1.INTRODUCCIÓ

"Totes les modificacions morfològiques, fisiològiques i psicològiques, que apareixen com a conseqüència de l'acció del temps en els éssers vius". Bonet i Bourlière

Què és l’envelliment? Recurs

Benvinguts a l’assignatura de genètica i òmiques de l’envelliment.

Al diccionari mèdic del Medline el concepte “aging” es defineix com: "to become old : show the effects or the characteristics of increasing age, the increasing lifetime". Per tant el concepte "aging" que es podriem traduïr com "envellir", ens parla de temps acumulat per un objecte i d'un fenotip associat a aquest increment en edat.

L’envelliment es pot definir com un conjunt de processos que produeixen una acumulació progressiva de canvis deleteris en un organisme amb el pas del temps i que condueixen a pèrdues funcionals, augment de la probabilitat d’emmalaltir i de morir.

Fins al moment, el gerontòleg rus Zhores Medvedev va contar al voltant de 300 teories distintes per a tractar d’explicar com i per quines l’harmonia molecular es perd, las cèl·lules s’afebleixen, els teixits incompleixen les seves funcions i l’organisme sencer envelleix fins que, finalment, es rendeix. L’acumulació de tantes i tan diverses teories sobre l’envelliment reflecteix clarament la seva complexitat i tal vegada la nostra ignorància sobre les seves claus fonamentals.

L’estudi de l’envelliment es complica pel fet conegut com a envelliment diferencial: no tots els individus envelleixen al mateix ritme ni tots els òrgans i sistemes del mateix individu ho fan al mateix temps. Hi ha, doncs, un envelliment diferencial entre individus de la mateixa espècie i entre òrgans del mateix individu.

Aquests processos poden tenir lloc tant a nivell cel·lular, tissular com orgànic. Encara que existeixen totes aquestes teories diferents sobre les causes que produeixen l’envelliment, en aquest curs s’explicaran solament les teories a nivell molecular que han tingut una major rellevància a nivell científic.

A nivell molecular, per entendre com funciona un determinat gen o proteïna o el funcionament d’una cèl·lula o teixit concret en un moment determinat, les tècniques d’investigacions moleculars actuals no tracten d’un gen o d’una proteïna tan sols, sinó de milers. Aquests tipus d’investigacions a gran escala a nivell molecular són les ciències “òmiques”, necessàries per entendre com funciona un organisme de forma global.

La terminació –òmica prové de la terminació grega –oma que significa “tot” i per tant les ciències òmiques s’encarreguen d’investigar el conjunt de molècules en els seus diferents àmbits d’estudi: la Genòmica és la ciència que s’encarrega de l’estudi del conjunt de gens, la Proteòmica del conjunt de proteïnes i la

Metabòlomica del conjunt de metabòlits.

Els nostres objectius Recurs

L’objectiu fonamental d’aquesta assignatura és que l’alumne adquireixi els coneixements bàsics del vessant biològic del procés d’envelliment ensenyant-li els conceptes, mètodes i aplicacions de les ciències òmiques en l’estudi de l’envelliment.

Esperem que pugueu gaudir amb el procés d’aprenentatge d’aquesta assignatura.

Unes quantes referències Recurs

The Biology of Aging: Observations and Principles, the third Edition (2006). Robert Arking. Oxford University Press (Biblioteca URV: 616-053.9 Ark)

Aging of the genome: The dual role of DNA in life and death (2007). Jan Vijg. Oxford University Press

The biology of Human Longevity. Inflammation, Nutrition, and Aging in the Evolution of Lifespans" (2007). Caleb Finch. Elsevier press.

(Biblioteca URV: 616-0513.9 Fin)

Biología molecular de la célula (1994). Bruce Alberts. Omega (Laboratori de Biologia Molecular i Recerca, hospital de Tortosa Verge de la Cinta)

Teorías del envejecimiento. Perspectiva evolutiva. Laura Ruth Guelman.

Biología del envejecimiento. Viviana Pérez & Felipe Sierra (2009).

The evolutionary theories of aging revisited - A mini-review. Predrag Ljubuncic & Abraham Z. Reznick (2009).

Mammal aging: Active and passive mechanisms and their medical implications. Theodore C. Goldsmith (2009).

Why aging research? The moral imperative to retard human aging. Colin Farrelly (2010).

Theories of ageing. Jose Viña et al. (2007).

2. BIOLOGIA MOLECULAR DE LA CÈL·LULA

"Els individus envelleixen de manera diferent i dins d'un mateix individu la forma d'envellir dels diferents òrgans i sistemes també varia". Selva O'Callaghan

Presentació del tema Recurs

En aquesta lliçó es farà un breu repàs de diferents conceptes de biologia molecular bàsica tant a nivell genètic, proteic com metabòlic per entendre les teories i el procés de l’envelliment.1. Definició cèl·lula 2. Orgànuls i parts de la cèl·lula3. Àcid desoxiribonucleic (ADN) 4. Àcid ribonucleic (ARN) 5. Proteïnes 6. Metabolisme cel·lular 7. Cicle cel·lular

Definició de la cèl·lula Recurs

Unitat fonamental de la matèria vivent, generalment de tamany microscòpic, i amb capacitat de reproduir-se independentment. El seu descobridor va ser Robert Hooke al segle XVII quan va poder observar les parets cel·lulars de les cèl·lules mortes del suro. Posteriorment, es van anar fent diferents descobriments que van permetre descriure els diferents tipus cel·lulars i les seves estructures. De forma general, hi ha dos grans grups de tipus cel·lulars, els procariotes i els eucariotes. La principal diferència rau en que els eucariotes tenen nucli i els procariotes no.

En aquesta unitat sols s’explicarà la cèl·lula eucariota, i dintre de les eucariotes ens centrarem sols amb l'eucariota animal, sense entrar amb les cèl·lules eucariotes vegetals (amb paret cel·lular), els fongs i els protists.

La mida de les cèl·lules eucariotes és molt diversa i pot oscil·lar entre dècimes fins a varis centenars de micròmetres, però normalment és troba entre 10 i 30 micròmetres. De la mateixa manera les seves funcions també poden ser molt diverses. En el següent esquema es poden veure les principals parts que constitueixen una cèl·lula eucariota, i que anirem descrivint de forma més extensa al llarg d’aquest capítol.

Esquema 1: Cèl·lula eucariota: 1: membrana cel·lular; 2: citoplasma, 3: mitocondris, 4: aparell de Golgi, 5: reticle endoplasmàtic, 6: ribosome, 7: lisosomes, 8: centríols, 9: membrana nuclear, 10: nucli, 11: nuclèol.

Per a saber més

sobre la cèl·lula eucariota

http://www.youtube.com/watch?

feature=player_embedded&v=hBTImxRZrDM

Orgànuls de la cèl·lula Recurs

En el següent apartat es descriuran de forma general les parts més bàsiques que composen una cèl·lula eucariota animal i que s’han vist prèviament a l’esquema 1.

Membrana citoplasmàtica

Doble capa lipídica amb proteïnes associades que rodeja a la cèl·lula i a través de la qual es realitza l’intercanvi de substàncies i la transducció de senyals. Els components principals de la membrana són lípids (la major part d’ells amfipàtics amb una part hidrofílica i una altra hidrofòbica) i proteïnes, però també hi pot haver glúcids en forma de glicoproteïnes o de polisacàrids.

Citoplasma

Constituent fonamental de la cèl·lula, delimitat per la membrana plasmàtica i la membrana nuclear, on estan inclosos tots els orgànuls i els restants elements cel·lulars, on la porció líquida del citoplasma es coneix com citosol.

Nucli

Orgànul cel·lular limitat per una doble membrana (que estructuralment és idèntica a la membrana citoplasmàtica) i constituït essencialment per cromatina, que regula el metabolisme, el creixement i la reproducció cel·lular i normalment amb una mida entre 3-10 micròmetres. La cromatina és una substancia complexa formada per àcids nucleics (ADN) i proteïnes. La eucromatina és la part de la cromatina que és activa transcripcionalment i la heterocromatina és la part inactiva.

Per altra banda, el nuclèol és una àrea ben diferenciada on es produeix la síntesi de l'ARN ribosomal i la seva unió a proteïnes. En humans el nucli conté 23 parells de cromosomes constituïts principalment d’àcid desoxiribonucleic i proteïnes.

Ribosomes

Orgànul cel·lular que té per funció la síntesi de proteïnes. En els eucariotes estan adherits a la superfície externa del reticle, però també lliures en el hialoplasma, aïllats o disposats en cadenetes de 5 a 40 ribosomes, formant els polisomes. Cada ribosoma és constituït per dues subunitats corpusculars diferents, cadascuna de les quals és formada per un compost proteic i per una cadena d'ARN ribosomal. Per la superfície de la

subunitat més petita s’adhereix a l'ARN missatger, mentre que per la més gran pot adherir-se al reticle endoplasmàtic.

