhidas apresentaram positividade ao clembuterol com valores a oscilarem entre 5 e os 90 ng/ml. A análise de uma amostra de fígado colhida no talho onde as famílias se tinham abastecido, revelou teores de clembuterol bastante elevados, 500 µg/kg. Todos os pacientes evoluiram bem, apenas tendo havido necessidade de um internamento por um perí-odo de doze horas de uma doente com antecedentes de miocardiopatia dilatada e que sofreu uma crise hipertensiva. Os sintomas duraram entre 3 e 72 horas.

Vinte e duas pessoas de oito famílias diferentes de duas regiões de França foram afectadas por uma intoxicação com clembuterol após terem, igualmente, ingerido fígado de vitela (Pulce et al., 1991). Os sinto-mas comuns foram tremores e cefaleias, apresentando ainda a grande maioria dos afectados, palpitações, vertigens, mialgias e, mesmo, algumas cãibras muscu-lares. Os sinais clínicos descritos apareceram 1 a 3 horas após a ingestão do fígado contaminado e regrediram passados 1 a 3 dias, a maioria dos casos sem qualquer tipo de terapêutica e sem deixar sequelas. Duas amostras do fígado idêntico ao que havia sido ingerido foram analisadas por GC-MS e revelaram possuir teores de clembuterol de 375 e de 500 µg/kg.

Em Itália, três famílias (Maistro et al., 1995) e 62 pessoas (Brambilla et al., 1997) sofreram os efeitos do clembuterol após comerem carne de vaca. Dez minutos a três horas depois das refeições apareceram os sintomas de tremores, palpitações/taquicardia, ner-vosismo, associados a distúrbios gastrointestinais, cefa-leias, mialgias e, em alguns casos isolados, fraqueza e uma certa confusão (Brambilla et al., 1997; Maistro et al., 1995). No entanto, uma das pessoas de uma família que estava a tomar 50 mg diários de atenolol, um bloqueador dos receptores ß, não apresentou qual-quer sintomatologia, o que prova que os medicamentos utilizados como ß-bloqueantes podem ser usados no tratamento sintomático das intoxicações por clembute-rol, caso seja necessário (Maistro et al., 1995). Numa amostra de carne analisada foram encontrados 500 µg/kg de clembuterol (Maistro et al., 1995), enquanto noutra se encontraram concentrações médias da ordem dos 4500 µg/kg, verdadeiramente absurdas (Brambilla et al., 1997).

No nosso País já foram descritos três casos, a saber:

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• Em Ourém foram afectadas dez pessoas de duas famílias diferentes com idades compreendidas entre os 5 e os 60 anos, tendo-se verificado que a sintoma-tologia começou a manifestar-se 7 a 8 horas após a ingestão de carne de borrego. A determinação de agonistas adrenérgicos ß

2 em três amostras de carne

idênticas às que haviam sido ingeridas pelas famílias demonstrou a presença de clembuterol em todas elas, sendo que duas apresentavam quantidades relativa-mente elevadas, 343 e 275 mg/kg, enquanto a terceira continha apenas 9,7 mg/kg (Cruz, 1998).

• Em Aveiro, numa amostra de fígado, já confeccio-nado, proveniente do frigorífico da família intoxicada foi determinada uma concentração de clembuterol verdadeiramente preocupante, 1171 mg/kg, enquanto uma amostra de músculo colhida no talho abastecedor continha 116 mg/kg (Ramos et al., 2001b)

• Em Coimbra, dois pacientes, pai e filha, de 58 e 28 anos de idade, deram entrada nos serviços de urgência dos Hospitais da Universidade de Coimbra com tremores grosseiros das extremidades, taquicar-dia, ansiedade, mal estar geral, cefaleias, náuseas, palpitações e tonturas, 2 horas após terem ingerido fígado de vitela frito. Os antecedentes familiares e pessoais não acrescentaram nada de relevante para o esclarecimento clínico da situação, apenas se tendo registado, nos exames complementares de diagnóstico, uma hipocaliémia como elemento significativo em ambos pacientes. A administração de 10 mg de diaze-pam I.M. na urgência e a prescrição de cloreto de potássio 600 mg i.d., bem como de propanolol 40 mg 3 i.d., ambos por via oral, constituiu a terapêutica eleita, a que se seguiu a alta hospitalar com conse-quente acompanhamento na consulta externa. Dois dias depois, os pacientes voltaram aos serviços de urgência com o mesmo quadro clínico, excepto a hipocaliémia, tendo sido verificado que não tinha ocorrido a toma de propanolol, conforme tinha sido prescrito. Administrado o propanolol de acordo com a prescrição inicial, a situação clínica ficou totalmente resolvida, e sem sequelas, ao fim de cinco dias. Uma amostra de fígado remanescente analisada revelou a concentração de 1420 mg/kg de clembuterol (Ramos et al., 2001a)

O limite máximo de resíduos (LMR) de clembuterol permitida num alimento é determinado a partir da dose do medicamento que não é capaz de provocar qualquer efeito espasmolítico brônquico, “NOEL – nível sem efeitos observáveis”, ou seja, 42 ng/kg/dia (Kuiper e Groot, 1996). A dose diária de ingestão aceitável (DDA) é calculada através da divisão da NOEL por um factor de segurança, neste caso 10, o que dá uma quantidade de 4,2 ng de clembuterol/kg/dia (DDA = NOEL/10 = 4,2 ng), que poderá ser ingerida sem qualquer problema de toxicidade. Com este dado, e partindo do princípio que uma pessoa pesa 60 kg e come, em média, 500 gramas de carne por dia, repartidos entre 300 g de músculo, 100 g de fígado,

50 g de gordura e 50 g de rim, encontramos um LMR de 0,5 µg/kg de carne, muito distante, portanto, das quantidades que deram origem às intoxicações relatadas (Boenisch e Quirke, 1992).

Meyer e Rinke (1991) fizeram o estudo do período de retirada do clembuterol em bovinos para obter uma concentração de resíduo da ordem de 0,8 µg/kg na carne, por forma a evitar os efeitos secundários aquando da ingestão desse alimento proveniente de animal tratado com o clembuterol. Duas semanas foi o tempo encontrado pelos autores, embora, mesmo assim, desaconselhem o consumo de fígado e de gordura, enquanto recomendam a análise de resíduos no olho do animal para verificar a presença/ausência de resíduos de clembuterol uma vez que neste tecido ele se acumula durante mais tempo e em maior quantidade (Ramos et al., 2001c).

Conclusões

A revisão sobre agonistas adrenérgicos ß2 e produção

animal que, agora, se dá por concluída, abordou diver-sos aspectos, entre os quais se incluem os receptores adrenérgicos, o mecanismo de acção dos fármacos referidos, a sua relação estrutura-actividade, a sua farmacocinética, os seus efeitos zootécnicos e as suas implicações sobre a qualidade da carne. A questão principal que levou a este conjunto de três artigos foi enunciada logo no primeiro da série: os problemas de Saúde Pública resultantes da utilização ilegal dos agonistas adrenérgicos ß

2.

A BSE, “doença das vacas loucas”, colocou a questão da segurança alimentar na ordem do dia, com os consumidores a exigirem, cada vez mais, que a sua dieta não contenha os chamados “OCNIs” (Objectos Comestíveis Não Identificáveis).

A quantidade de fármacos utilizados como promo-tores do crescimento animal tem vindo a crescer exponencialmente, sobretudo devido às novas formas de pecuária intensiva, com o resultado a ser traduzido, é certo, pelo aumento das disponibilidades alimentares, embora, nalguns casos, com a presença de resíduos desses fármacos nos alimentos, em quantidades não desprezíveis.

No caso da carne, o seu controlo de qualidade, mais do que avaliar o produto final como era prática corrente até há pouco tempo atrás, começa a estar, hoje em dia, organizado de forma diferente, compreendendo o rastreio completo da vida do animal, desde o seu nascimento até ao seu abate, onde a alimentação e o próprio habitat constituem factores primordiais a ter em conta quanto à excelência pretendida. O controlo completo e permanente em todas as fases do processo da produção, da quinta ao garfo do consumidor, torna-se, assim, imperioso.

Como se deixou escrito na revisão efectuada, os principais efeitos tóxicos dos agonistas adrenérgicos

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ß2 são reflexo de respostas farmacológicas exageradas

devidas à administração de doses elevadas. Contudo, e considerando o significado potencial dos seus resíduos nos tecidos comestíveis derivados de animais produto-res de carne, deve existir uma rigorosa vigilância, especialmente tendo em atenção as populações-risco. Esta população é constituída, principalmente, pelos que sofrem de cardiopatias isquémicas, hipertensão arterial e/ou que apresentam problemas hidro-electro-líticos (Garay et al., 1997). Também os que necessitam de tomar diuréticos e todos aqueles que se encontram sob tratamento com fármacos do mesmo grupo tera-pêutico, ou seja, cerca de 10% da população mundial que sofre de problemas asmáticos em maior ou menor grau (Fontes, 1995), devem merecer especial atenção.

Nesse sentido, e apesar do diagnóstico de intoxica-ção por agonistas adrenérgicos ß

2, num paciente iso-

lado, ser extremamente difícil, os autores atrevem-se a propor que essa hipótese seja seriamente encarada quando a sintomatologia descrita no capítulo anterior aparecer num grupo de pessoas que tenham ingerido fígado, dado ser este o tecido edível onde os citados fármacos se acumulam em maior quantidade e por mais tempo.

Os autores atrevem-se ainda, e como contributo para a melhoria da segurança alimentar, a sugerir que, em casos semelhantes, as autoridades sanitárias sejam logo alertadas, nomeadamente a nova Agência para a Qualidade e Segurança Alimentar, tendo em vista a sua imediata actuação. Salvo melhor opinião, o procedimento a adoptar deverá obedecer aos seguintes passos: após a recolha de urina e de sangue dos pacientes na unidade de saúde, bem como dos alimen-tos envolvidos na intoxicação que ainda permaneçam na casa das famílias afectadas ou no talho onde foram adquiridos, identificar o talho distribuidor da carne, o matadouro e a exploração pecuária, por forma a poder agir contra a eventual “rede de tráfico de droga para animais” por crime contra a Saúde Pública.

Os autores, com esta revisão, esperam ter contribu-ído para que os problemas de Saúde Pública, ocorridos em Portugal e que resultaram da utilização ilegal dos agonistas adrenérgicos ß

2, possam vir a ser minorados,

quer em quantidade, quer em qualidade.

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Resumo: A produção variada (composição bioquímica e organização tecidual) do mesmo tipo de alimento de origem animal (carne ou leite) permite definir o sistema de produção animal a instalar. Reforça-se a ideia da necessidade no Mundo, de um esforço de produção de alimentos de origem animal a dobrar a sua produção actual nos próximos 20 anos, face à duplicação previsível da população Humana nos próximos 50 anos. Ao mesmo tempo a competitividade da produção, face à comercialização em mercados abertos, exige o aumento da eficiência produtiva. Teremos assim o incremento da produção massal de alimentos de origem animal, originados em sistemas intensivos de produção. Para este aumento da eficiência biológica muito contribuirá a aplicação de novas tecnologias em produção animal, responsáveis por custos de produção mais baixos e competitivos. Nos domínios metabólico, genético, reprodutivo e produtivo novas técnicas, quando não ponham em causa a saúde pública e eticamente sejam aceites pelo consumidor, permitirão aplicar no próximo século e nos sistemas de produção intensiva outras técnicas de produção. O melhoramento genético e produtivo do Segmento Mãe e do Segmento Filho permitirão atingir níveis de eficiência produtiva (mais produto por unidade de alimento ingerido) responsáveis por custos de produção mais baixos. São tecnologias que visam a produção massal de alimentos de origem animal, diluindo os custos com a manutenção do animal. São sistemas intensivos de produção animal.Por outro lado há outra forma de produzir alimentos de origem animal, desenvolvendo sistemas de produção natural ou extensiva que defenderá as qualidades genuínas do produto animal. O melhoramento produtivo, neste caso de produção, deve tornar mais eficiente o sistema, sem contudo alterar as características do produto final. Estas condicionarão a inovação tecnológica a aplicar na produção animal natural. Os custos de produção mais elevados poderão ser compensados pelo valor acrescentado a obter pela venda destes alimentos de origem animal, ou pela necessidade política sentida de os produzir.Há assim formas diferentes de produzir o mesmo alimento, conduzindo o Consumidor a escolher.A produção intensiva e a produção natural são sistemas comple-mentares de produção animal cuja produção e distinção entre os mesmos produtos, terá de ser regulamentada, coordenada, melhorada e defendida a sua origem e genuidade. A Imagem Pública da produção animal terá de ser defendida através da formação da opinião do Consumidor. A estrutura produtiva deve preocupar-se com a saúde pública e ambiental e o bem estar animal. Indústria animal e Produção Natural coabitam o mesmo espaço e produzem alimentos variados que o Homem pode escolher. Trata-se de uma produção massal (sistemas intensivos) e uma produção de oferta limitada (produção natural), esta feita com o recurso local, a raças autóctones e alimentos de composição nutritiva com reflexos nos flavores do produto final. O esforço

de produção e a eficiência de produção conduzirão por outro lado à evolução da animalicultura que assentará as suas raízes na evolução do Conhecimento Científico e da aceitabilidade pública da aplicação de novas tecnologias, passando do animal modelo ao animal molécula, assente na identificação e expressão do ácido desoxiribonucleico, DNA. Há que produzir com competitividade, produzir de formas diferentes, oferecer alimentos de características diversas, defender a natureza do que se vende, da etiqueta e por outro lado, saber comercializar.

Palavras-chave: Sistemas de produção animal, características do produto animal, sustentabilidade, mecanismos genéticos e metabólicos de produção animal.

Abstract: Varied production (biochemical composition and organization of tissue) of the same type of animal origin food (meat and milk) makes it possible to choose the adequate animal production system. There will be a need to duplicate the production of animal origin food during the next 20 years since it is predicted that human population will double in the next 50 years. At the same time, the competitiveness of production demands an increase of productive efficiency due to commercialization in open markets. Therefore, there will be an increase of mass production of animal origin foods from intensive systems of production. New technologies which allow lower and competitive production costs will play an important role in the increase of biological efficiency. New technologies in the metabolic, genetic, reproductive and productive fields will make it possible to apply other production techniques in intensive production systems in the next century as long as these are not harmful to public health and are ethically accepted by consumers. The genetic and productive improvement of both dam and offspring segments will make it possible to reach levels of productive efficiency (more product per feed intake) that will allow lower production costs. The aim of these technologies is mass production of animal origin food. Natural or extensive production systems are another way to produce animal origin foods. This type of production ensures the genuine qualities of the animal product. In natural or extensive production, productive improvement should make the system more efficient without changing the characteristics of the final product. These will determine the type of technology to be used. Higher production costs may be compensated by the added value obtained from the commercialization of these animal origin foods.Therefore, the same food may be produced in different ways and the Consumer may choose.These animal production systems complement one another. However, the distinction between the same products from each of these systems will have to be regulated, coordinated and improved

Sistemas de produção de alimentos de origem animal no futuro

Production Systems of animal origin food in the future

Apolinário Vaz Portugal

Estação Zootécnica Nacional 2000 Vale de SantarémFaculdade de Medicina Veterinária Rua Professor Cid dos Santos 1300-477 Lisboa

ARTIGO DE OPINIÃO R E V I S T A P O R T U G U E S ADE


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in order to ensure the originality of these products. The Public Image of animal production requires that the opinion of the Consumer be shaped. The productive structure should be concerned with public and environmental health as well as with animal welfare. Both Animal Industry and Natural Production share the same space and produce a variety of foods Man may choose. Intensive production systems are responsible for mass production while natural production systems account for production of limited offer. The latter has specific characteristics and derives from local resources, local breeds and feeds which nutritive composition influences the flavour of the final product. On the other hand, the effort and efficiency of production will lead to the evolution of animal production which foundation is set on the evolution of scientific knowledge and on the acceptability of applying new technologies. Thus the standard animal will give way to the molecule animal which is based on the identification and expression of deoxyribonucleic acid (DNA). There is a need to produce competitively, produce in different ways, offer foods with different characteristics, defend what is sold and labelled and know how to commercialize.

Keywords: Animal production systems, animal product charac-teristics, metabolic and genetic mechanisms of animal production.

Introdução

A pressionante procura de alimentos de origem animal e a competitividade na venda destes alimentos em mercados abertos e organizados constituirão elementos a marcar o Futuro, que se apoiará nos avanços da Ciência Animal para definir as tecnologias de produção a adoptar.

O animal máquina biológica manipulável (Portugal, 1995) converterá, com grau de eficiência biológica e económica variáveis, a massa orgânica e mineral ingeridas, procurando que, em todas as circunstâncias de produção, haja sempre a garantia de produção de “inputs”, tornando os sistemas de produção animal sustentáveis. Há que evitar em produção animal que se esgote a capacidade de produção das primeiras fontes alimentares convertíveis da cadeia alimentar (sustentabilidade dos sistemas de produção).

As actividades a nível digestivo e metabólico, procuram que se aumente a quantidade de macro e micronutrientes depositados em relação ao nível e qualidade do ingerido pelo animal, reduzindo a fracção não utilizável e que constitui agente poluente do Meio (gases e matéria orgânica fecal e urinária). Verifica-se assim que a eficiência biológica do sistema produtivo é uma constante permanente a se atingir, marcando novas perspectivas e valores na cobertura das necessidades das funções de produção animal.

Colocam-se assim algumas questões. Por um lado há que fazer um esforço de produção de alimentos de origem animal. Por outro lado, há que desenvolver este esforço de produção, procurando com a aplicação dos sistemas de produção animal, a defesa da saúde pública, a não agressão ambiental, a sustentabilidade das operações da cadeia alimentar e o bem estar animal, evitando, neste último, fundamentalismos que dificultem

e onerem os custos de produção animal.Necessidade de produção de alimentos de origem animal face à evolução demográfica e à dimensão humana nos próximos vinte anos (Início e meio do Século XXI).

Considera-se como projecção, no espaço de cinquenta anos, a duplicação da população mundial, nomeada-mente com crescimentos significativos nos países em vias de desenvolvimento. Não se prevêem aumentos significativos nos países desenvolvidos mas procura-se continuar o esforço para reduzir a percentagem de população com fome (ver quadro 1) o que significa mais um desafio a aumentar o esforço de produção.

Quadro 1 - Fome no Mundo: Estimativa de população subalimentada e subnutrida nos países Subdesenvolvidos e em vias de Desenvolvimento População total SubalimentadosPeríodo Milhões Milhões % do total1969 - 71 2583 893 35 1979 - 81 3228 878 27 1989 - 92 4064 809 20 2010 (proj) 5668 730 13 (U.N. informação, P. Cunningham, 1996)

Este esforço de produção identifica-se com a indústria da produção animal e deve ser considerado como um desafio a cobrir as necessidades alimentares, provocadas pelo crescimento por ano em mais de 80 milhões de habitantes. Há que duplicar em vinte anos a produção mundial de alimentos e esta produção tem, desejavel-mente, de se verificar nas áreas onde a população duplica. Projecções do consumo, por exemplo de carne, são expressas no Quadro 2.

Quadro 2 – Consumo de carne de 1982 a 2020 Consumo Total de Carne (Milhões de MT) 1983 1993 2020 Países Subdesenvolvidos 50 89 194 Países Desenvolvidos 88 99 113 China 17 39 89 Sub-Sahara e África 4 5 11 (Delgado et al. 1998)

Como exemplo, a China será necessariamente uma das maiores potencias a aumentar a procura de alimentos, pois o inevitável e previsível aumento do poder de compra determinará esta situação. A produção animal cresce mais que outros sectores da agricultura (FAO, 1996) e paralelamente o uso de cereais na alimentação animal terá de duplicar nos próximos 20 anos. Nos países desenvolvidos 2/3 da produção de cereais é utilizada na produção animal (recurso a sistemas intensivos ou semi-intensivos de produção cuja concentração nutritiva dos alimentos ingeridos é superior a 9,5 Mj/kg MS - matéria seca). Esta situação coloca a necessidade de retirar à alimentação dos poligástricos, parte dos cereais utilizados na sua alimentação, valorizando melhor a biomassa fibrosa disponível e renovável, nomeadamente na produção de carne.

A utilização da erva em cerca de 3,35 biliões de hectares no Mundo, ou seja 2,5 vezes a área destinada à produção de cereais (Seré e Steinfeld, 1996), o uso

Portugal, A. V. RPCV (2002) 97 (542) 63-70

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de resíduos da cultura dos cereais e a utilização de subprodutos, poderá fundamentar a base da alimentação de herbívoros e nomeadamente ruminantes, libertando a pressão sobre o uso de cereais e disponibilizando estes para o aumento das capitações pela população humana nos países em desenvolvimento. Contudo e contrariando esta desejável atitude, mais grão é necessário para a produção animal nos próximos 20 anos com o crescimento da indústria de rações (mais ou menos 1,5% de aumento de grão por ano no consumo animal, Bradford, 1999). Necessariamente que a sustentabilidade dos sistemas responsáveis pela produção de grão terá de se verificar. Há que por outro lado, introduzir esta cultura em outras regiões da Terra.

Acrescente-se que o progressivo aumento do poder de compra nos países em vias de desenvolvimento, aumenta a procura de alimentos de origem animal e determinará o nível de pressão nos mercados. A dieta do Homem é coberta, em média, com 1/6 da energia e 1/3 da proteína ingeridas por alimentos de origem animal. É importante avaliar a contribuição da produção animal para o fornecimento de alimentos, em quantidade e qualidade, para a dieta do Homem no futuro, evitando a fome instalada. Os consumos de leite, carne e ovos variam largamente entre países reflectindo diferenças na capacidade e natureza da produção local de alimentos, nos sistemas de produção animal instalados, na capacidade de compra da população, no rendimento por pessoa (Income) e nos factores educacionais e tradicionais. Acreditamos que o aumento da procura pode ser satisfeito, desde que funcionem mecanismos de distribuição justos, o que necessariamente, face às carências dos países em desenvolvimento, fará renascer outros conceitos para uma nova Ordem Económica e Social. Julgo que o pessimismo manifestado por Brown (1997) será ultrapassado se de facto se verificar um esforço de produção e de eficiência de produção que cubra a procura projectada. No caso animal, três situações se desejarão: Maior out-put por unidade de in-put alimentar; menos animais, mais produto e menos contaminação; menos produção de metano por unidade animal, pela modificação das fermentações retículo-ruminais. Os desafios serão assim: produzir com custos de produção mais baixos e com aumento da eficiência produtiva, assegurando maior competitividade nos mercados dos alimentos de origem animal. A produção animal cresce mais do que os outros sectores da agricultura: 3,4% ano para produtos de origem animal e 2,3% para cereais (FAO, 1996).

Que princípios para o desenvolvimento sustentado da produção animal: eficiência produtiva e sistemas intensivos de produ-ção

Seguramente o aumento da eficiência produtiva animal torna-se uma necessidade e provoca uma determinação: produzir alimentos de origem animal a custos de produção mais baixos, pois estes limitam e marginalizam

a necessidade de aumento da produção (Portugal, 1998). Paga-se, de uma forma geral, ao produtor cerca de 1/3 do preço pago pelo consumidor para aquisição do alimento o que deve conduzir a uma maior transparência nos circuitos produção-distribuição com os agricultores a participarem nos mesmos.

Verificou-se que de 1986 a 1992, na UE dos 12, os preços pagos à produção sofreram a seguinte evolução: a carne de ovinos reduziu-se em 32%; a carne de suínos e bovinos em 24% e no leite a redução do preço ao produtor foi de 35%. Por outro lado, verificou-se: redução do número de explorações; aumento da dimensão das explorações; aumento da produtividade animal; aumento da produtividade Homem; aumento da produtividade ha. Exprime-se assim, a necessidade de aumento de eficiência do sistema produtivo para realizar o esforço desejado de produção controlada. A própria WTO (Organização dos Mercados Mundiais) sente que a eficiência na produção de alimentos saudáveis deve ser baseada na Ciência o que poderá contribuir para a necessidade inquestionável de incrementos da produtividade biológica. Para fazer face às prementes solicitações de alimentos de origem animal há que melhorar a eficiência de produção que por sua vez exigirá, necessariamente, a aplicação de novas aproxi-mações científicas às tecnologias a aplicar (Robinson e McEvoy, 1999).

O aumento da eficiência produtiva (genética, metabó-lica e de maneio) ligar-se-á à redução de custos de produção e à maior competitividade do alimento em mercados abertos. Registe-se que nos últimos 20 anos a produção de carne por animal aumentou três vezes mais do que o número de animais e na produção de leite o aumento duplicou por vaca, reduzindo-se o número de vacas (Cunningham, 1996 b). É factor dominante o crescimento da eficiência mais do que o aumento do número de cabeças animais, reduzindo-se assim, o impacto da produção animal no Ambiente. O criador não ganhará mais, produzindo com mais animais, mas aumentando a eficiência da produção (melhoria no uso de recursos), reduzindo os custos de produção e assegurando a sustentabilidade dos sistemas de produção animal.

Surgirão assim os sistemas intensivos, utilizando alimentos de concentração nutritiva elevada ( > 11,0 Mj/Kg MS) e adoptando métodos de produção que evidenciem maior conversão alimento/produto animal, diluindo, com níveis de produção mais elevados, os encargos com a conservação do animal. Daí surgir a necessidade de produzir alimentos de origem animal recorrendo a sistemas de produção animal intensiva. O recurso a acções biotecnológicas justificarão a fundamentação da sobrevivência dos sistemas intensivos de produção. O uso de promotores da produção (maior eficiência digestiva e manipulação exógena e endógena do metabolismo intermediário) aumentarão a eficiência, baixarão os custos de produção (tornando mais compe-titiva a produção) e reduzirão os efeitos poluidores dos animais, mas exigirão que, recorrendo-se a métodos

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químicos mais exigentes e sofisticados, se faça a pesquisa de novos resíduos ou metabolitos no produto animal a comercializar. Há que acompanhar as “fábricas” de produção animal!

As necessidades de maior eficiência do sistema produtivo, motivadas por se fazer face a margens de segurança mais reduzidas entre preço de alimento ingerido e preço da carne, leite ou ovos, exigem: reduzir “tempos” ou “fases” improdutivas do animal; aumentar a energia retida (ER); diluir os encargos com a manutenção do animal; aumentar e antecipar a intensidade de selecção (identificação dos genes responsáveis por características produtivas, QTL ou económicas, ETL, reduzindo a variação genética). Surgem novos conceitos de melhoramento genético, reduzindo-se as vantagens que resultam da selecção de polimorfismos produtivos, causadoras de variações significativas nos ganhos produtivos PORTUGAL, 1997).

Não esquecer:a) O produto animal elaborado, sua composição

qualitativa e quantitativa e sua estrutura física e molecular caracterizam a sua forma de produção.

b) A modificação das actividades fisiológicas normais e naturais do animal por manipulação do metabolismo por agentes externos e internos, determinam variações na quantidade e qualidade do produto animal.

c) A aceleração de ritmos biológicos de produção permitirá diluir os gastos com a manutenção do animal. Obtém-se mais produto (elaborado e acrescentado), aumenta-se a eficácia produtiva e é-se responsável pela obtenção de um produto animal de qualidade com características diferentes, mas normalizadas (produto massificado).

d) A aplicação conjunta de diferentes agentes promo-tores de aumento da produção, com a finalidade de obtenção de acções metabólicas diversas promovem o aparecimento do produto animal como o Homem o idealiza (exemplo a acção conjunta da hormona de crescimento (GH) e esteróides anabólicos no aumento da proteína muscular e no depósito de gordura suficiente, para melhorar a qualidade).

A evolução da Ciência em Ciência Animal através de novas técnicas reprodutivas, da identificação de mapas genéticos, da clonagem, dos animais transgénicos, das hormonas recombinantes, da imunomodelação e da produção de vários tipos de leite ligados à estrutura da caseina (polimorfismos bioquímicos e outros) perspectivam novos mecanismos de manipulação na produção massal de alimentos, quer por acção no Segmento Filho, quer no Segmento Mãe. Há que avaliar as interacções genótipo/nutrição e facultar orientações adequadas para princípios de selecção a aplicar na criação animal futura.

Procura-se assim identificar quem faz e o que faz. No domínio metabólico deveremos saber: que trajectos metabólicos a seguir e a induzir; que participação dos tecidos e orgãos na definição das necessidades produti-vas; que necessidades nutricionais são colocadas pelo desenvolvimento da embriogenese; que coordenação

neuro-hormonal; que metabolismo intermediário. No domínio genético exige-se conhecer: a visão conjunta do animal e da sua actividade molecular (marcação e caracterização do DNA - ácido desoxiribonucleico); a identificação de polimorfismos e de genes maiores; a aplicação da selecção assistida por marcadores (MAS), usando micro-satélites, fragmentos de restrição do DNA e outras técnicas de identificação e partição do DNA. Ter-se-á que melhorar o conhecimento de como os nutrientes da dieta promovem a expressão de genes para características produtivas chave (interacção ambiente/genoma) e que orientações se devem aplicar na selecção animal. Pode verificar-se no domínio reprodutivo, a redução do declínio da fertilidade pela identificação, em programas de selecção, utilizando marcadores genéticos (Darwash et al., 1999) e pela aplicação de novas técnicas reprodutivas. No domínio produtivo é indispensável reduzir os períodos improdu-tivos do animal e promover o Bem Estar Animal.

É ainda cedo para definir ritmos de sucesso e custos previsíveis com a aplicação de Novas Tecnologias, nomeadamente reprodutivas, mas seguramente temos de estar atentos à sua evolução no século XXI, à entrada do novo Milénio, com o aprofundar da Ciência. A consolidação do conhecimento e da prática em novas técnicas reprodutivas (captação, sucção e maturação de ovocitos, fertilização in vitro, transferência embrionária, clonagem e multiplicação de animais transgénicos), estarão na base da aplicação da engenharia genética e de mecanismos reforçadores da uniformidade na resposta animal. Deseja-se contudo que a diversidade animal se mantenha e se reforce.

A produção de proteínas bio-activas e de produtos farmacêuticos e dietéticos, converterão em alguns casos produtivos, a glândula mamária de ruminantes em bio-reactores, por forma a “curarem” o Homem e os animais de doenças (por exemplo, produção de vários tipos de proteínas do leite). A transferência nuclear a partir de células cultivadas e o aparecimento de animais transgénicos são novas oportunidades em criação animal a exigirem novos conceitos de cobertura das necessidades nutricionais do animal. Willmut et al., 1997 afirmam que estas novas tecnologias abrem uma nova era na criação animal, mas necessariamente vão passar anos antes que se tornem em aceitáveis técnicas para serem exploradas rotineiramente. O desenvolvimento da Biologia Molecular claramente beneficia a exibição da produtividade, da eficiência e da saúde em produção animal (Cunningham, 1999). As aplicações biotecnológicas são previsíveis, ultrapassada a fase actual de ainda fraca expressão biológica, dos custos com o seu uso e dos aspectos éticos colocados pela sua aplicação, considerando a individualidade e integridade do animal e a aceitabilidade pelo consu-midor.

Em síntese, e como consequência do que atrás se apresenta, o aumento da eficiência produtiva condu- zirá a:

a) Reduzir a poluição (o animal é um potencial

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agressor do equilíbrio ecológico e do meio ambiente).b) Usar fontes não tradicionais na alimentação animal,

pelo processamento, conversão e utilização da biomassa disponível.

c) Potencializar os mecanismos digestivos pelo recurso à manipulação dos fenómenos biológicos (microbianos e outros) que decorrem no trato digestivo, optimizando a relação proteína/energia (P/E) absorvida.

d) Equilibrar a nível metabólico a eficiência da conversão da energia metabolizável (EM) em energia retida (ER).

e) Recorrer aos animais indicados (adaptados) aos objectivos dos diversos sistemas de produção.

Assim a produção intensiva manipulável vai ao encontro da necessidade do mercado que exige alimento de qualidade a preços mais compatíveis com a capacidade de compra da maioria dos consumidores.

Sistemas naturais de produção animal: sistemas extensivos de produção animal

O aumento continuado da eficiência de produção, optimizando a resposta biológica, conduz o animal a ser explorado em sistemas intensivos que justificarão em grande parte o esforço de produção exigido para combater a Fome no Mundo. A massificação e estan-dardização da produção não explora características diversas do produto, carne ou leite. Pretende ir ao encontro de necessidades de produção, face às pressões de procura nos mercados.

A base do desenvolvimento de sistemas naturais e locais de produção, procurará e exigirá outra atitude produtiva (orientação e melhoramento) que explore a riqueza da biodiversidade e as características genuínas do produto animal. Estes sistemas são outra forma de produzir alimentos de origem animal, aproveitando recursos disponíveis e adaptados a diversas e, mesmo marginais, condições de produção.

A produção natural, em sistemas extensivos de produção animal, justifica-se por:

a) Ser a única forma desejável para o uso do solo (produção de erva).

b) Evitar a desertificação.c) Animar e diversificar a paisagem rural.d) Estimular e defender a Biodiversidade Biológica.e) Enriquecer com produtos tradicionais, o Património

Histórico, Cultural e Social.São produtos que enriquecem o MEIO RURAL e

promovem o seu desenvolvimento.Os sistemas naturais e locais de produção animal

exigem:a) Análise de sistemas de produção instalados, com

avaliação de parâmetros produtivos, reprodutivos, epidemiológicos e genéticos em populações animais adaptadas.

b) Caracterização da diversidade genética.c) Adaptabilidade metabólica e reprodutiva de

genotipos e populações a sistemas de alimentação descontínua e situações cíclicas de escassez alimentar.

d) Produção em áreas marginais, por recurso à silvo-pastorícia e uso do ecossistema florestal.

e) Fixação das características genuínas do produto animal.

f) Não intervenção do Homem, manipulando a biologia dos sistemas de produção.

A produção animal sustentável, utiliza recursos naturais renováveis a ritmos mais baixos do que aqueles que são responsáveis pela sua produção contínua.

O aumento da eficiência biológica enquadrar-se-á em operações naturais que nunca ponham em causa as características do produto final que se deve registar e certificar. Exige-se que não se altere a composição bioquímica, a organização tecidual e os “flavores” do produto final. Procuram-se ritmos de produção mais lentos para defender as características do produto final, permitindo que o grau de deposição se adapte a um metabolismo intermediário característico de condições herdadas e naturais de exploração. A célula, o tecido e os orgãos não são inundados, na unidade tempo, por metabolitos e nutrientes, o que pressupõe acções e rendimentos diversos (Mitchel, 1964). No caso da carne a sua qualidade depende do: ritmo de crescimento; ritmo de “turnover” metabólico; ritmo de deposição dos componentes do aumento de peso (onde, quando, o quê?); efeitos residuais da ingestão de alimentos; condições impostas pelo abate e tratamento da carcaça após abate para comercializar a carne.

