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  • Estudo do envelhecimento de

    aglutinantes em tmperas proteicas por

    cromatografia lquida de elevada eficincia

    Helena Valente Vargas

    Dissertao para obteno do Grau de Mestre em

    Qumica

    Jri

    Presidente: Maria Matilde Soares Duarte Marques

    Orientador: Maria Isabel Macedo Ribeiro

    Joo Emdio Silva da Costa Pessoa

    Vogais: Maria da Conceio Oliveira

    Novembro, 2008

  • ii

    AGRADECIMENTOS

    Gostaria de manifestar o meu sincero agradecimento a todas as pessoas que, de uma forma ou de

    outra, contriburam para a realizao e concluso deste trabalho.

    Agradeo em particular:

    Engenheira Isabel Ribeiro, Directora do Laboratrio de Conservao e Restauro Jos de Figueiredo

    (LCR) do Instituto dos Museus e Conservao (IMC), e orientadora desta tese, pelo interesse,

    disponibilidade em qualquer altura, incentivo, apoio e dedicao concedidos ao longo deste ano de

    trabalho. O seu interesse e incentivo foram essenciais para a realizao deste trabalho.

    Ao Professor Doutor Joo Pessoa, orientador desta tese, pelo apoio concedido, interesse, estmulo, e

    pelas sugestes e comentrios e correces que permitiram melhorar este trabalho

    A toda a equipa que forma o actual LCR: Dr. Maria Jos Oliveira, Dr. Llia Esteves, Dr. Ana

    Mesquita, Dr. Jos Caros Frade, Dr. Pedro Alves, Dr. Ana Margarida Cardoso e Dr. Sara Valadas,

    pelo estmulo, incentivo, amizade e pronta disponibilidade em prestar qualquer auxlio sempre que

    necessrio.

    Aos meus pais e minha irm por todo o apoio incondicional e por terem acreditado em mim e me

    ensinarem a querer sempre aprender mais e seguir mais adiante. Sem eles nada disto seria possvel.

    A todos, muito obrigada!

  • iii

    RESUMO

    A tcnica para identificao de tmperas proteicas (gema de ovo, gelatina e casena) baseada na

    metodologia Pico-Tag e cromatografia lquida de elevada eficincia (HPLC) foi implementada no

    Laboratrio de Conservao e Restauro Jos de Figueiredo (LCR). Segundo este mtodo, as amostras

    so hidrolizadas com cido clordrico, os aminocidos derivatizados com fenilisotiocianato, a amostra

    totalmente seca e seguidamente solubilizada numa soluo diluinte, e os aminocidos separados,

    detectados e analisados por HPLC. Usando esta tcnica, pretendeu-se tambm estudar a influncia da

    luz, temperatura, humidade e pigmentos no processo de envelhecimento das protenas, no que respeita

    composio em aminocidos e cromaticidade. Para tal, recorreu-se a ensaios de envelhecimento

    acelerado de tintas em cmaras de envelhecimento Verificou-se que as tmperas proteicas so

    aglutinantes muito estveis, especialmente as tmperas base de gelatina e casena, pois no se

    degradam significativamente ao longo do tempo sob a aco de qualquer um dos factores de

    envelhecimento. Nas tmperas base de gema de ovo verificam-se alteraes cromticas com o

    envelhecimento, mas provavelmente estas alteraes no se devem tanto s protenas mas a outros

    componentes desta tmpera, como cidos gordos. Os pigmentos no tm, em geral um efeito muito

    grande sobre o envelhecimento das tmperas, mas podem acelerar o processo de degradao das

    protenas e dificultar a sua identificao. sabido que os pigmentos base de cobre dificultavam a

    identificao das tmperas. Assim, foi ainda estudada uma metodologia, usando o agente quelante

    EDTA, para tentar inibir o efeito de alguns pigmentos na caracterizao das tmperas. Verificou-se que

    o mtodo usado (adio de 0,2M EDTA em tampo de amnia) no foi eficaz, sendo necessrio

    efectuar mais estudos.

    PALAVRAS-CHAVE

    Tmperas proteicas, Gema de ovo, Gelatina, Casena, Pico-Tag + HPLC, Envelhecimento acelerado.

  • iv

    ABSTRACT

    The technique for identification of proteinaceous binding media (egg yolk, animal glue and casein)

    based on the analytical technique Pico-Tag and high performance liquid chromatography (HPLC) was

    implemented at the Laboratrio de Conservao e Restauro Jos de Figueiredo (LCR). According to this

    method, samples are hydrolyzed with hydrochloric acid; amino acids are derivatized with

    phenylisothiocyanate and separated, detected and analyzed by HPLC. Using this method, accelerated

    aging tests of paints were applied to study the influence of light, temperature, moisture and natural

    pigments in the aging process of proteins in tempers was determined. The results indicate that

    proteinaceous binding media are very stable, particularly the glue and casein media, not degradating

    considerably with time by the action of the aging factors. The egg yolk media shows chromatic changes

    along the aging, but probably these are not due to proteins but are related to other media components,

    such as lipids. Although pigments do not have, in general, a large effect on temper aging, they can

    slightly accelerate the process of degradation of proteins and perturb their identification. It is known that

    copper pigments interfere with the identification of tempers. So a methodology was studied, using EDTA,

    to inhibit the effect of some pigments in the characterization of tempers. It was concluded that the

    method used (addition of 0,2 M Na2EDTA in a buffer ammonia/ammonium chloride) was not adequate,

    so more studies need to be done.

