marcadores biomoleculares de cancer de pulmon

BIOMARCADORES RUTINARIOS

En la actualidad, la presencia de mutaciones de EGFR puede considerarse crucial en un subgrupo depacientes con cáncer de pulmón no microcítico. Cuando estas mutaciones EGFR están presentes, elcomportamiento clínico del tumor y, sobre todo, la respuesta terapéutica a los inhibidores tirosincina-sa de EGFR, dan lugar a una supervivencia que sobrepasa los dos años de mediana frente a menosde doce meses del cáncer de pulmón convencional.

En casos seleccionados.(1) Otros factores pronósticos seleccionados: tipos histológicos.

RUTINARIO

Determinación de mutacionesde EGFR

RECOMENDABLE

Determinación de EML4-ALK

EVIDENCIAINSUFICIENTE

• Receptores de factoresde crecimiento y sus sistemasde señalización intracelular:- Otras metodologías

de determinación de la expresiónde EGFR (IHQ, FISH)

- Mutaciones de K-Ras- Alteraciones en otras víasPI3K/AKT, RAF, etc.

• Farmacogenómica:- ERCC1, RRM1 y 2, BRCA1- MKP-1, CHOK, EPOR

• Marcadores de angiogénesisVEGF, moléculas de adhesión(ICAM)

• Otros marcadores:- p53, factor angiogénico VIII,CD44, pRb, bcl-2, glutatión-S-transferasa, hMLH1 y 2

• Perfiles de expresión génicamicroarray

• Perfiles de expresión de proteínas

Biomarcadores moleculares y genómicaen el cáncer de pulmón

Javier de Castro Carpeño

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Determinación de mutaciones de EGFR

EGFR es uno de los miembros de la familia de receptores de membrana con actividad tirosincinasa cono-cidos de forma global como ErbB. La activación de este receptor supone tanto un beneficio de prolifera-ción como un importante freno a la apoptosis, pues implica rutas oncogénicas, tales como MAPK yPI3K/Akt/PTEN/mTOR. Por ello, no es de extrañar que sea una de las principales dianas para su bloqueofarmacológico. Este bloqueo dependerá del modelo de activación del receptor, ya sea por exceso de li-gando, por exceso del propio receptor o por activación constitutiva debido a mutaciones del dominio in-tracelular que permiten la señalización en ausencia de ligando o de pareja de dimerización. En ese senti-do, la sobreexpresión y las mutaciones del receptor (1) son los modelos de activación que mayor interésdiagnóstico han despertado en los pacientes con carcinoma no microcítico de pulmón (CPNM). Este inte-rés se ha suscitado tanto por la disponibilidad de fármacos frente a esta diana como por la controversiagenerada para garantizar la máxima fiabilidad en su identificación.

Así, numerosos estudios han evaluado el valor de diferentes técnicas, como la inmunohistoquímica, la re-acción en cadena de la polimerasa (PCR) o la hibridación fluorescente in situ (FISH) para la identificaciónde EGFR. La validez y aplicabilidad de estos procedimientos ha sido controvertida, ya que muchos estu-dios han sido retrospectivos y sin un grupo control para comparar. La estimación del valor predictivo po-sitivo de la inmunohistoquímica, PCR y FISH ha sido del 6,5% al 82%, del 7% al 100% y del 11% al 89%,respectivamente. A pesar de este inmenso rango, se ha publicado un metaanálisis que incluye a más de5.000 pacientes, en el que se considera que los tres métodos pueden predecir una respuesta a gefitinib(1). Por el contrario, tan sólo se dispone de un estudio que compare entre sí todos estos métodos parapredecir una respuesta, y se fundamenta en el tratamiento con erlotinib. En cualquier caso, la principal li-mitación de estas tecnologías es la hipótesis de partida, ya que la presencia de EGFR no supone, al me-nos a priori, una dependencia proliferativa de la célula que lo expresa. Además, cada una de estas tecno-logías da información muy distinta sobre la diana, por lo que la conjugación de todas ellas limita en granmedida la plausibilidad biológica que debería subyacer a cualquier metaanálisis de calidad.

A continuación se comentan las dos tecnologías con mayor valor teórico.

La FISH permite identificar, de forma simple y reproducible, el número de copias de un gen. Así, se ha en-contrado una posible correlación entre el aumento del número de copias del gen EGFR contabilizadaspor FISH y la eficacia de los inhibidores de la tirosincinasa (1) a pesar de que está pendiente de demos-trar in vivo que el aumento en el número de copias de EGFR implica un incremento en la señalización in-dependiente de ligando, sobre todo con métodos enzimáticos.

La secuenciación de ADN, a través de variantes más o menos sofisticadas de la PCR, podría considerar-se como el estándar en la identificación de secuencias predictoras de respuesta o resistencia a un fárma-co. En este sentido, la eficacia de los inhibidores de la actividad tirosincinasa de EGFR se ha asociadocon la posibilidad de bloqueo de la vía de señalización aberrante que se pone en marcha por mutacionesdel receptor (2, 3, 4). La correlación entre la presencia de mutaciones de EGFR y la respuesta a gefitinib yerlotinib ha quedado patente en estudios retrospectivos, con respuestas superiores al 65% y medianasde supervivencia de 20 a 30 meses (5). Además, estudios prospectivos, que han empleado estos inhibi-dores en primera línea en pacientes con mutación, han confirmado estos resultados (6). En la actualidad,el estudio español EURTAC está evaluando si el tratamiento con erlotinib produce un beneficio en la su-pervivencia libre de progresión frente a la quimioterapia, como tratamiento de primera línea, en pacientesportadores de la mutación.

El estudio IPASS, realizado en pacientes asiáticos con un perfil clínico típico de adenocarcinoma y no fu-mador, ha demostrado que en los pacientes con mutación de EGFR, la administración de gefitinib es su-perior que la quimioterapia como tratamiento de primera línea en términos de supervivencia libre de pro-gresión (7). Además, ha mostrado la mayor supervivencia de este subgrupo de enfermos portadores de

Marcadores moleculares y Genómica en Oncología

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INFORMACIÓN POR TUMORES

BIOMARCADORES MOLECULARES y GENóMICA EN EL CáNCER DE PULMóN

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mutación EGFR. Este estudio ha permitido la indicación de gefitinib por la European Medicines Agency(EMEA) para su administración en pacientes portadores de mutación EGFR.