Um sistema deste tipo a aplicar na produção de ruminantes deve procurar:

a) Ser economicamente rentável e só deve receber apoios quando justificável nomeadamente se integrado numa estratégia de desenvolvimento local e em progra-mas locais de produção.

b) Manter o equilíbrio entre quantidade desperdiçada pelo animal e capacidade de uma área de produção vegetal suportar a poluição que esses efluentes provo-cam.

c) Dimensionar a capacidade do sistema de produção animal à capacidade vegetal dessa área (produção de alimentos a converter).

d) Não competir com o Homem, suínos e aves para uso de recursos alimentares menos fibrosos.

Sente-se que estes sistemas de produção natural serão outras formas de produzir o mesmo produto. São sistemas necessariamente mais dispendiosos biologicamente pelo facto dos níveis de produção unitária diluírem com mais dificuldade os encargos com a manutenção do animal. Os efeitos, animal e alimento, conjugam-se para fixar a origem do produto, gerando em sua volta a organização que discipline e garanta a produção da diferença que justifica a certificação.

São sistemas de produção animal dirigidos a “nichos” de consumidores disponíveis para pagarem o produto a preços mais elevados. Valorizam-se como uma mais valia, em termos comparativos, para a utilização de recursos locais. A sua base de produção é a genuidade do produto ou as suas características a valorizar, no produto fresco, conservado ou industrializado. Defendem-se as

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características próprias, pois qualidade terá de ter tudo o que se comercializa. É a assunção de que se pode produzir o mesmo produto de formas diferentes. Há que valorizar tais situações.

A produção natural deve, com o apoio da Ciência, desenvolver tecnologias de produção que maximizem a utilização dos recursos locais disponíveis. Exige a colheita permanente de informação produtiva para:

a) Orientar a selecção conjugando os interesses do binómio Mãe/Filho adaptado às limitações de uso de recursos forrageiros locais.

b) Dimensionar a produção possível, enquadrada nos recursos renováveis do Meio.

c) Melhorar a produção (melhoramento produtivo), sem afectar as características do produto final.

d) Avaliar alternativas à produção natural, com base na raça local, nos recursos disponíveis e no valor comercial de sistemas alternativos (uso de cruzamentos e outros).

e) Fixar sistemas locais de produção animal.Os aspectos do melhoramento produtivo, responsáveis

pelo aumento da eficiência devem procurar não afectar as características do produto final.

No Segmento Mãe há que considerar o tamanho e peso da fêmea, a capacidade leiteira, a fertilidade (encurtando períodos improdutivos), a fixação de épocas de parição, a ligação das necessidades nutricionais da Mãe aos recursos forrageiros sazonais, a renovação dos efectivos (considerando a Mãe como potencial produtora de carne de qualidade), a dimensão do quantitativo Mãe e as exigências da cria e recria.

No Segmento Filho há que considerar o ritmo de crescimento, o peso ideal de abate (evitar períodos descontínuos do desenvolvimento corporal), o grau de acabamento, (considerando peso de abate/idade, por forma a maximizar o valor da carne e o rendimento da carcaça), o peso ideal zootécnico, (que melhor dilua os encargos com a manutenção do animal e o abastecimento, ao longo do ano, de carne certificada). Considere-se que os ritmos mais lentos de produção favorecem as características da carne ou seja o produto final.

Não esquecer por outro lado, quando da selecção, que filhos mais pesados, gerarão no tempo, mães mais pesadas, o que pode originar outros custos de produção para a manutenção do Segmento Mãe. O custo de produção do Segmento Mãe reflecte-se no custo da cadeia de produção e é factor determinante da eficiência e rentabilidade dos sistemas de produção de carne bovina (Archer et al., 1999). O trinómio Mãe/Filho/Meio determinarão a produtividade desejada e os esquemas de produção a adoptar.

Os sistemas locais de produção animal são outra forma de produzir. A oferta dos produtos resultantes destes sistemas terá de ser entendida como uma oferta limitada, por limitações da capacidade de produção. Nestas circunstâncias não é a procura do produto que dimensiona a produção, mas a capacidade de oferta,

identificada como capacidade limitada de produção distinguida e diferente. A tentativa para produzir mais por animal, nestas circunstâncias de produção, terá de ser sempre controlada pela observação da sua influência nas características do produto final.

Surge assim a defesa e a potencialização da criação de raças nacionais e locais, ligadas a sistemas de produção próprios. O Sul da Europa é rico nestas circunstâncias de produção e poderá, mais objectivamente, defender e apoiar, por políticas governamentais dirigidas, o desenvolvimento da Pecuária Natural. Para isso é necessário a responsabilização das Associações de Criadores de Animais para produtos com certificação de origem e baseados em raças nacionais e sistemas naturais de produção.

A qualidade do produto final ou seja a defesa das suas características próprias (composição química e organização tecidual) deve ser objectivo primário, orientando o melhoramento dos sistemas de produção. A aplicação de técnicas que melhorem a produtividade (de origem genética, nutricional, metabólica e produtiva) devem considerar o reflexo delas nas características do produto final, por forma a se determinar, se se adopta o melhoramento introduzido, ou se se elimina o mesmo. Não há que introduzir nestes sistemas de produção a mesma filosofia tecnológica que se segue nos sistemas intensivos de produção.

Complementaridade dos dois sistemas de produção animal: intensivo e natural

Há necessidade de produzir alimentos de origem animal de formas diversas apelando à capacidade de escolha do consumidor.

Os sistemas de produção animal, intensivo e natural, não são sistemas de produção competitivos, mas sim diferentes e complementares a exigirem organização, clareza de doutrina, actuação e vigilância. Identificam e rastreiam, em todas as circunstâncias, as origens do produto (forma de produzir e a partir do quê). Ao consumidor deve ser garantida a verdade do que se etiqueta e vende, informando-o assim da forma de produzir. Há que procurar em todas as circunstâncias a formação da opinião do consumidor, que tem de ser esclarecido para que faça a sua opção de compra em mercados que apresentam diversas formas de produzir o mesmo produto, sempre com segurança para a saúde do consumidor. Aqui está a riqueza dos sistemas de produção a adoptar.

Devem ter a preocupação permanente de estudar em pormenor a relação causa/efeito, procurando alargar o conhecimento, aplicar novas tecnologias, gerar informação e contribuir para a formação de opinião do consumidor (Portugal, 1997). Há que medir como o Consumidor reage à inovação e prever como se irá alimentar nos próximos cinquenta anos.

Por outro lado há que considerar sempre:

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a) A análise de reacções da estrutura produtiva e sociológica à modificação de novas tecnologias de produção (inovação e modernização).

b) A avaliação do impacto das medidas tecnológicas adoptadas no curto, médio e longo prazo.

c) A posição do Consumidor face a novos desafios à Investigação e Desenvolvimento em produção animal.

Saibamos defender os dois sistemas de produção, tornando a produção animal competitiva e complementar, evitando a redução do esforço de produção e promovendo a comercialização e etiquetagem de produtos registados e certificados.

Os desafios são produzir de forma diferente, produzir com competitividade, oferecer alimentos de caracterís-ticas diferentes, defender a natureza do que se etiqueta (o que é e como foi produzido), saber comercializar (fazer marketing), mas sempre saber produzir.

É necessário o controlo da forma de produzir de molde a identificar, em todas as circunstâncias, o produto que se comercializa. O avanço do Conhecimento permite conhecer o que se vende, a sua origem (a origem do DNA e portanto traçabilidade) e a existência ou não de resíduos ou metabolitos indesejáveis. Em extractos do produto pode-se conhecer a história da produção, criando serviços que controlem, no mercado, a coabitação desejável de alimentos de origem animal, obtidos de formas diversas, potencializando assim a utilização de raças autóctones ou locais.

Viveremos uma época (próximo século) em que na etiqueta do produto animal a comercializar se dirá da forma como este se obteve, o que pressupõe a montagem de um sistema de controlo bem organizado e apoiado por meios que acompanhem o sistema de produção e a identidade do que se produz.

O Futuro da produção animal

Cunningham (1996 b) interrogava-se recentemente sobre a capacidade do planeta em alimentar o dobro da população presente nos próximos 50 anos, de produzir alimento suficiente, de facultar espaço terra para suportar uma qualidade de vida distinguida do Homem, sem sobrecarregar e destruir o Ambiente e permitir ao Homem sobreviver, face a inquietações e ao stress.

O esforço de produção e o aumento da eficiência da produção maximizando a resposta biológica do animal, sem afectar o seu Bem Estar, exigem que a exploração dos animais se transforme em indústria animal. Esta a principal via para o desafio que se coloca. Com esta via coabitam os sistemas de produção natural que optimizam recursos locais próprios e são responsáveis pela genuidade das características dos alimentos. Assim a produção de alimentos de origem animal terá duas origens diferenciadas, ocupando espaços de produção próprios (ver Quadro 3).

A evolução residirá na coabitação entre os dois sistemas de produção animal que são diferentes, mas

complementares e a necessitarem de ser regulamentados, organizados, controlados e defendidos, nomeadamente os ligados à produção natural que o próprio Estado apoiará para evitar a desertificação do Meio Rural, fomentando a diversidade e a riqueza da paisagem rural.

Quadro 3

Quadro 4

Saibamos defender as duas opções de produção animal, justificando a evolução da Ciência e indo ao encontro de novos desafios tecnológicos. A produção animal distribuir-se-á pela Indústria e pela Arte em que se baseiam os sistemas de produção animal invocados. Os modelos ou sistemas de produção animal a aplicar localmente, traduzindo os incentivos específicos que definam a política de produção animal a adoptar,

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complementarão a forma de se atacar o esforço de produção solicitado.

A evolução, marcada pela Ciência, procurará que em todos os sistemas de produção animal se cumpram as exigências sinteticamente expressas no Quadro 4.

O Futuro inscreve-se no domínio da identificação e expressão do DNA, procurando assentar o melhoramento genético na selecção assistida por marcadores (MAS). O termo de marcador responsável por expressões fenotípicas orientará o ganho genético, o mérito genético e a intensidade de selecção quer no Segmento Filho quer no Segmento Mãe, optimizando a eficiência biológica em termos unitários e comparativos. O Futuro inscreve-se assim no domínio da molécula dominando a produção animal intensiva, massal e estandardizada, sem isolar o animal da sua integração nos sistemas agrícolas, nomeadamente sistemas locais de produção que usam recursos locais, alimentos de produção local e animais de raças autóctones. O futuro seguirá a evolução traduzida na passagem do animal modelo ao animal molécula.

A genética, a nutrição e a reprodução animais assumi-rão desempenhos fundamentais na marcação do futuro da indústria animal, evitando a doença, aumentando a produtividade, orientando as características e sistemas de produção, exprimindo a expressão da manipulação pelo Homem e acelerando o ritmo e intensidade de selecção. O desvendar e o utilizar a informação do DNA assumirão um papel essencial na marcação do tipo e ritmo da Produção Animal no futuro. O recurso à selecção utilizando marcadores (MAS) prosseguirá o trajecto da evolução e a formação científica nos domínios da estrutura e genética molecular, desenvolvendo novas aproximações no tratamento biomatemático dos dados obtidos.

A nutrição e a alimentação procurarão aumentar a eficiência da utilização digestiva, através de agentes microbianos modificados (agentes probióticos) ou enzimas sintetizadas. A nível metabólico a neutralização de hormonas frenadoras da expressão de outras, a presença de princípios activos e locais responsáveis por maiores níveis de produção e o predomínio de trajectos metabólicos de síntese, alargarão a expressão da produção animal. Torna-se desejável reduzir a síntese de compostos ou metabolitos indesejáveis caso colesterol, ácidos gordos saturados (AGS) e aumentar a de metabolitos desejáveis como os ácidos gordos insaturados (AGI – familias linoleica e linolénica), conjugados do ácido linoleico (CLA) e formas trans dos ácidos gordos (TFA). Contudo não deveremos esquecer que será a relação entre compostos desejáveis e indesejáveis que marcará o melhor conhecimento das acções, às vezes indevidamente atribuídas exclusi-vamente a metabolitos específicos. A Ciência marcará a indústria animal (Produção Massal) e defenderá a produção natural (produtos genuínos com características específicas), tomando atitudes diversas, em função do que se produz e se procura em mercados abertos. Ao Consumidor, a ser esclarecido, deixa-se a capacidade de

escolha, face à diversidade de oferta. Passamos ao Século em que os mecanismos de controlo e traçabilidade evoluirão e o uso de métodos moleculares avançados permitirá estabelecer ou confirmar a genuidade do alimento de origem animal, defendendo a escolha do Consumidor. Há que fazer coabitar diversificados mecanismos de produção, que se complementam e dirigem a várias naturezas de consumo (formas diferentes de oferta). O controlo da sua origem é essencial ao sucesso das iniciativas de produção. A construção da Animalicultura do Futuro, enraizada nos alicerces da Ciência, justificará e fundamentará a evolução. No fundo há que: Produzir com competitividade; Produzir de formas diferentes; Oferecer alimentos de características diversas; Defender a natureza do que se etiqueta e vende e por outro lado saber comercializar. Mas acima de tudo e em todas as circunstâncias há que saber produzir (Vaz Portugal, 1999).

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Resumo: O uso de métodos de detecção de ATP tem sido proposto em alternativa ao de métodos microbiológicos para fazer a monitorização rápida da higiene das superfícies, necessária nos planos HACCP. Fez-se um estudo para validar a utilização de um método comercial na monitorização do estado de higiene de superfícies, na produção e recolha de leite cru de bovino, integrada num plano de HACCP. Pretendeu-se, também explorar o potencial para utilização na área da higiene alimentar, de uma metodologia usada correntemente na avaliação e interpretação de métodos de ensaio semi-quantitativos em epidemiologia clínica. Estudaram-se: a precisão (repetibilidade e reprodutibilidade), a exactidão (quer através de um modelo de regressão linear, quer pela determinação da sensibilidade e da especicidade relativas) e a sensibilidade do método para fazer a detecção de matéria orgânica e de microrganismos. Como resultado, obtiveram-se valores para o limite de negatividade e para o limite de positividade dos resultados do método, que foram xados em 85 RLU e 110 RLU, respectivamente. Concluiu-se que, este método pode ser útil para a monitorização de pontos críticos em planos HACCP relacionados com a higiene de camiões cisterna utilizados na recolha de leite cru. Propõem-se estratégias para o tratamento dos resultados de monitorização da luminometria ATP, úteis em actividades de vericação de planos HACCP. Os autores concluem que, a realização de contagens de bactérias em superfícies com métodos da microbiologia tradicional, não pode ser substituída pela luminometria ATP, continuando a primeira a ser necessária em actividades de vericação e auditoria nos planos HACCP.

Summary: ATP detection methods have been proposed as an alternative to microbial methods for monitoring the hygienic status of surfaces, in the frame of HACCP plans. A commercial method was evaluated and validation studies were carried out to assess its utility as a possible monitoring method for the hygiene of surfaces in the raw milk process. The authors have studied the reliability and accuracy of the method and its sensitivity to detect diluted milk and microorganisms. They propose values to positive/negative cut-off of the results in this paper. The authors concluded that this method can be useful for monitoring activities of critical control points. However, methods based in the traditional microbiology can not be replaced, for the purposes of verication activities, due to an inadequate sensitivity threshold of the ATP method. They also considered the possible use as an auxiliary tool in verication activities on HACCP and make some

recommendations of its utilisation. The methodology proposed for the validation can be extended to validation activities concerning semi-quantitative assay methods.

Introdução

Para a implementação de planos HACCP é necessário dispor de métodos de ensaio capazes de fornecer uma resposta rápida, quer nas actividades de monitorização quer nas de verificação (CAC, 1997). No entanto, a Comissão do Codex Alimentarius (CAC, 1997) exige que, os métodos a utilizar em actividades de monitorização e de verificação, sejam validados previamente com a finalidade de se avaliar a sua capacidade para realizar os ns pretendidos. Não deve ser confundida a validação de um método de ensaio, para a qual existem na maior parte dos casos normas próprias e que é habitualmente conada a laboratórios de referência nacionais ou internacionais, com a validação do plano HACCP requerida pelo CAC (1997), claricada posteriormente quanto à acepção e metodologia (ILSI, 1999). Neste, a validação consiste no conjunto das actividades que a empresa deve levar a cabo para demonstrar que os elementos do plano HACCP são ecazes. A aplicação deste conceito aos métodos de ensaio que será preciso utilizar para implementar os planos HACCP, faz-se através de uma validação interna do método e destina-se a demonstrar a sua ecácia nas condições de trabalho próprias de cada empresa.

O uso de métodos de detecção de ATP tem sido proposto em alternativa ao de métodos microbiológicos para fazer a monitorização da higiene das superfícies (Griffith et al., 1994), pela rapidez da resposta, abilidade e facilidade de utilização, tudo isto com custos aceitáveis relativamente a outros métodos. Numa publicação sobre a aplicação de técnicas de detecção de ATP na avaliação da higiene em cisternas de transporte de leite Bell et al. (1994) e Stallard (1995) concluem que esta técnica pode ser utilizada ecazmente para

Validação interna de um método de ensaio baseado em ATP para a monitorização da higiene de superfícies de aço inox na indústria dos lacticínios.

Internal validation of an ATP assay method for hygiene monitoring of inox surfaces in the dairy industry.

J. Niza Ribeiro1*, J. Cerqueira1, P. Santos1 A. Louzã2

1 Laboratório de Sanidade Animal – Agros, R. Recarei, s/n, 44566 S. Mamede Infesta2 CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, UTL, R. Prof. Cid dos Santos 1300-477 Lisboa.

*Correspondente: [email protected]

RPCV (2002) 97 (542) 71-80 R E V I S T A P O R T U G U E S ADE


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monitorizar a eciência da limpeza das cisternas de transporte de leite. Quando um método com resposta quantitativa tem precisão e ou sensibilidade insucientes é usado, habitualmente, como um método qualitativo, interpretando-se os seus resultados em dois ou três níveis: positivo e negativo ou positivo, duvidoso e negativo. No entanto, em métodos como o que se estudou neste trabalho, pode-se tirar partido da sua capacidade de quantificação que, embora limitada, permite um aproveitamento que vai para além do simples positivo ou negativo. Isso é possível calculando as razões de verosimilhança positiva e negativa que, permitem associar a intensidade da resposta, num ensaio, à probabilidade de a amostra ser positiva ou negativa.

Não se encontram, coligidas num só guia, metodolo-gias para a avaliação de desempenho de testes comerciais que, permitam a sua validação nas condições acima referidas. Existem guias de orientação para a validação de métodos internos de ensaio em análise química (Relacre, 2000) ou microbiológica (Microval, 1997). Os métodos para detecção de ATP comercializados, no entanto, não se enquadram em nenhuma das categorias anteriores. No presente trabalho, os autores procedem à validação interna de um método comercializado para a detecção de ATP em superfícies, combinando a metodologia usada na validação interna de métodos quantitativos com a metodologia utilizada para a interpretação de resultados laboratoriais em medicina, de forma a validar o método para a sua utilização na monitorização de PCC, em camiões cisterna utilizados na recolha de leite cru. Testou-se um sistema comercial para leitura de luminometria ATP, comercializado pela firma Celsis-Lumac, para fazer a monitorização de higiene de superfícies.

Pretendeu-se neste trabalho, propor uma abordagem para a validação interna de métodos de ensaio com resposta semi-quantitativa, isto é, métodos cujos resultados permitem uma interpretação mais na do que o simples “pass-fail”, sem serem quantitativos. O procedimento assenta na avaliação de quatro itens principais: 1) a determinação dos valores limite, 2) o cálculo de parâmetros de exactidão, 3) o cálculo de parâmetros de precisão e 4) o cálculo de parâmetros para apoio à interpretação dos resultados.

Para clareza da exposição, apresentam-se seguida-mente as denições dos conceitos mais importantes utilizados de acordo com Anónimo (1997), Anónimo (1998) e Smith (1995). O limite de negatividade, é o valor máximo do resultado que corresponde a uma superfície limpa. O limite de positividade, é o valor mínimo do resultado que corresponde a uma superfície suja. O limite de detecção, é a menor quantidade do analito que o método é capaz de detectar. O limite de quanticação, é a menor quantidade do analito que o método é capaz de detectar em condições conhecidas e consideradas admissíveis de precisão e de exactidão. Entende-se por exactidão a aproximação entre o valor do resultado e o valor verdadeiro, de um analito

contido na amostra. No caso de um método qualitativo, a interpretação deste conceito assume uma forma particular. A exactidão de um método qualitativo, é dada pela proporção de resultados correctos nos resultados obtidos, numa série de ensaios. A especicidade relativa é entendida como a capacidade de um método para detectar amostras negativas no universo das amostras negativas. A sensibilidade relativa, é capacidade de um método qualitativo para dar resultados positivos no universo das amostras positivas. Entende-se por precisão, a aproximação entre resultados de ensaios independentes, realizados com fracções de uma amostra homogénea. A repetibilidade e a reprodutibilidade são medidas de precisão. Repetibilidade, é a aproximação de resultados de ensaios sucessivos de uma amostra, efectuados nas mesmas condições de medição. Repro-dutibilidade é a aproximação entre os resultados de ensaios de uma amostra com alteração de uma ou mais condições de medição, por exemplo o momento, o operador, o laboratório.

Material e métodos

Para proceder à validação interna da capacidade de um método comercial, da marca Celsis Lumac systemSURE, relativamente à sua capacidade de detecção de ATP leite cru, conduziram-se quatro protocolos experimentais diferentes. Utilizou-se o equipamento portátil e as zaragatoas da referida marca. Os ensaios de determinação de ATP executaram-se de acordo com as instruções do fabricante e a contagem de células somáticas e de microrganismos totais nas amostras de leite cru utilizadas foi feita em equipamentos de contagem automática da marca Foss ®, respectivamente Fossomatic e Bactoscan.

Para determinação dos limites de positividade e de negatividade do método, zeram-se 132 ensaios em diferentes superfícies de aço inoxidável, designadamente: tampas de câmaras de camiões cisterna utilizados no transporte de leite, tampos de bancadas de laboratório e superfícies de autoclave. Escolheram-se sempre superfícies visualmente limpas e, no caso dos camiões, foram utilizados sempre camiões lavados. Fizeram-se quatro ensaios consecutivos, sobre uma área de 100 cm2 com a limpeza da superfície entre cada ensaio, do seguinte modo: (1) passou-se a zaragatoa sobre a superfície delimitada, aparentemente limpa; (2) lavou-se depois, a superfície, com um produto de limpeza abrasivo e passou-se uma nova zaragatoa; (3) a seguir, esfregou-se a superfície com álcool e, após chamejamento, passou-se a terceira zaragatoa; (4) repetiu-se o terceiro passo e passou-se a última zaragatoa. Foram feitas, pelo mesmo operador, 33 séries de ensaios, com os 4 passos cada, em superfícies diferentes. Pretendeu-se com este protocolo determinar o limite de negatividade e o limite de positividade do método e conhecer a gama de variação dos resultados, numa superfície limpa. Calculou-se o limite de negatividade através da fórmula x+1,66s

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assumindo t(0,05, n=66), em que, x é a média e s é o desvio padrão e o limite de positividade através da fórmula x-3,1s assumindo t(0,001, n=66). A Tabela 1 apresenta os resultados desta experiência. Parte destes resultados serviu também para o cálculo da especicidade relativa (Esp) do método (Tabela 5). Estes resultados permitiram ainda, avaliar a possibilidade de haver interferências dos diferentes tipos de acabamento das superfícies utilizadas, nos resultados do método (Tabela 6).

Para determinação do limite de detecção de leite cru diluído em água, obtiveram-se 3 amostras de leite cru que se designaram por amostra A, B e C na Tabela 2. As amostras foram diluídas em solução de Ringer a 10%, 2%, 1,3%, 1%,e 0,2%. Espalhou-se 1 ml de leite cru em natureza e 1 ml de cada uma destas diluições, em superfícies de aço inox com 100 cm2, previamente limpas e desinfectadas. Os ensaios para detecção de ATP foram todos realizados pelo mesmo operador. Cada diluição foi ensaiada em duplicado. Fizeram-se também ensaios duplicados com solução de Ringer como controlo e ensaios a branco. Realizaram-se 48 ensaios no total. Os resultados desta experiência constam da Tabela 2. Trataram-se os logaritmos decimais dos resultados através de correlação e regressão linear, avaliando-se neste caso a variação da intensidade da resposta, em RLU, em função da variação da diluição (Tabela 4). Pretendeu-se, com este protocolo, determinar o limite de detecção do método para leite diluído em água, calcular a sua sensibilidade relativa (Se) (Tabela 5) e, ainda, determinar os seus valores de repetibilidade e reprodutibilidade, em superfícies de aço inox (Figura 2).

Para estudar o limite de detecção relativamente a microrganimos, seleccionaram-se uma estirpe de Escherichia coli e outra de Pseudomonas spp., isoladas a partir de amostras de leite cru provenientes do leite de tanques de refrigeração. Partindo de suspensões puras e muito concentradas de E. coli e de Pseudomonas spp., efectuaram-se diluições sucessivas, de base 10, em solução de Ringer até à diluição 10-4. Quanticaram-se os microrganismos presentes na suspensão mãe e nas diluições, de acordo com as NP - 1995 (1982) e NP - 2079 (1989) e exprimiram-se os resultados em unidades formadoras de colónias por mililitro (ufc ml-1). Fizeram-se 5 ensaios de cada diluição, tendo-se medido directamente na cuvete de reacção 50 µl da suspensão, para quanticação do ATP presente. Desta forma, eliminou-se dos resultados, a possibilidade de haver interferências devidas às superfícies utilizadas. Exprimiram-se os resultados em Unidades Relativas de Luz (RLU). Contou-se também, o número de ufc das estirpes presentes nos 50 µl de suspensão usados para cada ensaio (Tabela 3). Calcularam-se os logaritmos decimais destes resultados para determinar a correlação e regressão linear e, deste modo, determinar o limite de detecção do método relativamente a alguns micror-ganismos com importância na higiene dos alimentos (E. coli) e na tecnologia do leite cru (Pseudomonas spp.). Os ensaios foram realizados pelo mesmo operador e,

por isso, utilizaram-se para estimar a repetibilidade (Figura 2, Gráco 2).

Para avaliar o efeito da passagem do tempo sobre o limite de detecção do teste, diluiu-se uma amostra de leite cru em solução de Ringer a 10%; 1% e 0,1%. Espalhou-se 1 ml leite em natureza e 1 ml das restantes diluições numa superfície de 100 cm2, previamente limpa que foram ensaiadas em duplicado. Cada diluição, foi distribuída em quatro quadrados para ser ensaiada em diferentes momentos, designados 0, 10, 100 e 1000 de acordo com o tempo, em minutos, que decorreu entre o espalhamento das amostras e a realização dos ensaios. Fizeram-se duas experiências com 32 ensaios cada seguindo matriz, em dias diferentes, totalizando 64 ensaios. Estes foram sempre executados pelo mesmo operador. Pretendeu-se assim, vericar a existência de um possível efeito de interferência do tempo sobre os resultados (Figura 1). Estes resultados serviram ainda para estimar a reprodutibilidade do método (Figura 2, Gráco 1).

Para além da metodologia estatística já referida, utilizou-se o coeciente de variação expresso em per-centagem, CV (%), para fazer o cálculo da repetibilidade e da reprodutibilidade do método. Para o estudo do comportamento operacional do teste calcularam-se a sensibilidade (Se = resultados verdadeiro positivos / total de ensaios positivos) e a especicidade relativas (Esp = resultados verdadeiro negativos / total de ensaios negativos). Calculou-se a exactidão da seguinte forma: (Exactidão = ((resultados verdadeiro positivos)+(resultados verdadeiro negativos)) / total de ensaios realizados). A razão de verosimilhança positiva (RVP = Se/1-Esp), a razão de verosimilhança negativa (RVN = 1-Se/Esp). O software de apoio utilizado para cálculo da correlação e das rectas de regressão, foi o Statistica versão 5.5, 99.

Figura 1 – Resultados da experiência feita para avaliar o efeito da passagem do tempo sobre os resultados de uma mesma amostra, expressos em RLU. As amostra foram diluídas, sucessivamente em 4 diluições de base 10. São apresentadas na Tabela por debaixo do Gráco, os resultados da média dos dois ensaios realizados para cada diluição nos diferentes momentos. É perceptível a pouca interferência que o tempo tem na capacidade do método para detectar matéria orgânica.


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Resultados

A Tabela 1, apresenta os resultados dos ensaios realizados para determinar o limites de positividade e de negatividade, expressos em RLU. No fundo da Tabela estão calculados, a média e o intervalo de conança respectivo, o desvio padrão e o número de ensaios realizados para cada passo. Cada passo representa um estado de limpeza progressivamente maior. Procedeu-se ao cálculo do limite de positividade e de negatividade do método a validar, tratando os resultados constantes da Tabela 1, primeiramente através do método ANOVA. Vericaram-se diferenças signicativas entre os passos 1 a 4 (PFc < 0,001). A comparação posterior dos passos dois a dois, através do teste t-Student, mostrou que asdiferenças entre os passos 1, 2 e 3 são signicativas (Ptα< 0,05) mas as diferenças entre os passos 3 e 4 não são signicativas entre si (Ptα> 0,05). Ficou assimestabelecido que os resultados obtidos nos passos 3 e 4

Tabela 1 – Determinação dos limites de positividade e de negatividade do método.

Nº da coluna (1) (2) (3) (4) (5) Local Visualmente Após limpeza Após 1ª limpeza Após 2ª limpeza Após lim-peza limpa com abrasivo com álcool com álcool com álcool Passo 1 Passo 2 Passo 3 Passo 4 Passos 3 e 4 Tampa 53 23 7 5 — Tampa 32 71 41 60 — Tampa 8 26 13 10 — Tampa 14 25 10 6 — Tampa 61 38 90 40 — Tampa 14 33 47 34 — Tampa 29 74 79 53 — Tampa 98 37 17 24 — Tampa 60 59 35 40 — Tampa 200 78 50 19 — Tampa 176 58 40 42 — Tampa 300 205 102 88 — Tampa 148 150 12 49 — Tampa 95 150 97 51 — Tampa 56 76 55 31 — Tampa 138 122 75 29 — Tampa 94 84 73 55 — Tampa 38 20 37 32 — Tampa 120 191 102 19 — Tampa 82 70 45 44 — Tampa 53 58 31 25 — Bancada 9 81 17 28 — Bancada 173 2 20 30 — Bancada 62 174 11 22 — Bancada 105 89 26 16 — Bancada 169 25 20 12 — Bancada 63 63 26 21 — Bancada 318 6 16 24 — Bancada 76 19 6 5 — Bancada 256 193 19 10 — Autoclave 81 32 13 9 — Autoclave 149 5 10 12 — Autoclave 37 9 8 8 — Média 102,0 71,1 37,9 28,9 33,4 Desvio Padrão 80,39 58,74 30,13 19,06 25,42 IC 95% 27,43 20,04 10,28 6,50 6,13

Nº ensaios 33 33 33 33 66

correspondem a superfícies totalmente limpas, uma vez que já não é possível reduzir de forma signicativa o valor dos resultados dos ensaios através de uma melhor limpeza das superfícies. Por isso, calculou-se o limite de positividade e o limite de negatividade do método a partir dos resultados dos ensaios dos passos 3 e 4 (n = 66). Partindo da média e desvio padrão dos resultados apresentados na coluna 5 da Tabela 1, o limite de negatividade, foi fixado em 85 RLU e o limite de positividade em 110 RLU.

Os resultados da experiência feita para determinar o limite de detecção e de quanticação do método, usando leite cru, constam da Tabela 2. Nesta, apresentam-se os resultados, em RLU, das amostras de leite A, B e C, testadas em duplicado. Para cada amostra há duas linhas de resultados relativos à duplicação de cada ensaio. Nas colunas da direita, sob a designação “Dados da amostra”, estão os valores das contagens de células somáticas (CCS) e de microrganismos totais (ufc/ml) de cada amostra. Sabendo que o teor do leite cru em células somáticas e microrganismos poderia interferir com os resultados desta experiência, testou-se o seu efeito através de ANOVA, tendo-se vericado que as diferenças não afectaram os resultados da experiência (PFc > 0,2) (Tabela 2). Compararam-se, seguidamente, os resultados de cada uma das diluições, dois a dois, utilizando o teste t-Student. Entre a diluição 0,2%, a solução de Ringer e os valores do branco não se encontraram diferenças signicativas. Compararam-se depois as diluições 2%, 1,3% e 1% com as anteriormente testadas, que serviram de referência negativa. As diferenças encontradas entre as diluições 2%, 1,3% e as referências negativas, foram signicativas (Ptα< 0,05) e a diferença entre a diluição 1% e as referências negativas foi signicativa com (Ptα< 0,1).

Tabela 2 – Determinação da sensibilidade do método para leite cru.

Amostra Diluições (% de leite na solução) Controlos Dados da amostra 100,0%10,0% 2,0% 1,3% 1,0% 0,2% Ringer Branco CCS UFC /mlLeite A (RLU) 844 301 102 77 47 8 21 30 852 29 1221 220 55 64 95 43 44 31 Leite B (RLU) 884 234 144 65 34 20 19 26 901 69,5 1164 225 100 58 20 25 29 22 Leite C (RLU) 1365 208 105 78 53 8 45 10 617 36,5 620 263 33 11 39 27 18 15 Média 1016,3 241,8 89,8 58,8 48,0 21,8 29,3 22,3 — —IC 95% 223,3 27,5 31,7 19,8 20,5 10,6 9,9 6,7 — —

Os resultados da experiência realizada para determinar o limite de detecção e de quantificação do método, usando microrganismos são apresentados na Tabela 3 descriminados para E. coli e Pseudomonas spp. Fizeram-se séries de 5 ensaios por diluição e um ensaio a branco no m de cada série. Cada série corresponde a uma linha da Tabela. Apresenta-se a média, o desvio padrão (DP), o coeciente de variação em percentagem (CV (%)) e o intervalo de conança da média (IC 95%)


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de cada série. Sublinham-se os resultados cuja supressão reduziria o CV, na respectiva diluição, para valores inferiores a 10% e tornaria signicativas as diferenças da média dos resultados. Na coluna da direita encontra-se o valor médio de ufc contado nos 50µl de amostra de cada diluição ensaiada, expresso em log de ufc. Através de ANOVA pode-se comprovar que, existem diferenças significativas nos resultados, devidas à variação da concentração de ufc das estirpes usadas (PFc < 0,001). No caso da E. coli, existem diferenças signicativas (Ptα< 0,05) entre as diluições 10-1 e 10-2, que contêm 10 6,8 e 10 6,1 ufc, respectivamente. No caso da Pseudomonas spp, todas as diluições diferem entre si de forma signicativa (Ptα< 0,01). Verica-se que as diferenças se mantêm signicativas, em ambos os casos, mesmo quando a média dos valores RLU se encontra abaixo do

limite de negatividade calculado anteriormente.Calculou-se a equação de uma recta de regressão linear

com os dados da Tabela 2, onde a variável dependente foi o resultado dos ensaios, em RLU, expressos em função da diluição (variável independente). Vericou-se um excelente ajustamento quer da correlação, quer de R2 ajustado (Tabela 4). Esta equação foi, seguidamente, utilizada para estimar a diluição de leite em água que se obteria, para resultados nos valores limite atrás xados respectivamente 85 e 110 RLU, pela utilização do sistema systemSURE. As diluições de leite no limite de negatividade e no de positividade, obtidas por extrapolação, seriam de cerca de 2,5% e de 3,7% respectivamente. Partindo dos resultados atrás apresentados, julga-se poder xar o limite de positividade nos 110 RLU e o limite de negatividade nos 85 RLU.

