tese 3,9 mb

Estudo do envelhecimento de

aglutinantes em tmperas proteicas por

cromatografia lquida de elevada eficincia

Helena Valente Vargas

Dissertao para obteno do Grau de Mestre em

Qumica

Jri

Presidente: Maria Matilde Soares Duarte Marques

Orientador: Maria Isabel Macedo Ribeiro

Joo Emdio Silva da Costa Pessoa

Vogais: Maria da Conceio Oliveira

Novembro, 2008

ii

AGRADECIMENTOS

Gostaria de manifestar o meu sincero agradecimento a todas as pessoas que, de uma forma ou de

outra, contriburam para a realizao e concluso deste trabalho.

Agradeo em particular:

Engenheira Isabel Ribeiro, Directora do Laboratrio de Conservao e Restauro Jos de Figueiredo

(LCR) do Instituto dos Museus e Conservao (IMC), e orientadora desta tese, pelo interesse,

disponibilidade em qualquer altura, incentivo, apoio e dedicao concedidos ao longo deste ano de

trabalho. O seu interesse e incentivo foram essenciais para a realizao deste trabalho.

Ao Professor Doutor Joo Pessoa, orientador desta tese, pelo apoio concedido, interesse, estmulo, e

pelas sugestes e comentrios e correces que permitiram melhorar este trabalho

A toda a equipa que forma o actual LCR: Dr. Maria Jos Oliveira, Dr. Llia Esteves, Dr. Ana

Mesquita, Dr. Jos Caros Frade, Dr. Pedro Alves, Dr. Ana Margarida Cardoso e Dr. Sara Valadas,

pelo estmulo, incentivo, amizade e pronta disponibilidade em prestar qualquer auxlio sempre que

necessrio.

Aos meus pais e minha irm por todo o apoio incondicional e por terem acreditado em mim e me

ensinarem a querer sempre aprender mais e seguir mais adiante. Sem eles nada disto seria possvel.

A todos, muito obrigada!

iii

RESUMO

A tcnica para identificao de tmperas proteicas (gema de ovo, gelatina e casena) baseada na

metodologia Pico-Tag e cromatografia lquida de elevada eficincia (HPLC) foi implementada no

Laboratrio de Conservao e Restauro Jos de Figueiredo (LCR). Segundo este mtodo, as amostras

so hidrolizadas com cido clordrico, os aminocidos derivatizados com fenilisotiocianato, a amostra

totalmente seca e seguidamente solubilizada numa soluo diluinte, e os aminocidos separados,

detectados e analisados por HPLC. Usando esta tcnica, pretendeu-se tambm estudar a influncia da

luz, temperatura, humidade e pigmentos no processo de envelhecimento das protenas, no que respeita

composio em aminocidos e cromaticidade. Para tal, recorreu-se a ensaios de envelhecimento

acelerado de tintas em cmaras de envelhecimento Verificou-se que as tmperas proteicas so

aglutinantes muito estveis, especialmente as tmperas base de gelatina e casena, pois no se

degradam significativamente ao longo do tempo sob a aco de qualquer um dos factores de

envelhecimento. Nas tmperas base de gema de ovo verificam-se alteraes cromticas com o

envelhecimento, mas provavelmente estas alteraes no se devem tanto s protenas mas a outros

componentes desta tmpera, como cidos gordos. Os pigmentos no tm, em geral um efeito muito

grande sobre o envelhecimento das tmperas, mas podem acelerar o processo de degradao das

protenas e dificultar a sua identificao. sabido que os pigmentos base de cobre dificultavam a

identificao das tmperas. Assim, foi ainda estudada uma metodologia, usando o agente quelante

EDTA, para tentar inibir o efeito de alguns pigmentos na caracterizao das tmperas. Verificou-se que

o mtodo usado (adio de 0,2M EDTA em tampo de amnia) no foi eficaz, sendo necessrio

efectuar mais estudos.

PALAVRAS-CHAVE

Tmperas proteicas, Gema de ovo, Gelatina, Casena, Pico-Tag + HPLC, Envelhecimento acelerado.

iv

ABSTRACT

The technique for identification of proteinaceous binding media (egg yolk, animal glue and casein)

based on the analytical technique Pico-Tag and high performance liquid chromatography (HPLC) was

implemented at the Laboratrio de Conservao e Restauro Jos de Figueiredo (LCR). According to this

method, samples are hydrolyzed with hydrochloric acid; amino acids are derivatized with

phenylisothiocyanate and separated, detected and analyzed by HPLC. Using this method, accelerated

aging tests of paints were applied to study the influence of light, temperature, moisture and natural

pigments in the aging process of proteins in tempers was determined. The results indicate that

proteinaceous binding media are very stable, particularly the glue and casein media, not degradating

considerably with time by the action of the aging factors. The egg yolk media shows chromatic changes

along the aging, but probably these are not due to proteins but are related to other media components,

such as lipids. Although pigments do not have, in general, a large effect on temper aging, they can

slightly accelerate the process of degradation of proteins and perturb their identification. It is known that

copper pigments interfere with the identification of tempers. So a methodology was studied, using EDTA,

to inhibit the effect of some pigments in the characterization of tempers. It was concluded that the

method used (addition of 0,2 M Na2EDTA in a buffer ammonia/ammonium chloride) was not adequate,

so more studies need to be done.