    KEY-WORDS

    Proteinaceous media, Egg yolk, Animal glue, Casein, Pico-Tag+HPLC, Accelerated aging.

  • v

    GLOSSRIO

    C Graus Clsius

    a* Eixo verde-vermelho

    Ala Alanina

    Arg Arginina

    Asn Asparagina

    Asp cido Asprtico

    b* Eixo azul-amarelo

    CEN Correspondncia envelhecimento natural

    CIE Commission Internationale de lEclairage (Comisso Internacional de Iluminao)

    Cys Cistena

    DPMS Espectrometria de massa com pirlise directa (do ingls, direct pyrolysis mass spectrometry)

    EDTA cido etilenodiaminotetraactico

    EN Envelhecimento natural

    GC Cromatografia gasosa (do ingls, gas chromatrograpgy)

    GC-MS Cromatografia gasosa acoplada a espetrometria de massa (do ingls, gas chromatrograpgy-

    mass pectrometry)

    Gln Glutamina

    Glu cido Glutmico

    Gly Glicina

    h - Hora

    His Histidina

    HPLC Cromatografia lquida de elevada eficincia (do ingls, high performance liquid

    chromatrograpgy)

    HPLC-ESI-TOF Cromatografia lquida de elevada eficincia acoplada a espectrometria de massa de

    ionizao por slectrospray e TOF (do ingls, high performance liquid chromatrograpgy with electron

    spray ionisation-time of flight mass spectrometry)

    HPLC-MS Cromatografia lquida de elevada eficincia (do ingls, high performance liquid

    chromatrograpgymass spectrometry)

    HPLC-UV Cromatografia lquida de elevada eficincia com detecor Ultra-Violeta (do ingls, high

    performance liquid chromatrograpgy with ultra violet detector)

    HR Humidade relativa

    Ile Isoleucina

    Kd Coeficiente de distribuio

    L* Luminosidade

    LCR Laboratrio de Conservao e Restauro Jos de Figueiredo

    Leu Leucina

    Lys Lisina

  • vi

    g Micrograma

    l Microlitro

    MALDI Estectrometria de massa por ionizao MALDI (do ingls, matrix assisted laser desorption

    ionisation-mass sepectrometry)

    Met Metionina

    min Minutos

    nm Nanmetro

    Nor - Norleucina

    OH-Pro Hidroxiprolina

    Phe Fenilalanina

    Pro Prolina

    R Resoluo

    RP-HPLC Cromatografia lquida de elevada eficincia em fase reversa (do ingls, reverse phase high

    performance liquid chromatrograpgy)

    sc. Sculo

    Ser Serina

    T Temperatura

    tR Tempo de reteno

    Thr Treonina

    Trp Triptofano

    Tyr Tirosina

    UV Ultravioleta

    UV-Vis Ultravioleta-visvel

    UV-Visvel Ultravioleta-visvel

    Val Valina

    W/m2 Watt por metro quadrado

    W Largura na base dos picos

  • vii

    NDICE GERAL

    Agradecimentos............................... ii

    Resumo.......... Iii

    Abstract........... iv

    Glossrio....................... V

    ndice Geral........ vii

    ndice de Figuras....... ix

    ndice de tabelas........ xi

    1. Introduo.......... 1

    2. A pintura a tmpera.. 3

    2.1 Aglutinantes proteicos....... 3

    2.1.1 As protenas......... 3

    2.1.2 Gelatina e cola animal....................... 4

    2.1.3 Gema de ovo........ 5

    2.1.4 Casena......... 6

    2.2 Pigmentos........ 6

    2.3 Envelhecimento acelerado vs. Natural............... 8

    2.3.1 Mecanismos gerais de degradao das protenas em tmperas.. 9

    3. Caracterizao de aglutinantes proteicos em obras de arte... 13

    3.1. Cromaticidade......... 14

    3.2 Cromatografia Lquida de elevada eficincia, HPLC.. 15

    3.2.1 Anlise de aminocidos pelo mtodo Pico-Tag 16

    4. Parte experimental............... 21

    4.1 Preparao de filmes de tmperas proteicas. 22

    4.2 Implementao da tcnica Pico-Tag+HPLC para identificao de tmperas proteicas... 23

    4.3 Envelhecimento acelerado de filmes de tmperas proteicas 26

    4.4 Utilizao do EDTA para inibir o efeito dos pigmentos sob as tmperas proteicas... 28

  • viii

    5. Apresentao e discusso de reultados 29

    5.1 Utilizao da tcnica Pico-Tag + HPLC para identificao de tmperas . 29

    5.2 Estudo do envelhecimento de aglutinantes de tmperas proteicas. 31

    5.3 Utilizao do EDTA para inibir o efeito dos pigmentos so