Tabela 4 – Cálculo da capacidade de detecção esperada de leite cru diluído e de microrganismos do método em avaliação, por estimativa a partir de modelos de regressão linear.

Produto ensaiado Nº ensaios R R2 ajustado Modelo de regressão linear Detecção esperada (n=36); (n=25) (extrapolação) 85 RLU 110 RLULeite cru 36 0,93 0,87 log(rlu) = 0,66 log (dil) + 2,99 2,5% 3,7% E. coli 25; (20) 0,79; (0,57) 0,62; (0,29) log(rlu) = 0,26 log (cfu) - 0,40 10 8,9 10 9,4

Pseudomonas spp 25; (20) 0,93; (0,96) 0,85; (0,91) log(rlu) = 0,63 log (cfu) - 2,22 10 6,6 10 6,8

Modelos de regressão linear calculados a partir dos resultados das Tabelas 2 e 3, respectivamente para leite cru, E. coli e Pseudomonas spp. Estão descriminados o valor da correlação (R) e de R2 ajustado e o número de amostras utilizado para o cálculo de cada um. Entre parênteses estão os valores dos parâmetros, calculados com supressão dos resultados das suspensões mãe (SM) da Tabela 3. Nas colunas da direita indicam-se as concentrações estimadas de cada material testado, no limite de negatividade (85 RLU) e no limite de positividade (110 RLU), obtida por extrapolação dos modelos.

Tabela 3 – Resultados da experiência realizada para determinação da sensibilidade microbiológica do método.

Espécie Diluição Ensaio Média DP CV (%) IC 95% Log contagem (ufc/50 µl) 1 2 3 4 5 SM 109 88 97 107 99 100,0 8,4 8,4 7,39 7,84 10-1* 14 20 13 12 14 14,6 3,1 21,4 2,74 6,84 10-2 14 6 9 10 10 9,8 2,9 29,2 2,51 6,08 10-3 5 6 22 5 6 8,8 7,4 84,0 6,48 4,86 10-4 4 20 5 4 5 7,6 6,9 91,4 6,09 3,79 Branco 4 7 7 9 7 6,8 1,8 26,3 SM 4896 3955 4745 5083 4488 4633,4 437,3 9,4 383,31 8,55 10-1 168 163 168 146 136 156,2 14,5 9,3 12,68 7,49 10-2 39 34 35 49 68 45,0 14,2 31,5 12,41 6,69 10-3* 18 15 18 20 17 17,6 1,8 10,3 1,59 5,66 10-4 10 10 11 11 10 10,4 0,5 5,3 0,48 4,56 Branco 2 3 7 4 1 3,4 2,3 67,7

E. c

oli

Pseu

dom

onas

spp

Figura 2 – Precisão do método: reprodutibilidade sobre superfícies de aço inox, expressa em percentagem do coeciente de variação (CV%) (Gráfico 1); repetibilidade expressa em percentagem do coeficiente de variação (CV%), ensaiada em superfícies e directamente na couvette (Gráfico 2). Visto que repetibilidade dos resultados positivos é aceitável pensamos que este método pode ser utilizado em actividades de monitorização em planos HACCP.


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Os resultados obtidos numa gama entre estes valores devem ser considerados duvidosos.

Testou-se um modelo de regressão linear simples para os resultados cada espécie onde log de ufc foi a variável independente e o log da resposta em RLU foi dependente. Primeiro testou-se o modelo incluindo a suspensão mãe e as quatro diluições e, depois, testou-se apenas com as quatro diluições, excluindo a suspensão mãe. Os resultados obtidos mostram que o modelo utilizado apenas descreve de forma aceitável a resposta do método no caso de Pseudomonas spp (Tabela 4). Verica-se neste caso que a correlação e o valor de R2 ajustado são superiores aos da E. coli. No caso desta, uma vez suprimidos os resultados da suspensão mãe, os valores da correlação e do R2 ajustado baixam de forma que o modelo de regressão linear já não explica os resultados. Com base na determinação do limite de negatividade das experiências anteriores pode-se estimar, por interpolação a partir do modelo de regressão linear, a quantidade de ufc prováveis para os valores de RLU no limite de negatividade e no limite de positividade (Tabela 4).

A avaliação da precisão do método, requer uma avaliação da sua repetibilidade e reprodutibilidade. Para avaliar a repetibilidade, utilizaram-se os resultados das Tabelas 2 e 3. Determinou-se, separadamente, a repetibilidade dos resultados positivo (≥110 RLU), duvidoso (≥85 e <110 RLU) e negativo (<85 RLU) e a repetibilidade global. O CV(%) médio da repetibilidade, sobe à medida que os valores resultados diminuem (Figura 2, Gráco 2), caso do CV(%) dos ensaios a branco e dos ensaios com resultado negativo. Isto acon-tece devido, ao peso que alguns resultados individuais, discrepantes (sublinhados na Tabela 3), têm sobre o desvio padrão. A repetibilidade média global e por tipo de resultados, do método, foi sempre pior no caso dos ensaios feitos sobre superfícies, o que se explica, em nossa opinião, por variações na quantidade de material da amostra recolhido pela zaragatoa ou devido a irregularidades no espalhamento desta, nas superfícies. Os resultados dos ensaios feitos directamente na cuvete, com microrganismos, apresentaram melhor repetibilidade. O CV(%) dos ensaios com resultados negativos, foi elevado nos ensaios com E. coli. O CV(%)

Tabela 5 - Variação dos parâmetros de exactidão do método e dos respectivos parâmetros.

Cut-Off VP VN Se IC Se Esp IC Esp RVP RVN Exactidão 20 26 27 0,87 0,11 0,41 0,59 1,47 0,33 0,55 30 24 37 0,80 0,13 0,56 0,44 1,82 0,36 0,64 40 21 46 0,70 0,15 0,70 0,30 2,31 0,43 0,70 50 19 53 0,63 0,16 0,80 0,20 3,22 0,46 0,75 60 17 58 0,57 0,16 0,88 0,12 4,68 0,49 0,78 70 17 58 0,57 0,16 0,88 0,12 4,68 0,49 0,78 80 17 61 0,57 0,16 0,92 0,08 7,48 0,47 0,81 90 17 63 0,57 0,16 0,95 0,05 12,47 0,45 0,83 100 15 64 0,50 0,16 0,97 0,03 16,50 0,52 0,82 110 13 66 0,43 0,16 1,00 0,00 nd 0,57 0,82 120 13 66 0,43 0,16 1,00 0,00 nd 0,57 0,82

Variação da Se e da Esp do método quando se fazem variar o valor do limite de negatividade (Cut-Off, em RLU, na coluna da esquerda) e os respectivos intervalos de conança a 95% (IC Se; IC Esp). Apresenta-se, também, a razão de verosimilhança positiva e a razão de verosimilhança negativa. A exactidão foi calculada para cada limite de negatividade. Nas colunas VP e VN, estão registados respectivamente o número de ensaios verdadeiro positivo e verdadeiro negativo, detectados pelo método quando se faz variar o valor do limite de negatividade. Total de amostras incluídas: verdadeiro positivas = 30, verdadeiro negativas 66.

Figura 3 – Curva de desempenho (Gráco 1) e curvas da RVP e da exactidão do método (Gráco 2). Gráco 1 – Curva de desempenho do método System Sure. Cada ponto da curva representa a razão entre a probabilidade de resultado verdadeiro positivo (Se) e a probabilidade de resultado falso positivo (1-Esp) para valores crescentes do limite de negatividade. A recta de tendência da curva está representada, com o respectivo R2. Gráco 2 – Crescimento dos valores da exactidão e da razão de verosimilhança positiva (RVP) do mesmo método à medida que se eleva o limite de negatividade. Cada valor do cut-off apresentado na Tabela 6 tem um ponto correspondente nas três curvas dos Grácos 1 e 2. Por exemplo: quando o valor do cut-off for de 100 RLU, ele corresponderá a valores de Se, Esp, RVP e de Exactidão, respectivamente de 0,5; 0,97; 16,5 e 0,82.


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médio dos resultados nos ensaios com Pseudomonas spp é inferior a 10%, se excluirmos a diluição 10-2 onde ocorreu também um resultado anormal. Pensamos que, os resultados com valores anómalos, obtidos quando se utilizaram microrganismos, serão, em parte devidos a agregados de bactérias, que terão aumentado a quantidade de ufc, presentes nos ensaios cujos resultados estão sublinhados na Tabela 3.

Calculou-se a reprodutibilidade, a partir dos resultados das experiências realizadas com leite cru, ambas sobre superfícies, cujos resultados são apresentados na Tabela 1 e na Figura 1. Determinou-se separadamente a reprodutibilidade dos resultados positivo, duvidoso, negativo e a reprodutibilidade global do método (Figura 2, Gráco 1). O CV da reprodutibilidade média global em superfícies é semelhante para ambos protocolos, cerca de 40%. O CV da reprodutibilidade exclusivamente dos resultados positivos é melhor, cerca de 20% apenas.

Os critérios para a interpretação probabilística dos resultados de métodos quantitativos, necessitam da determinação prévia de alguns parâmetros que tornem possível o seu cálculo. Esses parâmetros são apresentados na Tabela 5.

A sensibilidade relativa (Se), foi calculada a partir dos resultados dos 30 ensaios realizados com leite cru diluído apresentados na Tabela 2. Sabendo-se que as referidas amostras contêm leite, os resultados negativos são considerados falso negativos. Incluíram-se as seguintes diluições: 100%, 10%, 2%, 1% e 0,2%. Tendo em consideração que 2% é o limite de negatividade, a exclusão das amostras diluídas a 1,3% permite manter a proporção de amostras positivas adequada ao cálculo da sensibilidade. À medida que se aumenta o limite de positividade a sensibilidade baixa. Por exemplo, se esse limite for xado nos 85 RLU, são consideradas positivas pelo método 57% das amostras com leite, mas se for fixado nos 110 RLU apenas 43% das amostras (contendo leite diluído) serão consideradas positivas. Para determinar a especificidade relativa (Esp), aproveitaram-se os resultados dos 66 ensaios que constam das colunas 3 e 4 da Tabela 1. Tomando como exemplo os limites utilizados anteriormente, verica-se que mais de 92% das superfícies são consideradas limpas se o valor limite aceite for 85 RLU e todas serão consideradas limpas se ele for de 110 RLU. Em síntese, à medida que o cut-off sobe, os valores da Se e da Esp

crescem em sentidos inversos. Para valores de 85 RLU, o limite de negatividade estabelecido, a Se é de 57% (± 16%) e a Esp é de 92% (± 10%). Para valores 110 RLU, o limite de positividade estabelecido, Se = 43% (± 16%) e Esp = 100% . A razão de verosimilhança positiva (RVP) e a razão de verosimilhança negativa (RVN), estão também calculadas na Tabela 5, para diferentes valores do limite de negatividade, compreendidos entre 20 e 120 RLU. A probabilidade de um resultado positivo no teste ser um resultado verdadeiro positivo, aumenta à medida que sobem as RVP e a RVN, o que acontece quando aumenta o limite de negatividade do teste. A curva de desempenho do método é dada pela fórmula: y = -0,4072x2 + 0,903x + 0,4752. Esta curva traduz a certeza dos resultados positivos do método, à medida que aumenta a intensidade da resposta em RLU.

Os resultados da experiência feita para avaliar o efeito da passagem do tempo sobre o limite de detecção do método, encontram-se na Figura 1. Esta experiência, permitiu evidenciar que, para cada diluição, os valores dos resultados dos ensaios, efectuados em momentos cada vez mais afastados do momento do espalhamento do leite, momento 0, não eram significativamente diferentes entre si. Passadas mais de 16 horas sobre a distribuição das amostras, vericou-se que os valores médios dos resultados dos ensaios, se mantiveram inalterados. A análise dos resultados, utilizando ANOVA, permite fundamentar a hipótese de que o factor tempo não interfere com os resultados (PFc<0,05). As diferenças, pelo teste t-Student, entre a média dos resultados de cada diluição, medidos em momentos diferentes revelou-se não signicativa a 95%.

Discussão

Procurou-se determinar os limites de negatividade e de positividade do método systemSURE, recorrendo à realização de três experiências diferentes, cujos resultados constam das Tabelas 1 a 3. Trataram-se os resultados através de duas abordagens metodológicas diferentes: uma clássica que consiste no tratamento dos resultados como variáveis contínuas e através da qual se pretende determinar o limite de detecção do método, assim como o seu limite de quanticação; a outra abordagem consiste no tratamento probabilístico dos resultados, após a sua transformação dicotómica em resultado positivo ou negativo o que requer a denição prévia de um valor limiar (o “cut-off” ou ponto de corte). Um dos nossos objectivos neste trabalho, era o de vericar se um dos valores, o do limite de positividade ou o do limite de negatividade, seria semelhante ao valor do cut-off, ou seja, se através de metodologias diferentes se poderia chegar valores semelhantes ou aproximados para estabelecer a diferença entre resultados positivos e negativos.

No caso do tratamento probabilístico dos resultados deve escolher-se, para valor do cut-off de um método, a

Tabela 6 - Efeito do tipo de superfície ensaiado sobre o valor do limite de negatividade e do limite de positividade do método.

Local Ensaios Média D. padrão IC Lim. Lim. (N.º) (a) (95%) Neg PosTampa camiões 42 43,19 (b) 26,89 8,13 87,8 126,6Bancada 18 18,28 (c) 7,32 3,38 30,4 41,0Autoclave 6 10 2,10 1,68 13,5 16,5

A Tabela 6 foi calculada com dados da Tabela 1, correspondendo às superfícies ensaiadas depois de limpas. (a) ANOVA - Diferença signica-tiva das três médias entre si, com PFC < 0,001; (b) t-Student - Diferenças signicativas entre as tampas os outros tipos de local. Pt < 0,001; (c) t-Student - Diferenças signicativas entre as bancadas e o autoclave. Pt < 0,001.


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gama de resultados onde há maior exactidão. Vericou-se que a exactidão dos resultados sobe à medida que o cut-off escolhido se aproxima dos 80 RLU e que é máxima entre os 80 e os 90 RLU (Tabela 5). Este é, portanto, o valor ideal em superfícies de aço inox para que estas possam ser consideradas limpas. Uma outra forma de determinar o cut-off de um método é através do modelo de tendência da curva de desempenho do método (Response Operative Curve, Figura 3, Gráco 1). O cut-off localiza-se na zona de inexão da curva, onde a tangente é igual a 1 e pode ser obtido, resolvendo a equação em ordem a x e substituindo y por 1. Calculado desta forma, o limite de negatividade encontra-se próximo dos 80 RLU. Também a curva da RVP (Figura 3, Gráco 2) inecte de forma marcada a partir dos 70 RLU, signicando que, a partir desta zona, a certeza de resultados verdadeiro positivos cresce de forma marcada com a intensidade do resultado.

Vê-se que, a denição do valor do limite de negativi-dade através da primeira metodologia, 85 RLU, foi conrmada pela abordagem probabilística. Entendemos que este não é um exercício redundante porque confere solidez à denição dos valores limite dos resultados e proporciona alternativas práticas de interesse na interpretação dos mesmos e porque os parâmetros usados para o cálculo da exactidão do método, permitem as estratégias mais adequadas para a utilização do systemSURE na monitorização de planos HACCP. No cálculo da Se e da Esp, são tomadas em conta, simulta-neamente, todas as fontes de variação relacionadas com a exactidão e com precisão do método. Os parâmetros calculados a partir destes valores, tornam possível estabelecer planos de amostragem devidamente quanti-cados, adaptados à realidade de campo (Noordhuizen, et al., 1997).

Os resultados observados permitem verificar que limite de detecção do método, quando se trata de microrganismos, é inferior ao limite de negatividade proposto visto que ainda consegue diferenciar, de forma signicativa, entre concentrações de 105 e 106

Pseudomonas spp (Tabela 3). Não é possível, contudo, trabalhar na prática abaixo do limite de negatividade devido à falta de precisão do método (Figura 2). A falta de precisão do systemSURE abaixo dos 80 RLU, deverá resultar de interferências externas como podem ser o tipo de superfície, a temperatura dos reagentes e da amostra, a variabilidade na recolha de resíduos pela zaragatoa e, eventualmente, outras. A análise dos dados da Tabela 3 permite concluir que, poderão ser consideradas negativas superfícies onde as zaragatoas recolham até 105 ufc da área de amostragem.

A Tabela 4 permite analisar a linearidade da resposta. Constata-se que este método possui características que permitem considerá-lo semi-quantitativo: por um lado observa-se um aumento linear da intensidade da resposta quando há acréscimos na concentração de matéria orgânica ou de microrganismos na amostra; por outro, o método tem uma fraca sensibilidade que se traduz num

baixo declive, bastante inferior a 1, especialmente para a E. coli. A relativa falta de sensibilidade e uma precisão insuficiente, para as necessidades de quantificação não permitem, portanto, a sua utilização como método quantitativo mas não impedem a sua utilização como método qualitativo. Não impedem, também, que se faça uma aproximação à quanticação, através da utilização das razões de verosimilhança. A utilização destas, permite que a interpretação dos resultados se faça associando uma probabilidade ao resultado.

A precisão do método, segundo os nossos resultados em que se manteve constante o operador, varia entre os 20% e os 40%, quer para a repetibilidade, quer para a reprodutibilidade entre amostras. Os resultados obtidos noutros estudos (Griffth, 1994; Grifth 1997; Silliker, 1996) feitos com mais de 8 marcas diferentes de equipamentos no mercado e diversos substratos orgânicos apresentam valores para a precisão, expressos como CV(%), compreendidos entre os 23% e os 61%.

Analisámos já a maior parte das fontes de variação possíveis, destacando aqui as interferências provocadas pelas superfícies onde se trabalha ou a capacidade de absorção da zaragatoa. Pode-se verificar a sua importância pela análise do Gráfico 2 da Figura 1, onde se compara a repetibilidade dos ensaios com microrganismos, que se zeram directamente na cuvete com a repetibilidade de ensaios feitos em superfícies de aço inox. Irregularidade na distribuição da amostra sobre as superfícies de aço inox e a eventual existência de agregados de bactérias (E. coli) nas suspensões assim como a variabilidade entre a resposta de máquinas diferentes, pode também ser importante. Esta última fonte de variação dos resultados, é controlável com a calibração dos equipamentos. Silliker (1996) e Griffth et al. (1994) referem que os operadores são outra importante fonte de variação, que pode ser controlada através de programas de treino adequado. A melhor precisão, CV próximo dos 20%, consegue-se na zona de resultados positivos o que, é favorável, para o uso do método. A menor precisão encontrada na gama dos resultados negativos afecta de forma importante o limite de negatividade do método, que poderia ser bastante inferior (cerca de 40 RLU), se os valores do CV nesta gama de resposta fossem na casa dos 10%. Os valores propostos para o limite de negatividade, compensam pois, a falta de precisão constatada.

Vanstaen (1980) refere que o ATP se degrada rapida-mente, quer nas células quer fora delas, pressupondo-se que, poderá haver redução na resposta de ATP numa superfície suja com o passar do tempo (caso aconteça um desenvolvimento microbiano reduzido). Testou-se, por isso, o efeito da passagem do tempo sobre os resultados de amostras de leite espalhadas em superfícies de aço inox, no intuito de esclarecer ser haveria limitações de ordem prática, no momento de realização dos ensaios de monitorização, relativamente ao momento da lavagem dos camiões. Os nossos resultados (Gráco 1), mostram que o tempo não tem interferência signicativa sobre a


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capacidade do método para fazer a detecção de ATP em superfícies, no caso do leite cru.

Uma análise detalhada da Tabela 1 mostra que os resultados obtidos nas diferentes superfícies limpas podem ser diferentes entre si. Testou-se a hipótese de que o tipo de acabamento da superfície, poderia inuenciar os resultados e, no caso vertente, quanto mais no este fosse, menor a interferência vericada - as superfícies do autoclave têm o polimento mais no e as tampas de camião têm o pior acabamento -. A Tabela 6, sintetiza os valores médios dos resultados por cada tipo de local e os resultados dos testes efectuados para avaliar o signicado estatístico dessas diferenças. Constata-se que há diferenças signicativas nos resultados dos ensaios feitos nos diferentes tipos de superfície. Colocou-se a questão, de saber se esta interferência alterava o cálculo do limite de negatividade e do limite de positividade próprio de cada superfície. Verificou-se que valores limite, calculados exclusivamente para as tampas dos camiões, foram pouco afectados (Tabela 6), devido sobretudo à sua predominância na população do ensaio (63%). Por isso não vimos motivo para modicar os valores dos limites propostos. Embora, no caso vertente, não seja necessário modificar esses valores, parece aconselhável que, sempre que novos tipos de superfícies são incluídas num plano HACCP, sejam conduzidos ensaios prévios, para avaliar o seu efeito sobre compor-tamento do método e as suas repercussões sobre o limite de negatividade.

Também deve ser tida em conta, a possível existência de interferências de restos de produtos da lavagem nos resultados. As substâncias químicas que provoquem alterações significativas do pH da solução reagente, desviando-o do pH óptimo ( 7,75) reduzem a intensidade da resposta ATP (Vanstaen, 1980). Podem apreciar-se na Tabela 1 alguns ensaios cujos resultados do primeiro passo são inferiores aos dos passos seguintes, provavel-mente devido a interferências de restos de solução de lavagem à base de Soda usada na lavagem dos camiões. A adição de quantidades conhecidas de Luciferina –Luciferase à solução de ensaio, após a leitura do resultado à solução permite quantificar este efeito (Vanstaen, 1980). A temperatura é outro factor que interfere na reacção, mas foi controlada a 22ºC nos nossos ensaios.

Os resultados apresentados na Tabela 2 mostram que é possível detectar leite diluído a 2% o que, em nossa opinião, confere ao método um suciente valor prático para este ser usado na monitorização da higiene em planos HACCP. É que, nesta gama de diluições, o leite não é detectável a olho nu.

Para que as superfícies sejam consideradas limpas, os limites críticos recomendados, situam-se entre 101 ou no máximo 103 ufc 100 cm2 (Bell et al., 1994) O limite inferior de quanticação do método depende da espécie mas é sempre superior a 103 ufc. Demonstrou-se que, dado o elevado limite de detecção para microrganismos, o método avaliado não pode ser usado para substituir a

bacteriologia convencional na vericação da higiene em superfícies em planos HACCP.

Partindo dos resultados apresentados e discutidos, é possível propor as estratégias para utilização do sistema avaliado. A monitorização de superfícies nos planos HACCP carece de respostas rápidas, qualitativas do tipo ‘pass / fail’ ou ‘limpo / sujo’. Elas devem ser dadas com base num limite de negatividade pré-denido mas pensamos que, periodicamente, este pode ser reavaliado e ajustado, se necessário, em função da proporção de resultados positivos que ocorrem no processo. Isto permite aumentar, de forma progressiva, os níveis de exigência, contribuindo para a melhoria contínua da higiene dos processos. A decisão sobre o limite a adoptar, em cada momento, deve ter em vista a maior exactidão possível, reduzindo, quer a ocorrência de resultados falso positivos quer a de resultados falso negativos. Embora a Se seja elevada para limites baixos, o que confere um bom valor predito ao resultado positivo, a Esp é baixa, gerando muitos resultados falso negativos, o que prejudica a exactidão do método. Por esta razão é preciso precaução na denição de limites de negatividade baixos, que podem induzir em erro por excesso de resultados falso negativos. Importa, em suma, ter presente a necessidade de manter, permanentemente, o melhor compromisso entre a Se e a Esp, através da selecção do melhor limite, para obter a máxima exactidão possível, na prática. A proporção esperada de resultados positivos (a taxa de superfícies sujas), é um factor determinante para a selecção do limite de negatividade.

Durante a realização de actividades de vericação ao plano HACCP ou em auditorias, faz sentido utilizar os resultados do método de uma forma semi-quantitativa. Uma vantagem desta utilização é o recurso às RVP e RVN que permitem fazer uma relação entre a intensidade da resposta e a probabilidade de o resultado ser positivo. Utilizando médias das razões de verosimilhança dos resultados é possível realizar estudos das tendências dos resultados, vericando se o nível médio da higiene das superfícies tende a melhorar ou não. A aplicação de métodos de controlo estatístico de processo é uma forma de potencializar os resultados obtidos através da utilização deste método e encontra-se mencionada por Hayes et al., 1997.

Um último parágrafo para mencionar a necessidade de treino dos operadores para efectuar os ensaios. É muito importante garantir a conança dos resultados através de treino adequado dos operadores e da sua reciclagem periódica. Os CV% encontrados nos resultados dos ensaios a branco e com soluto de Ringer evidenciam essa necessidade (Tabelas 2 e 3).

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Resumo: Foi estudado e validado um método rápido de pesquisa de Salmonella baseado em “Fluorescent In Situ Hybridization” (FISH), desenvolvido por Nordentoft et al. (1997) (J. Clin. Micro-biol. 35, 2642-2648) para detecção de estirpes de referência e iso-lados clínicos. O protocolo foi testado em 250 isolados de Salmo-nella obtidos a partir de alimentos e de fontes ambientais, corres-pondentes a 34 serovariedades. Todos os isolados apresentaram hibridação positiva com a sonda específica para Salmonella. O limite de detecção da técnica FISH foi determinado para Sal-monella Enteritidis CECT4300 e para Salmonella Typhimurium CECT443, bem como a relação entre a contagem de colónias pelo método convencional e o número de células detectadas por FISH. Resultados preliminares obtidos a partir da aplicação directa da técnica FISH a amostras de alimentos demonstram que esta per-mite detectar Salmonella spp. em aproximadamente 7 horas, sem ser necessário o isolamento prévio deste microrganismo.

Summary: A rapid method for Salmonella detection, based on Fluorescent In Situ Hybridization (FISH), developed by Norden-toft et al. (1997) (J. Clin. Microbiol. 35, 2642-2648) for reference strains and clinical isolates, was applied for detection of different serovars of the microorganism. The protocol was tested against 250 Salmonella cultures obtained from food and environmental samples, corresponding to 34 serovars. The specific probe hybridi-zed with all Salmonella serovars. The detection limit of the FISH technique was determined for Salmonella Enteritidis CECT4300 and Salmonella Typhimurium CECT443, as well as the relation between traditional plating method and FISH cell counting. Pre-liminary results obtained from the direct application of the FISH technique to food samples show that it allows the detection of Salmonella spp. in approximately 7 hours, eliminating the neces-sity for previously isolate the microorganism.

Introdução

Salmonella constitui uma das principais causas de toxinfecção alimentar em todo o mundo (ICMSF, 1996). As salmoneloses, cujas manifestações clínicas podem variar de gastrenterite ligeira a septicemia grave, estão associadas ao consumo de carnes, ovos, lacticínios e

produtos de pesca. Anualmente, registam-se nos Esta-dos Unidos 2 a 4 milhões de casos, e mesmo quando sujeitos a tratamento hospitalar, 1 a 10 % são mortais (U.S.F.D.A., 2001).

Embora existam diversos métodos para detectar este microrganismo em alimentos, as técnicas bacterioló-gicas convencionais apenas permitem obter resultados presuntivos após 5 dias. Os avanços biotecnológicos dos últimos anos levaram ao desenvolvimento de novas técnicas para a detecção de Salmonella, de execução mais simples e rápida do que as técnicas microbioló-gicas convencionais. Estas incluem testes comerciais para confirmação (ELISA, VIDAS, Gene-Trak, entre outros) (Hill e Olsvik, 1994; ICMSF, 1996), técnicas imunomagnéticas (Hill e Olsvik, 1994), hibridação em colónia (Olsen et al.,1995) e PCR. Apesar de este último método ser utilizado correntemente para detec-ção de diversos microrganismos patogénicos (Wang et al., 1997), a sua aplicação a Salmonella não tem sido fácil, provavelmente devido à dificuldade em desenvol-ver conjuntos de “primers” dotados da especificidade suficiente para detectar todos os serogrupos existentes (Hill e Olsvik, 1994). Os alvos da PCR mais comuns para a detecção deste microrganismo são os genes que codificam para factores de virulência (Soumet et al., 1997), para a proteína de invasão associada (invA) (Wang et al., 1997) e genes ribossomais (Lin e Tsen, 1996). Apesar da aplicação da PCR à análise directa de alimentos ser extremamente difícil, devido a proble-mas relacionados com a preparação das amostras, com a presença de inibidores da PCR nos alimentos, e com o baixo nível de sensibilidade da técnica (Hill e Olsvik, 1994; Lantz et al., 1994), já se encontram disponíveis alguns protocolos para este fim específico (Guo et al., 2001).

Outra técnica molecular, a hibridação in situ fluores-cente (FISH), também tem sido aplicada à detecção de microrganismos patogénicos, como Escherichia coli (Poulsen et al., 1994) e Listeria monocytogenes (Oli-veira et al., 2002). Esta técnica baseia-se na hibrida-

“Fluorescent In Situ Hybridization” aplicado à detecção rápida de Salmonella de origem alimentar e ambiental.

Fluorescent In situ Hybridization applied to the rapid detection of Salmonella isolates from food and environmental origins.

Manuela Oliveira* e Fernando Bernardo**

CIISA - Laboratório de Inspecção Sanitária; Faculdade de Medicina Veterinária, Rua Prof. Cid dos Santos, Polo Universitário da Ajuda, 1300-477 Lisboa



* Bolseira de Doutoramento da FCT (BD 905/2000) ** Professor Associado da Faculdade de Medicina Veterinária Correspondente: e-mail [email protected]

RPCV (2002) 97 (542) 81-85

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RPCV (2002) 97 (542) 81-85Oliveira, M., Bernardo, F.

ção de sondas de oligonucleótidos marcadas com fluo-rocromos, complementares de genes alvo específicos.

Os objectivos deste estudo foram avaliar a aplicabili-dade de um protocolo de FISH, desenvolvido por Nor-dentoft et al. (1997), para a detecção de isolados de Salmonella obtidos de alimentos e do meio ambiente, determinar o limite de detecção desta técnica e estimar a relação entre as contagens de colónias obtidas através do método bacteriológico convencional e o número de células detectadas por FISH.

Materiais e métodos

Neste estudo foram utilizados 250 isolados de Salmo-nella, encontrados em amostras de alimentos e ambien-tais (Bernardo e Machado, 1989, 1990, 1993), corres-pondendo a 34 serovariedades (Tabela 1).

Para fixação das bactérias, centrifugou-se uma sus-pensão celular realizada a partir de culturas em fase exponencial (14000 rpm, 10 mins). O sedimento foi ressuspenso em 100 µl de uma solução de paraformal-deído a 4 % (Merck Lab, S.A.). Esta suspensão foi incubada durante 20 mins, centrifugada (14000 rpm, 10 mins), e lavada em 1000 µl de PBS. As bactérias foram recuperadas por centrifugação (14000 rpm, 10 mins). A optimização deste passo foi realizada empi-

ricamente, tendo-se igualmente testado fixações pelo calor e pelo metanol.

A aplicabilidade do protocolo de Nordentoft et al. (1997) foi testada em suspensões bacterianas de cultu-ras de Salmonella isoladas de amostras de alimentos e ambientais. Após o revestimento das lâminas de Teflon com 10 poços (Heinz Herenz Hamburg) com uma solu-ção de 3-trimetoxisililpropilamina a 2 % (Merck Lab, S.A.) em acetona, pipetaram-se 10 µl de uma suspen-são de bactérias fixadas para os respectivos poços. Apli-cou-se o protocolo de hibridação descrito por Norden-toft et al. (1997), tendo-se introduzido algumas modifi-cações (fixação e temperatura de hibridação).

Neste trabalho utilizaram-se 3 sondas oligonucleotí-dicas: uma sonda específica de Salmonella spp. (Sal3)

Tabela 1- Número de Serovariedades de Salmonella de origem alimentar e ambiental testadas através do protocolo de FISH específico. Serovariedade Origem Total Hibridação Positiva H O R B Ov S F Sal3 Eub338 Non338Enteritidis 9 15 1 2 2 62 91 91 91 0Anatum 1 38 39 39 39 0Derby 1 17 18 18 18 0Ohio 11 6 17 17 17 0Newport 1 14 15 15 15 0Saintpaul 1 10 1 1 13 13 13 0Blockley 10 10 10 10 0Infantis 1 5 6 6 6 0Typhimurium 2 1 2 5 5 5 0London 1 1 1 1 4 4 4 0Havana 3 3 3 3 0Agona 2 2 2 2 0Essen 2 2 2 2 0Seftenberg 2 2 2 2 0III bg1: k: 1,5 2 2 2 2 0Thompson 2 2 2 2 0Virchow 1 1 2 2 2 0Bardo 1 1 1 1 0Bovismorbificans 1 1 1 1 0Bredency 1 1 1 1 0Cladar 1 1 1 1 0Coeln 1 1 1 1 0C1 1 1 1 1 0Hayindogo 1 1 1 1 0Heidelberg 1 1 1 1 0Kedongon 1 1 1 1 0Liverpool 1 1 1 1 0Mokola 1 1 1 1 0Norwich 1 1 1 1 0Richmond 1 1 1 1 04,5:I:k 1 1 1 1 06,7:z10:_ 1 1 1 1 0Tilburg 1 1 1 1 0Veniziana 1 1 1 1 0Total 9 21 15 62 12 42 89 250 250 250 0H – Humana; O – Ovos, R – Rações; B – Bovinos; Ov – Ovinos; S – Suínos; F - Frangos

Figura 1 – Representação gráfica da relação entre o método microbiológ-ico convencional e a técnica FISH para S. Enteritidis CECT4300 (a) e para S. Typhimurium CECT443 (b).

dirigida para o 23S rRNA (Nordentoft et al., 1997), uma sonda bacteriana universal (Eub338) (Christensen et al., 1999), e uma sonda “nonsense” complementar a Eub338 (Non338). As sondas Eub338 e Non338 foram usadas, respectivamente, como controlos posi-tivo e negativo deste protocolo de hibridação. As sondas foram sintetizadas e marcadas com fluoresceína na extremidade 5’ (MWG-Biotech).

Finalmente, as lâminas foram montadas em Vec-tashield Mounting Medium (Vector Laboratories, Inc.). Todos os ensaios foram realizados em duplicado. As bactérias hibridadas foram visualizadas por microsco-

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pia de fluorescência numa ampliação de 1000 x (Objec-tive HCX PLAN APD), num microscópio Leica DMR equipado com uma lâmpada de mercúrio de 100 W e um filtro I3 (Leica) para excitação entre 450 e 490 nm. As imagens foram obtidas através de uma câmara Leica DC200.