De igual modo, el grupo español ha presentado el perfil clínico y evolutivo de más de 2.000 pacientes conmutación EGFR (8). Se confirma el mejor pronóstico de los enfermos cuyos tumores tienen mutación y, apesar de que este tipo de pacientes suele entrar dentro del grupo de mujeres, con adenocarcinoma y nofumadoras, hay un grupo significativo de pacientes que presenta otras características, por lo que los cri-terios clínicos no pueden reemplazar a la determinación de mutaciones.

Sin embargo, hoy se sabe que las mutaciones del exón 19 (pequeñas deleciones) y del 21 (mutacionespuntuales que suponen una modificación en la secuencia proteica L858R) muestran una sensibilidaddiferente a los inhibidores de la tirosincinasa y que hay mutaciones en el exón 20 (T790M/L858R,G719A y L861Q) que ofrecen una resistencia de novo o adquirida a los mismos. Además, el métodomás común para detectar las mutaciones precisa de purificar el ADN de la muestra tumoral completa,amplificar por PCR y secuenciar, con la limitación del tamaño dela muestra, habitualmente pequeña enel CPNM. Por ello, se están desarrollando nuevos procedimientos que permitan una detección másexacta, incluso con un material muy escaso, como el procedente de citologías por punción, esputo ode líquido pleural (9). En este sentido, merece mención especial la detección de mutaciones en célulastumorales circulantes, que permite monitorizar la respuesta al tratamiento y predecir la progresión (10).

Dos estudios asiáticos que han comparado la administración de quimioterapia frente a inhibidores tirosin-quinasa, en concreto gelitunib, como terapia de primera línea en pacientes con tumores EGFR mutadoshan demostrado recientemente el impacto positivo en la supervivencia libre de progresión cuando se ad-ministra el inhibidor en primer lugar (11, 12). De igual modo, el estudio SATURN ha confirmado el benefi-cio con erlotinib como terapia de mantenimiento en la población EGFR mutada (13).

Recientemente, se ha publicado el resultado del tercer estudio realizado en la población asiática que hacomparado la administración de quimioterapia frente a erlotinib en pacientes con tumores con mutacio-nes EGFR, confirmándose el beneficio en supervivencia libre de progresión del grupo tratado con erloti-nib (14). Los resultados del estudio EURTAC, con un diseño similar al anterior, quimioterapia frente a erlo-tinib en pacientes con tumores portadores de mutaciones EGFR, han sido comunicados en ASCO de2011 y están pendientes de publicación. De nuevo, existe un beneficio estadístico en supervivencia librede progresión cuando los enfermos son tratados con erlotinib frente a los que reciben inicialmente qui-mioterapia.

En resumen, los inhibidores de la actividad tirosincinasa de EGFR, como erlotinib (Tarceva®, OSI/Genen-tech, Boulder, CO/South San Francisco, California, EE. UU.) y gefitinib (Iressa®, AstraZeneca, Maccles-field, Reino Unido), pueden interferir la citada actividad y logran una tasa de respuesta objetiva del 10% al27% en los pacientes con CPNM tras la progresión a quimioterapia. Este beneficio parece ser máximo enlos pacientes cuyas neoplasias son portadoras de mutaciones en los exones 19 y 21.

Métodos de medición

El estudio de mutaciones de EGFR deberá ser realizado en laboratorios que tengan una técnica homolo-gada y reproducible para este procedimiento. Con el fin de obtener la máxima rentabilidad, dado el esca-so material disponible, se deben aplicar las técnicas más sensibles para una mejor determinación de lamutación de EGFR. En este sentido, existen diversas fases que son críticas para la excelencia en la de-terminación de las citadas mutaciones. En primer lugar, el material sobre el que se purificará el ADN tu-moral debe ser evaluado por un patólogo experto que delimite la zona sobre la que se realizará la micro-disección por láser, si está disponible, o la macrodisección sobre el portaobjetos donde está depositadoel corte de la pieza original. Si existe material suficiente, se debe realizar una tinción con hematoxilina-eo-sina en los cortes situados en los extremos del material para extracción, garantizando así que existe unaconcentración similar en los cortes delimitados por ellos. En una segunda fase, debe garantizarse que la


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purificación del ADN es de suficiente calidad a través de los métodos estándares, evitando la secuencia-ción de smears o de ADN muy fragmentados, lo cual podría reducir la sensibilidad de la técnica. Además,es necesaria la presencia de controles internos de calidad, así como grupos controles que garanticen laexistencia de la reacción. En relación con la metodología de PCR que se ha de emplear, es crítico el he-cho de que se realice en centros con amplia experiencia en secuenciación automática, así como con di-latada experiencia en prestar servicio de secuenciación a centros externos. Por ello, se recomienda elcontacto directo con los distintos parques científicos nacionales o con los grupos con calidad contrasta-da en secuenciación automática, más allá de la selección aleatoria o fundamentada en la extrapolaciónde prestigio desde campos ajenos a la misma. Además, se hace especial hincapié en la necesidad de laextracción automatizada del ADN. Por último, tanto la PCR para hibridación de la secuencia problema,como la necesaria para la secuenciación colorimétrica, deberían realizarse en el mismo centro, con lo quese evitarían manipulaciones adicionales del material.

Actualmente se están desarrollando diversos anticuerpos monoclonales para la identificación de la muta-ción por técnicas de inmunohistoquímica. Los resultados preliminares confirman un buen rendimiento deeste procedimiento que, de confirmarse, permitirá facilitar la identificación de este tipo de pacientes.