Reticle endoplasmàtic

Orgànul que s’organitza amb un conjunt de cavitats aplanades o cisternes limitades per membrana. Aquesta membrana es troba en continuïtat estructural amb la membrana externa de l’embolcall nuclear. Es distingeixen dos tipus de reticle endoplasmàtic, el llis i el rugós. El reticle endoplasmàtic rugós té adherits ribosomes i participa en el processament de les proteïnes. El llis no té ribosomes i està implicat en el metabolisme de lípids, citoesquelet i conducció d'estímuls.

Aparell de Golgi

Conjunt d’orgànuls anomenats dictiosomes, situats en el citoplasma cel·lular, prop del nucli, en les cèl·lules animals i en algunes de vegetals. Cada dictiosoma està format per un sistema de 5 a 8 sàculs apilats, rodejats de membrana i

aplanats, implicats en la modificació, selecció i empaquetament de macromolècules per a la secreció o per a l’exportació a altres orgànuls. El conjunt de tots els dictiosomes presents en la cèl·lula és el que es coneix amb el nom d'Aparell o complex de Golgi .

Lisosoma

Vesícules rodejades de membrana que contenen enzims hidrolítics destinades a les digestions intracel·lulars.

Peroxisoma

Vesícules rodejades de membrana que contenen enzims oxidatius que generen i destrueixen el peròxid d’hidrogen.

Mitocondris

Orgànul de les cèl·lules eucariotes en què té lloc la respiració cel·lular. Aproximadament de la mida dels bacteris, els mitocondris són les centrals energètiques de totes les cèl·lules eucariotes; utilitzen el material reduït obtingut del catabolisme i l'oxigen com a acceptor final per a produir energia (ATP). Consta d’una doble membrana (externa i interna) i de la matriu mitocondrial que conté una solució concentrada amb enzims diferents. El full de membrana intern s'invagina en nombrosos llocs i forma cloendes incompletes, anomenades crestes, que penetren profundament a la matriu mitocondrial, i les parets dels quals presenten granulacions abundants.

L’activitat metabòlica dels mitocondris és molt variada. Mitjançant tècniques de centrifugació i fraccionament hom ha identificat diversos sistemes enzimàtics: els del cicle de Krebs, els de la cadena respiratòria, els de la fosforilació oxidativa, els de l’oxidació dels àcids grassos, etc. També hi ha ARN i, en menys quantitat, ADN, que hom creu que poden constituir un sistema genètic autònom respecte al nuclear, fins i tot regulant la multiplicació dels mitocondris. També hi ha la hipòtesi de que els mitocondris són bacteris adaptats o en simbiosi amb la cèl·lula.

Citoesquelet

Conjunt de fibres intracel·lulars que organitzen la distribució dels orgànuls cel·lulars i donen forma i mobilitat a la cèl·lula. Present a totes les cèl·lules eucariotes, és format per una xarxa de filaments proteics. Els tres principals tipus de filaments del citosquelet son els microtúbuls, els filaments d’actina i els filaments intermedis.

Àcid desoxiribonucleic (ADN) Recurs

L’àcid desoxiribonucleic (ADN) és la molècula portadora de la informació genètica en els essers vius. Una cadena d’ADN és un llarg polímer, no ramificat, composat únicament per quatre tipus de subunitats. Aquestes unitats son els desoxiribonucleòtids que contenen la base Adenina (A), citosina (C), guanina (G) i Timina (T). Els nucleòtids estan units per enllaços covalents fosfodiester entre el carboni 5’ de un grup desoxiribosa i el carboni 3’ del següent.

La molècula d’ADN és un polímer helicoïdal de doble hèlix format per dues cadenes complementàries.

Les bases púriques d’una cadena (A i G) és complementen amb les bases pirimidíniques de l’altra cadena (T i C) respectivament, i viceversa.

Els gens són les seqüències d’ADN que constitueixen la unitat funcional per a la transmissió dels caràcters hereditaris i contenen tota la informació biològica necessària per al desenvolupament dels individus.

La transmissió dels gens i de tot el material genètic d’una cèl·lula mare a les seves filles s’aconsegueix amb la Replicació de l’ADN. En aquest procediment cadascuna de les cadenes de la molècula d’ADN són separades i replicades mitjançant diferents enzims (DNA polimerasa, helicasa, lligasa, etc).

Cadascuna de les cadenes originals fan de patró per a les cadenes duplicades que es creen de nou, aquest

tipus de replicació es semiconservatiu.

Una de les característiques més impressionants de la replicació és la seva precisió. La seqüència de nucleòtids d’una molècula d’ADN es copia amb menys d’un error per cada 109 nucleòtids afegits. No obstant, de quan en quan la maquinaria de la replicació salta o afegeix alguns nucleòtids, o col·loca una T on hauria d’anar una C, o una A en lloc d’una G. Cadascun d’aquests canvis en la seqüència d’ADN constitueix un error genètic anomenat mutacions. Aquestes mutacions poden ser silencioses quan no produeix ningun efecte, però també pot produir la inactivació d’una proteïna. Rarament, es produeixen mutacions que aportin una avantatja, però en aquests casos a través de la selecció natural pot quedar fixada en la població, substituint el gen original.

La informació que conté l’ADN s’expressa indirectament a través d’altres molècules: l’ADN dirigeix la síntesi de ARN específics i de molècules de proteïna que a la vegada determinen les propietats físiques i químiques de la cèl·lula.

Àcid ribonucleic (ARN) Recurs

Els àcids ribonucleics presenten una estructura molt semblant a l’àcid desoxiribonucleic i, com aquest, tenen una importància capital en la síntesi de proteïnes. N’hi ha tres tipus principals: l'ARN missatger (ARNm), l'ARN ribosòmic (ARNr) i l'ARN transferidor (ARNt). Cadascun d'ells està format per una sola cadena de polinucleòtids, tenen un pes molecular característic i una determinada composició de bases. Els nucleòtids estan formats per una D-ribosa, un àcid fosfòric i una base nitrogenada, que pot ser púrica (Adenina o Guanina) o pirimidínica (Citosina o Uracil), mai trobarem Timina en l’ARN, de la mateixa manera que mai trobarem Uracil en l’ADN. Tots són sintetitzats en el nucli mitjançant la transcripció. Els ARNm són els que porten la informació genètica. Els ARNt actuen com a molècules transportadores d’aminoàcids específics durant la síntesi proteica en el ribosoma mitjançant la formació d'aminoacil-ARNt. L'ARNr forma fins al 65% dels ribosomes.

L’ARN conté tota la informació de la seqüència de ADN de la que ha estat copiada, y manté les propietats de l’ADN d’aparellament de

bases. Les molècules d’ARN es sintetitzen a través d’un procediment conegut com Transcripció de l’ADN, que en molts aspectes s’apareix a la replicació de l’ADN ja que una de les dos cadenes de l’ADN actua com a patró.

La transcripció de l’ADN es diferencia de la replicació de l’ADN en diferents punts importants. En primer lloc, l’ARN produït no permaneix associat a l’ADN. Immediatament, darrera de la regió en la que s’afegeixen els ribonucleòtids, l’hèlix original de l’ADN es forma de nou i la molècula de l’ARN es separa. Així, les molècules d’ARN tenen una sola cadena. A més a més, les molècules d’ARN son relativament curtes en comparació amb les d’ADN, ja que són copiades a partir d’una regió limitada de l’ADN.

Per a la transcripció de l’ARNm els gens eucariotes presenten seqüències codificants (anomenades exons) interrompudes per seqüències no codificants (anomenades introns). Per produir una proteïna primer es transcriu tot el gen amb introns i exons inclosos conegut com a transcrit primari. Abans de sortir del nucli al transcrit primari se li eliminen els introns i s’empalmen els exons (ARN Splicing). Aquest procediment es coneix com maduració de l’ARN. L’ARNm un cop madurat es transporta al citoplasma on es tradueix la seva informació en una proteïna.

Proteïnes Recurs

La traducció és el procés mitjançant el qual es tradueix una determinada seqüència de nucleòtids de l'ARN missatger en una determinada seqüència d’aminoàcids (codi genètic) gràcies al concurs dels ribosomes. Les regles a través de les quals es tradueix la seqüència de nucleòtids en seqüència de aminoàcids és coneixen com codi genètic. Cada triplet de bases, denominats codó, determina un aminoàcid. Ja que el ARNm és un polímer lineal amb quatre nucleòtids diferents, existeixen 43=64 triplets de codons possibles. Habitualment en les proteïnes es troben sols 20 aminoàcids diferents, així que la majoria d’aminoàcids són codificats per codons diferents(codi genètic degenerat).