KEY-WORDS

Proteinaceous media, Egg yolk, Animal glue, Casein, Pico-Tag+HPLC, Accelerated aging.

v

GLOSSRIO

C Graus Clsius

a* Eixo verde-vermelho

Ala Alanina

Arg Arginina

Asn Asparagina

Asp cido Asprtico

b* Eixo azul-amarelo

CEN Correspondncia envelhecimento natural

CIE Commission Internationale de lEclairage (Comisso Internacional de Iluminao)

Cys Cistena

DPMS Espectrometria de massa com pirlise directa (do ingls, direct pyrolysis mass spectrometry)

EDTA cido etilenodiaminotetraactico

EN Envelhecimento natural

GC Cromatografia gasosa (do ingls, gas chromatrograpgy)

GC-MS Cromatografia gasosa acoplada a espetrometria de massa (do ingls, gas chromatrograpgy-

mass pectrometry)

Gln Glutamina

Glu cido Glutmico

Gly Glicina

h - Hora

His Histidina

HPLC Cromatografia lquida de elevada eficincia (do ingls, high performance liquid

chromatrograpgy)

HPLC-ESI-TOF Cromatografia lquida de elevada eficincia acoplada a espectrometria de massa de

ionizao por slectrospray e TOF (do ingls, high performance liquid chromatrograpgy with electron

spray ionisation-time of flight mass spectrometry)

HPLC-MS Cromatografia lquida de elevada eficincia (do ingls, high performance liquid

chromatrograpgymass spectrometry)

HPLC-UV Cromatografia lquida de elevada eficincia com detecor Ultra-Violeta (do ingls, high

performance liquid chromatrograpgy with ultra violet detector)

HR Humidade relativa

Ile Isoleucina

Kd Coeficiente de distribuio

L* Luminosidade

LCR Laboratrio de Conservao e Restauro Jos de Figueiredo

Leu Leucina

Lys Lisina

vi

g Micrograma

l Microlitro

MALDI Estectrometria de massa por ionizao MALDI (do ingls, matrix assisted laser desorption

ionisation-mass sepectrometry)

Met Metionina

min Minutos

nm Nanmetro

Nor - Norleucina

OH-Pro Hidroxiprolina

Phe Fenilalanina

Pro Prolina

R Resoluo

RP-HPLC Cromatografia lquida de elevada eficincia em fase reversa (do ingls, reverse phase high

performance liquid chromatrograpgy)

sc. Sculo

Ser Serina

T Temperatura

tR Tempo de reteno

Thr Treonina

Trp Triptofano

Tyr Tirosina

UV Ultravioleta

UV-Vis Ultravioleta-visvel

UV-Visvel Ultravioleta-visvel

Val Valina

W/m2 Watt por metro quadrado

W Largura na base dos picos

vii

NDICE GERAL

Agradecimentos............................... ii

Resumo.......... Iii

Abstract........... iv

Glossrio....................... V

ndice Geral........ vii

ndice de Figuras....... ix

ndice de tabelas........ xi

1. Introduo.......... 1

2. A pintura a tmpera.. 3

2.1 Aglutinantes proteicos....... 3

2.1.1 As protenas......... 3

2.1.2 Gelatina e cola animal....................... 4

2.1.3 Gema de ovo........ 5

2.1.4 Casena......... 6

2.2 Pigmentos........ 6

2.3 Envelhecimento acelerado vs. Natural............... 8

2.3.1 Mecanismos gerais de degradao das protenas em tmperas.. 9

3. Caracterizao de aglutinantes proteicos em obras de arte... 13

3.1. Cromaticidade......... 14

3.2 Cromatografia Lquida de elevada eficincia, HPLC.. 15

3.2.1 Anlise de aminocidos pelo mtodo Pico-Tag 16

4. Parte experimental............... 21

4.1 Preparao de filmes de tmperas proteicas. 22

4.2 Implementao da tcnica Pico-Tag+HPLC para identificao de tmperas proteicas... 23

4.3 Envelhecimento acelerado de filmes de tmperas proteicas 26

4.4 Utilizao do EDTA para inibir o efeito dos pigmentos sob as tmperas proteicas... 28

viii

5. Apresentao e discusso de reultados 29

5.1 Utilizao da tcnica Pico-Tag + HPLC para identificao de tmperas . 29

5.2 Estudo do envelhecimento de aglutinantes de tmperas proteicas. 31

5.3 Utilizao do EDTA para inibir o efeito dos pigmentos so