Para determinar o limite de detecção da técnica FISH, e a sua relação com o método de contagem convencio-nal, recorreu-se a diluições seriadas realizadas a partir de suspensões padrão a 0,5 MacFarland (bioMérieux® SA) de S. Enteritidis CECT4300 e S. Typhimurium CECT443. Efectuaram-se diluições decimais que foram simultaneamente semeadas por incorporação em “Plate Count Agar” (PCA) (Difco, 0479-01-1), para efeitos de contagem, e fixadas para FISH. As placas foram incu-


badas a 37º C durante 24 h, período no final do qual se procedeu à contagem das colónias. Paralelamente, pro-cedeu-se à contagem do número de células hibridadas existentes em 5 campos microscópicos. Os testes foram repetidos 5 vezes, em duplicado.

Resultados

Na avaliação da aplicabilidade do protocolo de FISH para a detecção de 250 culturas de Salmonella isoladas a partir de amostras de alimentos e ambientais, verifi-cou-se que todos os isolados (100 %) apresentaram um sinal de hibridação positivo com a sonda Sal3 (Figura 2). Todos os isolados apresentaram também sinal de

Tabela 2 – Resultados da contagem de colónias (ufc) e do número de células hibridadas em 5 campos microscópicos (log10

), de S. Enteritidis CECT4300 e de S. Typhimurium CECT443, utilizados na determinação da relação entre o método microbiológico convencional e a técnica FISH. Nº do S. Enteritidis CECT4300 S.Typhimurium CECT443 Ensaio Log

10 ufc/ml Log

10 Nº células Desvio Log

10 ufc/ml Log

10 Nº células Desvio

(PCA) hibridadas/ ml* Padrão (PCA) hibridadas / ml* Padrão 1 8,26 9,49 0,87 8,08 8,70 0,44 2 8,20 9,36 0,82 8,40 9,45 0,74 3 8,00 9,30 0,92 7,73 9,34 1,14 4 7,91 9,34 1,01 7,71 9,58 1,32 5 8,00 9,38 0,98 8,52 9,34 0,58 Média 8,07 9,37 0,92 8,09 9,28 0,84

Figura 2 - Células bacterianas com sinal FISH positivo. Podem-se observar células distribuídas em agregados (è). S. Anatum B365 (a), S. Enteritidis O32 (b), S. Newport F371 (c) e S. Typhimurium F404 (d). Originais.

a

b

c

d

84

hibridação positivo com a sonda Eub338, e nenhum hibridou com a sonda Non338 (Tabela 1).

A reproductilidade da técnica FISH foi determinada para S. Enteritidis CECT4300 e para S. Typhimurium CECT443, através dos resultados da contagem de coló-nias em PCA, ou seja, pelo método bacteriológico con-vencional, e do número de células hibridadas, detecta-das em 5 campos microscópicos (Tabela 2). Por com-paração entre os valores de UFC/ml obtidos em PCA e de células hibridadas/ml, determinou-se o limite de detecção da técnica FISH; nas condições deste estudo, esse valor foi estimado em 1 bactéria/ml para as duas estirpes de Salmonella de referência. Estes valores foram ainda utilizados para determinar a relação entre o método de contagem convencional e a técnica FISH (Figura 1).

Discussão

O método rápido desenvolvido por Nordentoft et al. (1997) para a pesquisa de Salmonella usando uma técnica FISH, revelou-se eficaz na detecção de todos os isolados indígenas. Os estudos de aplicabilidade do método configuram-se extremamente relevantes, na medida em que estes agentes estão sujeitos a diversas pressões ecológicas (choques térmicos, osmóticos e ácidos) nas condições naturais de conservação nos ali-mentos, e que podem afectar intrinsecamente a fisiolo-gia e a morfologia das referidas células (Foster e Spec-tor, 1995; Tolker-Nielsen e Molin, 1996).

Foi realizada uma alteração em relação ao protocolo original, no que diz respeito ao processo de fixação das células bacterianas. Este passo é crucial para o sucesso da técnica FISH, visto interferir na permeabilidade das paredes bacterianas, influenciando, por essa via, a efi-cácia de penetração da sonda. Serve ainda para prote-ger os ribossomas da degradação por RNases endó-genas e permite preservar a morfologia celular para além da imobilização (Amann et al., 1995). A fixação deve ser realizada durante a fase exponencial do cresci-mento, de modo a garantir o número máximo de ribos-somas, e, consequentemente, a fluorescência máxima (Rice et al., 1997). Existem diversos protocolos de fixa-ção, que incluem a utilização de álcoois para bactérias Gram +, e de aldeídos para bactérias Gram - (Amann et al., 1995), embora estejam referidas excepções (Bid-nenko et al., 1998; Meier et al., 1999). A optimização das condições de fixação foi realizada empiricamente, como se referiu anteriormente. Verificou-se que os melhores resultados foram obtidos através da adição da solução de paraformaldeído. Nestas condições, as bac-térias apresentam sinais de hibridação mais evidentes e uma distribuição mais uniforme ao longo do poço, con-dição essencial para se estabelecer uma relação signifi-cativa entre o número de colónias obtido por plaquea-mento e o número de células observado através da téc-nica FISH.

Para determinar o limite de detecção da técnica FISH e a relação entre esta técnica e o método de contagem convencional, recorreu-se a duas estirpes de referência, S. Enteritidis CECT4300 e S. Typhimurium CECT443, uma vez que estas duas serovariedades são as que se encontram com maior frequência nos alimentos e nos humanos em Portugal (Bernardo e Machado, 1989, 1990, 1993). Constatou-se que o limite de detecção desta técnica é de 1 bactéria/ml, tanto para S. Enteriti-dis CECT4300 como para S. Typhimurium CECT443, valor muito superior ao do método de contagem con-vencional. Este resultado já havia sido referido por outros autores (Auty et al., 2001). A maior sensibili-dade da técnica FISH pode ser explicada pela detec-ção de células não viáveis que ainda possuam rRNA (Amann, et al., 1995), e pela observação de células bacterianas individualizadas, mesmo quando formam agregados (Figura 2).

Neste estudo, avaliou-se a aplicabilidade do proto-colo de FISH para a detecção de estirpes de Salmonella isoladas a partir de amostras de alimentos e ambientais, determinou-se o limite de detecção da técnica e a sua relação com o método de bacteriológico convencional. Os resultados mostram que a técnica FISH pode ser aplicada à rápida detecção deste microrganismo em amostras de alimentos e ambientais.

Resultados de um estudo preliminar da aplicação directa a amostras de alimentos (leite, ovos e queijo) artificialmente contaminadas (resultados não apresen-tados) indicam também que esta técnica se revela pro-missora na aplicação à pesquisa directa de Salmonella em alimentos, permitindo a detecção e identificação destes organismos em aproximadamente 7 horas.

Agradecimentos

Agradecemos ao Professor Sergi Ferrer (Universitat de València) todo o apoio técnico e científico dispen-sado.

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Resumo: Os tumores testiculares do gato (Felis catus) são raros. Neste estudo, descreve-se um caso de sertolinoma maligno num testículo ectópico de um gato com metástases disseminadas pelo corpo, nomeadamente no fígado, baço e peritoneu. O diagnós-tico definitivo baseou-se no exame imunocitoquímico das células tumorais, que apresentavam marcação citoplásmica homogénea com os anticorpos monoclonais anti -NSE (neuron-specic eno-lase - BBS/NC/VI-H14) e anti-vimentina (Vim 3B4), com padrão de marcação semelhante ao observado nos sertolinomas caninos. A classificação TNM deste tumor é T3NXM1. O animal não apresentava sinais de feminização.

Palavras-chave: tumor, neoplasia, gato, testículo, células de Ser-toli.

Summary: Testicle neoplasms are rare in the cat (Felis catus). This paper reports a case of a malignant Sertoli cell tumour in an ectopic testis of a cat with widespread metastases, namely in the liver, spleen and peritoneum. The final diagnosis was based in immunocytochemical analysis of the tumour cells, which showed homogenous cytoplasmic staining with the monoclonal antibod-ies anti-NSE (neuron-specific enolase - BBS/NC/VI-H14) and anti-vimentin (Vim 3B4). This pattern of staining is similar to the one observed in canine Sertoli cell tumours. The TNM classifica-tion of this neoplasm is T3NXM1. The animal didn’t show any sign of feminization.

Keywords: tumour, neoplasm, feline, testis, Sertoli cells.

Introdução

Os tumores testiculares são raros no gato (Brodey, 1970; Burke, 1976; O’Keefe, 1995; Withrow e Reeves, 1996; Buergelt, 1998; Morrison, 1998; England, 1999), o que é reflectido no estudo de Cotchin (1957) que, em 253 neoplasias de gatos do sexo masculino, não referiu nenhum tumor testicular ou prostático. Posteriormente, Dorn et al. (1968; 1968a) estudaram, ao longo de 3 anos, 256 casos de neoplasia em gatos (sexo mascu-lino), não tendo também assinalado qualquer tumor tes-ticular. Um dado também ilustrativo é fornecido por

Nielsen e Lein (1974), que afirmaram que os tumores testiculares caninos constituem mais de 90% de todas as neoplasias deste órgão nos mamíferos domésticos, seguindo-se-lhe o garanhão e o touro.

No gato, já foram assinalados tumores das células de Sertoli (Meier, 1956; Baptista e Silva, 1985; Johnston, 1993; O’Keefe, 1995; Withrow e Reeves, 1996), semi-nomas (Withrow e Reeves, 1996), tumores das células de Leydig (O’Keefe, 1995; Withrow e Reeves, 1996), um tumor da rete testis (Peyron e Cocu, 1938) e dois teratomas (Johnston, 1993; Miyoshi et al., 2001). Alguns dos tumores das células de Sertoli e semino-mas apresentavam metástases (Meier, 1956; Baptista e Silva, 1985; O’Keefe, 1995). Também já foi referido um tumor de células de Leydig ectópicas num gato cas-trado 11 anos antes (Rosen e Carpenter, 1993).

Nos felídeos silvestres, assinalaram-se também alguns tumores testiculares, como o caso de Doster et al. (1989), referente a um seminoma num leopardo da neve (Panthera unica), e o de Scudamore e Meredith (2001), relativo a um sertolinoma num tigre de Amur (Panthera tigris altaica).

Material e métodos

Material

Este estudo refere-se a um gato Europeu Comum (Felis catus), com cerca de 5 anos, que foi enviado à consulta externa do Hospital da Faculdade de Medi-cina Veterinária de Lisboa em 12 de Maio de 1999. O exame clínico revelou caquexia, desidratação marcada, dilatação do abdómen, temperatura de 38 ºC, tumefac-ção perianal e, à palpação, notaram-se massas intrab-dominais. A proprietária informou que o animal tinha sofrido a ablação cirúrgica de um testículo. Foi feito o diagnóstico provisório de neoplasia testicular. Tendo em consideração o quadro clínico e o possível diagnós-tico, o animal foi eutanasiado após consentimento da proprietária.

Sertolinoma maligno em testículo ectópico de gato (Felis catus)

Malignant Sertoli cell tumour in an ectopic testis of a cat (Felis catus)

J.F. Silva

SEPAT, DEMOC, Faculdade de Medicina Veterinária, Rua Prof. Cid dos Santos (Polo Universitário - Alto da Ajuda), 1300-477 Lisboa, Portugal.



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Telefone: 213 652 888; e-mail: [email protected]

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Métodos

Foi realizada a necrópsia do animal, tendo sido colhi-dos fragmentos do testículo (três, um deles com ductos eferentes anexos), de um nódulo na entrada do peito, pulmão, fígado e baço. Os fragmentos foram fixados em formol a 10 % e incluídos em parafina. Realiza-ram-se ao micrótomo cortes com 5 µm de espessura, que foram corados pela hematoxilina de Ehrlich - eri-trosina.

Um fragmento de testículo (com os ductos eferentes incluídos), um de fígado e outro de baço foram selec-cionados, após o exame histopatológico de rotina, para investigação imunocitoquímica. O método utilizado foi o da estreptavidina - biotina - peroxidase. Foram utili-zados os anticorpos monoclonais (soros primários) anti-citoqueratinas 5, 6, 8, 17 e talvez 19 (clone MNF116, Dako), anti-vimentina (clone Vim 3B4, Dako), anti-enolase específica dos neurónios (neuron-specic eno-lase (NSE), clone BBS/NC/VI-H14, Dako) e anti-des-mina (clone DE-R-11, Dako), nas concentrações, res-pectivamente, de 1:50, 1:200, 1:500 e 1:60. O tempo de actuação para cada um destes soros foi de 1 hora, tendo a marcação imunocitoquímica sido efectuada mecani-camente no aparelho TechMate ™ (Dako), no Instituto Português de Oncologia Francisco Gentil - Secção de Anatomia Patológica (Lisboa). A recuperação dos epí-topos foi feita por alta temperatura em panela de pres-são com tampão citrato a pH = 6,0 (1 minuto), excepto no caso da pesquisa de citoqueratinas, em que foi feita uma pré-digestão em pepsina (Sigma, P-7000) a 0,4%, a pH = 2, durante 20 minutos. Fez-se uma ava-liação semi-quantitativa das células neoplásicas mar-cadas com a seguinte notação (CT – células tumorais marcadas; x – preparação microscópica considerada):

0 % CT = -; 0 % CT < x ≤ 5 % CT = +/- (no caso de haver raras células isoladas positivas, adoptou-se o símbolo +/--); 5 % CT < x ≤ 25 % CT = +; 25 % CT < x ≤ 50 % CT = ++; 50 % CT < x ≤ 75 % CT = +++; 75 % CT < x ≤100 % CT = ++++.

Foram estudados imunocitoquímicamente, como padrão, os testículos apresentando morfologia normal (ao exame histológico, com a coloração da hematoxi-lina de Ehrlich - eritrosina) de dois gatos, respectiva-mente de 6 e 16 anos. Estes animais morreram devido a urémia aguda consequente a obstrução da uretra, apre-sentando ambos cistite hemorrágica com dilatação vesi-cal. Fragmentos de testículo foram fixados em formol a 10 % e incluídos em parafina. Usaram-se os quatro anticorpos monoclonais já aludidos. Também foi uti-lizado como referência o artigo de Patnaik e Mostofi (1993), sobre algumas propriedades imunocitoquími-cas do testículo normal e neoplásico do cão.

Resultados

Exame anatomopatológicoNo exame externo, observou-se caquexia, desidrata-

ção, tumefacção acentuada na região perianal e conjun-tivite purulenta bilateral.

À abertura da cavidade torácica, observou-se uma massa de cor vermelha-acastanhada com 1,5 cm x 0,9cm, situada na extremidade cranial do mediastino, perto do manúbrio do esterno. A cavidade pleural apre-sentava alguns coágulos sanguíneos. O lúmen da região distal da traqueia encerrava muco com alguns coágu-los sanguíneos e os brônquios continham muco no seu interior.

A cavidade abdominal apresentava hidro-hemopio-peritoneu (260 ml). Na região do folheto parietal do peritoneu que atapetava o diafragma, no omento e no mesentério notavam-se inúmeros pequenos nódulos de cor branca-amarelada com um diâmetro médio de 2 mm. O fígado continha dois nódulos volumosos dis-coidais umbilicados, de textura multilobulada (os lóbu-los irradiavam desde os centros umbilicados), de cor branca-amarelada, com os diâmetros respectivos de 8cm e 7,5 cm; o resto deste órgão apresentava o parên-quima semeado de nódulos menores (com diâmetros compreendidos entre 0,5 cm e 2 cm), e de cor seme-lhante à dos nódulos maiores; alguns deles eram umbi-licados. No baço, notavam-se nódulos disseminados, em geral esféricos, sem umbilicação, com diâmetros de 1 cm a 3 cm e de cor semelhante à dos nódulos hepáticos. O espaço retroperitoneal apresentava nódu-los semelhantes aos já mencionados, formando placas compactas e firmes que invadiam os músculos sublom-bares.

A tumefacção da região perineal correspondia a um testículo com 4 cm x 2 cm x 1,8 cm (Figura 1), de aspecto oval, superfície micronodular e superfície de corte multilobulada e de cor branca. Este testículo estava em parte situado na região inguinal, sendo coberto por pele intacta no seu polo posterior, que não apresentava diferenciação anatómica de escroto.

Exame histopatológicoTestículo - As células tumorais agrupavam-se em

cordões de diâmetros diferentes, uns finos, outros bas-tante grossos (Figura 2). O centro de alguns dos cor-

Figura1 - Aspecto macroscópico do testículo tumoral (indicado por um bisturi), retirado do cadáver. Notam-se também nódulos metastáticos no fígado (1) e no baço (2).

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dões de maior diâmetro era ocupado por áreas extensas de necrose. Os cordões eram separados uns dos outros por septos conjuntivos de espessura variável. O exame de alguns cordões celulares grossos com a objectiva de x40 revelou que estes eram formados por agregados de cordões finos estreitamente justapostos, separados uns dos outros por septos conjuntivos muito delicados.

A fiada de células tumorais mais periférica formava um arranjo em paliçada ao longo dos septos conjunti-vos; estas células tinham uma forma aproximadamente rectangular (Figura 3). As células mais interiores eram arredondadas ou poliédricas, emitindo pequenos prolon-gamentos finos; o citoplasma destas células era escasso e acidófilo. Os núcleos de todas estas células eram redondos ou ligeiramente ovóides, hipercromáticos ou então ricos em eucromatina; nestes últimos, notava-se um nucléolo evidente. As figuras de mitose eram raras, estando presentes também algumas figuras de apoptose. Em alguns campos, notavam-se agregados de células de citoplasma volumoso, poliédrico, finamente vacuoli-zado e ligeiramente acidófilo, estreitamente associadas num arranjo epitelióide. Os seus núcleos eram peque-nos e hipercromáticos.

A albugínea e a região dos ductos eferentes estavam invadidas por células tumorais. Notavam-se alguns

êmbolos de células tumorais em vénulas.Fígado - As metástases eram constituídas por cor-

dões finos e grossos de células neoplásicas. Nestes, notava-se uma nítida fiada periférica de células cúbicas em paliçada (Figura 4). Na maior parte das vezes, os cordões estavam separados uns dos outros por septos conjuntivos muito finos, notando-se menos frequen-temente septos um pouco mais espessos e fibrosos. As células tumorais apresentavam ligeira anisocariose. Não eram visíveis as células de citoplasma volumoso e espumoso observadas no tumor primário. O parên-quima hepático adjacente às metástases apresentava atrofia por compressão.

Baço - A anisocariose das células tumorais das metás-tases neste órgão era mais acentuada do que a obser-vada no tumor primitivo e nas metástases hepáticas. O citoplasma era mais abundante e fracamente acidófilo. Notava-se congestão da polpa vermelha no parênquima esplénico não atingido pelo processo tumoral.

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Figura 2 - Estrutura histológica do sertolinoma, composto por cordões de células alongadas, separados uns dos outros por septos conjuntivos. Coloração pela hematoxilina de Ehrlich - eritrosina. Objectiva x 10.

Figura 3 - Entre o terço direito e médio da fotografia, situa-se um fino septo vertical de tecido conjuntivo. As células neoplásicas adjacentes a ele formam uma paliçada, em alguns pontos um pouco irregular. Coloração pela hematoxilina de Ehrlich - eritrosina. Objectiva x 40.

Figura 4 - Metástase hepática. O aspecto em fiada (paliçada) das células neoplásicas periféricas de cada um dos dois cordões é evidente. Coloração pela hematoxilina de Ehrlich - eritrosina. Objectiva x 40.

Nódulo da entrada do peito – Esta formação corres-pondia a um linfonodo mediastínico anterior com con-gestão intensa. Notavam-se abundantes imagens de eri-trofagocitose por macrófagos. Estavam presentes três micrometástases do tumor testicular, em posição predo-minantemente subcapsular (seio subcapsular).

Pulmão - Notava-se congestão dos capilares interal-veolares. O lúmen de muitos alvéolos estava ocupado por um exsudado fibrinoso ou fibrino-hemorrágico. No lúmen dos brônquios e bronquíolos notavam-se rolhões de fibrina e muco, encerrando alguns eritrócitos e célu-las inflamatórias, a par de descamação do epitélio da mucosa brônquica (bronquite e bronquiolite). Obser-vava-se também hiperplasia moderada das glândulas brônquicas. Uma veia de médio calibre encerrava um trombo.

Exame imunocitoquímico

Exame do tumorAnticorpo anti-NSE (BBS/NC/VI-H14) - Este anti-

corpo marcou homogeneamente o citoplasma das célu-

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las tumorais testiculares (Figura 5) e das células volu-mosas de citoplasma vacuolizado. O padrão de marca-ção ao longo do corte era heterogéneo, havendo algu-mas zonas com células neoplásicas não marcadas (mar-cação global do corte: ++++). O mesmo padrão foi observado nas metástases hepática e esplénica, embora as áreas não marcadas fossem mais vastas do que as observadas no testículo (baço: +++; fígado: +++). Os controlos positivos internos (ou intrínsecos) eram cons-tituídos no testículo por terminações nervosas no mús-culo liso dos ductos eferentes, no baço por linfócitos da polpa branca e no fígado por fibras nervosas dos espaços porta. Estes controlos internos foram marca-dos pelo anticorpo anti-NSE.

Anticorpo anti-vimentina (Vim 3B4) - O citoplasma das células neoplásicas testiculares foi marcado homo-geneamente em pequenos focos celulares (marcação +/-). Na metástase esplénica, o padrão de marcação foi semelhante ao testicular (marcação ++). Na metás-tase hepática, só raras células isoladas foram marcadas (marcação +/--). Os controlos positivos internos foram fornecidos pelos endotélios vasculares e fibroblastos, que não foram marcados no caso do baço e do fígado, e muito poucos apresentaram marcação no testículo.

Anticorpo anti-citoqueratinas (MNF116) – As célu-

rentes (testículo) e da cápsula esplénica. O fígado não apresentava controlos internos positivos adequados (os ramos da artéria hepática localizados nos espaços porta dispunham de uma túnica média pouco evidente).

Exame dos tecidos testiculares normaisAs células de Sertoli só foram marcadas pelo anti-

corpo anti-NSE, adquirindo o citoplasma um padrão de marcação homogéneo e finamente granuloso (marca-ção: ++++). As células germinais não foram marcadas por nenhum dos quatro anticorpos monoclonais utili-zados.

Discussão

Há que considerar dois factores para a possível expli-cação da raridade dos tumores testiculares no gato:

a) O mais óbvio é a castração a que são submetidos muitos gatos (Brodey, 1970; Burke, 1976; Withrow e Reeves, 1996). Como exemplo, pode citar-se a obser-vação de Cotchin (1957) de que em 457 felinos do sexo masculino ingressados num Hospital Veterinário da Grã-Bretanha para exames clínicos, 61 % eram cas-trados.

b) Outro factor residirá numa característica fisioló-gica / fisiopatológica inerente à espécie (Felis catus domesticus) presentemente desconhecida, hipótese alu-dida por Bloom (1954) e Ladds (1985).

Os sertolinomas pouco diferenciados podem asse-melhar-se a seminomas (Bloom, 1954; Scudamore e Meredith, 2001). Apesar de o sertolinoma deste caso ser pouco diferenciado, o fenótipo histológico das suas células (nomeadamente a disposição em paliçada das células periféricas dos cordões neoplásicos) sugere este tipo de tumor. Além disso, as mitoses são pouco fre-quentes (tal como sucede com o sertolinoma de outras espécies e ao contrário do que acontece com o semi-noma - Bloom, 1954; Nielsen e Lein, 1974; Meier e Hauser, 1998) e não se observam as infiltrações linfoci-tárias que são comuns nos seminomas caninos (Bloom, 1954; Nielsen e Lein, 1974; Meier e Hauser, 1998) e

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Figura 5 - O citoplasma das células tumorais é marcado homogeneamente pelo anticorpo anti-NSE. Os fibroblastos dos septos conjuntivos (contro-los internos negativos) não são marcados. Coloração imunocitoquímica. Objectiva x 40.

las neoplásicas testiculares e as das metástases hepática e esplénica não foram marcadas (marcação: -). Con-tudo, este anticorpo marcou células epiteliais (colora-ção ++++ = 100%), como as da rete testis, da lamina epithelialis mucosae dos ductos eferentes, os hepatóci-tos e o mesotélio da cápsula esplénica (controlos posi-tivos internos, respectivamente, do testículo, fígado e baço). Notaram-se descontinuidades no revestimento da rete testis, devidas a invasão desta pelas células tumo-rais (Figura 6).

Anticorpo anti-desmina (DE-R-11) - Tal como acon-teceu com o MNF116, as células neoplásicas do tumor primário e das metástases não foram marcadas (marca-ção: -). O controlo interno positivo foi constituído pelos miócitos lisos da túnica muscular dos ductos efe-

Figura 6 - Marcação pelo soro MNF116. As células epiteliais do ducto da rete testis são marcadas, notando-se descontinuidade do revestimento epitelial à direita devido a invasão por células tumorais não marcadas. Objectiva x 40.

humanos (Cotran et al., 1999). Estas três característi-cas morfológicas permitem um diagnóstico diferencial relativamente seguro em relação ao seminoma. Todavia, no caso presente, os cordões de células tumorais eram separados frequentemente por septos finos de tecido conjuntivo, ao contrário do que sucede na maioria dos sertolinomas, em que os septos intercordonais são espessos (Kennedy et al., 1998; Acland, 2000). Assim, a coloração de rotina pela hematoxilina de Ehrlich - eritrosina não permitiu a elaboração de um diagnóstico realmente definitivo.

Para se poderem interpretar os dados imunocitoquí-micos relativos a um tumor, deve ter-se previamente em conta as características da substância química pes-quisada nos tecidos correspondentes normais (de las Mulas et al., 1995). As informações bibliográficas sobre a imunocitoquímica do testículo normal do gato e do cão é presentemente muito escassa. O autor só tem conhecimento de um estudo relativo ao cão, o de Pat-naik e Mostofi (1993), e de dois relativos ao gato (Scu-damore e Meredith, 2001; Silva, 2001).

No exame imunocitoquímico, os dois testículos-con-trolo normais apresentaram um padrão de marcação, no que respeita aos anticorpos anti-NSE e anti-vimentina, semelhante ao observado por Scudamore e Meredith (2001).

Enquanto que as células de Sertoli normais não foram marcadas pelo soro anti-vimentina (ao contrário do que sucede no cão - Patnaik e Mostofi, 1993 - e no homem - Achtstätter et al., 1985), as células de Sertoli tumorais deste caso apresentaram marcação. É possível que as células de Sertoli normais do gato possuam vimentina cujos epítopos estejam mascarados por outras molécu-las (iões, proteínas) e que se dê a exposição desses epí-topos com a transformação tumoral. Outra hipótese será uma possível alteração estrutural do epítopo com a alte-ração neoplásica (Schaafsma et al., 1989).

A marcação das células neoplásicas pelos soros pri-mários anti-NSE e anti-vimentina mostrou-se seme-lhante à que se observa no sertolinoma do cão (Patnaik e Mostofi, 1993). Nesta espécie, as células tumorais do seminoma não são marcadas pelo soro anti-NSE e a marcação citoplásmica pelo soro anti-vimentina não é homogénea, apresentando-se sob a forma de um halo perinuclear (Patnaik e Mostofi, 1993). É interessante referir-se que, no seminoma humano, as células tumo-rais são marcadas pelo soro anti-NSE (Ujie e Monma, 1991), que, por sua vez, também marca alguns sertoli-nomas (Bufo et al., 1999).

Os agregados de células volumosas de citoplasma vacuolizado observados no tumor primário correspon-dem a células de Sertoli neoplásicas de citoplasma car-regado de finas gotículas lipídicas, como a análise imu-nocitoquímica mostrou (citoplasma positivo ao soro anti-NSE).

A marcação heterogénea ao longo do corte das célu-las tumorais pelos anticorpos anti-NSE e Vim 3B4 explica-se pela má conservação dos epítopos dos res-

pectivos antigénios, que é característica da fixação pelo formol a 10 %, sendo neste caso agravada pelo uso de formol não neutralizado (Battifora, 1991; Allsbrook e Simms, 1992; Werner et al., 2000). A conservação dos epítopos da vimentina era particularmente deficiente, visto que os controlos internos positivos (fibroblastos, células endoteliais) não foram marcados, enquanto que, num controlo externo positivo (endotélios, linfócitos e adipócitos de um corte de apêndice cecal humano), a marcação foi do tipo ++++.

Outro ponto a assinalar é o criptorquidismo unila-teral observado neste caso. Para Burke (1976), é uma situação que está longe de ser pouco comum. Contudo, Millis et al. (1992), num grupo de 1345 gatos, apenas detectaram 1,7 % de criptorquidismo. Segundo estes autores, desconhece-se presentemente se os testículos ectópicos felinos estão sujeitos a sofrer transformação neoplásica, tal como ocorre no cão. Devido ao que se observa nesta última espécie, Burke (1976) recomenda a remoção cirúrgica de testículos ectópicos no gato.

No cão, a percentagem de sertolinomas que metasti-zam é baixa (entre 2 e 15 % - Withrow e Reeves, 1996). Neste caso, notava-se metastização disseminada pelo corpo; já foram referidos casos de sertolinomas no gato com metástases (Meier, 1956; Baptista e Silva, 1985; O’Keefe, 1995).

25 a 50 % dos cães com sertolinoma apresentam sinais de feminização devido a um aumento de secre-ção de estrogéneos pelas células de Sertoli neoplásicas (Withrow e Reeves, 1996). Estas células, no indivíduo normal, segregam quantidades mínimas de estrogéneos para o sangue (Guyton, 1986; Wrobel e Dellmann, 1993). No gato do presente caso, não foram observados sinais de hiperestrogenismo, como ginecomastia, alo-pécia simétrica do abdómen ou diátese hemorrágica. A próstata não foi observada microscopicamente, mas o aspecto macroscópico não apresentava alterações dignas de registo (a metaplasia escamosa muitas vezes provoca um aumento de volume do órgão).

Segundo o sistema TNM adaptado para os animais domésticos (Johnston, 1993), o tumor deste caso é classificado como T3NXM1. É de referir que foi o exame imunocitoquímico que permitiu o estabeleci-mento do staging T3 (invasão da rete testis pela neo-plasia). Devido à existência de inúmeros nódulos de pequenas dimensões no espaço retroperitoneal, não se pôde avaliar os linfonodos regionais, de onde o NX.

Agradecimentos

O autor deseja agradecer ao Sr. Prof. Dr. Jorge Soares e à Sra. Profª. Drª. Odette de Almeida, respectivamente ex-Director e Directora do Serviço de Anatomia Pato-lógica do Instituto Português de Oncologia Francisco Gentil, de Lisboa, por terem gentilmente disponibili-zado os meios para a execução das marcações imuno-citoquímicas, à Sra. D. Paula Cardoso, que as realizou, ao Prof. Dr. Fernando Bernardo, pela digitalização de

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algumas imagens e à Drª. Sandra de Jesus, pela apre-sentação do caso.

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Summary: Preliminary results of sexing pre-implantation bovine embryos by PCR amplification of chromosome-Y specific DNA fragments of biopsy samples from embryos in vitro produced and from embryos recovered from superovulated dairy donors of commercial herds are reported for the first time in Portugal. In Experiment 1, 50 good quality, morula and blastocyst stage embryos originated from in vitro matured, fertilized and cultured oocytes were used, from which 48 (96 %) had a sex diagnosis. In Experiment 2, 86 good (n = 73) and poor (n = 13) quality embryos recovered from 13 superovulated dairy donors were sub-mitted to the sexing procedures. From these, 78 (90 %) had a sex diagnosis, although in 8 (9 %) of them an unambiguous diagno-sis could not be given. The embryos were recovered at the herd and transported to the laboratory. After the biopsy sample was obtained the embryos were frozen or sent back to the herds, at which time the sexing results were given by phone. The preg-nancy rate in 33 recipient heifers for good (n = 26) and poor (n = 7) quality embryos was 50 % and 14 %, respectively. Consid-ering the sex of the calves born, the accuracy of sexing was 93 % (13 out 14). In conclusion, the efficiency and accuracy of the sexing procedures are compatible with the commercial use of sexing in embryo transfer programs in dairy cattle.

Resumo: Neste artigo são apresentados os resultados prelimin-ares do primeiro programa português de sexagem de embriões pré-implantação de bovino, após amplificação por PCR de frag-mentos de ADN específicos do cromossoma Y, obtidos de bióp-sias de embriões produzidos in vitro e de embriões recolhidos de dadoras superovuladas. No Ensaio 1, 50 embriões de boa qual-idade, no estadio de mórula ou blastocisto, obtidos de oocitos maturados, fertilizados e cultivados in vitro foram submetidos a sexagem, 48 (96 %) dos quais tiveram diagnóstico do sexo. No ensaio 2, 86 embriões de boa (n = 73) e de má (n = 13) quali-dade, recolhidos de 13 dadoras superovuladas foram submetidos a sexagem. Destes 86 embriões, 78 (90 %) tiveram diagnóstico do sexo, mas em 8 (9 %) deles um diagnóstico inequívoco não pôde ser indicado. Os embriões foram recolhidos na vacaria e trans-portados ao laboratório. Após a obtenção da biópsia, os embriões foram congelados ou transportados para a respectiva vacaria, sendo o resultado da sexagem comunicado por telefone. A taxa de gestação de embriões de boa (n = 26) e má (n = 7) qualidade sub-metidos a biópsia e transferidos a fresco para 33 novilhas recep-toras foi de 50 % e de 14 %, respectivamente. Considerando o sexo dos vitelos nascidos, a precisão da sexagem foi de 93 % (13 em 14). Em conclusão, a eficiência e a precisão do método de sexagem são compatíveis com a sua utilização comercial.

Introduction

In Portugal, the actual dairy cattle industry places a much higher value in purebred female calves (for replacement or sale) than in male calves (virtually with no commercial value). Male calves born following the use of expensive reproductive technologies repre-sent a major economic loss for the herd. The use of sexed embryos can increase the economic efficiency of embryo transfer programs (Willett and Hillers, 1994) and the rate of genetic gain both at the herd and at the selection nucleus level (Colleau, 1991). Pre-implanta-tion bovine embryo sexing was achieved by cytoge-netic (Picard et al., 1985), immunological (Booman et al., 1989) and metabolic methods (Tiffin et al., 1991) or by using male-specific chromosomal DNA probes (Bondioli et al., 1989). However, only the use of chro-mosome-Y specific DNA probes, together with the use of the polymerase chain reaction (PCR) for the amplification of embryo-derived biopsy samples, pres-ent efficiency and running speed compatible with a non-research use (Herr and Reed, 1991; Bredbacka et al., 1995).

PCR amplification of DNA fragments allows for the use of a small size biopsy sample, which is of great value for early cleavage stage in vitro produced embryos (Macháty et al., 1993), for splitted embryos (Bredbacka et al., 1994), for parent donor embryos for cloning by nuclear transfer (Le Bourhis et al., 1998) or for multiple genotype analysis (such as sex, marker genes or abnormal genetic mutations) (Chrenek et al., 2001). The major drawbacks of embryo biopsy are the associated increased risk of contamination by patho-gens (IETS, 1998) and the decreased viability after freezing (Gustafsson et al., 1994; Thibier and Nibart, 1995; Shea, 1999).

