universidad de colima - .diferencia de la mayoría de los bloqueadores de canales, la cloroquina

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  • UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE MEDICINA

    BASES ESTRUCTURALES MOLECULARES DEL BLOQUEO DEL CANAL DE POTASIO RECTIFICADOR ENTRANTE Kir2.1 POR

    CLOROQUINA

    TESIS

    QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

    DOCTOR EN CIENCIAS FISIOLGICAS

    PRESENTA

    M. en C. ALDO AZMAR RODRGUEZ MENCHACA

    ASESOR

    Dr. JOS ANTONIO SNCHEZ CHAPULA

    COASESOR

    Dr. RICARDO ANTONIO NAVARRO POLANCO

    COLIMA, COL, NOVIEMBRE DE 2007

  • A mis padres, Delma y Antonio

    a mis hermanos, Arel, Albin y Anuar

    a Mayra

    por su gran amor y apoyo

  • AGRADECIMIENTOS

    Al Dr. Jos Antonio Snchez Chapula

    Al Dr. Ricardo Antonio Navarro Polanco

    Al Dr. Colin G. Nichols Washington University in St. Louis

    Al Dr. Martin Tristani Firouzi University of UTAH

    A mis compaeros y amigos

    Gabriel, Martn, Ivn, Edgar, Eloy, Arael, Miguel, Anglica, Daniela y muchos otros que me han brindado su amistad.

    A los revisores de este proyecto por sus valiosas sugerencias.

    Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa, por el apoyo econmico otorgado para la realizacin de este Doctorado.

  • NDICE

    NDICE DE FIGURAS 1

    ABREVIATURAS 2

    RESUMEN 4

    ABSTRACT 5

    ANTECEDENTES 6

    Identidad molecular de los canales rectificadores entrante cardiacos 8

    Mecanismo de la rectificacin entrante o anmala 10

    Farmacologa de los canales de potasio rectificadores entrantes 16

    Efectos electrofisiolgicos de la cloroquina 17

    JUSTIFICACIN Y PLANTEAMIENTO DEL PROYECTO 21

    HIPTESIS 24

    OBJETIVOS 25

    METODOLOGA 26

    Biologa molecular 26

    Transfeccin de DNA en la lnea celular HEK-293 26

    Experimentos de fijacin de voltaje en la lnea celular HEK293 26

    Anlisis de los datos 27

    RESULTADOS 28

    La cloroquina aplicada del lado extracelular bloquea preferentemente las

    corrientes salientes del canal Kir2.1 28

  • La cloroquina bloquea los canales Kir2.1 por la superficie citoplasmtica 29

    Dependencia de voltaje del bloqueo por cloroquina 32

    El desbloqueo de la cloroquina a voltajes negativos a EK es dependiente de [K+]

    extracelular 35

    Los bloqueadores endgenos no protegen al canal Kir2.1 del bloqueo por

    cloroquina 37

    El sitio de unin de la cloroquina en el canal Kir2.1 es dentro del poro

    citoplasmtico 40

    Modelo de bloqueo del canal Kir2.1 por cloroquina en presencia de bloqueadores endgenos 42

    DISCUSIN 43

    CONCLUSIONES 48

    BIBLIOGRAFA 49

  • NDICE DE FIGURAS

    Figura 1 Curvas corriente-voltaje de una conductancia linear y una que presenta rectificacin entrante.

    7

    Figura 2 Topologa de una subunidad de un canal de K+ de rectificacin entrante.

    9

    Figura 3 Estructura general de los canales rectificadores entrantes. 10 Figura 4 Esquema del modelo hipottico del mecanismo de

    compuerta (gating) de los canales Kir. 11

    Figura 5 Modelo del largo poro de conduccin de los canales Kir basado en las estructuras cristalizadas de los canales Kir2.1 y KirBac1.1.

    13

    Figura 6 Modelo del bloqueo del canal Kir2.1 por espermina. 14 Figura 7 Modelo del bloqueo secuencial del canal Kir2.1 por

    espermina. 15

    Figura 8 Efecto de la cloroquina en potenciales de accin de fibras de Purkinje y miocitos ventriculares de gato.