Els codons d’una molècula d’ARNm no reconeixen directament els aminoàcids. La traducció d’un ARNm a proteïna depèn d’una molècula adaptadora que reconeix un aminoàcid per una banda i per l’altra un grup de tres nucleòtids. Estos adaptadors són un grup de petites molècules d’ARN conegudes com ARN de transferència, cadascuna de les quals té al voltant d’uns 80 nucleòtids de longitud. L’anticodó és el triplet de bases de l’ARNt que s’uneix al codó.

El procés de reconeixement dels codons, que transfereixen la informació genètica del ARNm via ARNt a la proteïna, depèn de les interaccions entre parells de bases. No obstant, la mecànica d’ordenació de les molècules de ARNt sobre el ARNm és complicada i requereix de la presència dels ribosomes, que és un complex de més de 50 proteïnes diferents associades a varies molècules del ARN estructural (ARNr). Cada ribosoma funciona com una gran màquina sintetitzadora de proteïnes en la qual les molècules de ARNt es col·loquen per si mateixes per llegir el missatge genètic codificat a la seqüència de les molècules de ARNm. El ribosoma es fixa primer en un punt específic de la molècula de ARNm i es va desplaçant al llarg de l’ARN traduint codó per codó la seqüència de nucleòtids a seqüència d’aminoàcids. Quan un ribosoma arriba al final del missatge es alliberat al citoplasma.

La cadena dels diferents aminoàcids sintetitzada en el procediment de traducció generarà les diferents proteïnes codificades en el gens. Les seqüències de pocs aminoàcids es coneixen com pèptids. La cadena senzilla completa d’aminoàcids és denomina estructura primària de la proteïna. Les interaccions regulars dels enllaços d’hidrogen entre fragments contigus de la cadena polipeptídica dóna lloc a la estructura hèlix α i làmina β, les quals constitueixen l’estructura secundaria de la proteïna.

Certes combinacions de hèlixs α i làmines β s’empaqueten formant unitats globulars enllaçades de forma compacta, cadascuna de les quals es denomina domini proteic o estructura terciària, i és la que li dóna funcionalitat a la proteïna. Les proteïnes més petites poden tenir un sols domini i les més grans poden tenir diferents dominis. L’estructura quaternària sols es donaria quan una proteïna té diferents dominis i aquests queden totalment organitzats entre ells.

Les propietats químiques d’una molècula proteica depèn quasi completament dels residus d’aminoàcids que queden exposats a la seva superfície un cop s’ha organitzat, i que són capaços de formar enllaços dèbils no covalents amb altres

molècules. Els llocs d’unió de les proteïnes son cavitats superficials en les diverses cadenes laterals dels aminoàcids que es localitzen d'una forma precisa gràcies al plegament de la proteïna. Les proteïnes poden realitzar una àmplia gama de funcions: Estructural, produir o accelerar reaccions químiques, funcions mecàniques, metabolisme cel·lular, bombeig d’ions, senyalització cel·lular, replicació de l’ADN, etc.

Metabolisme cel·lular Recurs

El metabolisme és el conjunt de totes les reaccions químiques que es donen dins les cèl·lules. Dins del metabolisme diferenciem anabolisme i catabolisme.

L’anabolisme és un conjunt de processos d’assimilació dels nutrients (substàncies simples) i la seva conversió en matèria vivent (substàncies complexes). És, per tant, un fenomen constructiu, que inclou processos de síntesi i requereix energia. En canvi, el catabolisme és l’oposat i consta d’un c onjunt de reaccions de degradació que comporten una oxidació i, per tant, un alliberament d’energia. En aquest apartat sols es farà un breu repàs del catabolisme ja que s’ha vist que són els conjunts de processos que més poden estar implicats en l’envelliment.

Les cèl·lules eucariotes animals no poden obtenir energia a través de la fotosíntesi com fan les vegetals, per això han d’obtenir energia de “segona mà” a partir de la ingesta de plantes o de “tercera mà” obtinguda a partir de la ingesta d’altres animals.

Les cèl·lules obtenen energia mitjançant l’oxidació de molècules orgàniques. No obstant la cèl·lula no oxida les molècules a través d’un sol pas, tal i com passa amb la combustió. Al contrari, hi ha un gran número de reaccions que sols en contades ocasions incorporen l’addició directa d’oxigen. Cal recordar que, de forma general, l’oxidació fa referència a l’eliminació d’electrons d’un àtom i la reducció a l’addició d’electrons.

Les proteïnes, els lípids i els polisacàrids, que constitueixen la major part dels aliments que mengem, han de ser degradats a molècules menors abans de que les nostres cèl·lules puguin utilitzar-les. Es pot considerar que la degradació enzimàtica, o catabolisme, d’aquestes molècules succeeix en tres etapes. En aquestes tres etapes s’obté principalment CO2, H2O, Adenosin Trifosfat (ATP) que seria la moneda energètica cel·lular així com la nicotinamida adenina dinucleòtid reduïda (NADH) i el flavín adenín dinucleòtid reduït (FADH2) que donarien poder reductor al cicle catabòlic.

-Fase 1 (Digestió): Les grans molècules polimèriques s’escindeixen en unitats monomèriques – les proteïnes a aminoàcids, els polisacàrids a monosacàrids i els greixos a àcids grassos i glicerol. Aquests procediments es produeixen fora de les cèl·lules, dins del tub digestiu, mitjançant l’acció d’enzims digestius.

-Fase 2: Les petites molècules obtingudes en la digestió son absorbides per les cèl·lules intestinals i enviades via sanguínia al fetge que s’encarrega de distribuir-les per l’organisme. Al citoplasma cel·lular poden sofrir una degradació posterior. La majoria de sucres es transformen en piruvat, que penetra a les mitocòndries, on es transforma en els grup Acetil del component químicament reactiu acetil coenzim A (Acetil CoA). També es produeixen grans quantitats d’acetil CoA mitjançant

l’oxidació d’àcids grassos.

-Fase 3: El grup acetilo de l’acetil CoA es degrada completament fins a CO2, i H2O mitjançant el cicle de l’àcid cítric o cicle de Krebs. Aquesta fase es produeix als mitocondris. En la cèl·lula eucariota, els mitocondris són el centre on conflueixen tots els processos catabòlics, tant si comencen des de sucres, greixos o proteïnes, on tots són transformats a acetil CoA o algun dels intermediaris del cicle de Krebs.

La fosforilació oxidativa és l’últim pas del catabolisme i el procés en que s’allibera la major part de l’energia metabòlica. En aquest procés, les molècules de NADH i FADH2 transfereixen a l’O2 els electrons que han obtingut de l’oxidació de les molècules dels aliments. La reacció, que formalment equival a la combustió de l’hidrogen a l’aire formant aigua, allibera una gran quantitat d’energia química. Part d’aquesta energia s’utilitza per forma ATP i la resta s’allibera en forma de calor. Aquesta transferència d’electrons es produeix gracies a la cadena de transport electrònic que succeeix a la membrana mitocondrial interna, on es troben totes les molècules transportadores.

Fruit del metabolisme cel·lular es poden crear radicals lliures que són molècules altament reactives i inestables pel fet de tenir, com a mínim, un electró desaparellat, que és susceptible de crear enllaços amb altres àtoms o molècules per tal d’aconseguir l’estabilitat electroquímica. A l’organisme, els radicals lliures poden alterar diferents molècules i estructures, com per exemple proteïnes, lípids, membranes cel·lulars i el material genètic de les cèl·lules. Aquests canvis provoquen la disminució de la seva funcionalitat i augmenten el risc de patir determinats trastorns, com alguns tipus de càncer o alteracions en els processos immunològics de defensa de l’organisme humà. Alguns dels símptomes relacionats amb l’envelliment, com per exemple l’aterosclerosi, s’atribueix també en part a l’acció del radicals lliures. Els factors ambientals i d’estil de vida com la contaminació, el tabaquisme, una alimentació inadequada o l’estrès, poden augmentar la producció de radicals lliures. Les reaccions químiques dels radicals lliures es donen constantment en les cèl·lules del nostre organisme, i encara que són necessàries per a la salut, hi ha nombrosos mecanismes endògens per a reduir el dany derivat, com l’acció dels enzims superòxid dismutasa, catalasa, glutatió peroxidasa o glutatió reductasa. Una alimentació a base d’aliments d’origen vegetal rics en antioxidants pot contribuir a disminuir els efectes dels radicals lliures i neutralitzar la seva acció oxidativa.

Cicle cel·lular Recurs

Els organismes pluricel·lulars són generats per mitjà de seqüències complexes de divisions cel·lulars. La divisió cel·lular es constant a nivell de la medul·la òssia (generació de les cèl·lules sanguínies), a nivell de epitelis (epidermis, intestí,...), a nivell de algunes glàndules (sebàcies, ..) y a nivell de gònades (gametogènesi). És requereix també la divisió cel·lular per a reposar les pèrdues degudes al desgast natural com per exemple la dermis i epidermis després de lesions o el fetge després d’una pèrdua parcial. Per tant, un ser humà adult ha de

fabricar molts milions de cèl·lules noves cada segon simplement per mantenir el seu “status quo”, i si la divisió cel·lular s’interromp llavors l’esser humà mor.