After developing a commercially available sexing protocol in our laboratory we are now on a preliminary basis evaluating the efficiency of the sexing procedures

Preliminary report on sexing bovine pre-implantation embryos under the conditions of Portugal

Relatório preliminar da sexagem de embriões pré-implantação de bovino em Portugal

L. Lopes da Costa1, J. Chagas e Silva2, P. Diniz1, R. Cidadão2

1 Faculdade de Medicina Veterinária, núcleo de Reprodução – CIISA, Rua Prof. Cid dos Santos, Polo Universitário, Alto da Ajuda, 1300-477 Lisboa, Portugal

2 Divisão de Selecção e Reprodução Animal, Rua Elias Garcia 30, Venda Nova, 2704-507 Amadora, Portugal



RPCV (2002) 97 (542) 95-98

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RPCV (2002) 97 (542) 95-98Lopes da Costa, L., et al.

and the pregnancy rate of both in vitro and in vivo pro-duced biopsied pre-implantation bovine embryos.

Materials and methods

In Experiment 1, the efficiency of the sexing pro-cedures was evaluated in 50 in vitro produced bovine embryos. The in vitro embryo production system was that previously described (Marques et al., 1995) with minor modifications. In this system, oocytes aspirated from ovaries collected at slaughterhouse are in vitro matured and in vitro fertilized with in vitro capacitated sperm and the obtained zygotes are in vitro cultured in a granulosa cell monolayer co-culture system for 7 to 8 days. Only good quality (grades 1 and 2; IETS, 1998), compact morula or blastocyst stage embryos were used. In Experiment 2, the efficiency of the sexing procedures and the pregnancy rate of the sexed embryos were evaluated with in vivo produced bovine embryos (n = 86). Donor cows (n = 13) were superovulated, inseminated and the ova recovered 7 to 8 days later and evaluated for stage and quality, using methods previ-ously described (Lopes da Costa et al., 2001). At the herd, morula and blastocyst stage, embryos of good (n = 73) and poor (n = 13) quality (grades 1 to 3; IETS, 1998) were loaded in 0.25 ml French straws and then transported at environmental temperature to the labora-tory. After the biopsy was obtained the embryos were evaluated for quality and loaded in 0.25 ml French straws and were either frozen or transported back to the farm, at which time the results of sexing were given by phone. Upon this information, the farmer decided which embryos (number and sex) were to be trans-ferred. In order to make a preliminary evaluation of the pregnancy rate of fresh biopsied sexed embryos, trans-fers were done to previously selected recipient heifers (n = 33), according to methods described elsewhere (Lopes da Costa et al., 2001). Good (n = 26) and poor (n = 7) quality embryos were transferred.

The sexing procedures were those previously described by Herr and Reed (1991), and AB Technol-ogy (1993). Briefly, the embryos were washed in serum and BSA free medium and placed, one at each time, in a 50 µl medium micro-drop inside a 90 mm diameter Petri dish, under an inverted microscope (CK2, Olym-pus, Japan). A biopsy sample was obtained from each embryo using a microblade tool attached to a hydrau-lic micromanipulator (MO 155, Narishige, Japan). The biopsy sample size was about 5 % to 10 % of the embryo size (Figure 1a). For blastocyst stage embryos the biopsy was taken from the trophoectoderm cells (Figure 1b). The biopsy sample was then transferred into a capillar PCR tube containing cresol solution, after which the DNA Y-specific probe (YCD Reagent, AB Technology, Inc.) was added. After running the PCR program (1 hour) the contents of the capillar tubes were dispensed into the wells of a 3 % agarose gel. After electrophoresis (25 minutes), the gel was trans-

ferred to an UV transilluminator for reading. In each sexing session, three controls were run (no DNA con-tent, male and female controls). The presence of a non-specific DNA band and of a primer band indicated that a viable biopsy sample and an active DNA probe were present in the reaction tube, respectively. A spe-cific band identified the male biopsy samples, while the female biopsy samples were identified by the absence of this band (Figure 2).

Figure 1 - a) Morula stage, good quality embryo recovered from a superovulated cow, after the biopsy procedure. The biopsy sample is about 10 % (6 to 8 blastomeres) of the main embryonic mass. The zona pelucida is sectioned and two fragments of it are shown on each side of the biopsy sample.b) Blastocyst stage, good quality embryo obtained by in vitro pro-cedures. The microblade is cutting a biopsy sample from the tro-phoectoderm cells.

a

b

Figure 2 - Photograph of the agarose gel after electrophoresis of one sexing session of embryos from a superovulated donor. In positions 1 and 2 the no DNA control (only the primer bands are present); in position 3 the male control (from up to down, the inespecific autosomal DNA band, the Y-chromosome specific band and the primer band); in position 6 the female control (up, the inespecific autosomal DNA band and down, the primer band); in positions 4,5,8,9 and 13, male diagnosis; in positions 7,10 and 11, female diagnosis; in position 12, a result of no diagnosis (absence of DNA bands).

Lopes da Costa L1, Chagas e Silva J2, Diniz, P1, Cidadão R2

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The efficiency of the sexing procedures was mea-sured by the percentage of embryos with a sex diag-nosis and by the accuracy of sexing for embryos that developed to term. Pregnancy diagnosis of recipients was done at 60 days of gestation by ultrasound and the calving dates and the sex of the calves recorded. Data were analysed by standard descriptive statistical methods and Chi square tests.

Results

In both experiments no DNA contamination was detected as judged by the controls run in each session. The efficiency of the sexing procedures is shown in Table 1. In Experiment 1, 48 out 50 (96 %) in vitro derived embryos had a sex diagnosis. In Experiment 2, 78 out 86 embryos (90.1 %) had a sex diagnosis. However, in 8 of these 78 embryos, the biopsy samples developed faint male-specific bands, therefore only 78 out 86 (81 %) biopsies originated an unambiguous sex diagnosis. The sex of these embryos was subjectively assigned as probable male (n = 5) or probable female (n = 3), depending on the presence or almost absence of the band, respectively. The biopsy samples of the remaining 8 embryos did not develop bands, so a sex diagnosis could not be given. The percentage of embryos with no sex diagnosis was higher, although not significantly, for poor quality embryos than for good quality embryos (23.1 % versus 6.8 %, respec-tively).

by Macháty et al. (1993): 95 %. For embryos recovered from superovulated donors, the efficiency obtained in this experiment was 81 %. This is lower than that reported in other studies (Le Bourhis et al., 1998: 90 %; Thibier and Nibart, 1995: 95 %). However, in a large six-year retrospective study reported by Shea et al. (1999), the between-year variation of the percent-age of biopsy samples with undetermined sex ranged from 6 % to 18 %. Only a few studies (Thibier and Nibart, 1995) report the percentage of biopsies that give ambiguous sex diagnosis 2 %. If these are included, the efficiency of sexing of this experiment raises to 90 %.

An ambiguous sex diagnosis was obtained from 9 % of the in vivo embryos. Faint male-specific bands might be produced by an incomplete PCR amplifica-tion reaction, by a too small size biopsy sample or by a degenerated biopsy sample. Alternatively, non-specific bands might be produced due to DNA contamination or to irregular migration after electrophoresis. This latter was probably the case of the embryo diagnosed as probable female that originated a male calf, as no DNA contamination was detected in all sexing sessions. Thi-bier and Nibart (1995) reported that whenever the sex diagnosis is not straight forward, no attempt should be made to assign a sex to the embryo.

Absence of non-specific, male-specific and primer bands is observed in cases where the amplification of reaction products by PCR does not occur or in cases of fail to dispense the biopsy sample into the PCR reac-tion tube. This latter is a particularly sensitive step of the sexing procedure when using capillar PCR tubes and was a probable cause for the absence of a sex diag-nosis of 4 % and 9 % of the in vitro and of the in vivo produced embryos, respectively. In poor quality embryos, in order to do not further compromise their viability, the biopsy sample consisted mainly of degen-erated cells excluded from the main embryonic mass. The DNA of these dead or degenerated cells could be already denaturated, which could affect the PCR ampli-fication.

Embryo quality prior to sexing affected the in vivo survival of the transferred embryos, as also reported by Thibier and Nibart (1995). The pregnancy rate of freshly transferred good quality biopsied embryos into recipient heifers was 50 %, which is similar to that reported by others (Gustafsson et al, 1994: 39 %; Thi-bier and Nibart, 1995: 53 %; Shea, 1999: 56 %). The sexing accuracy here obtained (93 %) is identical to that reported by Shea (1999).

One problem faced by the team was that farmers wanted all embryos to be sexed, irrespective of their quality. The results showed that poor quality embryos gave a higher percentage of no sex diagnosis and a lower pregnancy rate after transfer, compared to good quality embryos. Also, it is expected that poor quality embryos are not suitable for freezing. Therefore, the number of offspring of the desired sex from donors that yield a low percentage of good quality embryos can be

Table 1 Efficiency of sexing dairy cattle embryos. Sex diagnosisEmbryo Quality n Unambiguous Ambiguous* No diagnosisIn vitro Good 50 48 (96.0 %) 0 2 (4.0 %)In vivo Good 73 61 (83.6 %) 7 (9.6 %) 5 (6.8 %)In vivo Poor 13 9 (69.2 %) 1 (7.7 %) 3 (23.1 %)In vivo All 86 70 (81.0 %) 8 (9.0 %) 8 (9.0 %)* Embryo assigned as probable male or probable female

Table 2 Accuracy of sexing of dairy cattle embryos.Embryo sexing diagnosis n Calvings Correct DiagnosisFemale 22 10 10 (100 %)Probable female 3 2 1 (50 %)Male 4 1 1 (100 %)Probable male 3 1 1 (100 %)No diagnosis 1 0 -Total 40 14 13 (93 %)

The pregnancy rate in recipient heifers was 50 % and 14 % for good and poor quality embryos, respectively. Considering the sex of the calves born, the accuracy of sexing was 93 % (13 out 14; Table 2). One embryo assigned as probable female originated a male calf.

Discussion

The efficiency of the sexing procedures in providing an unambiguous sex diagnosis here reported for in vitro produced embryos (96 %) is similar to that described


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quite low. This might give a negative perspective of the technique to the farmers.

Distance between the herd and the lab is also of prac-tical importance. For herds far from the lab (say over 2 to 3 hours travel), fresh transfers after returning to the herd (about 8 to 10 hours after embryo recovery) might negatively affect embryo survival. However, freezing also negatively affects in vivo survival of biopsied sexed embryos (Gustafsson et al., 1994; Thibier and Nibart, 1995; Shea, 1999). These aspects are currently being evaluated under the conditions of Portugal. Another possibility is to perform the biopsies at the farm level, freeze the embryos, hard-freeze the biopsies and send them to lab for sex diagnosis (Thibier and Nibart, 1995).

In conclusion, the efficiency and accuracy of the sexing procedures are compatible with the commercial use of sexing in embryo transfer programs in dairy cattle.

Acknowledgements: The development of the sexing techniques was funded by a CIISA research project (CIISA 21-Sexagem).

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19

SUPLEMENTO R E V I S T A P O R T U G U E S ADE


TUMORES Y NÓDULOS CUTÁNEOS. PROTO-COLO PRÁCTICO DE DIAGNÓSTICO Y TRATA-MENTO

Luís FerrerUniversitat Autònoma de Barcelona, Barcelona, España

Introducción1. Los nódulos y tumores son un motivo frecuente de

consulta com el veterinario. Los tumores cutáneos son los primeros por su incidencia en el perro (700 casos/10000/año) y los segundos en el gato.

2. Hay que diferenciar tumores y neoplasias; aunque los términos se utilizan de forma indistinta en la prá-tica.

3. El protocolo de diagnóstico es el mismo en todos los casos de nódulos (simples o múltiples), tumores, neoplasias y quistes.

4. Antes de detallar el protocolo es importante señalar unos principios básicos: a) la gran mayoría de tumores/neoplasias cutáneas son curables si se actúa adcuada-mente. El pronóstico depende, sobre todo de la actua-cíon del clínico, no del tipo de neoplasia; b) es impor-tante actuar de forma rápida; no hay que observar los tumores. El diagnóstico y el tratamento precoces son las mejores armas; c) la oncología no es sólo un tema de especialistas. La mayor posibilidad de curar una neo-plasia cutánea la tiene el veterinário generalista cuando lo detecta a tiempo y actúa correctamente; d) la citolo-gía y la histopatología son los procedimentos diagnós-ticos clave en el diagnóstico y tratamiento de las neo-plasias cutáneas. Si no se realizam, todos los otros pro-cedimentos son inútiles.

5. El protocolo de diagnóstico es, en esencia, el mismo que se utiliza en otros procesos y presentaciones dermatológicas.

Protocolo de diagnóstico1. Incluye: historia clínica completa, examen físico

general y dermatológico, pruebas diagnósticas y trata-miento.

2. En la historia clínica, además de recoger la infor-mación general sobre el paciente y sus antecedentes hay que considerar desde cuando existen los nódulos o tumores y cual há sido la velocidad de crecimiento de

los mismos. Hay que investigar también la existencia de signos o alteraciones extracutáneos.

3. El examen clínico debe ser completo y há de incluir el examen físico general (la neoplasia cutánea puede ser una metástasis o generar metástasis internas) y derma-tológico (localización, número y tamaño de los tumores, movilidad, adherencias, linfadenopatías). Una vez aca-bado, si se sospecha una neoplasia hay que realizar una clasificación de la misma utilizando el sistema TNM.

4. En todos los casos hay que realizar una citología por aspiración de los nódulos y un estudio histopatoló-gico.

5. El examen citológico permite en la mayoría de casos: i) saber si se trata de un nódulo inflamatorio o neoplásico, ii) identificar el tipo de inflamación (puru-lenta, eosinofílica, piogranulomatosa, granulomatosa) o de neoplasia (de células epiteliales, de células fusifor-mes o de células redondas) y, en caso de neoplasia, fre-cuentemente permite predecir si se trata de un proceso benigno o maligno (criterios de malignidad). En oca-siones (mastocitoma, leishmaniosis,...) la citología per-mite un llegar casi al diagnóstico definitivo.

6. La citología no es una alternativa al estudio histo-patológico, que debe realizarse en todos los casos. Si el tumor es accesible y de pequeñas dimensiones, el estudio histopatológico puede realizarse después de la extirpación quirúrgica. En caso de neoplasias de gran-des dimensiones, de tumores múltiples, de neoplasias que obliguen a un tratamiento muy agresivo (amputa-ción, quimioterapia,...) el estudio debe hacerse también antes de la extirpación. Si el nódulo regional aparece aumentado de tamaño, también debe examinarse citoló-gicamente.

7. El estudio histopatológico debe informar de: natu-raleza inflamatoria, hiperplásica o neoplásica del tumor; tipo de neoplasia – nombre-; benignidad/malignidad; grado histológico (si existe para este tipo de neoplasia); invasión de tejidos próximos y de los bordes de resec-ción. Si se há extirpado el nódulo linfático, éste debe también examinarse histológicamente.

8. En ocasiones puede estar indicado utilizar, méto-dos de diagnóstico por imagen (RX, ecografía, TAC, RNM) para completar el diagnóstico.

Tratamiento1. En la gran mayoría de casos el tratamiento de elec-

ción consiste en la extirpación quirúrgica completa de los tumores. Com la extirpación se persigue la curación

X Encontro da Sociedade Portuguesa de Patologia Animal (Porto, 18-19 de Abril de 2002)

Palestras

20

definitiva, lo cual se consigue en aquellas neoplasias en las que no se han producido todavía metástasis ni gan-glionares ni distantes.

2. En casos en los que se sospecha una neoplasia de baja malignidad se extirpa de forma completa el tumor, com un margen en toda la periferia el mismo de 1 cm de tejido sano como mínino. En sospechas de neopla-sias malignas o com tendencia a la recidiva se amplía el margen (3 cm) o se realiza una cirugía radical o en bloc. Es muy importante el seguimeinto histológico de la extirpación (bordes de resección). Si los bordes apa-recen infiltrados por células neoplásicas hay que inter-venir en seguida, no hay que esperar a la recidiva.

3. Algunas neoplasias se tratan com quimioterapia: tumor venéreo trasmisible (vincristina), mastocitoma (cirugía-quimioterapia-radioterapia), linfomas (quimio-terapia de combinación), histiocitosis (leflunomida).

LEISHMANIOSIS CANINA: ACTUALIZACIÓN EN DIAGNÓSTICO Y TERAPÉUTICA

Lluís FerrerUniversitat Autònoma de Barcelona, Barcelona, España

IntroducciónEn los últimos años se ha producido una revisión de

los grandes paradigmas de las enfermedades infeccio-sas. Pensemos, que las bases de la comprensión, diag-nóstico y tratamiento de las enfermedades infecciosas fueron establecidos hace más de un siglo, por los padres de la microbiología (Postulados de Koch). En primer lugar, los límites entre las enfermedades infecciosas y las enfermedades no infecciosas se han difuminado. Se ha demostrado que agentes infecciosos son la causa (o una de las causas) de enfermedades hasta ahora con-sideradas de etiología no infecciosa. Un ejemplo es la participación de Helicobacter pylori en la patogenia de las úlceras gástricas de las personas.

En segundo lugar, la relación entre infección y enfer-medad se ha vuelto más compleja. El esquema simple de contagio, infección y enfermedad se ha demostrado incorrecto en muchos casos. Por ejemplo, se ha com-probado que no todos los perros infectados con Borre-lia spp. desarrollan la enfermedad de Lyme; muchas infecciones tienen un curso asintomático.

Finalmente, parece que la curación clínica no siempre va asociada a la completa eliminación del agente infec-cioso. Cuando se aplican técnicas de elevada sensibi-lidad (PCR, nested PCR) es posible detectar los agen-tes infecciosos mucho después del tratamiento y de la curación clínica.

La leishmaniosis canina constituye un excelente ejem-plo de estos cambios conceptuales. La forma en que entendíamos la que es, probablemente, la enfermedad más importante del perro en la zona mediterránea, ha cambiado substancialmente. Hay un nuevo paradigma,

que explica mejor los hallazgos de cada día de la clí-nica y que tiene notables implicaciones diagnósticas y terapéuticas.

El viejo paradigma y el cambioHasta ahora hemos considerado que:1. La prevalencia de enfermedad en la zona mediter-

ránea era de un 5% y la seroprevalencia algo mayor, en torno al 10%.

2. La mayoría (si no todos) de los perros infectados desarrollaban la enfermedad (a diferencia de lo que ocurría en los seres humanos)

3. Los animales infectados desarrollaban una res-puesta humoral y se hacían seropositivos

Sin embargo, dos líneas de investigación han cam-biado estos postulados. Primero, los inmunólogos demostraron en el modelo experimental con L. major en el ratón que la respuesta inmunitaria juega un papel principal en la evolución de la infección. Así, en los ratones de líneas genéticas con deficiencias en la inmu-nidad celular (como la línea BALB/c) la infección progresa y aparece una grave enfermedad sistémica. Estos animales desarrollan una respuesta inmune de tipo humoral (T-helper 1) caracterizada por la produc-ción de anticuerpos, que resulta ineficaz. Por el con-trario, los animales de las líneas normales controlan la infección mediante una respuesta de tipo celular (Thel-per-2). En este caso se activan linfocitos T (CD4+) que producen gamma-interferon, el cual activa los macró-fagos capacitándolos para destruir los amastigotes. La base genética es, por tanto, fundamental en el control de la respuesta inmune y, a su vez, ésta es el principal factor del que depende la evolución de la infección.

Más tarde se demostró, en un modelo experimental, que la situación en el perro es muy similar a la del ratón: no todos los perros infectados desarrollaban la enfermedad. Además, los perros enfermos presentaban una respuesta inmune de tipo humoral, mientras que los animales resistentes presentaban una respuesta de tipo celular (T-helper1; con fuerte producción de gamma-interferon). Diferentes grupos de investigación (varios en España) demostraron también que los perros se com-portan de la misma forma en la infección natural.

Simultáneamente los estudios epidemiológicos demos-traron que la incidencia de la infección es mucho más elevada de lo que se pensaba con anterioridad. Por ejemplo, un estudio realizado en Mallorca mediante el uso de la PCR en diferentes tejidos demostró que 2 de cada 3 perros se infectan con Leishmania. La gran mayoría de estos animales infectados persisten asinto-máticos. Estudios similares realizados en el sur de Fran-cia y en Portugal obtuvieron resultados parecidos.

Finalmente, ambas líneas de investigación convergie-ron cuando se comprobó que los perros infectados que no desarrollaban la enfermedad tenían una respuesta inmune de tipo celular, efectiva y eran seronegativos mientras que los animales enfermos presentaban una respuesta humoral intensa (eran seropositivos) y pre-

SUPLEMENTO RPCV (2002) SUPL. 118: 17-46

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sentaban una débil respuesta inmune celular. La situa-ción en la población de perros probablemente no está tan polarizada como en los experimentos en ratones, hecho comprensible dada la existencia de muchas más variables en el campo que en el laboratorio (diversidad genética, variación en la infección, reinfecciones, infec-ciones concomitantes,...). En resumen, el nuevo para-digma estaba creado.

El nuevo paradigma

Puede resumirse de la siguiente forma:1. La prevalencia de la infección es mucho mayor que

lo que se suponía; probablemente, en zonas endémicas, más del 50% de perros se infectan.

2. Un buen porcentaje de los perros infectados eli-mina la infección o bien persiste sin síntomas clínicos (en cualquier caso no enferman). La prevalencia de la enfermedad se sitúa entre el 5% y el 10%.

3. Los animales infectados y asintomáticos presentan una respuesta celular específica frente a Leishmania y suelen ser seronegativos o presentar un título bajo de anticuerpos.

4. Los animales infectados enfermos presentan una respuesta de tipo humoral (son seropositivos) y una res-puesta de tipo celular nula o débil.

5. Un animal concreto puede cambiar de resistente a sensible y a la inversa. Factores como tratamientos far-macológicos, infecciones, inmunosupresiones, neopla-sias,... pueden cambiar el tipo de respuesta.

Implicaciones en el diagnóstico1. El diagnóstico es complejo. Hay que interpretar los

resultados de cada técnica adecuadamente. Por ejem-plo, una PCR positiva indica, únicamente, que el animal está infectado (como un frotis de MO positivo). Una serología positiva indica que ha habido infección y una respuesta de tipo humoral, de diferente magnitud en función del título (títulos muy elevados casi siempre van asociados a la enfermedad, títulos bajos o medios, no siempre).

2. El diagnóstico de leishmaniosis es siempre clínico; fundamentado en diferentes análisis, pero clínico. No hay una sola prueba que permita decir, sin explorar un perro, si el animal padece la enfermedad o no (no la infección).

3. Lo más adecuado es utilizar pruebas de diagnós-tico (de infección, de anticuerpos,..) sólo cuando el paciente muestra signos clínicos compatibles. El com-portamiento clínico a seguir en perros infectados pero clínicamente sanos es incierto. Son necesarios más datos para disponer de recomendaciones de fundamento científico.

4. Suele ser preciso combinar varias técnicas para establecer correctamente el diagnóstico. Las técnicas a utilizar se deciden en función del cuadro clínico y del paciente (por ej. en lesiones de piel una biopsia puede ser muy útil).

5. En muchos pacientes puede existir una causa aso-ciada a la infección, causa que es la responsable de la expresión clínica. La presencia de parasitosis, infeccio-nes hemáticas, malnutrición, neoplasias, tratamientos... deben investigarse en todo animal con leishmaniosis.

Implicaciones en el tratamiento1. La combinación de N-metil-glucamina (80-100mg/

kg/24 horas o mejor 40-50 mg/kg/12 horas; durante 1 mes) y alopurinol 10-20mg/kg/12 horas (mínimo 1 año) es muy efectiva en el control de la leishmaniosis. En casos de resistencia una alternativa es substituir la N-metil-glucamina por aminosidina o por anfotericina B.

2. Una alternativa que ya se está utilizando en medi-cina humana y que parece que pronto se comerciali-zará en veterinaria es la Miltefosina. Se trata de un alquil-fosfolípido de elevada actividad leishmanicida que además tiene la ventaja de la administración oral. En la actualidad se está determinando la dosis más ade-cuada para uso en el perro (probablemente en torno a los 2-3 mg/kg/día). Los principales efectos colaterales son gastrointestinales (vómitos, diarrea).

3. Hay que ser conscientes de que la eliminación defi-nitiva de la infección es muy rara sino imposible (múlti-ples estudios lo han demostrado). El tratamiento persi-gue reducir el número de parásitos y producir una fuerte recuperación de la respuesta inmune celular (linfocitos CD4 circulantes, test intradérmico con leishmanina, producción de gamma-interferon)

4. Tan importante como el tratamiento leishmanicida es el control de infecciones concomitantes (pioderma, ehrlichiosis,...) y el estado general del paciente.

5. El pronóstico debe emitirse de forma individua-lizada. La progresión de la respuesta inmune de tipo celular (incremento del test intradérmico, reducción del título de anticuerpos, aumento de los linfocitos CD4+ circulantes,...) es el mejor indicador de que el paciente avanza hacia la curación clínica.

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INFLAMMATORY SKIN DISEASES

Claudia von Tscharner, Monika Welle and Maja SuterInstitute for Animal Pathology, Interdisciplinary Dermatology Unit, Uni-versity of Bern

The pattern analysis approach to the diagnosis of inflammatory skin diseases in humans was invented by A.B. Ackermann in 1978. Pattern analysis is a morpho-logical approach rather than an etiologic or pathogenic one. The pattern concept was adapted for diagnostic veterinary dermatopathology and still is in a process of evolution.

The categories used in pattern analysis are as follows: 1) Perivascular dermatitis; 2) Interface dermatitis; 3) Vasculitis; 4) Intraepidermal vesicular/pustular derma-titis; 5) Subepidermal vesicular/pustular dermatitis; 6) Folliculitis, perifolliculitis and furunculosis; 7) Nodular and/or diffuse dermatitis; 8) Panniculitis; 9) Atrophic dermatosis.

Perivascular DermatitisTo understand this pattern one has to be familiar with

the normal vascular architecture in the skin. There are three major plexuses of blood vessels. The superficial plexus supplies, as is indicated by its name, the superfi-cial dermis and the epidermis. The middle plexus sends branches to the hair follicles and the adnexal glands. The deep plexus serves the deep dermis and the junc-tion of the panniculus.

You have to be aware of the fact that all inflamma-tory cells are initially located in a perivascular area, since they reach the skin by this way. Of all the inflam-matory reaction patterns, perivascular dermatitis is the most common and unfortunately the least diagnostic.

The diagnostic approach to pattern analysis includes:

1) Distribution of the infiltrateAccording to the involvement of the vascular plexu-

ses you find the following distribution patterns:- Superficial perivascular dermatitis à superficial

plexus only (all animals).- Periadnexal à middle plexus only (all animals).- Superficial and deep perivascular dermatitis à super-

ficial and deep plexus - exclusively (cat and horse).


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- Deep perivascular dermatitis à all three plexuses involved (all animals, but mainly dog).

In a chronic stage the distribution of the infiltrate often becomes so-called ‘interstitial’. This means, that the inflammatory cells migrate in the dermis between the collagen fibers.

2) Nature of the infiltrateThe perivascular infiltrate is invariably mixed.- Neutrophils indicate that the lesion is either acute or

ongoing (chronic-active). In the later mononuclear cells (lymphocytes and plasma cells) are mixed with neutro-phils. Neutrophils indicate often the presence of pyoge-nic bacteria (skin disease with microbial aetiology or self trauma).

- Lymphocytes are present in the normal dermis and belong to the skin-associated lymphoid system (SALT). It is important to have a “feeling” about the normal background population of lymphocytes. Increased num-bers of lymphocytes and plasma cells in skin lesions indicate na immune response to strong antigenic sti-muli.

- Predominance of plasma cells is mainly associated with chronic bacterial infections.

- In the dog, large numbers of eosinophils suggest ectoparasites, fleabite hypersensitivity, food allergy or herpesvirus infection in cats. In the cat mast cells are often predominating these latter lesions. In the cat, horse and bovine eosinophils are frequent and often difficult to interpret. Especially in the horse eosinophils are seen in most skin biopsies.

- In the dog, mast cells are increase in allergic derma-titis, while in the cat they are normally quite frequent in the dermis.

3) Associated epidermal changesa) Hyperkeratosis:This is an increased thickening of the cornified layer

due to increased epidermal turnover or delayed she-dding of squames. Two different types of hyperkera-tosis are known: orthokeratotic (anuclear, keratinised cells) or parakeratotic (nucleated, abnormally keratini-sed cells). Changes can be generalised or focal. Ortho- and parakeratotic hyperkeratosis occurring in alterna-ting layers are indicative of episodic changes in epider-mopoiesis.

In orthokeratotic hyperkeratosis it is important to dis-tinguish between basket-weave and compact hyperkera-tosis. Basket-weave hyperkeratosis is frequently seen in endocrine dermatosis, seborrhoea and dermatophytosis. Compact hyperkeratosis is a sign of long-term external trauma to the skin (pruritus à licking). Mild ichthyosis in the Golden Retriever presents with compact orthoke-ratotic hyperkeratosis only.

Parakeratosis indicates abnormal cornification and results in the retention of pyknotic nuclei in the corni-fied layer. If the parakeratosis is patchy and in conjunc-tion with spongiosis it is part of the dermatitis reaction. Special attention should be given when the parakerato-

sis is widespread, involves the follicular ostia, or is not associated with spongiosis.

Then think of:- Superficial necrolytic dermatitis (hepatocutaneous

syndrome)- Zinc -responsive dermatosis- Thallium poisoningb) Hyperplasia of the epidermis:Epidermal hyperplasia is an increase in thickness of

the epidermis due to na increase in the number of kera-tinocytes. Epidermal hyperplasia is also known as acan-thosis but this term refers only to hyperplasia of the stratum spinosum. Epidermal hyperplasia is the result of a rapid response of the epidermis to injury. signi-ficance. The most recent classification (A.A.Stannard, ESVD 1995) is as follows:

Regular: diffuse uniform increase in thickness without formation of rete ridges.

Irregular: formation of rete ridges, uneven in shape and depth of dermal penetration.

Psoriasiform: rete ridges of even width and depth.Papillated: epidermis develops a folded appearance

with projections above the normal skin surface.Pseudo-epitheliomatous: invasive form of acanthosis

simulating a squamous cell carcinoma. Occurs most often at the borders of chronic ulcerations.

c) Oedema of the epidermis:Intercellular oedema in the epidermis = Spongiosis.Spongiosis results in the separation of keratinocytes

by oedema fluid and can lead to formation of spongio-tic vesicles. It is common in various inflammatory pro-cesses and non-diagnostic. If it is associated with other diagnostic features the following should be considered:

- All acute inflammatory processes.- Patchy spongiosis in conjunction with lymphocytic

exocytosis à think of Malassezia dermatitis or atopic dermatitis.

- Diffuse spongiosis is seen particularly in: Feline eosinophilic plaques; Zinc-responsive dermatosis; Irri-tant contact dermatitis.

d) Intracellular Oedema:Epidermal intracellular oedema represents a degenera-

tive change of keratinocytes with formation of vacuoles.Hydropic degeneration (intracellular oedema); mainly

of importynce if affecting the basal cell layer and the outer root sheath of the hair follicle à points directly to the interface group of dermatosis. It occurs in: Lupus erythematosus; Dermatomyositis; Drug erup-tions; Erythema multiforme; Paraneoplastic exfoliative dermatitis (thymoma).

“Epidermal Pallor” (intracellular edema of the stra-tum spinosum) has some diagnostic use. It occurs in: Superficial necrolytic dermatitis (hepatocutaneous syn-drome).

Ballooning Degeneration (intracellular edema in all layers of the epidermis) is seen only rarely. It occurs in: Viral infections (poxvirus, picornavirus, feline herpes-virus-1, papillomavirus).

e) Exocytosis:


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Migration of inflammatory cells into the epidermis. It is frequently associated with spongiosis. It occurs in: Any dermatitis.

Lymphocytic exocytosis is suggestive of: Atopic der-matitis; Malassezia infection; Epitheliotropic T-cell lymphoma (Mycosis fungoides); Cell-rich erythema multiforme.

Eosinophilic exocytosis is suggestive of: Allergic dermatitis (e.g. flea allergy); Sarcoptic mange; Other ectoparasites.

Neutrophilic exocytosis is suggestive of: Superficial bacterial infections.

f) Epidermal necrosis:Focal areas of necrosis in the epidermis and superfi-

cial dermis: Self trauma.‘Punched out’ area of necrosis in the epidermis and

dermis: Look for vasculitis.Widespread coagulation necrosis: Toxic epidermal

necrolysis (TEN); Thermal burns.g) Apoptotic cells:A rare apoptotic keratinocyte can be found in any

inflammatory skin disease. Larger numbers suggest: Erythema multiforme (entire epidermis) ; Epitheliotro-pic T-cell Lymphoma (entire epidermis); Systemic and cutaneous lupus erythematosus (basal cell layer); Der-matomyositis (basal cell layer).

Satellitosis describes the clustering of mononuclear cells around dead keratinocytes.

h) Acantholysis:Loss of cohesion between keratinocytes leads to intra-

epidermal vesicle formation with free, round kerati-nocytes within the vesicle. The free keratinocytes are called acantholytic cells. It occurs in: Pemphigus com-plex; Epidermal mycotic infections (Microsporum per-sicolor); Superficial bacterial skin infections.

Interface DermatitisThis reaction pattern means a lesion that targets the

lower level of the epidermis and the upper level of the dermis à interface.

The basal cell damage consists either of hydropic degeneration and/or apoptosis.

There are two types: Cell-poor (few inflammatory cells; main lesion are damaged basal cells); Cell-rich (band-like mononuclear infiltration at the dermo-epi-dermal junction obscuring the junction, in addition to basal cell damage).

You will also find “hydropic” for cell poor and “liche-noid” for cell rich in the literature. As lichenoid is used in different ways by different dermatopathologists, we prefer to classify interface dermatitis as cell-poor and cell-rich.

1) Cell-poor interface dermatitis- Dermatomyositis à pathogenesis is still controver-

sial [immune-mediated vasculitis (Julie Yager); infec-tious (Gail Kunkle); link to canine lupus (Anne Hargis and Lynn Schmeitzel].

- Drug eruption TEN-type à extensive coagulation necrosis of the epidermis, few or no inflammatory cells in the dermis. It is important to realise, that there are different histological patterns for drug eruptions.

- Feline exfoliative dermatitis associated with thy-moma à discrete lesions; hydropic degeneration of basal cells; apoptotic cells also suprabasal; mild mono-nuclear exocytosis.

- Vaccine-induced alopecia (vaccine-induced ische-mic dermatopathy) resembles dermatomyositis.

- Lupus erythematosus (CLE and SLE) à although in the majority of cases lupus is associated with a cell-rich interface dermatitis, especially the chronic form can be cell-poor.

2) Cell-rich interface dermatitisa) Infiltrate mainly lymphocytic- Systemic and cutaneous lupus erythematosus à

band-like infiltrate of lymphocytes with fewer numbers of plasma cells and occasional histiocytes and mast cells; hydropic degeneration and/or apoptosis of basal cells.

- Erythema multiforme (EM) à interface pattern with many apoptotic keratinocytes at all levels of the epider-mis.