BIOMARCADORES RECOMENDABLESDeterminación de EML4-ALK

El oncogen de fusión EML4-ALK fue descrito inicialmente en 2007 (15, 16) cuando se encontró una peque-ña inversión dentro de una región del brazo corto del cromosoma 2 que daba lugar a una proteína quimé-rica con actividad tirosinquinasa y actividad oncogénica in vitro e in vivo. Esta proteína combinaba una par-te del extremo N-terminal de la proteína “echinoderm microtubule-associated protein-like 4” (EML4) con eldominio quinasa intracelular de la proteína “quinasa de linfoma anaplásico” (ALK) (17).

Además de EML44, ALK puede reordenarse con otras proteínas situadas en esa región del brazo cortodel cromosoma 2.

El reordenamiento de EML4-ALK es detectado mediante un procedimiento de FISH a través de una sondabreak apart.

Pronto se vio cómo EML4-ALK estaba presente en una pequeña proporción de pacientes con carcinomano microcítico de pulmón. En el primer estudio, 5 de 75 tumores de pulmón presentaban expresión de es-ta proteína, lo que suponía un 6,7% de incidencia. Estudios posteriores realizados mayoritariamente enpoblación asiática, con tumores potencialmente resecables y en estadios iniciales, detectaron el reordena-miento en una frecuencia inferior, del 1 al 4,9% (18, 19). Dado que en estos estudios se apuntaba un posi-ble perfil clínico parecido al de los portadores de mutación EGFR, es decir, histología de adenocarcinomao ausencia de hábito tabáquico, se ha realizado el mayor estudio de detección sobre 141 pacientes quedebían reunir al menos dos de las características clínicas de adenocarcinoma, género femenino, historiade ausencia de tabaquismo y raza asiática. En él, la frecuencia de mutación de EML4-ALK ha sido del

RECOMENDACIÓN

Dados los últimos resultados, el análisis de mutaciones de EGFR se debería hacer en el mayornúmero de pacientes posible. Ya que el problema en cáncer de pulmón es la presenciade muestra tisular tumoral suficiente para la realización de la mutación, y aunque no hay unconsenso totalmente establecido, se recomienda la realización del análisis de mutaciones deEGFR de forma sistematizada en los pacientes en los que se presume una mayor probabilidad deencontrar dichas mutaciones, como son los enfermos que nunca han fumado o cuyos tumorestienen una histología de carcinoma no escamoso o el género femenino.

13%, mientras que la de EGFR era del 22%. El perfil del paciente con mutación de EML4-ALK era de unenfermo varón, más joven que los portadores de mutación EGFR y con ausencia de hábito tabáquico.Además, 18 de los 19 pacientes con reordenamiento de EML4-ALK tenían un adenocarcinoma, con pre-dominio del subtipo de células en anillo de sello. Por otra parte, no había diferencias en la respuesta a laquimioterapia basada en platino si se comparaba con la población general (20). Además, se ha visto quela presencia de mutación de ALK es mutuamente excluyente con la de EGFR o la de K-ras y que los pa-cientes portadores de mutación de ALK son resistentes a inhibidores tirosinquinasa de EGFR. Estos datosclínicos son acordes con las observaciones preclínicas que mostraron mutación EML-ALK, en la línea ce-lular H3122, resistente a erlotinib (18).

La importancia de la determinación de ALK radica en dos hechos: por una parte, en que estamos ante unsubgrupo de enfermos con cáncer de pulmón diferente en cuanto a origen y evolución tumoral. Por otraparte, porque podrían ser tratados de una forma individualizada mediante inhibidores específicos de ALK.

PF-02341066 (actualmente denominado Crizotinib®, Pfizer) es un agente oral con capacidad de inhibicióndual de la actividad tirosinquinasa de ALK y del receptor MET/HGF que inicialmente demostró actividadantitumoral en un ensayo fase I (21).

En octubre de 2010 se publicaron los primeros resultados con la experiencia de crizotinib en 82 pacientesidentificados con presencia de reordenamientos de ALK después de analizar muestras de,aproximadamente, 1.500 pacientes (22). Se alcanzó una tasa de respuesta del 57% y un control de laenfermedad en el 90%. Aunque sin datos de supervivencia, el 72% de los enfermos no había progresadoa los seis. Todos estos datos invitan a pensar en una gran eficacia terapéutica en estos gruposseleccionados de enfermos. Por eso, actualmente se están realizando diferentes estudios en poblaciónALK positiva, uno comparativo frente a quimioterapia de segunda línea y otro en pacientes que ya hanprogresado a las líneas habituales de tratamiento.


Para identificar los reordenamientos de ALK se realiza una técnica de FISH en muestras tumora-les conservadas en parafina a través de una sonda break apart (Vysis LSI ALK Dual Color, BreakApart Rearrangement Probe; Abbott Molecular, Abbott Park, IL).

Para definir una muestra como positiva, tiene que existir más de un 15% de células tumoralescon señales divididas, en una muestra de al menos 60 células.

Mediante inmunohistoquímica se pueden confirmar los resultados (anticuerpo monoclonal de ra-tón contra ALK [clone ALK1;DAKOUSA, Carpinteria, CA]).



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RECOMENDACIÓN

Dados los interesantes resultados obtenidos, se recomienda la realización de la determinaciónde reordenamientos de EML4-ALK en aquellos pacientes en los que se sospeche su existencia paraque puedan ser incluidos en los estudios actualmente en marcha con el agente inhibidor crizotinib.Aunque la experiencia no es muy amplia por el momento, se recomienda realizar el estudio delreordenamiento de ALK en pacientes con perfil clínico sugestivo, como enfermos no fumadores,jóvenes o con histología de adenocarcinoma. Además, parece que las mutaciones de EGFR y deKRAS son mutuamente excluyentes con las de ALK, por lo que en grupos en los que se haidentificado una alteración molecular, el análisis de ALK no sería prioritario. Si se tiene en cuenta quehasta el momento el estudio del reordenamiento de ALK se ha realizado en su mayor parte portécnica de FISH y en tejido tumoral pero no en citología, se recomienda la máxima optimización de lahabitualmente escasa muestra tumoral a la hora de indicar análisis moleculares.

BIOMARCADORES CON EVIDENCIA INSUFICIENTEReceptores de factores de crecimiento y sus sistemas de señalización intracelular

• Otras metodologías de determinación de la expresión de EGFR (IHQ, FISH).