El cicle cel·lular eucariòtic consta de quatre fases successives. La interfase està formada per tres d’aquestes fases i la mitosi és la quarta del cicle cel·lular. La primera fase d’elles és la fase G1 on la cèl·lula té una elevada activitat biosintètica i és molt activa metabòlicament. La segona fase és la S que comença amb la síntesi del nou ADN i acaba quan el contingut d’ADN del nucli s’ha duplicat. La tercera fase és la G2 i en aquesta la cèl·lula és prepara per a poder entrar en la darrera fase que és la mitosi.

La mitosi és el procés de divisió de les cèl·lules somàtiques dels eucariotes, que consisteix, fonamentalment, en una divisió longitudinal dels cromosomes i en una divisió del citoplasma. En la mitosi el contingut del nucli es condensa donat lloc a cromosomes visibles cadascun d’ells formats de cromàtides germanes. La mitosi es divideix tradicionalment en sis fases: profase, prometafase, metafase, anafase, telofase i citocinesi.

-Profase: La cromatina que es troba difusa en la interfase, es condensa lentament formant cromosomes ben definits, el número exacte d’aquests cromosomes dependrà de cada espècie. Cada cromosoma s’ha duplicat en la fase S i ara consta de dues cromàtides germanes, cadascuna de les quals conté una seqüència de ADN específica, coneguda com a centròmer, necessària per a la correcta segregació de les cromàtides. Al final de la profase, els microtúbuls citoplasmàtics que formen part del citosquelet interfàsic es despolimeritzen i es comença a formar el principal component de l’aparell mitòtic, el fus mitòtic. Es tracta d’una estructura bipolar composada de microtúbuls i proteïnes associades.

-Prometafase: La prometafase s’inicia bruscament amb la desintegració de l’embolcall nuclear. Els microtúbuls del fus mitòtic que es trobaven ara fora del nucli poden entrar a la regió nuclear. El microtúbuls cinetocòrics són els que s’encarreguen d’estirar els cromosomes a través del centròmer.

-Metafase: Els microtúbuls cinetocòrics alineen els cromosomes en un pla situat a mig camí dels dos pols del fus.

-Anafase: En aquesta fase les cromàtides es separen permetent que cada cromàtide sigui arrastrada lentament cap als pols del fus mitòtic.

-Telofase: Les cromàtides filles separades arriben als pols i els microtúbuls

cinetocòrics desapareixen i es forma un nou embolcall nuclear per a cada pol.

-Citocinesi: El citoplasma es divideix per un procés conegut com segmentació. La membrana de la zona central de la cèl·lula i perpendicular a l’eix del fus i entre els nuclis fills, es desplaça cap a dintre originant un solc de segmentació, que cada cop es torna més profund fins que la cèl·lula es divideix.

En la mitosi les cèl·lules filles tenen la mateixa quantitat d’ADN que la cèl·lula progenitora.

L’altre tipus de divisió cel·lular és la meiosi, que es dóna sols a les cèl·lules germinatives. El procés consisteix en dues divisions nuclears successives. En totes les dues divisions hom pot distingir les corresponents profase, metafase, anafase i telofase.La divisió meiòtica rep també el nom de divisió reduccional, perquè el nombre de cromosomes de les cèl·lules resultants (n) és la meitat dels de la cèl·lula que es divideix (2n).

En la primera divisió, la profase consta de cinc estadis:

- Leptotè: Els cromosomes (formats per 2 cromàtides germanes juxtaposades) es condensen formant un llarg filament amb un eix proteic central.

- Zigotè: els cromosomes s’aparellen formant una estructura bivalent.

- Paquitè: Tenen lloc entrecreuaments entre les cromàtides no germanes de l’estructura bivalent. És l’etapa més llarga i més estable.

- Diplotè: Es separen els cromosomes homòlegs, tot i així cada bivalent presenta unions anomenades quiasmes que són zones on hi ha hagut entrecreuament del material genètic.

- Diacinesi: És la etapa de transició a la metafase, els cromosomes es condensen, s’observa que cada bivalent esta format per 4 cromàtides (les germanes unides pels seus centròmers i les no germanes, que s’han entrecreuat, unides per quiasmes).

En la metafase, els cromosomes es situen al pla equatorial, equidistants dels pols del fus acromàtic. En l’anafase els quiasmes es separen i els cromosomes migren cap als pols del fus mitjançant la contracció de les fibres del fus, cada grup de material genètic és format per un conjunt haploide de cromosomes, en comptes d’ésser-ho per un conjunt diploide de cromàtides, com a la mitosi. En la telofase els cromosomes s’agrupen a l’interior dels dos nuclis fills amb n cromosomes i 2n cromàtides, i arriba una fase de repòs, o interfase, que té una durada variable.

La segona divisió de la meiosi és molt semblant a una mitosi normal de cadascun dels nuclis fills. El resultat final és la formació de quatre cèl·lules haploides a partir d’una de diploide. La meiosi és específica dels organismes que es reprodueixen

sexualment, i els resultats fonamentals són la continuïtat del nombre de cromosomes d’una espècie a l’altra, la formació de nous genotips produïts pels processos de recombinació intracromosòmica i per la segregació independent dels centròmers en la primera divisió meiòtica.

3. BIOLOGIA I TEORIES DE L'ENVELLIMENT

"Procés biològic d’esdevenir vell, que comporta un conjunt de canvis estructurals i funcionals que apareixen amb el pas del temps i que no són conseqüència de malalties ni accidents" Acadèmia de

Ciències Mèdiques de Catalunya i Balears.

Presentació del tema Recurs

En aquesta lliçó es farà un breu repàs de les teories de les causes de l’envelliment més rellevants desenvolupades durant els darrers anys. Aquestes diverses teories no són mútuament excloents, sinó que fan més o menys èmfasi en determinats factors o modificacions que es donen amb el procés d’envelliment.

L'envelliment és un fenomen multifactorial, que afecta tots els nivells d'organització biològica, des de les molècules als sistemes fisiològics, que duen que la persona tingui una major predisposició a desenvolupar certes malalties i com a conseqüència final present un major risc de mort.

1. Teories estocàstiques o teories basades en el dany i desgast cel·lular

Són aquelles que engloben fenòmens producte de l'atzar i que s'acumulen al llarg del temps. Són teories que es basen en el concepte d'acumulació de dany, de productes tòxics del metabolisme, de l'acumulació d'errors en l'ADN, etc. que amb el temps fan ineficients els sistemes de manteniment i de defensa de l'organisme, causant així l'envelliment.

Aquestes teories postulen que es produeix una acumulació fortuïta d’esdeveniments perjudicials provocada per l’exposició a factors exògens adversos. Dintre d’aquest grup estan incloses les teories dels radicals lliures, immunològica, dels productes de desfet, de les unions creuades, de l’error-catàstrofe, de la mutació somàtica, i les teories genètiques (de regulació gènica, de la diferenciació terminal i de la inestabilitat del genoma).

2. Teories deterministes de l'envelliment programat

Són aquelles que engloben el fenòmens que es descriuen mitjançant un nombre limitat de variables conegudes, que evolucionen exactament de la mateixa manera en cada reproducció del fenomen estudiat. És a dir que l’envelliment seria la continuació del procés de desenvolupament i diferenciació, i correspondria a l’ultima etapa dintre d’una seqüència d’esdeveniments codificats en el genoma. Així que l’envelliment, a més de ser el producte de l’acumulació de dany cel·lular es troba determinat genèticament i controlat per diferents factors entre els quals destaca el paper del sistema endocrí.

Fins al moment no existeix evidència en l’home de l’existència d’un gen únic que determini l’envelliment, però a partir de la Progèria (síndrome d’envelliment prematur), es pot extrapolar la importància de l’herència en el procés d’envelliment.

Dintre d’aquest grup estan incloses: la teoria de la capacitat replicativa finita, les teories de programes o de desenvolupament (de rellotges biològics, la hipòtesi dels gens determinants de la longevitat, de la inactivació de múltiples còpies d’ADN) i les teories evolutives (de Weissman, d’acumulació del dany, d’acumulació de mutacions, antagonistica pleitròpica, del soma descartable o desgast i del gen egoista).

Teories estocàstiques o teories basades en el dany i desgast cel·lular Recurs

Les mutacions i les anomalies cromosòmiques s’acumulen amb l’edat i són compensades per l’existència d’ADN redundant fins que s’acaba el reservori. Errors en la duplicació de l’ADN augmenten amb l’edat per acció d’agents nocius. L’acumulació d’errors dóna lloc a ARNm i proteïnes no funcionals.