- Epitheliotropic T-cell Lymphoma (Mycosis Fungoi-des) à not a dermatitis reaction but a neoplastic dise-ase; subepidermal band-like infiltration of neoplastic lymphocytes; lymphocytic exocytosis into all layers of the epidermis; apoptotic cells in spinous layer; Pautrier microabscesses can be present. In early stages, the dise-ase may be difficult to differentiate from a cell-rich interface dermatitis.

- Feline exfoliative dermatitis associated with thy-moma à although most cases are cell-poor, cell-rich forms have been seen.

b) Subepidermal band-like infiltrate without interface change

A band-like infiltrate can also occur without epider-mal damage. The inflammatory infiltrate does not obs-cure the dermo-epidermal junction:

- Most inflammatory lesions at the mucocutaneous junctions and at the footpads (Mucocutaneous pyo-derma; Plasmacellular pododermatitis).

- Band-like mastocellular infiltration in cats (Allergic dermatitis).

- Vogt-Koyanagi-Harada-like syndrome à band-like histiocytic infiltration at the dermo-epidermal junction . Histiocytes clearly predominate over lymphocytes and plasma cells; pigmentary incontinence; rarely apopto-tic keratinocytes in the basal cell layer may be present (mild sign of interface dermatitis).

VasculitisInflammatory cells infiltrate the vessel wall and accu-

mulate around the blood vessel. This is a very difficult diagnosis. Large or small vessels can be affected. The terms vasculopathy and vasculitis are used variably by


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pathologists. Some use “vasculitis“ only in cases with presence of inflammatory cells within the vascular wall. Cases with vascular wall damage but absence of intra-mural inflammatory cells are referred to as vasculopa-thy. Other pathologists use cell-rich vasculitis for the first and cell-poor vasculitis for the latter lesions.

The following diagnostic criteria are suggestive of a vasculitis: Areas of microhaemorrhage and “nuclear dust”; Tight perivascular cuffs of inflammatory cells in the deep dermis; Atrophic hair follicles (sign of hypo-xia); Sharply demarcated coagulation necrosis of the epidermis and the underlying dermis; Hyalinised colla-gen.

According to the inflammatory infiltrate the following types are recognised: Neutrophilic vasculitis (Immune-mediated; Drug-induced; Infectious (bacterial, viral) à leishmaniasis, rickettsiosis; Lupus erythematosus; Der-matomyositis; Leukocytoclastic vasculitis of the nose of Scottish Terriers; Plasmacellular pododermatitis; Cold agglutinin diseases; Septicemia.

Lymphocytic vasculitis: Drug induced; Dermatomyo-sitis; Rabies vaccine-induced panniculitis; Familial cuta-neous vasculopathy of German Shepherd dogs.

Eosinophilic vasculitis: Arthropod-/insect-induced eosinophilic pustular dermatitis and folliculitis; Culi-coides hypersensitivity; Habronemiasis; Collagenolytic granuloma.

Vasculopathy (cell poor): Dermatomyositis; Rabies vaccine-induced panniculitis; Solar-induced vasculopa-thy of the horse; Familial cutaneous vasculopathy of German Shepherd dogs; Lupoid dermatosis of dogs; Cutaneous and glomerular vasculitis in greyhounds; Vasculitis of the pastern area with dermatophilosis.

The leukocytoclastic type of the neutrophilic vasculi-tis is the most frequent form of vasculitis.

Intraepidermal vesicular/bullous and pustular dermatitis

Vesicles, bullae or pustules in the epidermis can be located in the different epidermal layers:

The following facts help to identify specific entities within this group of vesiculopustular disorders: Loca-tion (Subcorneal; Intragranular; Panepidermal; Supra-basilar).

The location is an important diagnostic or rule-out clue. It is therefore very important to biopsy intact vesi-cles, bullae or pustules if they are present.

Formation of vesicles and bullae by: Spongiosis; Intra-cellular oedema; Acantholysis; Cleavage (frictional).

Predominant cell type in pustules:Neutrophil-rich. This is the most common pattern,

and is a feature of superficial bacterial infections of the skin but also occurs in non-infectious conditions, inclu-ding some immune-mediated diseases (e.g. Pemphigus foliaceus).

Eosinophil-rich pustules most commonly occur in parasitic diseases but can also be seen in some allergic, autoimmune or idiopathic conditions.

Mononuclear cell-rich pustules are rare. They are also referred to as Pautrier’s microabscesses and are pathog-nomonic for epitheliotropic T-cell lymphoma (Mycosis Fungoides).

1) Intraepidermal pustular dermatitis predominantly neutrophilic

- Superficial pyoderma à pustules are commonly located subcorneal and filled with mature, often degene-rate neutrophils. Bacterial colonies are often not appa-rent in the pustule. The stratum spinosum at the base of the pustule is often spongiotic containing neutrophils. Inflammatory crusts with degenerate neutrophils mark the end stage of a previous pustule.

- Pemphigus foliaceus à (autoantibodies to Desmo-glein 1) pustules are located subcorneal or intragranu-lar in the epidermis or the infundibular epithelium of the follicles; acantholytic cells between well preserved neutrophils; band-like or superficial perivascular infil-trate consisting mainly of lymphocytes, plasma cells and mast cells with occasional neutrophils. In crusts the acantholytic cells are no longer viable and therefore have a pyknotic nucleus and a hypereosinophilic cyto-plasm.

2) Intraepidermal pustular dermatitis predominantly eosinophilic

Insect bite dermatitis à variety of insects involved; flea bite and sarcoptic mange lesions are common; microabscesses and spongiform pustules with eosino-phils; the main pattern is perivascular, eosinophil-rich.

3) Intraepidermal vesicular dermatitis with minimal inflammation

- Pemphigus vulgaris à (autoantibodies to Desmo-glein 3) suprabasilar clefts or vesicles with acantholytic cells; basal keratinocytes remain attached to the base-ment membrane like a row of “tombstones”.

- Paraneoplastic pemphigus à (autoantibodies against envo- and periplakin) suprabasal cleft formation like pemphigus vulgaris plus erythema multiforme-like lesions.

Subepidermal vesicular pustular dermatitis

This pattern is characterized by a split at the dermo-epidermal junction. The roof of the vesicle is made up of the full thickness epidermis The chief pitfall is artefactual separation of the dermis from the epidermis caused by poor biopsy technique or insufficient fixation. Subepdiermal vesicular diseases must also be differen-tiated from subepidermal blistering secondary to basal cells damage such as dermatomyositis, bullous lupus and bullous drug eruption. In these later diseases the blister roof is ragged, while in the real subepidermal vesicular diseases basal cells are intact and form a smooth surface of the blister roof. In addition, missing apoptosis of basal keratinocytes is an important diffe-


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rentiating feature. Differentiation within this group, however, is often only possible by using immunohisto-chemistry and/or molecular biological methods.

Autoimmune Diseases:- Bullous pemphigoid à (autoantibodies to NC16A

domain of BP II antigen = collagen XVII) vesicles and bullae in well selected biopsies. Because of the split formation in the lamina lucida, the PAS positive lamina densa lies at the base of the vesicle; eosinophils predo-minate within the vesicle/pustule; mild mixed cellular infiltration in the superficial dermis.

- Mucous membrane (cicatricial) pemphigoid à (auto-antibodies to collagen XVII, in the majority of cases the NC16A domain) lesions predominate in the oral cavity and also occur at mucocutaneous junctions and muco-sae; histologically blistering with no inflammation or few eosinophils, neutrophil and mononuclear cells in the vesicle; separation as in BP in the lamina lucida.

- Epidermolysis bullosa aquisita à (autoantibodies to collagen VII) separation within the anchoring fibers; the PAS positive lamina densa remains at the blister roof; mostly infiltration of neutrophils at the dermo-epider-mal junction before blister formation and therefore pus-tules filled with neutrophils early on in the blistering process; mild band-like predominantly marked neutro-philic infiltration in the superficial dermis.

- Linear IgA dermatosis à (autoantibodies to LAD-1 = soluble, extracellular part of collagen XVII) vesicle formation within the lamina lucida without inflamma-tory cells of with few neutrophils.

Inherited Blistering Diseases:- Junctional epidermolysis bullosa à (defect in ancho-

ring filament protein laminin-5), separation within the lamina lucida; epidermis and hair follicles can be invol-ved; no inflammatory infiltrate.

- Dystrophic epidermolysis bullosa à (inherited defect of collagen VII = anchoring fibers); separation within the sublamina densa, PAS positive lamina densa remains at the blister roof; blister formation without inflamma-tory cells initially.

Caution: secondary cleft formation after basal cell damage (blister roof is ragged and uneven): Der-matomyositis; Lupus erythematosus (bullous form); Bullous drug eruption; Sun induced blisters.

Perifolliculitis, folliculitis and furunculosis1) PerifolliculitisInflammation of the periadnexal vasculature without

involvement of the follicular wall. This can be a sign of an old folliculitis in remission, especially in conjunc-tion with perifollicular fibrosis and large numbers of plasma cells.

2) FolliculitisFolliculitis can be subdivided as follows: a) Mural

folliculitis; b) Luminal folliculitisMural folliculitis:Inflammation targets the wall of the follicle without

involvement of the follicular lumen.

a. Interface mural folliculitis- Demodicosis à often mild lymphocytic infiltration

of the upper portions of the hair follicle with vacuolar degeneration of basal cells; pigmentary incontinence around all parts of the follicle. This pattern is often the only one present with low numbers of mites.

- Lupus erythematosus à concurrent with epidermal lesions; vacuolar degeneration and/or apoptosis of basal cells; perifollicular band-like infiltrate of lymphocytes and plasma cells in cutaneous lupus.

- Erythema multiforme à similar to lupus, but trans-mural apoptosis in the follicular infundibulum

- Ischaemic dermatopathy à cell poor interface mural folliculitis; “fading follicles”. Dermatomyositis and rabies vaccine reaction are two examples.

- Dermatophytosis à interface vacuolar degeneration and mild lymphocytic infiltration.

b. Infiltrative mural folliculitis- Sebaceous adenitis à mild lymphocytic and/ or his-

tiocytic mural folliculitis in conjunction with sebaceous gland atrophy.

- Epitheliotropic T-cell lymphoma à Similar to the epidermis the follicular wall can be infiltrated by lym-phocytes. In some biopsies the follicular involvement is more prominent than the epidermal (this phenomenon is not restricted to feline mycosis fungoides).

- Feline idiopathic mural folliculitis à lymphocytic and histiocytic infiltration of the follicular wall. This is still a poorly defined disease. Some cases probably match into the sebaceous adenitis category, others into mycosis fungoides.

- Equine linear alopecia à severe infiltration of mainly lymphocytes, some histiocytes and giant cells through the entire follicular wall of the infundibulum and isth-mus; progression to follicular degeneration.

- Pseudopelade à (autoimmune reaction against the follicular epithelium of the isthmus) predominantly lymphocytic mural infiltration.

c. Necrotizing mural folliculitis- Eosinophilic furunculosis à severe eosinophilic

infiltration and destruction of the follicular wall; nodu-lar to diffuse dermatitis with eosinophils predominant. This lesions result often from insect bites or stings.

- Feline Mosquito bite hypersensitivity à similar to canine eosinophilic furunculosis but less severe follicu-lar involvement; follicular rupture is absent.

- Equine Culicoides hypersensitivity à in some cases similar lesions as described under feline mosquito bite hypersensitivity.

- Feline idiopathic destructive folliculitis à severe mixed infiltration of the isthmus with destruction of the follicular wall; variable, often striking follicular mucin deposition (also called: feline degenerative mucinotic mural folliculitis).

d. Pustular mural folliculitisFrequent pattern in pemphigus foliaceus and erythe-

matosus; pustules have the same morphology as in the epidermis.


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e. BulbitisAlopecia areata à predominantly lymphocytic infil-

tration of the follicular bulb; peribulbar lymphocytic infiltration; lesions can be very mild; the so called “swarm of bees” is very rare; the hairs in the affected follicles are dystrophic. End-stage alopecia areata shows follicular atrophy.

Luminal folliculitis shows evidence of inflammation throughout the follicular wall with involvement of the follicular lumen and often the hair shaft.

Neutrophilic - Staphylococcal infection, superficial or deep à neutrophils predominate in the follicular lumen; progresses often to furunculosis; perivascular to interstitial infiltration with mainly neutrophils in early lesions; in older lesions plasma cells predominate.

Eosinophilic/Neutrophilic - Dermatophytosis à same lesions as bacterial, but eosinophils are sometimes pre-sent; possibly associated with a mild interface folliculi-tis.

3) FurunculosisRuptured hair follicles due to inflammatory damage.

The lesion is pyogranulomatous. Since it is nodular, it may be initially confused with a nodular/diffuse pattern. The identification of the involvement of the follicles makes however correct designation possible. Someti-mes this is quite difficult as all that is left of the follicle may be remnants of hair shaft or fragments of keratin.

- Demodicosis à pyogranulomatous furunculosis often together with a pyogranulomatous sebaceous ade-nitis.

Nodular and/or diffuse dermatitisThe dermis is obliterated by infiltrating inflammatory

cells either forming nodules or diffuse sheets. Inflam-matory cell types are indicative of the possible aetio-logy. "Check if the nodular pattern is follicular or not"

The following classification refers to non-follicular nodular pattern.

Classification- Neutrophils predominate: Cutaneous abscess, usu-

ally bacterial; Juvenile cellulitis.- Macrophages predominate (granulomatous): typi-

cally persistent infectious agents such as facultative intracellular bacteria (Atypical mycobacteria (= rapidly growing mycobacteria); Leishmania; Foreign bodies; Other protozoa (e.g. Ehrlichia); Microfilaria.

- Neutrophils and macrophages (pyogranulomas). Furunculosis has to be ruled out (Fungal infections such as blastomycosis; Sterile pyogranuloma; Seba-ceous adenitis).

- Eosinophils predominate: Nodular parasitic lesions such as equine Habronemiasis or canine Dirofilariasis; Eosinophilic granuloma of cats and horses.

Three pathological processes are associated with eosi-nophilic infiltration.

- Flame figure à focal degeneration of collagen asso-ciated with the degranulation of eosinophils; occurs in

all species and can be found in a variety of inflamma-tory diseases and in mast cell tumours.

- Eosinophilic mush à focal coagulation necrosis of eosinophils. It occurs in the horse and is a diagnostic feature of habronemiasis but is also found in axillary nodular necrosis and mastocytosis.

- Collagenolysis à a special type of collagen degene-ration, which acts as a foreign body and elicits a granu-lomatous response. It occurs in feline and equine colla-genolytic granuloma.

- Lymphocytes predominate à in “pseudolymphoma”, and other situations in which there is intense local immunological stimulation: vaccine reactions; tick bites; sebaceous adenitis.

The main differential diagnosis is cutaneous lym-phoma.

PanniculitisPanniculitis refers to inflammation of the subcuta-

neous layer of the skin. There is overlap of panniculitis with other patterns of inflammatory skin disease. There are three major types: 1) Lobular panniculitis in which the lobules of fatty tissue are primarily affected; 2) Septal panniculitis in which the lesion is centered on the interlobular connective tissue; 3) Diffuse panniculi-tis in which both compartments are affected.

The diffuse type is the most common in the dog and the septal type is the most common in the cat. The most common inflammatory type of panniculitis is pyogra-nulomatous. Panniculitis may also be neutrophilic, or lymphocytic. In septal panniculitis, it is important to check for vasculitis. Neutrophilic Panniculitis occurs in: Cellulitis; Subcutaneous abscesses; Foreign body reac-tion; Panniculitis; Feline nutritional pansteatitis.

Lymphocytic Panniculitis occurs in: Vaccine reac-tions; Lupus panniculitis.

Pyogranulomatous Panniculitis occurs in: Idiopathic nodular panniculitis; Foreign body reactions; Injection site pyogranuloma; Deep mycotic infections; Atypical mycobacteriosis; Feline leprosy; Filamentous bacterial infections (Actinomyces, Actinobacillus, Nocardia and Botryomycosis) form “Club” colonies (Splendori-Hoe-ppli).

Atrophic dermatosesThis pattern does not describe an inflammatory lesion.

It has been included in the pattern analysis to describe the non-inflammatory lesions in the skin characterized by atrophic changes. The following features point towards atrophic dermatoses: Follicular atrophy (mainly telogen or catagen hair follicles); Atrophy of sebaceous glands; Epidermal atrophy (most likely seen in the infundibulum); Dilated infundibula; Dermal atrophy.

Atrophic changes of the adnexal structures: Endocri-nopathies; Follicular dystrophies; Paraneoplastic alope-cia; End stage sebaceous adenitis; End stage alopecia areata.; Ischemic dermatopathy.

Follicular atrophy occurs in: Endocrinopathies; Folli-


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cular dystrophies; Vasculopathy (ischemic dermatopa-thy); Dermatomyositis; Color dilution alopecia; Pancre-atic paraneoplastic alopecia; End-stage alopecia areata

Dilatation of infundibula are present in: Endocrino-pathies.

Epidermal atrophy with involvement of the follicular infundibula occurs in: Hyperadrenocorticism.

Atrophy of sebaceous glands is present in: Hypera-drenocorticism; End-stage sebaceous adenitis.

Dermal atrophy is seen in: Hyperadrenocorticism (some cases); Some forms of Ehlers Danlos Syndrome.

LA FIEVRE APHTEUSE, SON DIAGNOSTIC CLINIQUE ET DIFFERENTIEL

Jean-Marie GourreauLaboratoire D’Études et de Recherches en Pathologie Animale et Zoon-oses, Unité d’EpidémiologieAgence Française de Securite Sanitaire des Aliments (afssa), France

Les manifestations cliniques de la maladieCommune aux ruminants et aux porcins, tant domes-

tiques que sauvages, la fièvre aphteuse est une maladie généralisée qui s’extériorise avant tout par des lésions cutanéo-muqueuses apparaissant dans les 24 à 48 heures qui suivent l’invasion de l’organisme par le virus.

Comme son nom l’indique, cette maladie se traduit par l’apparition d’aphtes – lesquels résultent de la coa-lescence de vésicules – qui, en quelques heures, se rom-pent pour donner naissance à des ulcères dits superficiels car, à l’inverse des ulcères profonds, ils n’atteignent pas le derme ni les tissus sous-jacents. 12 à 24 heures plus tard, un tissu de néoformation commence à combler le fond de ces ulcères, la cicatrisation complète de la lésion étant obtenue, en l’absence de surinfections, en une huitaine de jours. Il faut toutefois tenir compte du fait que toutes les lésions n’évoluent pas en même temps, les aphtes secondaires apparaissant huit à douze heures après l’aphte primaire, ce laps de temps cor-respondant au cycle de réplication cellulaire du virus. Ainsi, chaque stade lésionnel de la fièvre aphteuse peut se rencontrer durant 48 heures et évoluer de façon con-comitante d’autres stades plus ou moins avancés.

A - Bovins et porcinsChez les espèces très sensibles au virus telles que les

bovins ou les porcins, ces lésions se rencontrent classi-quement dans la bouche, sur les mamelles et au niveau des pieds. Dans la bouche, on les observe préférentiel-lement sur la langue, les gencives et la face interne des lèvres, mais le palais et les autres parois de la cavité buccale peuvent être également atteints. Chez le porc en outre, l’un des sites d’élection des aphtes est le groin, la vésicule pouvant atteindre un diamètre de 2 centi-mètres!

Ces lésions sont extrêmement douloureuses, entraî-

nant un abondant ptyalisme et une incapacité de la déglutition. En effet, lorsque l’on saisit la langue d’un bovin en phase clinique de la maladie, une grande partie de l’épithélium lingual affecté se détache par lambeaux, lesquels restent dans la main. Le derme apparaît alors à vif mais intact, son intégrité étant visualisée par la présence des papilles dermiques en relief et l’absence de toute hémorragie. Ce qui s’explique aisément si l’on garde à l’esprit que les vaisseaux sanguins sont totale-ment absents de l’épiderme et n’atteignent pas le corps muqueux de Malpighi, espace séparant le derme de l’épiderme. Or, dans le cas de la fièvre aphteuse, le cli-vage occasionné par la formation de la vésicule se situe précisément à ce niveau.

Des lésions du même type se rencontrent sur les trayons: les aphtes, plus fréquemment situés à leur extrémité distale, peuvent occuper la quasi-totalité du trayon et, même, chez la truie, remonter sur la mamelle. Mais, à l’inverse de ce que l’on observe chez les bovins, ils se surinfectent rapidement, par suite de l’inoculation de germes buccaux ou environnementaux par les porce-lets lors de la têtée.

A leur début, tout au moins, les lésions podales de la fièvre aphteuse se situent sur le bourrelet coronaire de l’onglon et/ou dans l’espace interdigité. Comme dans la bouche, l’aphte, qui résulte de la coalescence de plusieurs vésicules, se surinfecte rapidement du fait des souillures du milieu extérieur et se transforme en pustule: celle-ci éclate rapidement, laissant place à un ulcère surinfecté que l’on devra laver soigneusement pour le visualiser correctement.

Ces lésions cutanéo-muqueuses sont toujours accom-pagnées de signes généraux graves : abattement, hyper-thermie et anorexie étant les signes cliniques dominants. La douleur entraîne une incapacité à se déplacer et, chez les porcins, lorsque l’on force l’animal à le faire, il marche «sur des aiguilles», c’est-à-dire sur l’extrémité de ses onglons. Sa température est de 39,5 – 40°C, voire davantage chez les porcins. En outre, il est souvent pros-tré, et l’une des caractéristiques de la maladie lorsque l’on pénètre dans un élevage atteint, est le silence inha-bituel qui y règne, les animaux ne manifestant aucune surprise à l’arrivée d’une personne étrangère, comme ils le font généralement. Quand il y a de la mortalité, celle-ci s’observera exclusivement chez les porcelets à la mamelle. Des avortements peuvent être observés mais ils ne sont nullement caractéristiques de la mala-die.

Rappelons enfin que la fièvre aphteuse est la maladie la plus contagieuse du bétail, tout au moins sous nos latitudes. Aussi n’est-il pas rare de trouver un grand nombre de bêtes – sinon la quasi-totalité d’entre elles, jeunes comme adultes – malades lors de la visite du vétérinaire, si précoce soit-elle. Sur le plan épidémiolo-gique, il faut également garder à l’esprit que cette mala-die sévit très généralement durant les périodes froides de l’année, l’incidence maximale se situant aux envi-rons de février et de mars.


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B - Petits ruminantsDans le cas des espèces peu sensibles comme les

ovins et les caprins, les symptômes sont beaucoup plus frustes. Les boiteries sont peu fréquentes, l’anorexie peu visible. L’attention de l’éleveur n’est attirée que par la présence d’avortements et de mortinatalités en nombre inhabituel. Seuls quelques rares animaux pré-sentent des lésions podales ou buccales frustes et fugi-tives, sous la forme de petits ulcères buccaux ou inter-digités. Ils succèdent bien évidemment à un stade vési-culeux qui passe inaperçu et cicatrisent en 48 heures ou 3 jours.

C - Espèces sauvagesLes animaux sauvages sensibles à la fièvre aphteuse –

cervidés, mouflon chamois, isard et sanglier – peuvent être rangés dans cette même catégorie car ils ne sem-blent pas manifester de lésions aussi graves que celles que l’on peut voir chez les bovins ou les porcins, même en cas d’inoculation expérimentale. Leur sensibilité serait même réduite car les enquêtes sérologiques dans la faune sauvage, effectuées à l’issue des dernières épi-zooties de fièvre aphteuse en France, n’ont pas permis de montrer une quelconque transmission du virus aux sangliers ou aux cervidés. Ce qui tendrait d’ailleurs à prouver que ces animaux ne sont pas réservoirs.

Le diagnostic différentielDu fait du pléomorphisme et du manque de spécifi-

cité de ses lésions, la fièvre aphteuse peut être très faci-lement confondue avec de nombreuses autres maladies de l’élevage, fort heureusement plus courantes. Chez les bovins, il s’agit avant tout de la maladie des muqueuses mais, également, de la rhinotrachéite infectieuse et du coryza gangreneux; chez petits ruminants, de la forme buccale de l’ecthyma contagieux mais aussi de la nécro-bacillose et, chez les porcins, de la maladie vésiculeuse des suidés et de la nécrobacillose.

A - Chez les bovins1) La maladie des muqueusesTrès répandue dans le monde entier, la maladie des

muqueuses évolue sous deux formes : l’une, fruste ou inapparente, vraisemblablement la plus répandue, et l’autre, à tropisme cutanéo-muqueux avec atteinte de tout le tractus digestif, de la bouche à l’intestin mais aussi de l’espace interdigité et du trayon. Les animaux qui présentent cette forme sont toujours des individus Infectés Permanents Immunotolérants (I.P.I.), reconta-minés par un biotype viral cytopathogène. C’est en général l’I.P.I. lui-même qui génère, à partir de ses pro-pres virus non cytopathogènes, une souche cytopatho-gène, par recombinaison génétique.

Les animaux atteints de maladie des muqueuses pro-prement dite sont âgés en moyenne de 6 mois à 3 ans. Ils présentent une hyperthermie de 40 à 41°C, de l’anorexie et ils sont prostrés. Un important ptya-lisme est révélateur de lésions buccales, en l’occurrence

d’ulcères superficiels - petits mais nombreux - sur les gencives, la langue et le palais. Ils peuvent être arron-dis mais aussi prendre une forme allongée, dite en «coup d’ongle», que l’on ne rencontre pas dans la fièvre aphteuse. Mais les critères qui permettent le mieux de différencier la maladie des muqueuses de la fièvre aphteuse sont:

- l’absence totale de vésicules;- la présence fréquente d’une congestion intense du

bourrelet gingival à la base des incisives;- la présence quasi-constante d’une diarrhée profuse,

souvent liquide, voire mucoïde ou sanguinolente. Mais, comme dans la fièvre aphteuse, on peut observer des lésions inflammatoires puis ulcératives du bourrelet coronaire de l’onglon et de l’espace interdigité. De même, la peau du trayon, voire celle de la mamelle, est le siège de processus congestifs et ulcératifs pouvant être confondus avec les lésions de la fièvre aphteuse.

2) La rhinotrachéite infectieuseMoins répandue que la maladie des muqueuses, la rhi-

notrachéite infectieuse provoque aussi des lésions buc-cales et des lésions podales. Toutefois, il n’y a jamais de vésicules, et les lésions buccales sont plutôt des exul-cérations que des ulcères francs. Leur forme, souvent irrégulière, est dite «en carte de géographie». Si les lésions podales sont exceptionnelles (ulcères superfi-ciels de l’espace interdigité), les lésions nasales (éro-sions) sont, en revanche, très fréquentes. Du mucus séché enrobant des débris nécrotiques obstrue souvent l’orifice des naseaux et des râles sont généralement per-ceptibles à l’auscultation.

3) Le coryza gangreneuxEncore appelé fièvre catarrhale maligne des bovins,

le coryza gangreneux se traduit également par une forte fièvre s’accompagnant d’une congestion grave des muqueuses buccale et nasale, de la peau des trayons et de l’espace interdigité. A cette congestion succèdent des exulcérations très étendues qui se recouvrent d’un enduit nécrotique blanchâtre, simulant la nécrose de la paroi des aphtes. Là encore, il n’y a jamais de vésicu-les. Mais les éléments pathognomoniques de la maladie sont: a) une hyperthermie supérieure à 40,5°C; b) une adénopathie généralisée.

En outre, les animaux malades présentent une conges-tion oculaire bilatérale avec larmoiement intense puis une kératite, signes cliniques qui ne sont pas présents dans la fièvre aphteuse, sauf en cas de co-infection avec les germes responsables des kérato-conjonctivites. Par ailleurs, les lésions congestives et ulcéreuses de la peau s’étendent souvent aux lèvres, au mufle et aux naseaux. La contagion de bovin à bovin est nulle et, générale-ment, seuls 1 ou 2 animaux sont atteints.

4) La stomatite papuleuseC’est encore une affection virale qui, cette fois, ne

touche que les jeunes animaux. Les lésions initiales sont des papules à évolution centrifuge qui se creusent en leur sommet pour faire place à un ulcère qui se comble peu à peu de fausses membranes. La guérison, égale-


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ment centrifuge, se produit en une quinzaine de jours sans laisser de traces. Les lésions se rencontrent dans les parois de la cavité buccale (langue, gencives, face interne des lèvres) mais aussi à l’extérieur de la bouche (mufle, pourtour des naseaux, lèvres). Si les trayons peuvent parfois être touchés, on ne retrouve en revanche jamais de lésions podales. C’est une maladie bénigne, transmissible à l’homme,et qui, chez les bovins, prend souvent une allure épizootique se manifestant lors de rassemblements d’animaux, de carences alimentaires, de mauvais traitements ou d’affections intercurrentes (immuno-dépression).

5) L’épidermolyse bulleuse jonctionnelle récessive létale

Plus connue sous son nom latin d’Epitheliogenesis imperfecta, l’épidermolyse bulleuse jonctionnelle réces-sive létale est une anomalie congénitale de la peau à transmission autosomale que l’on rencontre chez toutes les espèces de mammifères, y compris l’homme. Comme son nom l’indique, cette maladie se traduit par un décollement de la peau consécutif à l’apparition de bulles, clivage qui se produit entre le derme et l’épiderme, très précisément au même endroit que dans la fièvre aphteuse. Si ces décollements peuvent avoir lieu en n’importe quel endroit du revêtement cutané, ils se produisent préférentiellement au niveau de la bouche, du bourrelet coronaire des onglons et des mamelles. Une fois décollé, l’épiderme se nécrose et laisse place à un ulcère superficiel très étendu et très fragile qui s’infecte vite et facilement, engendrant la mort de l’animal par septicémie. Il est facile cependant de différencier cette affection de la fièvre aphteuse du fait de : a) l’âge des animaux (quelques jours, voire quelques semaines) ; b) l’absence de contagion ; c) l’étendue des lésions.

Il existe de nombreuses autres affections bulleuses pouvant évoquer la fièvre aphteuse. Mais, à l’inverse de celle-ci, elles sont toutes localisées à un seul organe, langue, trayon, espace interdigité, et n’atteignent qu’un ou que quelques animaux. Ainsi en est-il de la thélite ulcérative herpétique, de certaines dermatites podales, de l ‘ «envenimation » par les chenilles processionnaires ou de certains traumatismes comme les brûlures par des produits caustiques. Il est cependant aisé pour l’homme de l’Art de les différencier s’il prend en compte à la fois les signes cliniques et les critères épidémiologiques.

B - Chez les petits ruminantsOutre l’épidermolyse bulleuse jonctionnelle létale

dont la clinique est identique à celle décrite chez les bovins, les affections qui, chez les petits ruminants, peuvent être confondues avec la fièvre aphteuse sont essentiellement la forme buccale de l’ecthyma conta-gieux, la nécrobacillose et le piétin.

1) L’ecthyma contagieux, dans sa forme buccaleL’ecthyma contagieux se manifeste sous trois formes:

a) la forme papulo-croûteuse classique, localisée, entre autres, sur les lèvres ; b) la forme papillomateuse, en chou-fleur, souvent associée d’ailleurs à une papilloma-

tose ; c) la forme strictement buccale, celle-ci se tradui-sant par la présence de volumineuses papulo-pustules sur la langue, les gencives et la face interne des lèvres des animaux atteints. Au début de la maladie, les papu-les se transforment en vésicules puis en ulcères plus ou moins bourgeonnants. Ce tissu de néoformation, inflammatoire et fragile, s’infecte rapidement du fait du microbisme ambiant, entraînant des lésions ulcératives profondes et très délabrantes qui finissent par cicatriser en formant des croûtes renfermant de grandes quanti-tés de virus. La douleur engendrée par la maladie est très vive. Elle entraîne un arrêt de l’alimentation et une sialorrhée intense : c’est précisément ce caractère qui permet de différencier l’ecthyma de la fièvre aphteuse : celle-ci en effet, chez les ovins comme chez les caprins, est très fugace et n’entraîne jamais de lésions importan-tes, si bien qu’il est possible d’affirmer qu’un mouton qui bave n’est pas atteint de fièvre aphteuse. Dans le cas de l’ecthyma, il sera toujours possible de déceler sur la face externe des lèvres de certains animaux les lésions papulo-croûteuses caractéristiques, surtout chez les jeunes animaux.

2) La nécrobacilloseMaladie que l’on rencontre dans toutes les espèces

animales, la nécrobacillose est une affection des éle-vages mal conduits. Chez les ovins et les caprins, elle prend une allure similaire à celle de l’ecthyma buccal au stade de l’ulcère profond. Ces ulcères se produisent d’emblée sans passer par le stade vésiculeux ou papu-leux. Ils se compliquent souvent de surinfections, en particulier par des champignons. On les rencontre essen-tiellement dans la bouche mais aussi sur les mamelles ou aux extrémités digitées où ils peuvent compliquer des lésions de piétin.

C – Chez les porcins1) La maladie vésiculeuse des suidésApparue en 1973 en France, cette affection est, d’un

point de vue clinique, similaire à la fièvre aphteuse. Symptômes et lésions sont en tous points identiques, si bien qu’il est extrêmement difficile sur le terrain de différencier les deux maladies. C’est seulement l’épidémiologie qui permettra de se faire une idée de la nature de l’affection en cause: en effet, dans la fièvre aphteuse, la mortalité se produit de façon quasi exclu-sive sur les porcelets à la mamelle, alors qu’on ne la rencontre que chez les porcs à l’engrais et les adultes dans la maladie vésiculeuse. Mais ce critère n’a qu’une valeur d’orientation diagnostique. Il faudra obligatoire-ment avoir recours au laboratoire pour en avoir la certi-tude.

2) La nécrobacilloseComme chez les ovins, la nécrobacillose ne se ren-

contre que dans les élevages mal tenus. Les causes en sont multiples : mauvaises hygiène, manque d’aération et excès d’humidité, sols en ciment (la maladie est éga-lement connue sous le nom de «Maladie du ciment») mauvaise alimentation… Sur un plan clinique, elle se


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traduit par un syndrome fébrile mais, surtout, par la pré-sence de profondes lésions ulcératives buccales et poda-les. Dans la bouche, les ulcères, qui peuvent atteindre les os, sont souvent remplis de fausses membranes. Au niveau des pieds, les lésions siègent le plus souvent sur le bourrelet coronaire des onglons, sur la muraille et la sole. Mais elles peuvent remonter sur les membres. Elles débutent par des lésions papuleuses et/ou conges-tives qui s’ulcèrent très rapidement; leur importance contraint les animaux à rester couchés, les empêchant même d’aller se nourrir. Quant on les force à se lever, ils marchent «sur des aiguilles», c’est-à-dire sur l’extrémité de leurs doigts. Ce sont surtout les animaux en crois-sance qui payent le plus lourd tribut à la maladie.

En conclusion, la fièvre aphteuse, si elle adopte une symptomatologie et un cortège lésionnel très évoca-teurs, est en réalité difficile à différencier d’autres affec-tions cutanéo-muqueuses plus fréquentes. Il faut tou-jours tenir compte de l’épidémiologie de l’affection en cause – espèces affectées, rapidité de la contagion, âge des animaux, localisation et nature des lésions. En cas d’incertitude, mieux vaut alerter la Direction des Ser-vices Vétérinaires plutôt que d’attendre la tournure que prendra la maladie dans les heures ou jours qui sui-vront.


