Ingeniería Genética Participa en la investigación contra la aterosclerosis

PROTOCOLO

Taller de experimentaciónMacrófago

Ingeniería genética - 2 -

Ingeniería genética Buscando una diana para el tratamiento de la aterosclerosis

Introducción

La investigación biomédica engloba el estudio de los procesos físicos y químicos que se producen dentro de los seres vivos, así como de aquellos procesos que desencadenan las enfermedades. Uno de los principales objetivos de este campo de investigación es identificar dianas terapéuticas, es decir, puntos del cuerpo donde se pueden dirigir nuevos tratamientos que estimulen respuestas y que ayuden a combatir las enfermedades.

Este protocolo se enmarca en una línea de investigación biomédica que se centra en el estudio de una posible diana terapéutica que podría ser reconocida por un fármaco contra la aterosclerosis.

¿Cómo se produce la aterosclerosis?

La aterosclerosis es un trastorno vascular causado por la acumulación de grasas en las paredes de

los vasos sanguíneos, que puede dar lugar a manifestaciones muy diversas y de gravedad variable

según sea la localización de los vasos afectados y el grado de evolución del trastorno. En nuestra

sociedad, el consumo de alimentos con alto contenido en grasas saturadas ha incrementado

considerablemente los riesgos de padecer enfermedades cardiovasculares. Este exceso de grasa en

nuestro organismo puede depositarse y acumularse en ciertos puntos de las paredes de las arterias

en forma de placas, llamadas placas de ateroma, que obstruyen el flujo sanguíneo.

-----� Arteria normal

-----� Aterosclerosis media

-----� Aterosclerosis severa

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El colesterol y los macrófagos

Una de las sustancias lipídicas que conforman las placas de ateroma es el colesterol. Para evitar que

el colesterol se deposite en las paredes, nuestro organismo tiene un sistema de "limpieza", los

macrófagos, que son células que circulan por la sangre y que tienen la capacidad de recoger las

moléculas de colesterol nocivo, conocidas como LDL (low-density-lipoprotein, lipoproteínas de baja

densidad).

Los macrófagos las reconocen gracias a un

receptor que tienen en su membrana. Este

sistema de limpieza es eficiente si el exceso de

colesterol no es muy grande.

Si las cantidades de colesterol son muy abundantes,

los macrófagos continúan recogiendo LDL, pero, una

vez han engullido grandes cantidades, se transforman

en unas células llamadas "espumosas". Éstas

producen unas sustancias que inducen la inflamación

y la proliferación de células de la pared arterial

(endoteliales), y que acabará con la formación de la

placa de ateroma, que bloquea la circulación

sanguínea.

Actualmente numerosos grupos de investigación de

todo el mundo, entre ellos el Grupo de Investigación

de Receptores Nucleares de la Universidad de

Barcelona, tienen como objetivo entender mejor cómo

los macrófagos participan en la regulación de los

niveles de colesterol y en el desarrollo de la

aterosclerosis.

Más específicamente, los científicos están estudiando el papel de una proteína que tienen los

macrófagos llamada MYLIP. Es una proteína que tiene como función principal degradar el receptor

que los macrófagos tienen en la membrana y que les permite reconocer las LDL. Los científicos han

LDL

LDL oxidado

Oxidación de LDL

Proliferación de células endoteliales

Activación sistema inmunitario

Oxidación de LDL

LDL

Célula espumosa

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visto que si se produce esta proteína en una cantidad demasiado abundante, la ingestión de

colesterol por parte de los macrófagos disminuye. Sin embargo, aún se desconoce con exactitud su

papel en el contexto de la aterosclerosis.

Dado que se ha visto que la proteína MYLIP está

relacionada con la regulación del colesterol

nocivo, los científicos estiman que en este

proceso de regulación podría haber una nueva

diana para el tratamiento de la aterosclerosis.

¿Cómo podemos estudiar la proteína MYLIP involucrada en la regulación del colesterol?