1. Teoria de l’error catastròfic

Es sap que es produeixen errors en els processos de transcripció i traducció durant la síntesi de proteïnes que poden provocar dany en la funció cel·lular com per exemple en els enzims.

Aquesta teoria va ser postulada per Orgel en els anys 60 i sosté que si alguna d’aquestes proteïnes arribés a formar part de la maquinària que sintetitza altres proteïnes o ADN, causaria encara més errors en la generació següent de proteïnes, i així successivament fins a arribar a una pèrdua “catastròfica” de l’homeòstasi cel·lular, la qual cosa conduiria a la mort cel·lular.

A favor d’aquesta teoria estan els errors de transcripció i traducció de l'ADN. En contra està la manca d'evidencies que aquests errors s'acumulen en el temps, que no canvia la seqüència d’aminoàcids en les proteïnes d’animals vells respecte als joves i que no augmenta de la quantitat de ARNt defectuós amb l’edat.

-----------------------------------------

2. Teoria dels enllaços i unions creuades

Aquesta teoria postula que tendríen lloc enllaços o entrecreuaments entre les proteïnes i altres macromolècules cel·lulars, el que determinaria envelliment i el desenvolupament de malalties dependents de l’edat. Els canvis que es produeixen quan dos o mes macromolècules s’uneixen per enllaços covalents o per ponts d’hidrogen, augmenta l’agregació i la immobilització molecular, interferint amb les reaccions químiques normals i produint alteracions funcionals que afecten des de la membrana fins a l’ADN cel·lular.

Aquesta teoria no explica tots els fenòmens relacionats amb l’envelliment, però si alguns. Es sap que el desenvolupament de "cataractes" és degut a que les proteïnes del cristal·lí sofreixen glicosilació i comencen a entrecreuar-se entre

elles, el que comporta l'opacificació progressiva d’aquest. També s’ha observat entrecreuament de les fibres de col·lagen entre elles, però la seva significació clínica no és del tot clara (per exemple la pell que amb l'edat es torna aspra i poc flexible). Es postula que els entrecreuaments podrien impedir els processos metabòlics per obstrucció del pas de nutrients i desaprofitaments des de i cap a les cèl·lules.

-----------------------------------------

3. Teoria del desgast o dany de l'ADN

Aquesta teoria proposa que cada organisme estaria format de parts irreemplaçables, i que l’acumulació de dany en les seves parts vitals portaria a la mort de les cèl·lules, teixits, òrgans i finalment de l’organisme.

Es va demostrar que hi ha prop de 10.000 danys oxidatius de l’ADN per dia; afortunadament, els mecanismes de reparació que existeixen normalment dintre de la cèl·lula són suficients per a reparar el dany present.

Cada tipus d’agressió a l’ADN té un subtipus específic de mecanisme reparador que enzimàticament reconeix i remou la porció danyada i sintetitza una nova usant la contrapart no alterada com model. A més, existeixen també mecanismes de reparació a nivell de l'entrecreuament de les cadenes i les ruptures de les mateixes. Tot això es troba lligat al procés de transcripció.

Degut al fet que l’ADN danyat és una font probable de mutació, és necessari que aquest sigui reparat abans de la divisió cel·lular; així, el procés de reparació s’acompanya per un bloqueig del cicle cel·lular per activació del gen supressor de tumor p53, així com d’altres gens antiproliferatius.

Això vol dir que ha d’existir un equilibri entre els processos de dany i els mecanismes de reparació, el qual permet mantenir l’ADN el més íntegre possible, ja que els estudis mostren no només que existeix una gran correlació entre l’habilitat de reparació de l’ADN i l’expectativa de vida, sinó a més, que els canvis sistemàtics relacionats amb l’edat constitueixen el major esdeveniment relacionat amb les modificacions funcionals característiques de l’envelliment.

Les principals causes del dany de l’ADN son els radicals lliures, les radiacions normals, la llum ultraviolada, els químics antineoplàstics, i els processos metabòlics normals.

En favor d’aquesta teoria esta la capacitat de reparació de l'ADN que es correlaciona positivament amb la longevitat de les diferents espècies, el mecanismes de reparació perden eficàcia durant l’envelliment i que el polimorfisme de certs gens que promouen la reparació pot condicionar l’eficàcia reparadora d’aquest individu. Tanmateix, estudis en animals no han demostrat una declinació en la capacitat de reparació de l'ADN en els animals que envelleixen. Per tant, falten encara mes estudis per a saber si realment s’acumula dany en l'ADN amb l’envelliment i per què organismes de la mateixa espècies viuen més temps (es desgasten menys? Tenen diferents estils i hàbits de vida?)

-----------------------------------------

4. Teoria dels radicals lliures

Aquesta és una de les teories més populars. Proposa que l’envelliment seria el resultat d’una inadequada protecció contra el dany produït en els teixits pels radicals lliures.

Vivim en una atmosfera oxigenada, i per tant oxidant. L’oxigen ambiental promou el metabolisme cel·lular, produint energia a través de la cadena respiratòria (enzims mitocondrials). Com l’utilització i maneig de l'O2 no és perfecta, es produeixen radicals lliures, entre ells el radical superòxid. Els radicals lliures són molècules inestables i altament reactives amb un o més electrons no aparellats, que produeixen dany al seu al voltant a través de reaccions oxidatives. La cèl·lula ha de defensar-se d’aquests agressors i per a això compta amb la presència de diversos mecanismes de defensa entre els quals es troba l’acció d’enzims protectors com la superòxid dismutasa, que accelera el pas de superòxid a peròxid d’hidrogen, la catalasa i la glutatió peroxidasa, (que converteix el peròxid d’hidrogen en aigua). A més, certes substàncies com la vitamina E tenen l’habilitat d’inserir-se dintre de les membranes cel·lulars i protegir els àcids grassos insaturats del dany oxidatiu. No obstant això, l’absorció de vitamina E està limitada a prop de 10 mg/dia per la qual cosa no és possible el seu ús com una mesura terapèutica.

Es creu que aquest tipus de dany podria causar:

- peroxidació dels àcids grassos insaturats en les membranes cel·lulars. - oxidació dels grups sulfito, entrecreuament proteic, i la inactivació enzimàtica. - despolimerització de polisacàrids.

- dany de l’ADN: ruptures, entrecreuament, hidroxilació de bases, escissió de bases.

Dintre d’aquestes, les més importants són la peroxidació lipídica i el dany causat a l’ADN. El dany net dependrà del tipus de radicals lliures presents, la seva taxa de producció, la integritat estructural de les cèl·lules i l’activitat dels antioxidants presents. Així, els increments en el dany cel·lular a causa de radicals lliures poden ser causats per alteracions en qualsevol d’aquestes variables.

La lipofucsina, anomenad també "pigment de l’envelliment", correspon a l’acumulació d’organuls subcel·lulars oxidats ( veure teoria dels productes de desfet) . S’ha trobat una bona correlació entre els nivells cel·lulars de superòxid dismutasa (enzim d’acció antioxidant) i la longevitat de diferents primats. A més, estudis en rates sotmeses a restricció calòrica han mostrat un augment en la longevitat d’aquestes, el que es creu és a causa de una menor producció de radicals lliures. Per altra banda, no hi ha estudis que hagin demostrat que animals sotmesos a dietes riques en antioxidants aconsegueixin augmentar la seva esperança de vida encara que els antioxidants tiòlics (grup tiol -SH) són efectius contra l’estrès oxidatiu i la disfunció immune que té lloc al envellir tant en animals de laboratori com en humans.

Desgraciadament, falten més estudis per a comprendre més a fons el rol dels

radicals lliures en el procés d’envelliment. El que sí és clar, és l'important paper que juga el dany produït per l’alliberament de radicals lliures en certes patologies relacionades amb l’envelliment, tals com les malalties cardiovasculars, càncers, cataractes, malaltia d’Alzheimer, i altres. Segons l’evidència amb la qual contem fins al moment, si assolim disminuir la generació de radicals lliures o neutralitzem el seu dany, assoliríem disminuir aquestes malalties. Llavors, seríem capaços de prevenir una mort precoç per aquestes patologies.

El que no ésta clar, és si assolim disminuir el dany per radicals lliures, assolirem augmentar la longevitat.