Comunicações livres (sumários)

ESTUDO IMUNOHISTOQUÍMICO DOS TUMO-RES DAS GLÂNDULAS HEPATÓIDES: MARCA-DORES DE PROLIFERAÇÃO CELULAR, GENE SUPRESSOR P53 E RECEPTORES HORMO-NAIS

Anabela Alves1; Laura Peña2

1Laboratório de Histologia e Anatomia Patológica. UTAD 5000-911 Vila Real2Depart. de Patologia Animal II. Faculdade de Veterinária de Madrid

No presente trabalho, efectuou-se um estudo aprofun-dado das glândulas hepatóides ou perianais caninas e dos seus tumores com técnicas histológicas convencio-nais e imunohistoquímicas para aclarar a sua etiopato-genia, caracterizar imunohistoquimicamente as glându-las normais e seus tumores e avaliar a possível existên-cia de marcadores tumorais imunohistoquímicos com valor prognóstico. Incluíram-se 89 animais (73 machos e 16 fêmeas) portadores de tumores das glândulas hepa-tóides, e as suas correspondentes neoplasias (n=89). Também se utilizaram amostras de 8 glândulas hepatói-des normais. Anotaram-se os dados dos animais (idade, sexo e raça) e características clínicas do tumor, ao fim de um ano pos-cirurgia, contactaram-se os donos para saber se tinham ocorrido recidivas. As amostras foram inclu-ídas em parafina e diagnosticaram-se segundo a classifi-cação da OMS (1998) em 64 adenomas, 11 epiteliomas e 14 carcinomas. Para o estudo imunohistoquímico uti-

lizou-se a técnica de estreptavidina-biotina-peroxidase e os seguintes anticorpos primários: proliferação celular (Ki-67 e PCNA), gene supressor tumoral p53 (proteína p53), síntese de esteróides (citocromo P450

scc) e recep-

tores hormonais (receptor de estrogénios e receptores de androgénios). Realizou-se a análise estatística para saber quais as variáveis clínicas histopatológicas e imunohis-toquímicas que estavam relacionadas entre si e com o aparecimento de recidivas. As glândulas hepatóides nor-mais foram positivas ao citocromo P450

scc e, negativas

à proteína supressora p53. Possuíam escassos receptores de estrogénios e elevado número de receptores de andro-génios. A proliferação tumoral medida mediante os índi-ces de Ki-67 (média=7,95%) e PCNA (média=35,95%) aumentou com a malignidade histológica (p<0,01) e invasão vascular (p=0,04 e p=0,0161). 69,7% das neo-plasias expressaram a proteína do gene supressor tumo-ral p53. Os tumores das glândulas hepatóides, exibiram positividade ao citocromo P450scc indicando a possibi-lidade de síntese de esteróides. Em 88,76% das neopla-sias observou-se imunorreactividade aos receptores de estrogénios, 97,8% das neoplasias apresentaram recep-tores de androgénios e 86,51% tiveram os dois recepto-res, demonstrando-se assim a sua hormono-dependên-cia.

UM CASO DE ADENOCARCINOMA DAS GLÂNDULAS HEPATÓIDES COM METASTIZA-ÇÃO EXTENSA

J.F. SilvaSEPAT, DEMOC, Faculdade de Medicina Veterinária (UTL) - Rua Prof. Cid dos Santos - Polo Universitário - Alto da Ajuda, 1300-477 Lisboa.

Os adenocarcinomas das glândulas hepatóides do cão (Canis familiaris) são relativamente pouco frequentes, quando comparados com os casos de hiperplasia / ade-noma dessas glândulas. Em três estudos sobre adeno-mas e adenocarcinomas das glândulas hepatóides, a percentagem de adenocarcinomas variou entre 3,3% e 18,2% do total de casos (Nielsen & Aftosmis, 1964; Wilson & Hayes, 1979; Goldschmidt & Shofer, 1992). Num estudo de 41 adenocarcinomas, só três (7,3%) metastizaram para órgãos distantes (Vail et al., 1990).

O presente caso refere-se ao estudo anatomo-histo-patológico do cadáver de um cão inteiro, de raça inde-terminada, com 6 anos, que foi enviado a 00/11/29 ao Laboratório de Anatomia Patológica da FMV (Lisboa) para necrópsia. A anamnese era parca, referindo apenas “suspeita de tumor” (sic). Ao exame macroscópico, apresentava dois nódulos no lado esquerdo da região perianal. Um deles media 2,2 cm x 1 cm e a sua superfí-cie de corte apresentava uma parte periférica rosa aver-melhada, estando a parte interna semeada de pequenos pontos brancos. Outro, inferior ao primeiro, tinha 4mm de diâmetro, consistência dura esuperfície de corte ama-relada. O exame histológico destes nódulos revelou que ambos correspondiam a adenocarcinomas das glândulas

hepatóides, cujas células neoplásicas eram poligonais ou arredondadas e apresentavam anisocitose e aniso-cariose marcadas. O citoplasma era francamente eosi-nófilo e por vezes encerrava gotículas lipídicas. Eram frequentes células gigantes bi- ou multinucleadas. As células tumorais estavam agrupadas em espaços alve-olares, delimitados por finos septos de tecido conjun-tivo.

O exame anatomopatológico também revelou hidro-hemotórax e metástases no folheto parietal da pleura, no pulmão direito, no folheto parietal do pericárdio, no coração (septo interauricular e parede do ventrículo direito), no fígado, no baço, no folheto visceral do peritoneu, nos rins e nos seguintes linfonodos: pré-escapulares, axilares, mesentéricos e inguinais inter-nos (sublombares).As metástases pulmonares, hepáti-cas, esplénicas do septo interauricular e do linfonodo sublombar foram investigadas ao microscópio fotónico, sendo o seu padrão histológico semelhante ao obser-vado nos tumores primitivos.

De acordo com a classificação TNM (Owen, 1980), este tumor era T2N3M1.

Referências:Goldschmidt MH & Shofer FS (1992) Skin Tumors of the Dog

and Cat. Pergamon Press Ltd., Oxford. pp. 66-74.Owen LN (1980) – citado em Vail et al. (1990).Nielsen SW & Aftosmis J (1964) Canine perianal tumors.

Journal of the American Veterinary Medical Association, 144: 127-135.

Vail DM, Withrow SJ, Schwarz PD & Powers BE (1990) Perianal adenocarcinoma in the canine male: a retrospective study of 41 cases. Journal of the American Animal Hospital Association, 26: 329-334.

Wilson GP & Hayes HM (1979) Castration for treatment of perianal gland neoplasms in the dog. Journal of the American Veterinary Medical Association, 174: 1301-1303.

HIPERPLASIA E TUMORES DAS GLÂNDULAS HEPATÓIDES:ESTUDO RETROSPECTIVO (1995 - 2001)

J.F. Silva, M.C. Peleteiro, J.J. CorreiaSEPAT, DEMOC, Faculdade de Medicina Veterinária (UTL) - Rua Prof. Cid dos Santos - Polo Universitário - Alto da Ajuda, 1300-477 Lisboa.

O estudo da patologia da região perianal do cão (Canis familiaris) reveste-se de um certo relevo, devido à incidência elevada da hiperplasia e adenoma das glân-dulas hepatóides. Estas lesões poderão ter importância a nível de Patologia Comparativa, pois são androgénio-dependentes. É possível que haja semelhanças a nível molecular entre a progressão das hiperplasias e adeno-mas das glândulas hepatóides e tumores androgénio-dependentes humanos, como o carcinoma prostático.

Foi feito o estudo retrospectivo dos casos de patolo-gia tumoral da região perianal e de crescimentos “ectó-picos” das glândulas hepatóides, diagnosticados no Laboratório de Anatomia Patológica da FMV (Lisboa), abrangendo o período entre 1995 e 2001 (sete anos).

Foram recolhidos 206 casos: hiperplasia/tumores das glândulas hepatóides - 188 (91,26%); tumores não-hepatóides - 16 (7,77%); carcinomas das glândulas dos sacos anais: 2 (0,97%).

Considerando-se as hiperplasias / tumores das glân-dulas hepatóides, as lesões benignas ocorreram em 111 casos (59,04% - hiperplasia: 43; hiperplasia + ade-noma: 24; adenoma: 44), enquanto que as lesões malig-nas constituiram 77 (40,96% - adenocarcinoma: 62; hiperplasia + adenocarcinoma: 5; hiperplasia + ade-noma + carcinoma: 3; adenoma + carcinoma: 7). A dis-tribuição por sexos foi: masculino - 95.70%; feminino - 4,30%. Quanto à região, 160 casos (85,11%) desenvol-veram-se na região perianal e 28 (14,89%) noutro local (de onde o termo “glândula hepatóide” ser de preferir a”glândula perianal” ou “glândula circum-anal”): 19 casos na cauda, 4 no forro, 3 no dorso, 1 na região lombar e 1 na região inguinal. Os cães de raça inde-terminada constituiram 40,57% dos casos de hiperpla-sias / tumores das glândulas hepatóides, seguindo-se o Cocker Spaniel (10,86%), o Caniche (7,43%) e o Fox Terrier (6,29%). As raças portuguesas também estive-ram representadas: Perdigueiro, Podengo, Cão de Água, Cão da Serra da Estrela e Cão de Castro Laboreiro. A média das idades (± desvio-padrão) foi de 10,98 anos ± 2,84 anos, a amplitude foi de 1 a 18 anos e a moda 12 anos.

Os tumores perianais não-hepatóides foram: mela-noma maligno (1 caso), leiomioma (2), fibroma (3), mastocitoma (1), hemangiopericitoma (1), hemangios-sarcoma (1), lipoma (2), fibrossarcoma (1), tricoblas-toma (1), neurolemoma benigno (1), adenoma das glân-dulas apócrinas (1) e fibropapiloma (1).

Os tumores das glândulas dos sacos anais foram: car-cinoma de tipo sólido e tubular (1 caso) e adenocarci-noma (1).

No que respeita às hiperplasias / tumores das glân-dulas hepatóides, há a considerar:

a) A elevada frequência de lesões malignas, quando se comparam estes dados com os de outros autores (pos-sível explicação: muitos nódulos perianais são extirpa-dos e não são subsequentemente submetidos a exame histopatológico - um erro grave).

b) A baixa representação do sexo feminino (cerca de 1:19).

c) Não é raro ser difícil avaliar histologicamente se uma lesão é ou não é maligna (de onde o mal definido “epitelioma” da nova classificação da O.M.S.).

FISTULAS PERIANAIS

Ana Lúcia E. Jesus LuísICBAS – Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da Universi-dade do Porto, Largo Prof. Abel Salazar, 2, 4099-003 Porto

Fistulas Perianais ou Furunculose Anal é uma doença inflamatória crónica da pele e mucosa, da zona ano-rectal e que é caracterizada pelo aparecimento de úlce-


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ras e trajectos fistulosos isolados, ou em toda a exten-são da circunferência do ânus. É um processo doloroso, por vezes purulento e com odor muito desagradável. O pastor Alemão é a raça predisponente, mas também pode ocorrer noutras raças ( Setter, Retrievers). O trata-mento é difícil, muito moroso e poderá consistir no tra-tamento cirúrgico e mais recentemente tem-se desen-volvido o tratamento médico através de agentes imu-nomodeladores ou da combinação de ambos. Tem-se portanto, colocado esta doença no grupo das doenças imunomediadas, devido à eficácia verificada destas drogas no seu controlo e tem-se também associado a sua semelhança à da Doença de Crohn dos humanos.

ACANTOMA INFUNDIBULAR QUERATINI-ZADO: CARACTERIZAÇÃO HISTOLÓGICA E DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL

M.A. Pires, F. Seixas TravassosLaboratório de Histologia e Anatomia Patológica. ICETA- UTAD 5000-911 Vila Real

Propomo-nos neste trabalho a descrever o aspecto histológico do queratoacantoma infundibular e os seus diagnósticos diferenciais.

O acantoma infundibular queratinizado (epitelioma intracutâneo cornificado ou queratoacantoma) é uma neoplasia folicular benigna e rara nos animais. Surge como nódulos solitários ou múltiplos, parcialmente alo-pécicos com diâmetro variável entre 0,5 a 4 cm de diâmetro. Os nódulos geralmente têm um poro central com tamanho variável (de 1mm a alguns centímetros). Os poros maiores podem conter cornos cutâneos ou massas de queratina e alguns pêlos envolvidos. Alguns destes queratoacantomas estão localizados mais pro-fundamente na derme, não existindo poro de abertura na superfície da pele.

Do ponto de vista histológico, o acantoma infundi-bular queratinizado é caracterizado por ter forma taci-tular, uma cripta preenchida por queratina, e um poro de abertura à superfície da pele. É um nódulo dérmico bem circunscrito que se orienta em volta do quisto cen-tral que se encontra preenchido por lâminas de quera-tina. A cripta é envolvida por uma parede composta por uma camada compacta, complexa e dupla de epitélio estratificado escamoso bem diferenciado com querati-nização gradual e uma camada de células basais con-tínuas. Na maior parte dos casos, há projecção perifé-rica de colunas de células epiteliais escamosas a partir da camada basal da parede, formando pequenos ninhos epiteliais, por vezes com pérolas de queratina no inte-rior. As células têm um núcleo central eucromático e bordos celulares bem definidos. A periferia do tumor é em geral bem delimitada. Está em geral pesente um estroma escasso a moderado contendo abundante mucina, raras células mesenquimatosas e ocasional-

mente pode ter metaplasia condróide ou óssea. É comum a presença de inflamação piogranulomatosa secundária devida à ruptura do epitélio da parede do quisto.

O diagnóstico diferencial deve ser feito com o Papi-loma Invertido, Carcinoma de Células Escamosas ou Epidermóide, Tricoblastoma Quístico, Quisto Epider-móide e Quisto Dermóide

UM CASO DE DEMODEXOSE PUSTULOSA GENERALIZADA COMPLICADA POR PIO-DERMITE.

Ferreira Afonso 1, Madalena Monteiro 1, Rui Baptista 1, Girão Bastos 2

Laboratório Nacional de Investigação Veterinária1. Departamento de Patologia 2. Departamento de Parasitologia

Os autores descrevem a ocorrência de uma pioder-mite generalizada, num canídeo, de raça Chow – Chow, do sexo masculino, com cinco meses de idade e com o nome de Ti-Ban, cujo cadáver deu entrada neste Labo-ratório Nacional em 21-02-02.

As suspeitas referidas pela médica veterinária assis-tente eram de intoxicação por Ivermectina e / ou doença auto – imune.

Os dados epidemiológicos igualmente referenciados pela clínica assistente, referem o início da doença em Novembro de 2001, tendo ocorrido a morte em 20-02-02.

O exame macroscópico do cadáver, revelou a pre-sença de uma piodermite generalizada, com maior expressão ao nível da região da cabeça, nomeada-mente pavilhões auriculares e pálpebras, região peito-ral e inguinal e dos membros. Observaram-se igual-mente: hipertrofia dos gânglios linfáticos retrofaríngeos e lesões pneumónicas localizadas nos lobos diafrag-máticos.

No exame microscópico da pele, foram observadas lesões de demodexose pustulosa generalizada, compli-cada por piodermite.

Ao nível do pulmão observaram-se lesões de pneu-monia necrosante de etiologia bacteriana.

No exame bacteriológico foi isolado Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa da pele, vísceras e hemo-cultura.

O exame parasitológico, identificou a presença de Demodex canis, em grande número, no material colhido.

A pesquisa de Ivermectina no parênquima hepático, foi negativa.

Pela interpretação dos resultados dos exames labora-toriais descritos e pela história clínica do animal, pen-samos tratar-se de um caso de demodexose pustulosa generalizada, complicada por piodermite.


DERMATITE PIOGRANULOMATOSA ASSO-CIADA A PLEURISIA NUM CÃO “PERDI-GUEIRO PORTUGUÊS”

M. Monteiro1, R. Esteves2, A. Amado3

1. L.N.I.V.- Departamento de Patologia2. Médica Veterinária- Clínica de pequenos animais3. L.N.I.V.- Departamento de Bacteriologia

Os autores relatam um caso de dermatite piogranu-lomatosa na parede costal dum cão Perdigueiro Portu-guês, com cerca de três anos de idade, que por exten-são aos tecidos profundos, nomeadamente aos múscu-los intercostais, atingiu a cavidade torácica. O exame macroscópico revelou a presença de pequenos abcessos no tecido subcutâneo com drenagem na superfície da pele; exuberantes lesões de pleurisia e de pericardite de aspecto hemorrágico, na superfície das quais se visu-alizaram pequenos grânulos amarelados semelhantes a enxofre; abundante derrame intratorácico espesso e hemorrágico. Microscopicamente, no tecido subcutâ-neo, na pleura e no pericárdio observaram-se múltiplos piogranulomas no centro dos quais eram visíveis aglo-merados bacterianos (Actinomyces ??); na pleura e no pericárdio registou-se também uma intensa prolifera-ção de pequenos capilares. As lesões observadas enqua-dram-se nas infecções provocadas por corpos estranhos, nomeadamente por praganas, que ocorrem em cães de caça ou que vivem no campo.

UM CASO CLÍNICO DE PODODERMATITE LINFOPLASMOCITÁRIA FELINA

A. Oliveira1, G. Costa2 e M.C. Peleteiro3

1.R. Vasco da Gama nº 45 – 2830-365 Barreiro2.Clínica Santiago Saguér – Santana – Sesimbra3.CIISA – Faculdade de Medicina Veterinária, Rua Prof. Cid dos Santos, Pólo Universitário do Alto da Ajuda, 1300-477 Lisboa

Este caso descreve a história clínica, diagnóstico e tratamento de um felino, raça Europeu Comum, de 9 meses de idade com lesões de pododermatite.

Na primeira apresentação, identificou-se no exame clínico hipertrofia de todas as almofadas plantares. O tratamento instituído (predenisolona, 3,5mg/kg, q24h) resultou em quase total cura clínica.

Dois meses depois, numa segunda apresentação, um nódulo de tecido vermelho vivo emergia de uma úlcera localizada na almofada metacarpiana esquerda central. Todas as outras almofadas plantares dos membros anteriores se encontravam hipertrofiadas. O tratamento incluiu ressecção cirúrgica do nódulo, antibioterapia e corticoterapia.

O exame histopatológico revelou dermatite difusa da derme com congestão dos vasos sanguíneos. A infiltra-ção inflamatória da derme era caracterizada por acen-tuada riqueza em plasmócitos, conjuntamente com lin-fócitos, neutrófilos e macrófagos. Em algumas zonas identificaram-se plasmócitos activados com exuberan-

tes corpos de Russel. O carácter crónico da lesão está patente na existência de áreas de fibrose da derme e pela ausência de glândulas écrinas. O exame histopato-lógico permitiu estabelecer o diagnóstico definitivo de pododermatite linfoplasmocitária felina.

PODODERMATITE PLASMOCITÁRIA FELINA – UM ESTUDO DE 8 CASOS

P. Dias Pereira1, A. Faustino1, F. Gärtner2.1.ICBAS – Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universi-dade do Porto.2.Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto (IPATIMUP), Porto

A pododermatite plasmocitária felina é uma doença cutânea rara que atinge as almofadas plantares dos gatos, cuja etiopatogenia é ainda desconhecida. Neste trabalho são descritos 8 casos de pododermatite plas-mocitária felina reunidos no Laboratório de Patologia Veterinária do ICBAS durante um período de 3 anos. Não se registou predisposição sexual, racial ou etária, nem localização preferencial das lesões. Todos os ani-mais apresentavam numa fase inicial tumefacção das almofadas plantares, com posterior desenvolvimento de úlceras. Histologicamente as lesões caracterizavam-se pela existência de um abundante infiltrado inflamatório consistindo essencialmente em plasmócitos maduros (nos quais se observava um corpo de Russel proemi-nente), que assumiam uma disposição predominante-mente perivascular. Foram também observados plasmó-citos binucleados e alguns em mitose. Em alguns casos estavam presentes imagens de vasculite. A identificação dos plasmócitos foi confirmada com recurso a técnicas histoquímicas (coloração de “Verde Metilo-Pironina”) e imunohistoquímicas (utilizando um anticorpo dirigido contra as cadeias leves de tipo lambda das imunoglobu-linas). O acompanhamento clínico dos animais demons-trou que em 4 casos as lesões regrediram totalmente após corticoterapia e que em 2 animais a exérese cirúr-gica completa das lesões, associada a antibioterapia, teve um efeito curativo. Não houve registo de recidivas em nenhum animal até à data. Não foi possível seguir a evolução clínica de 2 animais.

Os autores agradecem a prestável colaboração dos colegas da Clínica Veterinária da Areosa, Clínica Vete-rinária de Custóias, Clínica Veterinária de Matosinhos, Clínica Veterinária VetConde e Policlínica Central de Aveiro.

ESTUDO IMUNOHISTOQUÍMICO DE MARCA-DORES DE DIFERENCIAÇÃO EPIDÉRMICA EM CARCINOMAS DE CÉLULAS ESCAMOSAS OCULARES DE BOVINOS E DISTRIBUIÇÃO DE CITOQUERATINAS

H.Vala 1, D. Fondevilla2, T. Carvalho3, C. Pinto4, C. Peleteiro3, M. Pinho3, L. Ferrer2


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1 - Escola Superior Agrária de Viseu. Instituto Politécnico de Viseu. Campus Politécnico, 3500 Viseu, Portugal2 - Departament de Medicina i Cirugia Animals. Facultat de Veterinaria (UAB), 08193 Bellaterra. Barcelona, Espanha3 – Centro Interdisciplinar de Investigação em Sanidade Animal. Fac-uldade de Medicina Veterinária. Rua Prof. Cid dos Santos, 1300-477 Lisboa, Portugal4 – Serviço de Desenvolvimento Agrário de S. Miguel. 9504-541 Ponta Delgada, Açores, Portugal

O presente trabalho teve como objectivos principais a avaliação da aplicabilidade de alguns anticorpos como instrumentos de diagnóstico, no carcinoma escamoso ocular bovino (CEOB) e o estudo da relação entre o perfil imunohistoquímico obtido com cada um dos anti-corpos e o grau de diferenciação das neoplasias.

O estudo incidiu sobre trinta e duas amostras de deza-nove neoplasias oculares de bovino, colhidas no Mata-douro Frigorífico e Industrial de Ponta Delgada, S. Miguel, Açores. O material foi fixado em formol a 10%, incluído em parafina e os cortes corados por técnicas de rotina para diagnóstico e classificação das neoplasias.

O diagnóstico de CEOB foi confirmado em todas as amostras, estabelecendo-se três grupos de acordo com o grau de diferenciação: bem diferenciados (9 casos), moderadamente diferenciados (5 casos) e pouco dife-renciados (5 casos).

Aplicou-se a técnica indirecta de imunohistoquímica Avidina-Biotina-Peroxidase. Foram utilizados dois anti-corpos, permitindo evidenciar a expressão de queratinas distintas: anticorpo monoclonal MNF 1116, anti-cito-queratinas 5, 6, 8, 17 e 19 humanas (DAKO), caracterís-ticas dos queratinócitos mais indiferenciados e do epi-télio simples, e anticorpo monoclonal LP 34, anti-cito-queratinas 5, 6 e 18 humanas (DAKO), características dos queratinócitos mais diferenciados.

Foram também utilizados dois marcadores de diferen-ciação epidérmica: anticorpo monoclonal anti-involu-crina humana (Novocastra), específica dos queratinóci-tos das assentadas supra-espinhosas e granulosas e anti-corpo policlonal anti-profilagrina humana (ZYMED), específica dos queratinócitos da camada granulosa.

Todos os anticorpos, sem excepção, reagiram com os vários tipos de CEOB.

O anticorpo MNF 116 foi positivo em todos os car-cinomas, independentemente do seu grau de diferencia-ção. O anticorpo LP34 foi positivo em todos os carcino-mas, excepto em três casos pertencentes a cada um dos graus de diferenciação acima enunciados.

O anticorpo anti-involucrina foi positivo em todos os carcinomas, excepto num pouco diferenciado. O anti-corpo anti-profilagrina foi positivo apenas em dois carci-nomas moderadamente diferenciados, em todos os car-cinomas bem diferenciados, excepto num, e em todos os carcinomas pouco diferenciados, excepto num.

AgradecimentosO presente trabalho foi financiado pelo Programa

PRAXIS XXI da Fundação para a Ciência e Tecnologia do Ministério de Ciência e Tecnologia Português e pelo Centro Interdisciplinar de Investigação em Sanidade

Animal da Faculdade de Medicina Veterinária da Uni-versidade Técnica de Lisboa.

ESTUDO IMUNOHISTOQUÍMICO DE MARCA-DORES DE PROLIFERAÇÃO CELULAR E DE MUTAÇÃO DO DNA EM CARCINOMAS DE CÉLULAS ESCAMOSAS OCULARES DE BOVI-NOS

T. Carvalho1, H.Vala 2, D. Fondevilla3, C. Pinto4, C. Peleteiro1, M. Pinho1, L. Ferrer3

1 – Centro Interdisciplinar de Investigação em Sanidade Animal, Facul-dade de Medicina Veterinária, Rua Prof. Cid dos Santos, 1300-477 Lisboa, Portugal 2 - Escola Superior Agrária de Viseu, Instituto Politécnico de Viseu, 3500 Viseu, Portugal3 - Departament de Medicina i Cirugia Animals. Facultat de Veterinaria (UAB), 08193 Bellaterra. Barcelona, Espanha4 – Serviço de Desenvolvimento Agrário de S. Miguel, 9504-541 Ponta Delgada, Açores

O presente trabalho foi desenvolvido com o objectivo de determinar, através da técnica de imunocitoquímica, o índice proliferativo e a presença de danos no DNA genómico das células neoplásicas que constituem o Car-cinoma Escamoso Ocular dos Bovinos (CEOB). Para tal foram usados dois anticorpos policlonais contra as proteínas Ki67 e p53 humanas. A Ki67 é uma proteína nuclear expressa nas células em divisão, mais precisa-mente nas fases G1 tardia, G2, S e M a qual é rapida-mente degradada após a mitose. A p53 é uma proteína supressora de tumores de extrema importância na repa-ração de danos do DNA, contribuindo em grande escala para a estabilidade genética da célula. A mutação no gene que codifica para esta proteína torna-a mais estável, prolongando o seu tempo de semi-vida. A técnica de imunohistoquímica, Avidina-Biotina-Peroxidase (ABC), foi aplicada a amostras de CEOB de bovinos prove-nientes do matadouro Frigorífico e Industrial de Ponta Delgada, Ilha de S. Miguel, Açores. O estudo incidiu sobre trinta e dois cortes histológicos, que correspon-diam efectivamente a dezanove neoplasias diagnostica-das por exame histopatológico. O material foi fixado em formol a 10% e incluído em parafina. Os anticorpos primários utilizados foram: anti-p53 humana (NCL – p53 CM-1, NOVOCASTRA, UK) e anti-Ki67 humana (NCL – Ki67p, NOVOCASTRA, UK), ambos policlo-nais. As reacções positivas para os dois anticorpos foram avaliadas semi-quantitativamente.

Agradecimentos – Este projecto foi financiado pelo Centro de Investigação Interdisciplinar de Sanidade Animal, Faculdade de Medicina Veterinária, Universi-dade Técnica de Lisboa.


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Notas sobre publicações

Clinical Atlas of Ear, Nose and Throat Diseases in Small AnimalsS. Merchant, C. Mortellaro, R.A.S. WhiteCheryl S. Hedlund, Joseph Taboada (eds.) 2002

A avaliação do atlas clínico “Clinical Atlas of Ear, Nose and Throat Diseases in Small Animals” deve incluir comentários sobre três perspectivas diferentes: na qualidade de atlas; na apreciação do texto e seu con-teúdo; no tema proposto.

No sentido estrito do termo não creio que a presente obra se possa considerar um verdadeiro atlas. Embora com excelentes fotografias, esquemas elucidativos, e bem documentado do ponto de vista ilustrativo, não vive sobretudo desta documentação. O texto é funda-mental na concepção da obra e aparece não como com-plemento da ilustração, mas como elemento fundamen-tal. Neste contexto podemos de facto considerar de qua-lidade a documentação fotográfica e esquemática que, além de qualidade gráfica, é normalmente elucidativa e esclarecedora. Muitas patologias descritas vêm nesta perspectiva bem documentadas sendo de muita utili-dade para o leitor.

O texto, como já foi referido, é um elemento fun-damental da obra. Tem um cariz essencialmente prá-tico e aplicado, sem deixar de ter um apoio teórico de cada tema abordado. Não é um tratado de fundo sobre o tema, mas aborda quase todos as situações clínicas de relevância no contexto. É apresentado sob a forma de casos clínicos, numa perspectiva de diagnóstico, diag-nóstico diferencial e terapêutica incluindo a cirúrgica quando em questão. Esta abordagem sob a perspectiva de casos clínicos torna mais fácil e directa a utilização do leitor, sobretudo numa perspectiva prática e apli-cada. Revela também um conhecimento aplicado por parte dos autores no referente a estas patologias. Essa experiência real é talvez a base da qualidade e interesse da obra.

O tema proposto e abordado, embora de interesse real e aplicado, é muito limitado, sugerindo uma quase especialização na área. Esta é talvez a maior limitação

ao interesse da obra. Por outras palavras, embora bem conseguida no seu propósito e objectivo pode ser de interesse menos generalizado pelos temas restritos que aborda. Apesar disto não creio que esteja fora do inte-resse do clínico geral que também acaba por lidar com estes problemas e que pode encontrar nesta obra res-posta útil e de fácil consulta quando necessário.

Sumariando: o tema do atlas é relativamente restrito, mas no seu âmbito abrange patologias muito variadas incluindo lesões inflamatórias, degenerativas, infeccio-sas, imunomediadas e neoplásicas percorrendo quase tudo o que tem interesse no tema em questão. Embora tenha um apoio de texto correcto e esclarecedor o seu interesse reside sobretudo na complementação em fotos, ilustrações e esquemas que se consideram de grande utilidade. Por outro lado a ilustração depende inteira-mente da complementação do texto. Sobre as várias matérias abordadas considera-se a obra útil sobretudo do ponto de vista prático e aplicado. Envolve noções de diagnóstico e terapêutica incluindo a cirúrgica quando indicada. É apresentado sob a forma de casos clínicos que pressupõe e demonstra a experiência na área dos autores, bem como confere um aspecto de aplicabili-dade aos assuntos expostos. Resumidamente esta publi-cação pode ser avaliada no seu interesse específico pelas seguintes características: tema muito restrito e limitado; no conceito de atlas pode considerar-se de qualidade e utilidade na imagem; como atlas tem um apoio de texto considerado bom; a perspectiva é fundamentalmente a aplicada e clínica.

José Sales LuisProf. Associado da Faculdade de Medicina

Veterinária de Lisboa

Atlas of Diagnostic Radiology of the HorseKees J. Dik, Ilona GunsserSchlutersche (ed.)

Este livro é composto por uma extensa colecção de radiografias que ilustram as principais patologias que podem atingir o esqueleto apendicular do cavalo. Tal como os autores sustentam no prefácio, a radiologia continua a ser o principal meio de diagnóstico na clí-


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nica equina. O material iconográfico editado e disponí-vel em livro é limitado, e por isso uma obra deste tipo, a nosso ver, tem toda a justificação.

Este livro está dividido em dez capítulos, cada um deles referente a uma zona anatómica (por exemplo: casco e 3ª falange, articulação interfalângica distal, arti-culação interfalângica proximal, etc.) e na página de rosto de cada capítulo existe um sumário com as dife-rentes patologias abordadas na iconografia.

Cada patologia é ilustrada com radiografias de exce-lente qualidade de reprodução, acompanhadas por legen-das que identificam o animal em questão e os sinais radiográficos observados. Em muitos casos, os autores juntaram esquemas em que melhor ilustram e esclare-cem as lesões observadas, ou em que fazem uma súmula das alterações que podem caracterizar uma determinada patologia.

Sendo este livro um atlas, sem dúvida nenhuma que a excelente qualidade técnica das radiografias e a sua qualidade de reprodução, bem como o seu arranjo grá-fico, tornam-no numa obra muito atractiva, fácil de ler e de consultar por parte do leitor.

No caso específico das extremidades dos cavalos, as variações anatómicas normais são diversas e por isso achamos que os autores as deveriam ilustrar separada-mente da patologia. Embora nalguns casos façam refe-rência a esses desvios anatómicos, abordam-no junta-mente com a análise da patologia, o que não alerta suficientemente o leitor menos familiarizado com estas matérias. Da mesma forma, sendo este livro um atlas deveria fazer referência, com esquemas, aos diversos posicionamentos radiográficos do animal para o exame de uma determinada zona anatómica.

De qualquer modo trata-se de um livro com icono-grafia muito vasta e variada com reproduções radiográ-ficas de grande qualidade e de leitura fácil que poderá constituir um instrumento de estudo e consulta impor-tante para estudantes de graduação ou pós-graduação bem como para médicos veterinários que se dediquem à clínica equina.

António FerreiraProfessor Associado da FMV

Director do Hospital Escolar da FMVe-mail: [email protected]

Cartas ao editor

Seringa semi-automática Nas minhas andanças pelos alfarrabistas de Lisboa

deparei com uma obra escrita pelo Senhor Charles Chamberland (ancien éléve de l’École Normale Supé-rieur, Docteur dès sciences, Directeur du Labotatoire de M. Pasteur), editado em 1883 pelo Sr. Bernard Tignol, Quai des Grands- Augustins, 45, em Paris, sob o título “Le Charbon et la Vaccination Charboneuse - d’après les travaux récents de M. Pasteur”.

Uma preciosidade! Tratava-se nada mais nada menos

do que o relatório de um dos dois colaboradores de Louis Pasteur (o outro foi, como todos sabem, Emile Roux) sobre os resultados práticos da vacinação contra o Carbúnculo Hemático, escrito há mais de 100 anos.

Trata-se de um pequeno volume com 314 páginas, encadernado, com capa de dourados ao gosto da época, várias gravuras e bastante bem conservado. O relatório abre com uma carta assinada pelo próprio L. Pasteur que, entre outras coisas, afirma: “Esta publicação con-tribuirá para esclarecer os agricultores e reduzir até níveis exactos as dúvidas que se produziram e são inse-paráveis de todas as descobertas”. De facto, ao con-trário do que rezam as escrituras alusivas à descoberta de Pasteur, depois da demonstração com a vacinação anti-carbúnculo, iniciada em Pouillty-le-Fort, perto da Melun, no dia 5 de Maio de 1881, às duas horas da tarde e terminada em 14 de Junho seguinte, as dúvidas persistiram apesar do seu cuidadoso planeamento e dos resultados previstos e conseguidos quase matematica-mente – o que foi notável, para a época. Mas tudo era demasiado revolucionário para as mentalidades existen-tes. Os agricultores, em especial, desconfiados como sempre de quanto representasse inovação só acredita-vam quando viam os resultados com os seus próprios olhos. Depois, os próprios clínicos não estariam prepa-rados para lidarem com suspensões bacterianas e seus esporos, cumprindo rigorosamente no campo os cui-dados e as regras que Pasteur e seus assistentes reco-mendavam. Por isso, às experiências de Pouilly-le-Fort muitas outras se seguiram por quase toda a França, a Itália, a Grã-Bretanha, a Bélgica, etc. e até a Espanha, sob a orientação de “Comissões de Estudos Experimen-tais” e nem sempre as coisas corriam bem. Assim, por exemplo, na sessão da Sociedade Central de Medicina Veterinária de 8 de Junho de 1882, Pasteur reconhecia que a avirulência das suas vacinas não estava fixada, contrariando as suas expectativas. Por outro lado o médico veterinário Cagny, congratulando-se com a pre-sença do mestre e com a forma como ele reconhecia os seus erros, considera que “alguns dos acidentes des-critos eram consequência da imprevidência de alguns colegas”.