Para poder estudiar esta posible diana terapéutica, los investigadores necesitan producirla en el

laboratorio en grandes cantidades. Para ello, utilizan una técnica de ingeniería genética llamada

transformación bacteriana, con la que transfieren ADN de un organismo a una bacteria, para que ésta

produzca grandes cantidades de ADN que posteriormente introducen en otros tipos de células para

que produzcan la diana terapéutica de estudio.

Para ello parten de una forma purificada del gen que produce la proteína MYLIP, la unen a un

fragmento de ADN circular llamado plásmido, y la insertan dentro de bacterias para que produzcan

réplicas del material genético.

¡En este protocolo os invitamos a hacer de biotecnólogos y a llevar a cabo una transformación

bacteriana!

� Macrófago

� LDL oxidado

� Oxidación de LDL

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Organización del taller:

1. Llevaremos a cabo una transformación de bacterias para que incorporen el ADN responsable

de producir la proteína MYLIP, y para que actúen como biorreactores y nos fabriquen el material

genético en grandes cantidades.

2. Haremos crecer el cultivo de bacterias en un medio adecuado que nos permita seleccionar

aquellos que hayan incorporado el gen.

3. Purificaremos el material genético que contiene el gen responsable de producir la proteína

MYLIP para que pueda ser introducido en otros tipos de células que producirán la proteína (*).

(*) Dado que el crecimiento de bacterias requiere de un día y medio de tiempo, la purificación se llevará a cabo partiendo de un

cultivo de bacterias transformadas que los monitores ya habrán preparado previamente

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Equipo y materiales necesarios para cada grupo/mesa

2 tubos con bacterias

en hielo rotulados con

los n.º 1 y 2.

(A) Caja de poliestire-

no expandido + hielo

1 tubo en hielo con el

ADN circular llamado

Plásmido pCR2.1-

MYLIP.

(B)

1 tubo con medio de

crecimiento bacteriano

"LB"

(C)

Micropipeta de 20 µl y

200 µl

Puntas para las

micropipetas de 20 y

200 µl

Puntas para las

micropipetas de 20 y

200 µl

2 Placas de petri con

agar y antibiótico

(D) Ampicilina

Asas de plástico

Baño líquido con agua

destilada

Flotador para tubos

Cronómetro

Recipiente de residuos

sólidos

Recipiente de residuos

líquidos

Cinta adhesiva

Rotulador permanente

1 tubo con 1 ml de

cultivo bacteriano (E)

1 tubo con "Solución 1"

de miniprep (F)

1 tubo con "Solución 2"

de miniprep (G)

1 tubo con "Solución 3"

de miniprep (H)

1 tubo con "Cloropán"

(I)

1 tubo con "Etanol"

1 tubo con agua

ultrapura (milliQ).

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CONTENIDO DE LOS TUBOS:

(A) Bacterias que permiten la entrada de ADN (llamadas competentes XL1-blue)

(B) ADN circular llamado plásmido (pCR2.1)

(C) Medio de cultivo LB (Luria-Bertani): extracto de levadura 5 g/l, triptona 10 g/l, NaCl 5 g/l.

Esterilizar en autoclave. Almacenar en frío.

(D) Placas LB/ampicilina: Medio de cultivo LB, Agar 1,6%, ampicilina 100 µg/ml.

(E) Bacterias cultivadas en medio 2XYT, O.N. (16 h)

(F) Solución 1: 50 mM glucosa/ 25 mM TrisHCl pH8.0/ 10 mM EDTA / Diluir en H2O destilada.

(G) Solución 2: 20 µl de detergente SDS (sodium dodecyl sulfate, dodecilsulfato de sodio) 10% / 4 µl

NaOH 10N/ 176 µl de H2O mQ/ por cada muestra. Preparar por duplicado el día de la práctica.

(H) Solución miniprep 3: 73.60 g de acetato de potasio /28.75 ml de acido acético. Diluir en H2O mQ

hasta un volumen final de 250 ml.