-----------------------------------------

5. Teoria del soma disponible

Segons el fisiòleg Max Rubner existiria una relació entre taxa metabòlica, tamany corporal i longevitat de manera que com més gran sigui l’animal més temps viurà doncs la relació entre despesa metabòlica i massa corporal serà menor. Rubner va proposar l’hipòtesi del consum d’energia, segons la qual, hi hauria una energia determinada disponible des del naixement i segons el ritme de vida de l’animal (p.ex. maduració sexual precoç o tardana Austad, 1997) aquesta energia es gastaria més o menys ràpidament permetent una longevitat menor o major respectivament. Aquesta teoria lliga amb la de "soma disponible" que estudia Kirkwood segons el qual la selecció natural afavoreix una estratègia que inverteix menys en el manteniment de les cèl·lules somàtiques i teixits del que seria necessari per una supervivència indefinida, ja que es seleccionen aquells organismes que, en un context de perill ambiental (depredació...), destinen els seus esforços cap a la reproducció.

-----------------------------------------

6. Teories immunològiques

Segons aquesta teoria, existiria una disminució de la capacitat del sistema immune per a produir anticossos i per a discriminar entre els seus constituents i els aliens, el que generaria un augment de reaccions autoimmunes. La involució notable de la massa i la composició del timus que s’observa en ratolins vells i humans podria ser responsable de la pèrdua de la immunitat defensiva.

-----------------------------------------

7. Teoria dels productes de desfet

S’han trobat alts nivells de lipofucsina, pigments que són el resultat final de la peroxidació líipídica cel·lular (producte de l’estrès oxidatiu), en els lisosomes de cèl·lules postmitótiques. El dipòsit de lipofucsina s’acompanya d’una disminució en el volum del citoplasma, en el nombre de mitocondries i del nivell de vacuolització cel·lular. En 1974, Sheldrake va proposar que: “l’envelliment cel·lular es pot explicar en termes de l’acumulació de restes de productes citoplàsmics, alguns dels quals poden ser perjudicials per a la cèl·lula; l’unica manera que les cèl·lules

tenen per a evitar la seva mortalitat és créixer i dividir-se, ja que d’aquesta forma les restes de productes de desfet es dilueixen”. És a dir: la cèl·lula envelliria per a evitar la seva transformació en cèl·lula cancerosa.

-----------------------------------------

8. Teoria de la mutació somàtica

Aquesta teoria va ser proposada per Szilard en 1959, qui va predir que l’envelliment ocorreria com resultat de l’acumulació de mutacions en l'ADN de les cèl·lules somàtiques, a través del dany a l’atzar en les macromolècules vitals.

El concepte central d’aquesta teoria postula que l’acumulació d’un nivell suficient de mutacions en les cèl·lules somàtiques a través del temps provocaria la deterioració fisiològica característica de l’envelliment.

La lesió en l'ADN es produiria fonamentalment a nivell mitocondrial. D’aquesta manera, les cèl·lules privades de la capacitat de regenerar les seves poblacions mitocondrials, sofririen una disminució irreversible en la seva capacitat per a sintetitzar ATP, amb la consegüent degradació senescent del funcionament fisiològic, conduint finalment a la mort cel·lular. No obstant això, el dany a gens determinats de l'ADN nuclear, els promotors del qual podrien ser més vulnerables al dany oxidatiu, també ha estat postulat.

-----------------------------------------

9. Teories genètiques

9.1. Teoria de la regulació gènica

Cada espècie posseeix un conjunt de gens que asseguren el seu desenvolupament i reproducció. D’acord amb aquesta teoria, després de la reproducció es generaria un desequilibri entre els diferents factors gènics que van permetre el manteniment de la fase de reproducció, conduint a la deterioració dels diferents teixits (per exemple, la disminució de l’expressió de gens relacionats amb la neurotransmisió).

9.2. Teoria de la diferenciació terminal

Aquesta teoria suposa que després de cert nombre de divisions cel·lulars es produeix l’activació de gens que codifiquen per a certes proteïnes que, d’una banda, inhibeixen el creixement cel·lular i per l’altre, impedeixen l’expressió d’altres proteïnes que faciliten el creixement cel·lular.

Així, el fet que el pèl es torni blanc a l'envellir no és degut al fet que s’expressi un gen que fa que el pèl surti de color blanc, sinó que deixa d’expressar-se el gen que estimulava a la melanina perquè tingués color negre.

9.3. Teoria de la inestabilitat del genoma

En aquesta teoria es posa en relleu la inestabilitat del genoma com causa de l’envelliment, produint-se modificacions tant a nivell de l'ADN com de l’expressió

dels gens sobre l'ARN i les proteïnes.

-----------------------------------------

10. Teories matemàtiques i físiques

La teoria de la simplificació adverteix com a través de la vida la complexitat dels mecanismes de regulació homeostàtica s’empobreixen. L’estat jove es caracteritza per la vigència d’un gran nímero de factors reguladors interactuant en forma caòtica, i l’envelliment es caracteritzaria per la pèrdua de complexitat i la tendència a orientar-se cap a sistemes dinàmics no caòtics, mes simples, la qual cosa condueix a una pèrdua de la capacitat adaptativa de l’organisme.

Teories deterministes de l’envelliment programat Recurs

Aquestes teories proposen que l’envelliment seria la continuació del procés de desenvolupament i diferenciació, i correspondria a l’última etapa dintre d’una seqüència d’esdeveniments codificats en el genoma. Així que l’envelliment seria genèticament programat, ja sigui perquè el programa original s’altera (teoria de la mutació somàtica, teoria de l’acumulació d’errors) o perquè els canvis cel·lulars estan inclosos dintre de les instruccions contingudes en l'ADN des de la concepció, és a dir, són part del desenvolupament normal. En favor d’aquests teories es la progèria (síndrome de l’envelliment prematur) i que en totes les societats les dones viuen 8 anys més que els homes (síndrome XX).

1. Teoria del marcapassos o rellotge de l’envelliment ( Burnet, 1970)

Els sistemes immune i neuroendocrí serien "marcadors" intrínsecs de l’envelliment. La seva involució està genèticament determinada per a tenir lloc en moments específics de la vida. El sistema endocrí, exercici i nutrició (antioxidants, restricció calòrica) estan relacionats amb l'equilibri oxidatiu.

En la versió més popular d’aquesta teoria, es pensa que el «rellotge de l’envelliment» resideix en l'hipotàlem. El timus jugaria un rol fonamental en l’envelliment, ja que a l’alterar-se la funció dels limfòcits T, disminueix la immunitat i augmenta, entre uns altres, la freqüència de càncers. L’immunosenescènica pot afavorir major incidència d’infeccions, reaccions immunes i càncers. A favor d'aquesta teoria hi ha que en ratolins existeix una relació entre una bona funció de les cèl·lules T i una major longevitat, també que hi ha una modificació dels processos metabòlics regulats per hormones (per exemple la menor resposta renal a la hormona antidiürètica) com les cèl·lules beta del pàncrees que són menys sensibles als nivells de sucre en sang i també la menopausa al voltant dels 50 anys.

---------------------------------

2. Teoria de la capacitat replicativa finita o telòmers

És clar que el factor genètic és un important determinant del procés d’envelliment encara que no es coneixen exactament els mecanismes involucrats (un o més gens nocius, de gens de joventut i vellesa, gens que muten).

Existeixen patrons de longevitat específics per a cada espècie animal. També existeix una molt millor correlació en la sobrevida (vida mes allà de l’esperada) entre bessons monozigots, que entre germans. Així mateix, la sobrevida dels pares es correlaciona bé amb la dels seus fills.

En les dues síndromes d’envelliment prematur (síndrome de Werner i síndrome de Hutchinson-Gilford o Progèria), en els quals els nens moren de malalties relacionades amb l’envelliment, hi ha una alteració genètica autosòmica hereditària. En l’home, cèl·lules de la pell obtingudes de nounats es poden dividir 60 vegades, en les d’adults vells es divideixen 45 vegades, i les cèl·lules de subjectes amb síndrome de Werner es divideixen 30 vegades solament.

L'apoptosis o mort cel·lular programada es un procés important per assegurar el recanvi cel·lular, eliminar cèl·lules amb lesions genètiques i evitar neoplàsies. En estudis sobre C. Elegans de 1.099 cèl·lules, un 12% pateixen apoptosis y 14 gens estan relacionats amb un efecte protector. En humans, aquests gens tenen homologia amb proteases caspases, factors activadors de proteases apotòtiques i proteïnes proapoptìtiques com els bcls. En l’envelliment la desregulació de l’apoptosis no esta compensat per una major mistosis i existeix un baix rendiment funcional.

Fins avui es coneixen 4 grups de gens en els cromosomes 1 i 4, que donen informació sobre cessament de la divisió cel·lular (gens inhibidors). Es sap també que existeixen oncògens estimuladors del creixement, els quals al activar-se determinen divisió cel·lular infinita, resultant en una cèl·lula immortal (cancerosa).