• Mutaciones de K-Ras.

• Alteraciones en otras vías PI3K/AKT, RAF, etc.

A pesar de la gran cantidad de estudios que han analizado diferentes receptores y vías de señaliza-ción oncogénica activadas, de todos ellos merece mención especial el valor predictivo y pronósticoque puede aportar la determinación de la expresión de EGFR mediante la técnica de FISH.

En el análisis del subgrupo del ensayo BR.21, fue la expresión medida por FISH y no las mutacionesde EGFR, la que predecía a la respuesta anti-EGFR (25).

Se han publicado datos que avalan el papel del FISH para predecir la respuesta a cetuximab, un anti-cuerpo monoclonal anti-EGFR (26). Más recientemente, se ha establecido un baremo de expresión in-munohistoquímica de EGFR con una correlación entre altos niveles de expresión y respuesta a cetuxi-mab. Este procedimiento puede determinar en un futuro próximo la indicación de cetuximab en elsubgrupo de enfermos cuyos tumores tengan una alta expresión de EGFR (23).


Los estudios de FISH tienen el inconveniente de que no están disponibles en muchos centros y deque precisan de sistemas de estandarización que marquen el número de copias del gen y el tipode anomalías genéticas. Aun así, es una tecnología muy reproducible y fácilmente implantable en lamayoría de los centros. El entrenamiento que precisan los técnicos de Atención Primaria y los médi-cos especialistas en Anatomía Patológica, es muy inferior al necesario para la implantación de otrastecnologías.

La técnica de inmunohistoquímica es de fácil realización y muy utilizada en patología, aunque el em-pleo de baremos o scores de expresión exige un entrenamiento mayor.

Mutaciones de K-Ras

La activación de la vía mediada por Ras, especialmente a través de KRas, ocurre en un 30% de ade-nocarcinomas y en un 5% de carcinomas epidermoides (24). Además, la mutación que provoca la in-activación de NF1 RasGAP se describe en un 7% de CPCNP. Esta inactivación de NF1 RasGAP esmutuamente excluyente con la de EGFR y provoca una estimulación de todas las isoformas de RAS,aunque no se sabe si produce un efecto similar a los KRAS mutados o actúa más como mecanismode resistencia a los anti-EGFR.

Las mutaciones de KRAS en CPNM ocurren en los codones 12 y 13, y están asociadas al hábito tabá-quico. Un metaanálisis con 28 estudios que evaluaron el papel de la mutación de KRas en CPNM de-mostraron un papel pronóstico negativo para todos los estudios (HR 1.30, P=.01) y de 1.52 (P=.02)para los específicamente enfocados en el adenocarcinoma. A pesar de ello, muchos de estos trabajosson retrospectivos, y el auténtico valor de las mutaciones de KRas como factor pronóstico y factorpredictivo de respuesta a la quimioterapia no ha podido ser completamente confirmado. Por el con-


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RECOMENDACIÓN

Actualmente, no se recomienda la determinación de otras técnicas para la expresión de EGFR ensustitución de las mutaciones de EGFR a la hora de predecir la respuesta a inhibidores de la activi-dad tirosincinasa de EGFR.

trario, la presencia de mutaciones de KRas sí se relaciona significativamente con la ausencia de muta-ciones de EGFR y con la resistencia a los inhibidores tirosincinasa de EGFR.

Alteraciones en otras vías PI3K/AKT, RAF, etc.

A pesar de los avances realizados, actualmente solo se han podido identificar alteraciones molecula-res en menos de un 50% de los CPNM. A excepción de la mutación de KRAS, la mayoría de mutacio-nes se han encontrado en una incidencia muy baja, inferior al 5%, y casi todas suelen ser mutuamen-te excluyentes.

Amplificación de MET

MET es el gen que codifica para el receptor del factor de crecimiento hepatocitario (HGFR) situado enel cromosoma 7q21-q31. En series de pacientes no tratados con inhibidores EGFR, la presencia deamplificación de MET se ha descrito entre el 1.4 y el 21% de CPNM. Esta variabilidad se debe a losdiferentes métodos de detección empleados. La amplificación de MET se ha descrito tanto en adeno-carcinomas como en epidermoides, es independiente de la presencia de mutaciones de KRAS o deamplificaciones de EGFR y puede ser oncogénica por sí misma. También, la amplificación de MET seha descrito en un 20% de los pacientes cuyos tumores tienen resistencia adquirida a los anti-EGFR.Por el contrario, las mutaciones de MET son raras en CPNM.

Se están investigando diferentes inhibidores de MET, desde inhibidores de su actividad cinasa comoPF-02341066, GSK1363089 a anticuerpos como AMG 102. Algunos de ellos están mostrando resulta-dos muy interesantes en enfermos con tumores con mutación EGFR que progresan a inhibidores deEGFR por amplificación de MET.

Mutaciones de HER-2

HER-2 está sobreexpresado en un 20% de CPNM, pero la amplificación del gen solo ocurre en un 2%de los casos. Las mutaciones se presentan en un 2% y suelen consistir en inserciones en el exón 20,especialmente afectando a la secuencia Tir-Val-Met-Ala en el codon 776. Esta mutación aparece so-bre todo en mujeres, nunca fumadores, adenocarcinomas y población asiática. Además, no están pre-sentes en tumores que contengan mutaciones de EGFR o de KRas. Estas inserciones provocan unaactivación constitutiva del receptor y las células tumorales que la contienen son sensibles a inhibido-res tirosincinasa duales contra EGFR y HER-2 como lapatinib o BIBW 2292, pero no a inhibidores ex-clusivos de EGFR.

Mutaciones de BRAF

En CPNM, la incidencia de mutaciones de BRAF se sitúa entre el 1 y 3%, no se localizan en la mismaposición clásica del melanoma y son mutuamente excluyentes con las de KRas y EGFR. Las mutacio-nes de BRAF producirán un aumento de la actividad cinasa que conducirá a una activación constituti-va de MAPK2 y MAPK3 implicada en el desarrollo del CPCNP.