(I) Cloropán: 25 ml de fenol equilibrado/24 ml de cloroformo/ 1 ml de alcohol isoamílico. Centrifugar

10 min a 3000 rpm.

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Procedimientos 1- TRANSFORMACIÓN BACTERIANA

Una transformación bacteriana es un proceso biotecnológico mediante el cual los científicos

introducen el material genético responsable de producir una proteína que están investigando en una

célula bacteriana. Ésta actuará como biorreactor y producirá copias de este material genético, que se

podrá introducir posteriormente a otro tipo de célula para que produzca la proteína de interés. (*)

En este taller partimos del gen purificado de nuestra proteína "MYLIP", que ha sido introducido en un

plásmido o fragmento de ADN circular.

A partir de este material genético realizaremos una transformación bacteriana, es decir,

introduciremos el gen responsable de producir nuestra proteína dentro de la bacteria mediante un

choque térmico, o sea, sometiendo la muestra a diferentes temperaturas.

(*) Si la proteína de interés no es muy compleja, las mismas bacterias transformadas pueden actuar ya como

biorreactores para producir la proteína.

Gen

MYLIP

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Protocolo para la transformación bacteriana

1. Tenemos dos tubos con las bacterias en hielo. Cada tubo contiene una solución tampón que

facilitará la transformación gracias a los cationes Ca2+ de la sal CaCl2 que contiene el tampón.

¿Qué pasa? Los cationes Ca2+, en frío, preparan las

membranas celulares para que sean permeables al ADN. Los

iones Ca2+ se unen a los fosfolípidos de la membrana celular,

protegiendo sus cargas negativas y formando pequeños poros

en la membrana de la bacteria.

2. Añade el ADN en forma de plásmido a las bacterias: utilizando la micropipeta de 20 µl

pipetea 10 µl de plásmido (tubo P) y añádelos al tubo 2 donde tenías las bacterias. Tapa el tubo

y mezcla suavemente dándole golpecitos con el dedo. El tubo 1 será el control donde habrá las

bacterias sin el plásmido.

Ingeniería genética - 10 -

¿Qué pasa? Los iones Ca2+ también interactúan con los grupos fosfatos con

carga negativa del ADN y esto permite que se pueda acercar a la membrana de

las bacterias, sin repulsiones debidas a las cargas eléctricas.

3. Deja reposar los tubos 1 y 2 en hielo durante 15 minutos

* Entretanto, aprovecha este tiempo para ir realizando el primer paso del protocolo de "Crecimiento de las bacterias

transformadas" (pág.12).

4. Transcurridos los 15 minutos, pon los tubos 1 y 2 en el baño líquido a 42°C durante

exactamente 1 minuto 30 segundos.

¿Qué pasa? El ADN circular o plásmido penetra a través de

poros de algunas de las bacterias. ¿Cómo? A 42°C aumenta

la elasticidad de la membrana de las bacterias y esto facilita

la entrada del plásmido a través de los poros.

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5. Vuelve a poner los tubos 1 y 2 en hielo durante 2 minutos.

¿Qué pasa? Al bajar la temperatura se estabilizan las

membranas y el plásmido que ya había atravesado

los poros quedará en el interior de las bacterias.

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2- CRECIMIENTO DE LAS BACTERIAS TRANSFORMADAS

Una vez que las bacterias han incorporado el plásmido, hay que hacerlas crecer en un medio

adecuado y a una temperatura adecuada. Dado que la transformación bacteriana normalmente

produce una mezcla de pocas transformaciones y abundantes células no transformadas, necesitamos

un método para identificar las células que han incorporado el plásmido.

Para asegurarnos de que sólo hacemos crecer las bacterias transformadas, las haremos crecer en

placas de cultivo que contendrán un antibiótico. Al contener el plásmido un gen que hace que las

bacterias sean resistentes a este fármaco, sólo las bacterias transformadas crecerán en forma de

colonias. A partir de estas colonias, podremos posteriormente continuar el crecimiento únicamente de

las bacterias que produzcan el gen de interés.