Na obra em questão as “experiências” com a vacina-ção e os seus resultados ou consequências são porme-norizadamente descritos explicados e justificados, mas não é isso que nos leva a escrever esta nota.

Nesse tempo a vacina era aplicada subcutaneamente com a seringa de Pravaz, na qual o êmbolo era de couro e frequentemente o líquido a injectar refluía, ultrapas-sando o seu limite superior, falseando a dose injectada. A páginas 301 e 302 da obra encontram-se gravuras que nos mostram o modelo do tubo de vacina, fechado com rolha de borracha, modo de encher a seringa e de ajustar a dose. Esta era medida em gotas e o autor reco-menda que “…é preciso retirar o fio metálico que está no interior da agulha antes de ajustá-la na seringa”. A coluna do êmbolo estava dividida em oito partes iguais e possuía um cursor que permitia fixar a dose a injectar


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– uma ou duas divisões – conforme fossem carneiros, ou vacas e cavalos. Segundo Chamberland, com alguma prática vacinavam-se facilmente 150 a 200 carneiros por hora… As doses eram medidas por “gotas” – uma ou duas gotas, conforme o porte dos animais.

Certamente que a seringa de Pravaz era um instru-mento primitivo, com diversos inconvenientes para o trabalho no campo, sendo referidos em especial: 1º a sua fraca capacidade que obrigava a recorrer ao “tubo de vacina”, conspurcando-a e fazendo perder tempo; 2º perda de tempo para fazer rodar o cursor ou esquecer fazê-lo, não injectando líquido algum ou o conteúdo de toda uma seringa; 3º exigir uma limpeza delicada, fora do alcance de muitas pessoas, obrigando a que o vete-rinário se deslocasse a Paris, com as consequentes des-pesas e incómodos.

Para obviar a esses inconvenientes C. Chamberlain, em colaboração com Collin, fabricante de instrumentos de cirurgia, imaginou um modelo de seringa que será, certamente, percursora das modernas seringas automá-ticas. Era constituída por três peças fundamentais. Um reservatório de vidro com uma abertura superior por onde se introduzia a vacina e com capacidade suficiente para receber o conteúdo de uma embalagem que se fechava com pequena rolha de borracha e um gargalo ao qual se adaptava uma peça intermediária de borra-cha rígida. A esta peça adaptava-se perfeitamente uma montagem metálica que continha no interior um tubo elástico de borracha com duas pequenas válvulas que abriam para o lado terminal da agulha. Sobrepondo-se a esta montagem metálica existe um compressor que, quando premido, obrigava o líquido nele existente a sair pela agulha. Deixado livre, a elasticidade do tubo obrigava-o a subir, permitindo que o líquido vacinal o enchesse de novo. Assim, cada vez que se comprimia injectava-se uma dose certa e sempre a mesma desde que o pequeno tubo de borracha estivesse cheio. As embalagens de vacina eram tubos de vidro com extre-midades afiadas, fechadas por rolhas de borracha. A tubuladura mais estreita na abertura do reservatório e ao retirar a rolha superior o líquido escoava-se para este pela simples força da gravidade.

O mais curioso de isto tudo é que entre os poucos instrumentos cirúrgicos que restaram nos armários da disciplina de “Patologia e Clínica das Doenças Infecto-Contagiosas” na Escola Superior de Medecina Veteriná-ria, encontrámos por um feliz acaso um exemplar deste aparelho que descrevemos exactamente como é apre-sentado por Chamberland, há mais de 100 anos, res-guardado no seu estojo, completo, embora com as bor-rachas ressequidas pelo tempo.

Pareceu-nos por isso merecedor desta simples notícia para conhecimento dos mais novos. Aliás devo confes-sar que quando o observei pela primeira vez também não fazia ideia do que se tratava – um modelo, talvez o primeiro de uma seringa semi-automática para vaci-nação – o modelo Chamberland / Collin, construído, expressamente, para a vacinação anti-carbúnculo hemá-tico, também chamado, em francês, mal de montanha, febre do baço, pústula maligna, mal negro, baço de sangue e peste da Sibéria (por se julgar nesse tempo que viria do Oriente exactamente como todas as restan-tes pestes e os Messias…).

António Martins Mendes Na Faculdade de Veterinária, Alto da Ajuda

aos 25 dias de Janeiro de 2002

Reuniões científicas e cursos

O 27º Congresso Mundial de Veterinária decorrerá em Túnis, de 25 a 29 de Setembro de 2002. Supervi-sionado pela Associação Mundial de Veterinários, apre-senta um vasto programa científico incluindo áreas tão vastas como a Buiatria, a Parasitologia, a Educação Veterinária, Informática e Epidemiologia, Zoonoses, Higiene Alimentar entre outras, sendo a Segurança Ali-mentar o tema principal.

Informações: http://www.worldvetunisia2002.com

XVII Congreso Centroamericano y del Caribe de Avicultura: sob o lema “Por la sostenibilidad de la pro-ducción avícola regional, ante los retos del nuevo mile-nio”, terá lugar no Palacio de Convenciones, em La Habana, Cuba, de 1 a 4 de Outubro de 2002. Informa-ções: http://www.cuba.cu/eventos/iia/ ; Edificio MINA-GRI Ave. Independencia 5to.piso; Ciudad de La Habana, Cuba. Tel: (537) 845319 / 845536 / 579040 / 579034; Fax: (537) 579080 / 819097; e-mail: [email protected] / [email protected]

2º Congresso Paulista de Clínicos Veterinários de Pequenos Animais: terá lugar de 23 a 26 Outubro de 2002, no Hotel Transamérica, São Paulo, Brasil. Estão previstas intervenções em áreas como Dermatologia, Cirurgia, Nutrição, Doenças Infecciosas, entre outras. Nos dias 25 e 26 de Outubro, paralelemente ao con-gresso, decorrerá o VI Encontro das Entidades Represen-tativas da Medicina Veterinária do Estado de São Paulo, onde serão abordados temas polémicos como “Euta-násia em Medicina Veterinária” e “Impacto Ambiental de Resíduos e Serviços Médico-Veterinários”. Infor-mações: VNU Business Media; Rua Wanderley, 848 - Perdizes; CEP 05011-001; São Paulo-SP; Tel: (11) 3873-0081; Fax: (11) 3873-1912; e-mail: [email protected]

6th Conference of the European Society for Domes-tic Animal Reproduction: decorrerá de 12 a 14 de Setembro de 2002, na Universidade de Parma, Itália.


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Inclui 4 sessões plenárias, “New aspects of ovarian and tubal physiology”, “Ethical consensus and public perception of biotechnology”, “New strategies in arti-ficial insemination” e “Strategies to prevent mastitis in cattle”, 11 workshops e ainda sessões destinadas a comunicações livres. Informações: New Team, Via C. Ghiretti, 2, 43100 Parma, Italy. Tel: +39 0521 293913. Fax: +39 0521 294036; e-mail: [email protected]; website: www.newteam.it

Conference on Equine Sports Medicine and Science of the Elite Dressage and Three-Day-Event Horse: decorrerá de 19 a 21 de Outubro de 2002, em Saumur, França, o forum internacional destinado ao convívio e troca de informação entre os profissionais que exercem a sua actividade em cavalos de desporto. Simultanea-mente decorrerão seminários, no dia 18 e cursos práticos nos dias 22 e 23. Informações: Arno Lidner; Laurahöhe 14, D-45289 Essen, Germany. Tel: +49-201-5718873; Fax: +49-201-5718874; e-mail: [email protected]; website: www.cesmas.info

9th Conference for Ovine and Caprine Production & 7th Symposium on Animal Reproduction: decor-rerá em Ohrid, “Desaret” Hotel, República da Mace-dónia, de 4 a 7 de Setembro de 2002 e incluirá áreas tais como Fisiologia da Reprodução, Neuroendocrino-logia, Ultrasonografia entre outras. Informações: Vete-rinary Institute Skopje; Lazar Pop Trajkov 5-7; 1000 Skopje; Republic of Macedonia. Tel: ++389 2 115 125; Fax: ++389 2 114 619; e-mail: [email protected] ; website: www.vetinst.ukim.edu.mk

Forum de Reflexão e Formação em Ciências da

Saúde (F.R.F.C.S.): o Forum é uma Associação de Pro-fissionais de Saúde que pretende conforme o seu nome indica, promover a Reflexão e Formação em Ciências da Saúde e, nesse contexto, tem previstas as seguintes actividades para o corrente ano: - 3º Congresso Das Doenças Da Civilização, que decorrerá nos dias 8 e 9 de Novembro, no Auditório do Hospital do Barla-vento Algarvio, em Portimão; - “O Tempo Esse Grande Escultor. 3º Congresso” a realizar em Viseu, nos dias 4 e 5 de Outubro, no Auditório do Hotel Grão Vasco; - Cursos práticos, com realização prevista em várias regi-ões do país. Informações: Tel: 239 91 41 83; Fax: 239 91 41 87; e-mail: [email protected]

Informação associativa

Prémio Pfizer Ciências Veterinárias 2001: a ceri-mónia pública de entrega do prémio no valor monetário de 3500 euros, decorreu a 3 de Abril do corrente ano, nas instalações da Faculdade de Medicina Veterinária de Lisboa com apresentação oral do trabalho premiado “Tumores Mamários Caninos- Pesquisa de Novos Fac-

tores de Prognóstico”. Foi ainda atribuída uma menção honrosa ao trabalho intitulado “Avaliação da sobrevi-vência e da preservação celular de embriões bovinos após cultura prolongada até à fase de blastocisto: com-paração de métodos de criopreservação lenta e por vitri-ficação”. Cabe aqui uma justa referência ao colega Francisco Cerca Coelho que ao longo da sua brilhante carreira nos Laboratórios Pfizer foi um impulsionador deste prémio e contribuiu com o seu dinamismo e dedi-cação para o desenvolvimento da Saúde Animal em Portugal e para o progresso das Ciências Veterinárias.

Sociedade Científica de Suinicultura: no dia 11 de Abril de 2002, reuniu no Anfiteatro de Tecnologia da antiga ESMV, a assembleia geral da Sociedade Cientí-fica de Suinicultura, tendo como principal objectivo a eleição dos novos corpos gerentes. A única lista con-corrente foi eleita por unanimidade. Assembleia Geral: Presidente, Prof. Doutor J. Pires da Costa; 1º Secretário, Dr. Joaquim Dias Alves; 2º Secretário, Dr. Rui Gabriel Silva. Direcção: Presidente, Dr. Rui Miguel Varela Bap-tista; Vice Presidente, Dr. António Gerardo Mendonça Matos; Secretário, Dr. Pedro Barreiros; Tesoureiro, Dr. Manuel Ferreira Joaquim; Vogal, Dr. António M. Mar-ques dos Santos; Vogal, Dr. Rui Pedro Guedes Tomás; Vogal, Dr. João António Sabino Serra. Conselho Fiscal: Presidente, Dr. Daniel Luis Patacho de Matos; Relator, Dr. José Miguel Lopes Jorge; Vogal, Dr. António Carlos Sousa Quintans.

Terminado o acto eleitoral, o Presidente da Direcção abordou os novos rumos desta Sociedade Científica, cuja reactivação constitui o objectivo do seu mandato. Antevendo uma tarefa árdua e de enorme responsabili-dade, traçou o programa para o biénio 2002-2003, um programa não muito ambicioso, segundo as suas pala-vras, pois a principal preocupação é consolidar a Socie-dade Científica de Suinicultura e que tem os seguintes itens: 1º revisão e actualização dos estatutos; 2º estabe-lecer contactos a nível nacional e internacional e a filia-ção noutras sociedades científicas nacionais (SPCV) e congéneres internacionais; 3º realização de um pro-tocolo de colaboração com a Faculdade de Medicina Veterinária de Lisboa; 4º realização de um evento cien-tífico anual com apresentação de palestras e realização de debates. Tendo por objectivo a participação desta sociedade no âmbito das comemorações dos 100 anos da SPCV, encontra-se em fase de preparação um pro-grama de palestras sobre temas ligados à patologia, reprodução e alimentação; 5º criação das estruturas que permitam a publicação de uma revista de carácter cien-tífico com periodicidade semestral e ainda, a publica-ção regular de um boletim bibliográfico; 6º participa-ção activa em todas as matérias referentes aos diversos aspectos de natureza técnico-científica ligados à espé-cie suína. A intervenção terminou com o agradecimento pela confiança manifestada e pedindo a colaboração e compreensão de todos por forma a poder alcançar o êxito que se augura para este empreendimento.


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Condecoração: o nosso colega Professor Doutor Armindo Rodrigues Filipe ao atingir o limite de idade foi condecorado pelo Ministro da Saúde, Correia de Campos com a medalha de ouro por Serviços Distintos, durante a visita que realizou, em companhia do Minis-tro da Ciência e Tecnologia, Mariano Gago ao seu ainda local de trabalho, em Águas de Moura. Licenciado em Medicina Veterinária, em Lisboa, no ano de 1965, rea-lizou o estágio de licenciatura no Instituto de Higiene e Medicina Tropical, trabalhando em arborvirus, sob a orientação do Professor Manuel Reimão Pinto. Desde então não mais abandonou a área da Virologia, especia-lizando-se no estudo dos vírus transmitidos por artró-podes, já então ao serviço do Instituto Nacional de Saúde, Dr. Ricardo Jorge. Foi no Laboratório de Virolo-gia deste Instituto que se tornou especialista na sua área de trabalho, sendo considerado como o único arboviro-logista da Península Ibérica. Em 1985, a falta de espaço no Instituto – Mãe obriga-o a transferir-se para Àguas de Moura, para o antigo Instituto de Malariologia que entretanto fora desactivado e se encontrava extrema-mente degradado e com aparelhagem obsoleta. Recu-pera parte das instalações e cria o Centro de Estudos de Zoonoses. Doutora-se em Medicina Veterinária na área de Microbiologia e obtém o título de Professor Agre-gado. Simultaneamente lecciona na Escola Nacional de Saúde Pública. Em Águas de Moura, o Centro que criara com o seu esforço, transforma-se em Centro de Estudos de Vectores e Doenças Infecciosas (CEVDI), no qual estuda fundamentalmente, as viroses humanas transmitidas por artrópodos, sempre em condições rela-tivamente precárias que somente a sua dedicação e inte-resse pelo estudo permitiram ultrapassar e obrigaram à construção de um edifício moderno.

A sua actividade não foi fácil, como quase sempre sucede aos pioneiros, mas resta-lhe a satisfação de ver-se reconhecido oficialmente como perito de agen-tes infecciosos que certamente continuará a estudar. Por tudo isso a nossa revista congratula-se e endereça ao Prof. Doutor Armindo Filipe as suas mais vivas felici-tações desejando-lhe uma continuação de vida plena de realizações e sucessos.

Engº. Manuel Aboim Ascenção de Sande Lemos (4.7.1899-16.5.2001): ingrata tarefa esta de escrever sobre alguém que não se conheceu sem correr o risco de errar, por enaltecer qualidades, o que acontece fre-quentemente quando se fala sobre alguém que já não está entre nós ou, pelo contrário, por subestimar ou não atribuir o devido valor à sua obra. Perdoe aqueles que tiveram o privilégio de privar com o Engº. Manuel Aboim Sande Lemos e que, certamente com mais pro-priedade escreveriam estas linhas.

É através de uma breve biografia de duas páginas que se dá conta de sinais reveladores da imagem de um homem a quem foi ministrada uma educação rica em valores formativos sólidos, ao cursar o Colégio Militar e o Instituto de Altos Estudos Militares, tendo mais

tarde participado activamente em momentos conturba-dos de mudanças político-sociais das Guerras Mun-diais mas que revela contudo, um espírito dinamizador do progresso científico e uma incontida vontade da procura do desconhecido. Licenciou-se em Engenharia Químico-Industrial pelo Instituto Superior Técnico e foi autor de diversos trabalhos sobre Classificação e Cons-trução de Tiro, Siderurgia, Bioquímica aplicada à Nutri-ção, entre outros. Para além dos altos cargos desempe-nhados tais como a presidência da Cruz Vermelha Por-tuguesa, do Conselho Supremo da Sociedade Histórica de Independência de Portugal, do Conselho Supremo da Associação dos Antigos Alunos do Colégio Militar e o cargo de Secretário-Director da Associação Protec-tora da Primeira Infância, foi o fundador da Ordem dos Engenheiros, da Caixa de Previdência dos Engenheiros, da Associação de Beneficência Refúgio Aboim Ascen-ção e da Obra Social da Guarda Fiscal. Pela força da sua personalidade e reconhecido mérito pessoal foram-lhe atribuídos o título de “Académico de Mérito da Aca-demia Portuguesa de História”, a medalha de ouro da cidade de Faro, Ordens de Mérito Militar como Comen-dador da Ordem de Aviz, Ordem de Mérito Civil, cinco medalhas da Cruz Vermelha incluindo a sua Placa de Honra, a Grâ-Cruz (Grande Oficial) da Ordem de Mérito e ainda a atribuição do seu nome à sala de sessões da sede da Ordem dos Engenheiros. Uma homenagem é devida àquele que através da instituição do prémio “Aboim Sande Lemos”, concedido a trabalhos cientí-ficos ou técnicos, contribuiu para o fim último desta Sociedade e que é a promoção do progresso das Ciên-cias Veterinárias, tendo em vista a dignificação da pro-fissão médico veterinária.

Movimento de sócios: sócios admitidos e readmiti-dos de 1 de Janeiro a 31 de Junho de 2002. Sócios efec-tivos: 614 Fernando de Pinho Morgado; 1878 Sofia Ale-xandre Serra Bacelar; 2083 José Moras Cordeiro; 2085 Nuno Miguel Veiga Gomes; 2086 Ana Sofia Jesus Oli-veira; 2087 Nuno André de Carvalho Allen; 2088 Maria Aurora Mendes de Sousa; 2089 Rute Isabel Guedes dos Santos; 2090 Sónia Maria Antunes Capelo; 2091 Rui Pedro Rodrigues Oliveira; 2092 Cláudio Renato Sobral; 2093 Felisbina Luisa Guedes Queiroga; 2094 Maria Helena Larisma Madeira; 2095 Adelaide do Rio Pereira; 2096 Alda Francelino de Andrade Pires. Estudantes: 2084 Ana Margarida de Jesus Guilherme.

Necrologia: faleceu no dia 30 de Janeiro do corrente ano, o colega José Manuel Canas Simões. Na nota que recebemos do seu colega e amigo António Silvério Limão Oliveira pode ler-se: «… personalidade por vezes polémica, amigo do seu amigo, crítico por vezes mordaz dotado de um grande sentido de humor e acérrimo defensor da profissão veterinária». Dedicou-se durante a sua actividade profissional aos aspectos ligados à repro-dução animal na Estação da Venda Nova e na então Escola Superior de Medicina Veterinária onde foi assis-


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tente do 5º grupo. Foi autor de várias publicações entre as quais se destaca um livro sobre a Fisiopatologia da Reprodução. «… ficou a profissão mais pobre ao ter perdido um colega que sempre a prestigiou, defendeu e honrou com o seu trabalho, inteligência e espírito de bem servir.»


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TÍTULO AUTOR DIA

FORMAÇÃO Ciência e ensino universitário. Enquadramento da formação universitária. A. Vaz Portugal 10

Formação Contínua em Medicina Veterinária - Jaime Menezes Especialidades em Animais de Produção e Rendimento João Cannas da Silva 10 Especialidade em Saúde Pública Veterinária Armando Lousã 10 Especialidade em Clínica de Animais de Companhia Luís Morais 10 Potencialidades da Formação Veterinária Jaime Menezes 10

Formação Universitária - João Ramalho Ribeiro O Futuro do ensino das Ciências Veterinárias em Portugal SPCV, UTAD, ICBAS, EUVG, FMV, UE, FAEMV, EAEVE 10 RUMINANTES

Alimentação e Maneio em Produção Leiteira - Nuno Gaspar Gestão da secagem na vaca leiteira de alta produção Frederic Rollin 10 Maneio da exploração leiteira Jos Nordhuisen 10 DEBATE 10 Condição corporal e análise da exploração Jos Nordhuisen 10 Antibioterapia na clínica prática George Stilwell 10 Posters/Comunicações Livres 10

Medicina Interna em Bovinos - Miguel Saraiva Lima Maneio clínico da vaca leiteira Frederic Rollin 11 Discussão “Fluidoterapia prática em Bovinos” Miguel Saraiva Lima 11 Deslocação de Abomaso, novos conceitos João Cannas da Silva 11 Relação entre os sistemas digestivo e respiratório (efeitos fisiopatológicos) Frederic Rollin 11 Workshop: Doenças de Vitelos em engorda (extensivo e Intensivo) 11

Meios Auxiliares de Diagnóstico - João Cannas da Silva Diagnóstico de deficiência de fluidos em vitelos Frederic Rollin 11 Informática em fluidoterapia de Bovinos de carne e leite Hervé Navetat 11 DEBATE 11 Testes de Campo para diagnóstico sub-clínico em Vacas Frederic Rollin 11 Diagnóstico e correcção de carências em vitaminas e oligoelementos Frederic Rollin 11 DEBATE 11

Genética e Melhoramento - Luís Telo da Gama Raças em risco vs. genes em risco Luís Telo da Gama 11 Cooperação Ibero-americana na gestão dos recursos genéticos animais Juan Vicente Delgado 11 Posters / Comunicações livres 11

Reprodução - António Rocha Neosporose em Portugal e novos métodos de diagnóstico e isolamento do parasita Nuno Canada 11 Utilização de índices reprodutivos como forma de avaliar o desempenho reprodutivo e a eficiência dos inseminadores, em explorações de bovinos de leite António Rocha 11 Posters / Comunicações livres 11

Epidemiologia - Virgílio Almeida Encefalopatias espongiformes transmissíveis: 1-Sales Henriques e 1 - A epidemia de BSE em Portugal Rosário Bobone 12 Encefalopatias espongiformes transmissíveis: 2 - Potencial de exposição do consumidor Português a Materiais Especificados de Risco – Potencial 2-Telmo Nunes e Disposição do Consumidor Português Virgílio de Almeida Doenças Transmissíveis Emergentes: 1-Isabel Mariano e 1 - A tuberculose Bovina no Alentejo: Zoonose emergente? Amália Ferreira 12 Doenças Transmissíveis Emergentes: 2 - A Ameaça emergente do bioterrorismo 2-Armando Louzã DEBATE 12 Certificação Sanitária: 1 - Programa voluntário de certificação de explorações livres de diarreia viral 1-João Niza Ribeiro e bovina (BVD) no Entre-Douro e Minho Adelaide Pereira 12 Certificação Sanitária: 2 - Brucella melitensis em pequenos 2-Manuel Martins e ruminantes – erradicação e certificação sanitária Yolanda Vaz DEBATE 12 Posters / Comunicações livres 12

ANIMAIS DE COMPANHIAAbordagem Clínica da Infertilidade em Animais de Companhia - Jorge Cid

Abordagem clínica da infertilidade na gata Stefano Romagnoli 11 Abordagem clínica da infertilidade na cadela Stefano Romagnoli 11 DEBATE 11 Complicações da gestação na cadela - sua abordagem clínica Stefano Romagnoli 11 Tumores mamários na cadela: novas perspectivas Felisbina Queiroga 11 DEBATE 11

Infertilidade e Controlo do Ciclo Éstrico e IA em Animais de Companhia - Joaquim Vieira Lopes Controle do ciclo éstrico na cadela e na gata Stefano Romagnoli 11 Inseminação artificial na cadela, com sémen fresco, refrigelado e congelado Stefano Romagnoli 11 DEBATE 11 Infertilidade no cão - Abordagem clínica Stefano Romagnoli 11 Casos clínicos - Debate Stefano Romagnoli 11

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Workshop: Monitorização do Ciclo Éstrico na Cadela para I.A. OU C.N. - Luís Costa Controlo do ciclo éstrico para cruzamento ou IA na cadela: fundamento teórico Luís Costa 12 Sessão prática Luís Costa, Luísa Mateus, (1 monitor com 5 formandos): Isabel Alves 12 Realização e observação de esfregaços Luís Costa, Luísa Mateus, de citologia vaginal Isabel Alves 12 Preparação de amostras de sangue e realização de testes Luís Costa, Luísa Mateus, hormonais semi-quantitativos Isabel Alves 12 Visualização vaginoscópica e endoscópica (demonstração) Luís Costa, Luísa Mateus, do fundo de saco vaginal Isabel Alves 12 Discussão e interpretação de resultados 12

AVESPatologia Avícola - António Carlos Menezes

Actualização dos programas de diagnóstico e vacinação em avicultura Richard Currie 10 Doenças imunossupressivas das aves Eduards Loedel-Soca 10 DEBATE 10 Resistências antimicrobianas em avicultura Paulo Costa 10 Mesa redonda sobre salmoneloses aviárias Rui Sereno (moderador) 10

EQUINOSO Dopping na Clínica Equina - João Costa Ferreira

O Médico Veterinário e o desporto hípico João Pedro da Costa Pereira 11 O Controlo Anti Dopping no Desporto Equestre Francisco Camacho 11 DEBATE 11 International movement of horses Frits Sluyter 11 DEBATE 11 Posters / Comunicações livres 11

Clínica Equina, Presente e Futuro - José Luís Núncio Fragoso Mesa redonda: presente e futuro da clínica equina José Luís Núncio Fragoso, José Prazeres, Rui Mendes, Joana Alpoim Moreira 11

SUÍNOSSuinicultura - José Pires da Costa

Apresentação Pública da SCS-Sociedade Científica de Suinicuktura Rui Varela Baptista 11 Análise Económica de uma Exploração Suinícola Pedro Folque 11 Alimentação em Reprodutoras Gestantes-Novos Conceitos Pedro Barreiros 11 Pontos Críticos na Reprodução Simão Marçal 11 DEBATE 11

Patologia e Clínica em Suínos - Rui Baptista Patologias emergentes em suínos-Casos Práticos Pedro Lopes e Narciso Bento 11 Programa de erradicação da doença d’Aujesky: Federação Portuguesa das resultados dos primeiros meses de aplicação Associações de Suinicultores 11 DEBATE 11

SEGURANÇA E QUALIDADE ALIMENTARDetecção e Gestão de Risco em Alimentos - Fernando Bernardo / Conceição Martins

Métodos aplicados ao controlo microbiológico dos alimentos Maria João Fraqueza 12 Detecção e discriminação de Listeria monocytogenes nos alimentos Maria Manuela Guerra 12 Metodologias de Avaliação da Virulência em Vibrios spp. Maria Filomena Pereira 12 Posters / Comunicações livres 12 Gestão de riscos sanitários em Restauração e Hotelaria Carlos Brandão 12 Monitorização da contaminação microbiana de Carnes de Bovino durante o abate Catarina Barata 12 Importância dos sistemas de controlo na qualidade alimentar António Barreto 12 Posters / Comunicações livres 12 DEBATE 12

Segurança e Qualidade Alimentar - Fernando Soares da Silva Rastreabilidade - Um argumento de peso e segurança para o consumidor Sofia Almendra 12 Implementação de sistemas de segurança alimentar em mercados municipais. Maria Emília Sebastião 12 Intervenção do médico veterinário na segurança alimentar em restauração. Maria Emília Sebastião 12 Debate 12 Validação e auditorias a sistemas HACCP em produtos de origem animal Laurentina Pedroso 12 Papel do médico veterinário na segurança João Alvoeiro, Abreu Dias, e controlo alimentar (mesa redonda) Maria José Alves, Gabirro, António Barreto, Silvia Carvalho, António Menezes 12 DIAGNÓSTICO

Anatomia Patológica, Diagnóstico e Conduta Clínica - Fátima Gartner Biópsia de Pele - Relevância para o diagnóstico Conceição Peleteiro e em dermatologia Tânia Carvalho 10 Recolha e envio de material para análise histopatológica Maria dos Anjos Pires 10 DEBATE 10 Posters/Comunicações Livres 10 Análises histopatológicas. Porque demoram os resultados Anabela Alves 10 Mesa redonda sobre “Anatomia Patológica, Diagnóstico Conceição Martins e e Conduta Clínica” Conceição Peleteiro 10

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Diagnóstico Laboratorial em Ciências Veterinárias - Alexandre Galo Diagnóstico e Investigação em ciências Veterinárias Alexandre Galo 12 O Diagnóstico em Patologia Rui Baptista 12 As Doenças Bacterianas e a Saúde Animal José Regalla 12 Aspectos Gerais do Diagnóstico e da Investigação em Virologia Animal Miguel Fevereiro 12 Zoonoses de Etiologia Parasitária Eugénia Rebelo 12 A Pesquisa de Resíduos em Produtos de Origem Animal - Análise das Dificuldades e Propostas de Solução Jorge Barbosa 12 O Controlo dos Medicamentos Imunológicos em Medicina Veterinária António Valadares 12 Biologia Celular na Patologia Animal Fátima Loja 12 DEBATE 12

BEM ESTAR ANIMALBem Estar Animal - Selene Veiga

Evolução do bem estar animal na Europa Ingvar Ekesbo 11 Utilização de Animais em investigação/experimentação Bruce Lenhart 11 DEBATE 11 Posters / Comunicações livres 11

Mesa Redonda - Jaquelino Telo Mesa redonda: Bem Estar Animal. Aspectos relativos António Violante Afoito, à produção e à saúde pública (Aves, Suínos, Aquacultura, António Tavares, Touros de Lide) Jaime Menezes, Joaquim Grave 11

Comunicações Livres / Posters

Além dos temas constantes no programa, serão aceites trabalhos realizados em qualquer ramo das ciências veterinárias, para serem apresentados sob

a forma de comunicações livres ou posters. · Os resumos dos trabalhos em formato digital (Português e Inglês, não ultrapassando 250 palavras

cada um), deverão ser enviados até 10 de Julho de 2002 para o secretariado do Congresso e para o seguinte e-mail: [email protected].

· Cada comunicação livre terá a duração de 10 minutos. · Dimensão dos Posters: sujeito a confirmação. · Os autores serão notificados

até 30 de Agosto/02 sobre a aceitação ou rejeição do trabalho e sobre a sua forma de apresentação (Poster ou Comunicação Livre).

Os autores dos trabalhos submetidos ao Congresso sob a forma de Poster/Comunicação Livre, são convidados a submeter os artigos completos à Revista

Portuguesa de Ciências Veterinárias, onde poderão ser publicados após revisão por “referees” das áreas científicas a que pertencem. Para tal deverão

consultar as regras de submissão em: http://rpcv.fmv.utl.pt/intrucoes.htm

Comissão Organizadora: António Horta, António Simões Monteiro, João Ramalho Ribeiro e José Robalo Silva

Comissão Executiva: António Horta (SPCV), António Menezes (SPAMCA), António Rocha (SPRA), António Simões Monteiro (SCS),

Bruno Rôlo (SNMV), Fátima Gartner (SPPA), Fernando Ramôa Ribeiro (UTL), Filipa Rocha (AEFMV), Henrique Ramos da Costa

(SPCV), Jaime Menezes (OMV), João Cannas da Silva (APB), João Ramalho Ribeiro (SPCV), Joaquim J. Vieira Lopes (APMVEAC),

José Robalo Silva (SPCV), Luís Telo da Gama (SPRGA), Mário Barbosa (AMVCE), Selene Veiga (DGV), Virgílio Almeida (SPEMVP),

Organizações Envolvidas: Sociedade Portuguesa de Ciências Veterinárias (SPCV), Associação dos Estudantes da Faculdade de Medicina Veterinária

(AEFMV), Associação Portuguesa de Buiatria (APB), Associação Portuguesa dos Médicos Veterinários Especialistas em Animais de Companhia

(APMVEAC), Associação dos Médicos Veterinários Clínicos de Equinos (AMVCE), Direcção Geral de Veterinária (DGV), Laboratório Nacional de

Investigação Veterinária (LNIV), Ordem dos Médicos Veterinários (OMV), Secção Portuguesa da Associação Mundial de Ciência Avícola

(SPAMCA), Sindicato Nacional dos Médicos Veterinários (SNMV), Sociedade Científica de Suinicultura (SCS), Sociedade Portuguesa de

Epidemiologia e Medicina Veterinária Preventiva (SPEMVP), Sociedade Portuguesa de Patologia Animal (SPPA), Sociedade Portuguesa de Recursos

Genéticos Animais (SPRGA), Sociedade Portuguesa de Reprodução Animal (SPRA),

Apoios Institucionais

Câmara Municipal de Oeiras, Instituto Nacional de Investigação Agrária, Direcção Geral de Veterinária

Reitoria da Universidade Técnica, Instituto Superior Técnico (IST), TagusPark

Secretariado: Sociedade Portuguesa de Ciências Veterinárias, Edifício Escola Superior de Medicina Veterinária – Rua Gomes Freire – 1169-014 Lisboa.

Tel. 213580222, Fax 213580221.

Programa Actualizado na Internet: http://aemhorta.tripod.com/congressospcv/

Ficha de Inscrição:Congresso de Ciências Veterinárias100 Anos da Sociedade Portuguesa de Ciências Veterinárias (SPCV) Nome: _________________________________________________________________________________ Morada: ________________________________________________________________________________ Cod. Postal: __________________________________ Telef.: ___________________________ Assinale a(s) sua(s) opção(ões): Até 31Jul 1 Ago - 4 Out Depois de 6 Out 3 dias / 1 dia 3 dias / 1 dia 3 dias / 1 diaEstudantes: € 100 / 40 € 125 / 50 € 150 / 60Sócios (SPCV) € 125 / 50 € 150 / 60 € 200 / 80Não Sócios: € 175 / 70 € 200 / 80 € 250 / 100

Jantar de encerramento com animação (11-Out): € 25,00

WorkShop - Curso Prático com inscrição limitada a 15 participantes: € 125

Forma de pagamento:em numerário ou cheque passado em nome de Sociedade Portuguesa de Ciências Veterinárias - CongressoSociedade Portuguesa de Ciências Veterinárias - Edifício da Escola Superior de Medicina Veterinária, Rua Gomes Freire, 1169-014 Lisboa* A inscrição inclui a documentação do congresso com livro de actas, livre acesso às conferências com excepção do workshop do dia 12, almoços de trabalho e actos sociais.

agonistas adrenérgicos ß e produção animal: iii - efeitos ... · 51 artigo de revisÃo...

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