Segons sembla, l’envelliment cel·lular estaria condicionat per la pèrdua progressiva amb l’edat de material genètic en els extrems dels cromosomes: els telòmers. Els telòmers són les estructures que cobreixen els extrems dels cromosomes, i consisteixen en repeticions curtes terminals d’ADN. La seva funció és protegir el cromosoma contra els danys, mantenir la longitud normal de cada cromosoma i l’organització cel·lular, a causa de la seva associació amb la membrana nuclear i altres estructures. La pèrdua dels telòmers pot dur a translocacions, fusions o realineaments entre aquestes seccions del cromosoma. Cada vegada que una cèl·lula de l’organisme es reprodueix, el telòmer s’escurça. Com més s’escurci el telòmer, major és l’afectació en la forma d’expressió cel·lular i el resultat és l’envelliment cel·lular.

Com exemple, en la progèria els telòmers del nen al néixer tenen la longitud equivalent a una persona de 90 anys, en canvi en el síndrome de Werner tenen una longitud normal però s’escurcen més ràpidament que els telòmers normals. Així mateix, l’exposició excessiva al sol, les infeccions i les ferides, l’exposició a radiacions, l’estrès i el tabaquisme fan necessària una replicació cel·lular més ràpida, pel que s’accelera al seu torn la pèrdua dels telòmers.

A causa del escurçament telomèric es limita la capacitat de proliferació de les cèl·lules, això limitarà el nombre de divisions possibles i per tant condicionarà la durada de la seva vida (Rellotge telomèric).

Per tant, la capacitat de reparació de l'ADN al seu torn es correlacionarà positivament amb la longevitat de les diferents espècies. L'enzim telomerasa és capaç de compensar la pèrdua de l'ADN telomèric reconstruint la seva seqüència. Aquest enzim es troba principalment en les cèl·lules sexuals i en les canceroses.

Així, aquesta hipòtesi sosté que les cèl·lules potencialment immortals com les germinals i les cancerígenes mantenen l’activitat de la telomerasa i poden dividir-se indefinidament sense que els seus cromosomes s’escurcin. D’altre banda, les cèl·lules amb una expectativa de replicació limitada, poden no tenir activitat de telomerasa, i així el progressiu escurçament dels telòmers durant la divisió cel·lular pot servir com “un rellotge mitòtic”.

Segons els defensors d’aquesta teoria, aquest procés ocorre d’hora en l'embriogènesi, quan el gen que codifica la telomerasa és inactivada en les cèl·lules somàtiques. Així, encara que les manifestacions de l’envelliment es donen tardanament en la vida, els processos moleculars ocorren en etapes primerenques. Debatuda durant molt temps, per fi aquesta hipòtesi ha estat validada. La possibilitat de controlar el rellotge telomèric obre el camí cap a nous tractaments de les patologies relacionades amb la vellesa.

---------------------------------

3. Teories evolutives

Les bases lògiques de les teories evolutives es van establir a partir de 1950, un segle després que Darwin exposés la teroria de l'evolució biològica, degut al fet que durant aquest període el procés de l'envelliment es va considerar un fenomen misteriós i no relacionat amb la teoria clàssica de la selecció natural. Aquesta teoria, com és sabut, es fonamenta en la idea de la variació per l'atzar i per la transmissió hereditària d'aquells trets biològics que per selecció natural suposessin la reproducció preferent d'individus d'una espècie que resultessin més adequats enfront d'un determinat ambient. Per aquest motiu s'espera que s'obervi que l'evolució biològica actuï per a incrementar l'adaptació i el rendiment de les espècies evolucionades en successives generacions. La sanessencia i les malalties degeneratives de l'edat adulta no encaixarien en l'esperit inicial de la teoria darwiniana.

La problemàtica de l’evolució biològica de l’envelliment va ser estudiada inicialment en un plànol teòric i no experimental per nombrosos científics com A. Weismann en 1882, R. Fisher en 1930, P. Medawar en 1946, G. Williams en 1957, W. Hamilton en 1966 i B. Charlesworth en 1994.

La teoria evolutiva de l’envelliment podria considerar-se com part del procés d’evolució que expliqués com els organismes arriben a una reproducció adequada que eviti la seva extinció. Comparant unes espècies amb unes altres sorgeixen nombroses qüestions com per exemple: per que uns tenen una vida tan llarga i uns altres tan curta? o bé per què és necessari créixer, envellir i morir? Aquestes preguntes formen el centre de la teoria evolutiva de l’envelliment i són els temes prioritaris de la biodemografia de l’envelliment i de la longevitat. La seva contestació vindria donada per dues teories principals, la teoria de l’acumulació de mutacions i la teoria de la pliotropia antagònica, que es sintetitzen en:

a) La teoria de l’acumulació de mutacions suggereix que des d’un punt de vista evolutiu, l’envelliment és el resultat inevitable de la força decreixent de la selecció natural ocasionada per l’increment de l’edat. Les mutacions letals que es manifesten en individus joves, sofreixen una selecció natural en les espècies, mentre que aquelles altres d’aparició tardana, sobrepassada l’edat de procreació, s’anirien acumulant, produint a la llarga un increment de les taxes de mortalitat.

b) La teoria de la pliotropia antagònica suggereix que els gens amb efectes deletèries tardans poden veure's afavorits per la selecció natural, especialment si van tenir efectes beneficiosos primerencs.

Ambdues teories no s’exclouen mútuament i els mecanismes evolutius poden actuar simultàniament. La principal diferència entre elles radica que en la teoria de l’acumulació de mutacions els gens amb efectes negatius en l’edat adulta s’anirien acumulant d’una generació a una altra, mentre que en la teoria de la pliotropia antagònica aquests gens quedarien protegits dintre del genoma.

La denominació de pliotropia antagònica resulta ser un terme excessivament científic, pel que es va buscar un altre alternatiu que expliqués més senzillament per que un mateix gen pot tenir simultàniament efectes deletèries i beneficiosos. Per això es va proposar la teoria del “soma predisposat” o disponible que especula l’existència d’un tipus especial de gens amb efectes positius sobre la reproducció, però amb efectes negatius sobre les cèl·lules somàtiques de l’adult. Aquesta mateixa teoria havia rebut prèviament el terme de “l'error catastròfic” que en la seva forma original es limitava a considerar l’envelliment com resultat de la fallada de la síntesi proteica produït en les cèl·lules somàtiques. Aquesta teoria va ser àmpliament rebatuda, mentre que la teoria del soma predisposat va anar guanyant adeptes, a causa dels resultats de nous experiments sobre el paper del manteniment somàtic i de la reparació. Més recentment la teoria de la pliotropia antagònica ha rebut el nom de “pay later”, o pagui més tard, més d’acord amb el lèxic televisiu. Són de destacar certes investigacions que donen suport la teoria del soma predisposat, entre elles la teoria dels radicals lliures, la teoria mitocondrial, i la teoria de l’acumulació de deixalles, que més que teories són mecanismes relacionats amb l’edat.

En conclusió, existeix forta una evidència d’un control genètic del procés d’envelliment, tant en l’àmbit cel·lular com de l’organisme en la seva totalitat, però encara falten més estudis que analitzin la correlació entre aquest control genètic i els factors ambientals.

Factors determinants de l'envelliment Recurs

Per què envellim?

No existeix una teoria sobre l’envelliment que pugui explicar-lo completament.

Probablement envellir sigui la conseqüència d’una sèrie de factors, intrínsecs i extrínsecs, que interactuen sobre l’organisme al llarg del temps, i determinen finalment un debilitament de l’homeòstasi que culmina amb la mort. El procés d’envelliment seria el resultat de la interacció entre les noxes (agents nocius) que ataquen a l’organisme, i els mecanismes de defensa, tot això en un individu amb la seva càrrega genètica determinada.

GENESI MULTIFACTORIAL

ENVELLIMENT

Si bé és cert que l’envelliment és un procés universal, no ocorre de forma uniforme en els diferents individus d’una mateixa espècie, ni tampoc en els diferents òrgans d’una mateixa persona. És característicament heterogeni.

Encara falta molt per comprendre sobre procés d’envelliment i òbviament estem lluny de trobar la «fórmula de l’eterna joventut». Teòricament, la prolongació de la vida tindria un màxim determinat per la longevitat de cada espècie i sembla lògic afirmar que el secret de com perllongar la vida està en l’art d’aprendre com no escurçar-la.

En la pràctica, el que realment importa és l’edat funcional de la persona, i no la seva edat cronològica. És aquesta la qual va a indicar la seva capacitat d’autosuficiència per a les activitats del diari viure.

Més important que donar més anys a la vida, és donar més vida als anys, això és, al cap i al fi, augmentar la «qualitat de vida».

Genes/Interventions Database fitxer

http://sageke.sciencemag.org/highlights/gidb/

4. PROJECTE GENOMA HUMÀ I L'ERA DE LES CIÈNCES ÒMIQUES

"El ADN ni es preocupa de res ni sap gens. Simplement, és. I nosaltres ballem al so de la seva música". Richard Dawkins

Presentació del tema Recurs

El genoma és el conjunt de gens que caracteritzen a una espècie, és el responsable de que existeixin diferencies entre especies. Aquest podria comparar-se amb un text, i el que s’ha assolit amb el Genoma humà ha estat desxifrar el text complet, encara que sigui fragmentat.