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Protocolo para el crecimiento de las bacterias transformadas

1. Rotula las placas donde harás crecer las bacterias. Una será la placa control, con bacterias sin

plásmido, y la otra será donde harás crecer las bacterias con plásmido.

2. Utilizando la micropipeta de 200 µl añade 500 µl de medio de crecimiento bacteriano "LB", que

contiene nutrientes, a los tubos 1 y 2. Tapa los tubos y mézclalos suavemente dándoles

golpecitos con el dedo.

3. Incuba la mezcla en el baño líquido a una temperatura de 37°C durante 30 minutos.

¿Qué pasa? Este período da tiempo a que las bacterias se

multipliquen, por lo que al duplicar su ADN también generan

una copia del ADN plasmídico que contiene el gen de interés.

*Mientras esperas a que crezcan las bacterias, puedes ir haciendo la tercera etapa de este taller que consiste en aislar el

material genético de las bacterias (pág.16).

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4. Utilizando la micropipeta de 200 µl (con una punta nueva cada vez), añade las bacterias (100-

200 µl) de los tubos 1 y 2 a las placas de agar que contienen también el antibiótico ampicilina.

5. Esparce las bacterias por la superficie de cada placa de agar utilizando un asa de plástico

estéril para cada una. Ve girando la placa mientras mueves el asa hacia adelante y hacia atrás.

Cierra las placas con un poco de cinta adhesiva y escribe debajo tus iniciales, la fecha y el tipo

de bacteria.

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6. Incuba las placas invertidas a 37°C y al día siguiente observa el resultado obtenido. Si no

dispones de incubadora, simplemente deja crecer las bacterias a temperatura ambiente durante

un par de días.

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3- AISLAMIENTO DEL MATERIAL GENÉTICO RESULTANTE

A partir de las bacterias transformadas que han crecido formando colonias, los científicos toman una

muestra y la ponen a crecer en otro medio de cultivo con nutrientes para obtener grandes cantidades.

Posteriormente hay que aislar el material genético que nos han producido las bacterias, es decir, hay

que separarlo del resto de componentes bacterianos, como ARN, ADN de la bacteria o proteínas.

Para aislar el plásmido los científicos siguen un protocolo conocido como miniprep. Esta técnica

permite separar el ADN en forma de plásmido mediante diferentes disolventes y centrifugaciones, que

van descartando los diferentes componentes celulares.

El ADN purificado será de gran utilidad para los científicos para llevar a cabo experimentos

posteriores para estudiar su función en la regulación del colesterol y en la aterosclerosis y para

buscar nuevos fármacos.

Dado que el proceso de crecimiento de grandes cantidades de bacterias requiere un período de más

de un día y medio, para el taller se utilizará un cultivo que ha sido preparado previamente por los

monitores.

SOLUCIÓN 3 SOLUCIÓN 2

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Protocolo para purificar el ADN plasmídico del cultivo bacteriano (miniprep)

1. Centrifuga el tubo de cultivo bacteriano a máxima velocidad durante 30 segundos. A

continuación elimina el líquido sobrenadante.

¿Qué pasa? Se separan las células del medio de

cultivo en el que han crecido, que normalmente

contiene restos de células y otras moléculas que

queremos descartar.

2. A continuación elimina el líquido sobrenadante y pon el precipitado en suspensión de nuevo con

100 µl de la solución 1, utilizando la micropipeta de 200 µl, y mezcla con la misma pipeta.

¿Qué pasa? Se resuspenden las bacterias de nuevo para continuar la purificación, pero a más

concentración, ya que los tendremos en un volumen menor. La solución 1 es una solución

tampón que evitará la desnaturalización del ADN circular en forma de plásmido, que tiene lugar

si el pH sube por encima de 12,6.