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RECOMENDACIÓN

Hasta el momento, la búsqueda de inhibidores específicos eficaces de KRas ha resultado infruc-tuosa. Por eso, aunque la detección de mutaciones de KRas puede excluir razonablemente la exis-tencia de mutaciones de EGFR o de ALK, su determinación no sería prioritaria, dada la escasez dela muestra en CPCNP y la ausencia de un tratamiento específico eficaz.


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Se están desarrollando inhibidores específicos de BRAF como PLX4032 que ha demostrado su efica-cia en melanomas con mutación de BRAF.

Mutaciones de MAPK2

En CPCNP se han descrito mutaciones somáticas de MAP2K1 en un 1% de casos, sobre todo enadenocarcinomas. Estas mutaciones son mutuamente excluyentes con EGFR, KRAS, HER2, PIK3CAy BRAF. Las mutaciones situadas en las posiciones Lys57Asn y Gln56Pro conducen a una gananciade función, y las células que las portan demuestran sensibilidad a inhibidores que no compiten con eldominio de ATP como AZD6244 aunque algunas mutaciones son resistentes a este agente.

Mutaciones de la vía de PI3K

Las mutaciones en el gen PI3KCA son muy poco frecuentes en CPNM, donde su incidencia se sitúa en el2%. Las mutaciones se localizan en el exón 9, en los residuos Glu542 y Glu545 que codifican para la su-bunidad catalítica. Suelen ser tan frecuentes en la variante epidermoide como en el adenocarcinoma ypueden estar presentes incluso en pacientes con mutación de EGFR. Estas mutaciones producen unaganancia de la función enzimática in vitro y activan la vía señalizada por la proteincinasa B. Por otra parte,la amplificación de PI3KCA también se ha visto en CPNM, sobre todo en carcinomas epidermoides, hom-bres y fumadores, y no necesariamente asociadas a la presencia de mutaciones.

Pequeñas moléculas inhibidoras que tienen como diana PI3K y mTOR han mostrado actividad antitu-moral en modelos animales, pero en la etapa de desarrollo clínico precoz dan una modesta actividad.

Mutaciones de AKT

El gen que codifica para la proteincinasa B, AKT1 puede sufrir mutaciones en menos del 1% de CPCNP,y se han identificado solo en población occidental y en la variante de carcinoma epidermoide. La princi-pal mutación en AKT1 tiene lugar en la posición Glu171Lis, y provoca un escape al control de PI3K.

Farmacogenómica

• ERCC1, RRM1 y 2, BRCA1.

• MKP-1, CHOK, EPOR.

ERCC1

ERCC1 (excision repair cross complementation group 1) es una proteína implicada en la reparacióndel ADN que se ha relacionado con la resistencia al platino y con la evolución de la enfermedad.ERCC1 es un componente del complejo de reparación de nucleótidos (NER) y resulta crucial para lareparación del ADN dañado por el platino y otros genotóxicos. ERRC1 se expresa principalmente enel núcleo de la célula y sus niveles de expresión varían considerablemente.

La determinación de ERCC1 se ha realizado mediante técnicas semicuantitativas, así como los niveles deARNm ERCC1, o por análisis cuantitativo en tiempo real en tejidos en fresco o parafinados. Una sobreex-presión de ERCC1 se ha relacionado con una supervivencia menor en casos avanzados (27) y con una

RECOMENDACIÓN

En el momento actual, el estudio de diversas vías de señalización y de sus proteínas asociadasdebe considerarse eminentemente experimental, aunque resultados en MET y BRAF parecenprometedores y alguno podría incorporarse en un futuro no muy lejano.

menor respuesta a la quimioterapia (28). Asimismo, la quimioterapia adyuvante basada en cisplatino seha mostrado eficaz sólo en los pacientes cuyos tumores tienen una baja expresión de ERCC1, medidapor inmunohistoquímica (hazard ratio ajustada para muerte, 0,65; IC del 95%: 0,50-0,86; p = 0,002) (29).

Subunidad M1 de la ribonucleótido reductasa (RRM1)

La subunidad M1 de la ribonucleótido reductasa (RRM1) es un componente regulador del complejo ri-bonucleótido reductasa, que tiene una función básica en la conversión de nucleótidos en desoxinu-cleótidos, esencial en la síntesis de ADN. RRM1 se expresa principalmente en el núcleo y sus nivelesde expresión son variables.

RRM1 se ha relacionado con la resistencia a la gemcitabina (30). Niveles elevados de RRM1 produci-rían resistencia, mientras que niveles bajos se asociarían con sensibilidad a la gemcitabina de formadosis-dependiente (31).

Además, la alta expresión de RRM1 se ha relacionado con un peor pronóstico en los pacientes trata-dos con gemcitabina y cisplatino con medianas de supervivencia de 3,6 meses frente a 13,7 de lospacientes con niveles bajos de RRM1 (32). La adición de un alcaloide de la vinca parecía eliminar elefecto de la expresión de RRM1 sobre la supervivencia. De hecho, los niveles de RRM1 no parecenafectar la citotoxicidad mediada por docetaxel, vinorelbina o etopósido, pero sí la de los antifolatos,como el metotrexato o el pemetrexed.

Timidilato sintetasa

La timidilato sintetasa (TS) es una enzima involucrada en la síntesis de ADN, responsable de la pro-ducción de timidina. La TS se expresa en el citoplasma y en el núcleo celular de forma variable.

La TS es fundamental para mantener el depósito de timidina y sus niveles son predictores de res-puesta al 5-fluorouracilo en los tumores digestivos. El interés de la TS en el CPNM se ha suscitado alser relacionada con la resistencia al antimetabolito pemetrexed.

Parece ser que los niveles de expresión de la proteína y su ARNm son mayores en el carcinoma epi-dermoide que en el adenocarcinoma (33). Unos niveles elevados de TS se han relacionado con unpeor pronóstico en el CPNM (34). Por el contrario, unos niveles bajos de TS podrían predecir una ma-yor respuesta a los inhibidores de TS, como pemetrexed y, por tanto, una mejor evolución. Hay diver-sos estudios en marcha que están confirmando la relación de la TS con la eficacia a pemetrexed. Losresultados preliminares sugieren que los niveles de esta enzima pueden informar sobre la sensibilidada pemetrexed.