    18

    Figura 9 Efecto de la cloroquina sobre Ik1 en miocitos ventriculares de gato.

    19

    Figura 10 Estructura qumica de la cloroquina. 22 Figura 11 Inhibicin del canal Kir2.1 expresado en clulas HEK293

    por cloroquina. 29

    Figura 12 Efecto de la cloroquina sobre el canal Kir2.1 durante un potencial de accin ventricular de gato.

    30

    Figura 13 Curso temporal del bloqueo por cloroquina de los canales Kir2.1.

    31

    Figura 14 Efecto de la cloroquina sobre los canales Kir2.1 en ausencia de bloqueadores endgenos.

    33

    Figura 15 Cintica del desbloqueo de cloroquina en los canales Kir2.1.

    34

    Figura 16 Relaciones corriente relativa-voltaje del bloqueo del canal Kir2.1 por cloroquina.

    35

    Figura 17 El desbloqueo de cloroquina a voltajes negativos a EK es dependiente de voltaje y de [K+]o.

    36

    Figura 18 Lenta recuperacin del bloqueo por cloroquina del canal Kir2.1.

    38

    Figura 19 La espermina no protege a los canales Kir2.1 del bloqueo por cloroquina.

    39

    Figura 20 Mutaciones por alanina de las regiones del poro transmembranal y citoplasmtico del canal Kir2.1.

    41

    Figura 21 Modelo en caricatura del bloqueo por cloroquina del canal Kir2.1.

    42

  • ABREVIATURAS

    ATP: trifosfato de adenosina.

    Ba2+: bario.

    CO2: dixido de carbono.

    CQ: cloroquina.

    CTRL: control.

    ADN: cido desoxirribonucleico.

    ARN: cido ribonucleico.

    EK: potencial de equilibrio para el potasio.

    FV: fibrilacin ventricular.

    GFP: protena verde fluorescente.

    ICa-L: corriente de calcio tipo L.

    IK1: corriente de potasio de rectificacin entrante cardiaca.

    IKACh: corriente de potasio activada por acetilcolina.

    IKATP: corriente de potasio modulada por la concentracin intracelular de ATP.

    IKur: corriente de potasio de rectificacin tarda ultrarrpida.

    IKr: corriente de potasio de rectificacin tarda rpida.

    IKs: corriente de potasio de rectificacin tarda lenta.

    INa: corriente de sodio.

    Itof: corriente de potasio transitoria rpida.

    Itos: corriente de potasio transitoria lenta.

  • IKp: corriente de meseta.

    K+: potasio.

    Kd: constante de disociacin.

    KirBac1.1: canal de K+ rectificador entrante bacteriano.

    Phe: fenilalanina.

    TEA: tetraetil amonio.

    VIH-1: virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1.

    Z: valencia.

    [K+]o: concentracin de potasio extracelular.

    [Na+]: concentracin de sodio.

  • RESUMEN

    Aunque la cloroquina continua siendo un importante agente teraputico para el

    tratamiento de la malaria en muchas partes del mundo, su margen de seguridad es

    muy estrecho. La cloroquina inhibe la corriente de K+ de rectificacin entrante

    cardiaca IK1 y puede inducir arritmias ventriculares letales. En el presente estudio,

    caracterizamos las bases moleculares y biofsicas del bloqueo por cloroquina del

    canal Kir2.1 que forma la corriente IK1 cardiaca. La dependencia de voltaje y de K+

    del bloqueo por cloroquina implica que el sitio de unin esta localizado en el poro de

    conduccin. Mutaciones sitio-dirigidas revelaron que el sitio de unin de la

    cloroquina es dentro del poro citoplasmtico y no dentro del poro transmembranal. A

    diferencia de la mayora de los bloqueadores de canales, la cloroquina no se une

    dentro del poro transmembranal y puede ocupar su sitio de unin aun cuando las

    poliaminas permanezcan unidas profundamente en el poro. Estos resultados explican

    como un frmaco de relativa baja potencia como la cloroquina puede efectivamente

    bloquear la corriente IK1 an en presencia de bloqueadores endgenos de alta

    afinidad. Por otro lado, nuestros resultados proporcionan un marco estructural para el

    diseo