3. Añade 200 µl de la solución 2 y mezcla suavemente por inversión

¿Qué pasa? La solución 2, que contiene un

detergente, destruye las membranas de

fosfolípidos de las bacterias, liberando al

medio todo el contenido del interior de las

células mediante un proceso llamado lisis

bacteriana. Esta solución también contiene una

base fuerte (hidróxido de sodio, NaOH) que

desnaturaliza las proteínas involucradas en

mantener la estructura de la membrana celular

y el ADN propio de la bacteria. En cambio, el

ADN plasmídico no se ve afectado, ya que el

pH es inferior a 12,6.

SOLUCIÓN 2

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4. Añade 150 µl de la solución 3 y mezcla suavemente por inversión.

¿Qué pasa? La solución 3 es una solución ácida de

acetato de sodio, que permite neutralizar el pH de la

solución y detener el proceso de lisis. En este paso

la mayoría del contenido celular, como las proteínas

y los fosfolípidos de las membranas y el ADN propio

de la bacteria, precipitan formando una mucosa

blanca. El ADN propio de la bacteria, ya

desnaturalizado, forma un complejo insoluble que precipita, gracias a que los iones K+ se unen a los

grupos fosfato del ADN y neutralizan así su carga negativa.

5. Añade 350 µl de cloropán, mezcla bien por inversión y centrifuga durante 3 minutos a máxima

velocidad para separar el plásmido que contiene el gen de la MYLIP

¿Qué pasa? En este paso se separa el ADN

plasmídico de los contenidos celulares restantes, como

proteínas, lípidos y otros ácidos nucleicos. El cloropán

es una mezcla de solventes orgánicos que contiene

fenol y cloroformo. Estos solventes disuelven las

moléculas hidrofóbicas como los lípidos de la

membrana y desnaturalizan las proteínas haciéndolas

insolubles en agua. Con la centrifugación separamos la

mezcla en dos fases: los fosfolípidos y las proteínas celulares se quedan en solución en la fase

inferior de cloropán, o atrapadas en la interfase entre las dos fases en forma de precipitado blanco,

mientras que el DNA plasmídico quedará en la fase acuosa superior, ya que sus cargas eléctricas no

están neutralizadas y, por lo tanto, es soluble en agua.

6. Pasa la fase acuosa superior transparente a un nuevo tubo con la pipeta de 200 µl.

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7. Añade 900 µl de Etanol 100% con la pipeta de 200 µl y mezcla bien. El etanol hace que

precipite el ADN plasmídico de la solución acuosa.

8. Centrifuga 5 minutos a máxima velocidad. Observarás el precipitado que es el ADN en forma

de plásmido.

9. Saca TODO el etanol con la pipeta de 200 µl.

10. Vuelve a resuspender el precipitado de ADN plasmídico en 20 µl de H2O purificada.

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Resultados y discusión

1. Haz un esquema del proceso de transformación bacteriana y explica para qué sirve en la línea

de investigación de búsqueda de nuevos fármacos contra la aterosclerosis.

2. Explica, con la ayuda de un esquema, qué es un choque térmico.

3. Para hacer crecer las bacterias has utilizado una placa de cultivo que tenía un antibiótico. ¿Por

qué?

4. ¿Qué es una colonia de bacterias?

5. ¿En cuál de las dos placas que has sembrado, la de control o la de las bacterias transformadas,

obtendrás colonias? ¿Por qué?

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6. A partir de las colonias que se han formado, ¿cómo se obtienen múltiples copias del gen de

interés?

7. ¿Cómo se hacen precipitar el ADN bacteriano y el ADN de interés? Complementa la explicación

con un esquema.

8. Con la técnica de separación llamada miniprep, has conseguido aislar múltiples copias del ADN

de interés. ¿Qué hacen los científicos una vez obtienen este ADN?

Investigadores que han contribuido con contenidos: Theresa León, Jonathan Matalonga,

Universidad de Barcelona

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