BRCA1

El gen BRCA1 fue descrito en 1994 como gen de susceptibilidad al cáncer de mama y de ovario.BRCA1 tiene como función la reparación del ADN dañado. La expresión de BRCA1 está controladapor varios mecanismos, por lo que puede alterarse por mutaciones del gen o modificaciones epigené-ticas de su expresión. Se ha observado que las líneas celulares deficientes de BRCA se muestran re-sistentes a los taxanos, aunque serían más sensibles a la acción de los platinos (35). No obstante, es-te hecho no se repite en todos los tipos de líneas celulares tumorales y su mecanismo de accióntodavía debe ser definido.

Estudios del Grupo Español de Cáncer de Pulmón (GECP) han mostrado que los pacientes con nive-les bajos de BRCA1 tenían una mejor supervivencia que aquellos con niveles altos. Además, la tasade respuesta era superior (67% frente al 58%) en los pacientes con tumores que expresaban nivelesbajos de BRCA1 (36). Este trabajo se realizó con PCR en tiempo real en muestras parafinadas, pero



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otro estudio, realizado mediante inmunohistoquímica, no encontró asociación entre la expresión deBRCA1 y la respuesta al tratamiento (37).


El estudio de las diferentes dianas relacionadas con la sensibilidad o la resistencia a diferentes qui-mioterápicos se ha empleado en diversos procedimientos: inmunohistoquímica, determinación deARNm o de la proteína. Además, estos métodos se han realizado sobre tejido fresco o sobre tejidoconservado en parafina. Por todo ello, se necesita una estandarización de los métodos de medición,como primera medida, antes de confirmar los resultados obtenidos en estudios de investigación.

Marcadores de angiogénesis VEGF, moléculas de adhesión (ICAM)

El estudio pivotal ECOG 4599 sentó la indicación de bevacizumab en asociación con quimioterapiapara el tratamiento de primera línea de tumores no epidermoides (39). En los primeros 160 pacientesincluidos en el estudio, se analizaron de forma prospectiva los niveles plasmáticos de VEGF, bFGF, lasoluble intercellular adhesion molecule (ICAM) y la E-selectina (40). A pesar de que los niveles deVEGF se asociaron con la respuesta al bevacizumab, sólo los niveles bajos de ICAM se relacionaroncon un beneficio del bevacizumab en la supervivencia libre de progresión. No obstante, estos resulta-dos deben ser confirmados en estudios posteriores.


Dado que no hay ningún factor identificado de respuesta a antiangiogénicos, se debe continuar la in-vestigación tanto en la muestra del tumor como en la sangre.

Perfiles de expresion génica; microarrays de cADN o de oligonucleótidos

La aplicación de técnicas de alto rendimiento ha permitido realizar el estudio de perfiles de expresión géni-ca que han buscado una relación pronóstica del CPNM (41), una clasificación más objetiva que la funda-mentada en la anatomía patológica (42) o una búsqueda de predicción de la respuesta al tratamiento (43).


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RECOMENDACIÓN

En la actualidad, el estudio farmacogenómico en el CPNM sigue estando situado en el campode la investigación. Hay datos que apuntan su posible aplicación en la práctica clínica.En un estudio prospectivo, donde se pudo seleccionar el tipo de quimioterapia en funciónde los niveles de ERCC1 y RRM1 mediante PCR cuantitativa en tiempo real, se obtuvo una mayortasa de respuesta y un incremento en la supervivencia (38).Si los estudios actualmente en marcha obtienen datos congruentes con los previos, podríavalorarse en un futuro próximo su incorporación a la práctica asistencial.

RECOMENDACIÓN

En la actualidad, no hay ningún factor capaz de determinar la respuesta a los antiangiogénicos,ni tampoco ningún factor relacionado con el desarrollo de toxicidad. Por todo ello, se debecontinuar desarrollando una labor investigadora en este campo.Se recomienda incluir estudios de biomarcadores relacionados con la angiogénesisen los ensayos a realizar.


Los estudios de perfiles de expresión génica necesitan perfeccionar varios aspectos, como la técnica derealización, la homogeneización de los grupos evaluados y la mejora de los sistemas informáticosde análisis de datos. De forma global, podría indicarse que existen dos conceptos de plataformas muydiferentes: por un lado, las plataformas fundamentadas en oligonucleótidos y, por otro, aquéllas funda-mentadas en cADN. Ambos tipos se basan en la hibridación de secuencias por características de com-plementariedad entre las bases de la muestra problema y las depositadas en los soportes sólidos de ca-da plataforma. Además de la variabilidad intrínseca de ambas plataformas, existen distintos modeloscomerciales cuyas características concretas dependen de la inclusión de un mayor o menor número decopias de regiones de expresión conocidas, así como de la presencia de regiones denominadas EST. In-cluso, la actualización de las secuencias incluidas es esencial para garantizar la fiabilidad de los datosprocedentes de estas plataformas de distintas casas comerciales. En resumen, hay muchas variantes ypoca estandarización, lo cual ha llegado al límite de permitir distintos perfiles de expresión para predeciriguales resultados.

Perfiles de expresión de proteínas

Aunque resulta muy atrayente el hecho de determinar un perfil de proteínas que pueda predecir laevolución de la enfermedad o la respuesta al tratamiento, por el momento, pocos estudios han sidorealizados en el CPNM, por lo que se trata de un área en fase de experimentación (44).

OTROS FACTORES PRONÓSTICOS BIOLÓGICOSDiferenciación de los diversos tipos histológicos de cáncer de pulmón

En la actualidad, la definición del cáncer de pulmón de acuerdo a los tipos histológicos es muy impor-tante, ya que permite establecer la estrategia terapéutica a considerar y concretar el tipo de trata-miento.

Los principales tipos histológicos del CPNM son el adenocarcinoma, el carcinoma epidermoide y elcarcinoma de célula grande, según ha definido la Organización Mundial de la Salud (OMS) (45). La in-cidencia de estos tres tipos ha cambiado en los últimos años, de forma que se ha incrementado eladenocarcinoma al tiempo que se va reduciendo el carcinoma epidermoide (46).

Carcinoma epidermoide

Este carcinoma suele originarse en los bronquios proximales y tiende a estar localizado. El diagnósti-co histológico se basa en la presencia de áreas de queratinización, ya que la existencia de puentes in-tercelulares es un rasgo menos objetivo. Con frecuencia se asocia con fenómenos inflamatorios, es-pecialmente cuando hay cavitación y necrosis. Sin embargo, si no hay queratinización y las célulasson muy indiferenciadas, el diagnóstico es más complicado. Estas células más indiferenciadas suelen



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RECOMENDACIÓN

En el momento actual, el estudio de perfiles de expresión proteica es un procedimientoexperimental

RECOMENDACIÓN

En el momento actual, el estudio de perfiles de expresión génica es un procedimientoexperimental sin ningún tipo de aplicación clínica estándar.

proceder de las capas basales del epitelio escamoso y pueden dar lugar a variantes, como el carcino-ma basaloide o el de célula grande, que tienen una evolución peor al tener un comportamiento másagresivo (47). Para diagnosticar correctamente estas formas más indiferenciadas, será preciso realizarinmunohistoquímica con el objeto de determinar la presencia de las citoqueratinas 7 y 20 y la expre-sión de p63. Además, será preciso realizar el diagnóstico diferencial con el carcinoma de célula pe-queña, por lo que habrá que llevar a cabo la inmunohistoquímica de marcadores neuroendocrinos,como sinaptofisina, cromogranina o enolasa neuronal específica.

Adenocarcinoma

El adenocarcinoma suele tener una gran variabilidad de formas histológicas y el 80% son mixtos (48). Seorigina en la superficie del epitelio alveolar o en las glándulas mucosas de los bronquios, por lo que tien-de a localizarse en las zonas periféricas. A pesar de ello, en el momento del diagnóstico es frecuente laafectación metastásica incluso en ausencia de síntomas clínicos. Tiene una asociación con el tabaquis-mo, aunque un subgrupo de adenocarcinomas aparecerá en los pacientes no fumadores, especialmenteen mujeres. El aspecto histológico se caracteriza por la presencia de glándulas y mucina o estructuraspapilares. También puede presentar un patrón sólido que habrá que diferenciar del carcinoma epidermoi-de. En este caso, la determinación de TTF-1 permitirá el diagnóstico de adenocarcinoma.

Mención especial merece el carcinoma bronquioloalveolar (BAC). Se trata de una variante de adeno-carcinoma de crecimiento más lento, con un comportamiento clínico diferente y una mejor evolución.Desde el punto de vista histológico, los criterios diagnósticos se han restringido en los últimos años yse limitan a la presencia de un crecimiento lipídico a lo largo de los septos en ausencia de invasión delparénquima. Además, los BAC pueden desarrollar dos tipos, el mucinoso y el no mucinoso. Por tanto,aplicando estos criterios estrictos, su incidencia es reducida, ya que las formas mixtas deben ser con-sideradas como variantes convencionales de adenocarcinoma (49).

Carcinoma de célula grande

Este carcinoma es el menos frecuente de los CPNM y su incidencia va paulatinamente en descenso.Esto se debe a que se trata de un diagnóstico de exclusión, ya que muchos de ellos son realmenteformas poco diferenciadas del carcinoma epidermoide o del adenocarcinoma. Por tanto, a medidaque se definen mejor los dos tipos principales de CPNM, el diagnóstico de carcinoma de célula gran-de se reduce. Sin embargo, la clasificación de la OMS sigue admitiendo el grupo de carcinoma indife-renciado de célula grande para tumores sin rasgos que permitan decantarse hacia uno u otro tipo.Prueba de la dificultad que conlleva el diagnóstico de este tipo de cáncer de pulmón es que los estu-dios que analizan la variabilidad secundaria al observador han objetivado que las mayores diferenciasse presentan en el grupo de carcinomas indiferenciados (50).

Además, la clasificación de la OMS ha hecho una distinción del grupo considerado sarcomatoide coninclusión de variedades muy raras, como el rabdoide, el linfoepitelial o el de células claras.

Por otra parte, es preciso diferenciar el subtipo de carcinoma neuroendocrino de célula grande, queserá identificado mediante marcadores neuroendocrinos (51). Se trata de una entidad con un compor-tamiento clínico diferente al carcinoma de célula pequeña y a otras formas de CPNM, por lo que de-berá ser considerado como un grupo diferente en la práctica clínica.

Utilidad clínica: valor predictivo y valor pronóstico

La importancia de los subtipos histológicos en el CPNM puede justificarse por diversas razones:cada tipo de carcinoma procede de células con diferente origen embriológico y surge de distintas


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localizaciones anatómicas (vía central o periférica), con lo que las funciones de las mismas serán di-ferentes y, por tanto, la respuesta al tratamiento o la evolución pueden discurrir en función de estosfactores. En segundo lugar, algunas mutaciones son más frecuentes en ciertos tipos histológicoscomo, por ejemplo, las de KRAS (52) o EGFR (53), que se asocian más frecuentemente con adeno-carcinomas. Por ello, un tratamiento específico contra una diana podría depender, también, del tipohistológico donde esa diana es más relevante en el desarrollo de la neoplasia. De igual modo, losdistintos quimioterápicos actúan sobre ciertas vías celulares cuya función puede variar según el ti-po histológico del tumor. En este sentido, los niveles de timidilato sintetasa o de ERCC1, relaciona-dos con la resistencia a pemetrexed y platino, respectivamente, pueden ser más elevados en loscarcinomas epidermoides.

El tipo histológico como factor predictivo

Datos de dos estudios aleatorizados en fase III de quimioterapia, un análisis retrospectivo del estudiopivotal de pemetrexed frente a docetaxel en segunda línea (54, 55) y un análisis prospectivo del ensa-yo que comparó cisplatino y gemcitabina frente a cisplatino y pemetrexed en primera línea de trata-miento (56) han atribuido un valor significativo al subtipo histológico en relación con la respuesta altratamiento. De este modo, los pacientes con carcinoma no epidermoide tuvieron más supervivenciacuando fueron tratados con pemetrexed, mientras que los del carcinoma epidermoide tuvieron peorevolución con pemetrexed. Un tercer estudio, que comparó dos dosis de pemetrexed en segunda ytercera línea, mostró el mismo resultado (57).

Para confirmar el auténtico valor predictivo que la histología puede tener sobre el tratamiento oncoló-gico, los estudios a realizar deberían incluir un test de interacción que analizara esta posible relación(58, 59). Dado que para este tipo de análisis se necesitarían estudios de mucho mayor tamaño mues-tral, muchas veces inviables de realizar, la mayoría de los trabajos carecen del poder necesario paradetectar esta interacción (60). Por tanto, muchos ensayos siguen estableciendo análisis de subgrupopredeterminados o realizados de forma retrospectiva.

Relación del tipo histológico con el tratamiento con bevacizumab

En el estudio aleatorizado en fase II que objetivó el beneficio de la adición de bevacizumab a la qui-mioterapia basada en carboplatino y paclitaxel (61) se observó que la mayor respuesta se producíaen el grupo de pacientes con tumores no epidermoides. Además, se produjeron varios casos de he-morragia pulmonar mortal relacionada con el bevacizumab en enfermos con carcinoma epidermoide.No obstante, no se sabe si este incremento de la incidencia de hemorragia está directamente rela-cionado con el subtipo histológico epidermoide o con un mayor riesgo de sangrado de los tumorescentrales y cavitados, que en su mayoría son del tipo epidermoide. Por todo ello, los dos ensayos enfase III realizados para confirmar la eficacia de bevacizumab en el CPNM sólo incluyeron tumores noepidermoides.

Relación del tipo histológico con el tratamiento con inhibidores de la tirosincinasadel EGFR

A pesar de que el carcinoma epidermoide es que el tiene una mayor expresión del EGFR, la mejor res-puesta a los inhibidores de la tirosincinasa del EGFR se ha observado en los pacientes cuyos tumorestienen mutaciones activadoras del receptor, aunque todavía no se conoce el mecanismo exacto deactuación de estos agentes. Dado que la mayoría de las mutaciones suelen observarse en los adeno-carcinomas, el tipo histológico podría ser orientativo a la hora de estimar la existencia de mutacionesque predicen la respuesta a este tratamiento. No obstante, se ha observado también un beneficio a



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los inhibidores de la tirosinquinasa en los pacientes con carcinomas epidermoides. De hecho, el estu-dio BR.21, que dio la indicación de emplear erlotinib como tratamiento de segunda o tercera línea delCPNM, concluyó que el tipo histológico per se podría ser más un factor pronóstico de la enfermedadque un factor predictivo de respuesta al fármaco (62).

El tipo histológico como factor pronóstico

En una revisión de 408 publicaciones, realizadas entre 1982 y 2007, que exploraban el valor pronósti-co o predictivo de la histología en el CPNM, sólo se identificaron unas 30 que aportaban una relaciónconcluyente (63). Once de ellas encontraron asociación con la evolución pronóstica y siete sugeríanuna predicción de la respuesta a la quimioterapia. Además, 14 publicaciones identificaron un valorpronóstico o predictivo cuando se empleaban inhibidores del EGFR.

La ausencia de resultados concluyentes se ha debido a la falta de una metodología homogénea, conun material histológico insuficiente y con una variación en la clasificación de subgrupos. A pesar deestas dificultades, se sugiere que la histología podría ofrecer una información pronóstica y predictivarelevante, por lo que los futuros estudios deberán ser diseñados teniendo en cuenta el análisis de lossubtipos histológicos.

Métodos de mediciónDiferencias entre biopsia y citología

La citología da una información limitada de la celularidad tumoral y no permite obtener datos sobrela arquitectura del tumor. Por ello, en la actualidad se recomienda la obtención del diagnóstico deneoplasia mediante biopsia por fibrobroncoscopia. Es evidente que el tamaño de la muestra, quese consigue por vía endoscópica, es muy reducido, pero suele ser suficiente para realizar un diag-nóstico apropiado del tipo histológico. En un estudio comparativo entre biopsias bronquiales ybiopsias obtenidas por toracotomía, hubo buena correlación entre ambos métodos (κ= 0,70) (64).Las principales discrepancias en el diagnóstico histológico se dieron cuando existía necrosis ex-tensa o ausencia de diferenciación, y es que se estima que puede haber una heterogeneidad tu-moral importante en cerca de un 45% de los carcinomas estudiados (65).

Una vez conseguido el material adecuado, se debe realizar un diagnóstico anatomopatológico delcáncer de pulmón que diferencie los tipos histológicos de forma precisa. Para ello, será necesarioaplicar la técnica de inmunohistoquímica comentada previamente: citoqueratinas 7 y 20, determi-nación de marcadores neuroendocrinos, queratina, TTF-1 y p63.


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RECOMENDACIÓN

El diagnóstico de CPNM debe definir el tipo histológico concreto, haciendo la distinciónentre epidermoide y no epidermoide, lo que permitirá decidir si el paciente es candidatoa tratamiento con bevacizumab o pemetrexed.Además, el tipo histológico podría sugerir la realización de un estudio de mutaciones en EGFRpara el tratamiento con inhibidores de la tirosincinasa. De hecho, el adenocarcinoma esel que se asocia con mayor frecuencia a las mutaciones. Por ello, ante un paciente que reúnaun perfil clínico sugestivo de ser portador de una mutación EGFR, es decir, no tener hábitotabáquico previo, ser del sexo femenino o de raza asiática, debería asegurarse la presenciade un diagnóstico anatomopatológico de carcinoma no epidermoide, sin ser aceptableel diagnóstico aislado de carcinoma no microcítico de pulmón.

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marcadores biomoleculares de cancer de pulmon

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