En 2003, després d'anys d'investigacions de diversos bilions de dòlars, el Projecte Genoma Humà i Celera Genoma (una companyia no governamental de biotecnologia), conjuntament van anunciar la finalització del projecte Genoma Humà.

El genoma humà conté poc més de 30.000 gens (distribuïts entre els 23 parells de cromosomes), tot just 11.000 més que els d’un cuc, per tant està clar que no existeix una gran correlació entre la complexitat d’un organisme i la quantitat d'ADN que té. S’estima que la totalitat del genoma té 3.000 milions de parells de bases. L'ADN analitzat en el Projecte genoma humà procedeix en general de petites mostres de sang o de teixits obtingudes de persones diferents.

Encara que els gens del genoma de cada individu estan formats per seqüències d'ADN exclusives, s'estima que la variació mitja dels genomes de dues persones diferents és molt inferior al 1%. Per tant, les mostres d'ADN humà de diferents fonts presenten moltes més similituds que diferencies.

Un genoma duu la informació per a l’elaboració de totes les proteïnes requerides

per l’organisme, i les quals determinen l’aspecte, el funcionament, el metabolisme, la resistència a infeccions i altres malalties. En definitiva el genoma dirigeix el desenvolupament humà des de la fase d’òvul fecundat fins a la vida adulta. Cada cèl·lula del cos conté el genoma complet, però la diferència entre les unes i les altres cèl·lules es deu al fet que uns gens estan actius i uns altres no.

El coneixement de la seqüència de l’ADN humà suposa una potent eina per a la investigació de malalties poc conegudes, per a desenvolupar nous tractaments i per a millorar els diagnòstics. Però també inclou l’ús de teràpies gèniques per a suplir característiques físiques que no signifiquen la prevenció o curació d’una malaltia, seleccionar els éssers per a la perfecció, atemptaria contra la diversitat biològica.

La finalització del projecte Genoma Humà va demostrar que existeixen un número relativament limitat de gens que puguin explicar la totalitat dels complexos processos biològics humans. Aquesta investigació va permetre acabar de subratllar que hi ha altres nivells de regulació a part de la senzilla seqüència de l’ADN Amb aquesta idea, cada cop més, s’està passant de l’estudi de molècules aïllades a l’anàlisi ampli de col·leccions de molècules. Les ciències òmiques s’encarreguen d’investigar el conjunt de molècules en els seus diferents àmbits d’estudi.

L'era "òmica" i el genoma humà fitxer

El Proyecto Genoma Introducción

El desarrollo y financiación en los últimos años de un gran número de proyectos de secuenciación masiva, de entre los cuales cabe destacar el Proyecto Genoma Humano, ha motivado el perfeccionamiento y desarrollo de nuevas técnicas tanto en el campo de la biología como en el campo de la bioinformática. Los avances logrados en estás áreas han abierto la puerta a una nueva mentalidad en la que se desarrolla una visión global de los procesos biológicos. Este concepto de globalización, se ve reflejado en el desarrollo de lo que se ha denominado como “La era –Ómica”. El sufijo “-oma” tiene un origen latino, que significa “conjunto de” es por tanto que la adición de este sufijo a diferentes estudios en biología cubre las nuevas aproximaciones masivas en las que se está enfocando la biología recientemente.

Pese a la proliferación de ciencias “-ómicas” (desde la genómica y proteómica hasta la fisionómica, o metabolómica) se puede considerar el origen de este nuevo paradigma de investigación, el desarrollo de técnicas para la obtención de información masiva necesaria para la obtención de la secuencia completa del ADN de un organismo, también conocida como GENOMA (“conjunto de genes”). La genómica surgió por tanto como la rama de la biología encargada del estudio de los genoma

Los avances logrados en las técnicas de secuenciación a finales del pasado siglo, permitieron el abordaje de estudios masivos de secuenciación dirigidos a la elucidación de la secuencia completa del ADN de diferentes organismos. Debido al tamaño y complejidad de este tipo de proyectos, el primer genoma completo obtenido fue el de una bacteria (Heamophilus influenzae) que fue publicado en julio de 1995, (Science269,496-512). Después de este gran éxito continuaron publicándose los genomas de otros procariotas hasta que en Mayo de 1997 se publico el genoma completo de Saccharomyzes cerevisiae, el primer eucariota totalmente secuenciado (Nature387,5-105) y posteriormente en el año 1998, se publicaba por primera vez el genoma de un organismo multicelular, el nemátodo C. elegans (Science282,2012-2018).

Durante todo este tiempo se venía trabajando en proyecto de una mayor complejidad, el Proyecto Genoma Humano. Iniciado en el año 1990 mediante un consorcio internacional que agrupaba a más de 20 centros de diferentes países, el objetivo de este proyecto era la secuenciación completa del genoma humano y ponerlo a disposición de la comunidad científica internacional. Este proyecto ha sido comparado en numerosas ocasiones por su complejidad con el programa Apolo que llevó al ser humano a la Luna. Posteriormente se unió a la carrera una

iniciativa privada liderada por C. Venter y la empresa Celera.

El primer borrador del genoma humano fue publicado en el año 2001 (Nature409,860-921), pero el punto culminante de esta aventura se alcanzó cuando en el año 2003 y coincidiendo con el 50 aniversario de la publicación de la estructura del ADN se publicaron los resultados de los dos proyectos Genoma Humano que se habían desarrollado. El Proyecto Genoma Humano original y desarrollado por un consorcio internacional publico sus resultados en la revista Nature, mientras que la iniciativa de celera hizo públicos sus resultados en Science.

Algunos datos interesantes acerca de los resultados obtenidos por el Proyecto Genoma Humano son los siguientes::

El ser humano tiene solo el doble de genes que la mosca del vinagre, un tercio más que el gusano común y apenas 5.000 genes más que la planta Arabidopsis. El ADN humano es al menos en un 98% idéntico al de los chimpancés y otros primates.

3200 millones de pares de bases forman genes, repartidos entre los 23 pares de cromosomas. Los cromosomas más densos (con más genes codificadores de proteínas) son el 17, 19 y el 22. Los cromosomas X, Y, 4, 18 y 123 son los más áridos.

El equipo de Celera Genomics utilizó para secuenciar el genoma humano muestras de ADN de tres mujeres y dos hombres (un afroamericano, un chino, un asiático, un hispanomexicano y un caucasiano). El equipo de Celera utilizo DNA perteneciente a doce personas. Cada persona comparte un 99,99 % del mismo código genético con el resto de los seres humanos. Sólo 1.250 letras separan una persona de otra.

Hasta ahora se han encontrado 223 genes humanos que resultan similares a los genes bacterianos.

Sólo un 5 % del genoma codifica proteínas. El 25% del genoma humano está casi desierto, existiendo largos espacios libres entre un gen y otro.

Se calcula que existen unas 250-300.000 proteínas distintas. Por tanto cada gen podría estar implicado por término medio en la síntesis de unas diez proteínas.

Algo más del 35% del genoma contiene secuencias repetidas, lo que se conoce como DNA basura.

Se han identificado un número muy elevado de pequeñas variaciones en los genes que se conocen como polimorfismos nucleótidos únicos (SNP). La mayoría de ellos no tienen un efecto clínico concreto pero de ellos depende, por ejemplo, el que una persona sea sensible o no a un determinado fármaco o la predisposición a sufrir una determinada enfermedad.

La gran magnitud de la información a manejar se incrementa teniendo en cuenta que para llegar a reconocer dónde comienzan y terminan los genes e identificar sus exones, intrones y secuencias reguladoras se requieren comparaciones

entre secuencias de diversas especies (Genómica comparativa). El mapa de secuencias generado por el proyecto se está utilizando como fuente primaria de información para la biología humana y la medicina. El proyecto público liderado

por el Gobierno de Estados Unidos y varios europeos ha introducido toda la información en una base de datos de acceso gratuito. El aprovechamiento de toda la información exigirá una importante inversión porque la nueva era de la genómica

requiere complejas y costosas herramientas.

La conclusión de diferentes proyectos genoma ha proporcionado una gran cantidad de información a los investigadores, pero también ha abierto las puertas a nuevos interrogantes, como son los procesos de regulación de la expresión de los genes o la caracterización de las diferencias a nivel de genoma entre los diferentes individuos de una misma especie y de que manera las más sutiles alteraciones de cada una de estas operaciones predisponen a cada individuo a una enfermedad. El entendimiento de cómo las variantes genéticas regulan el fenotipo de células, tejidos y órganos ocupará

la investigación del siglo XXI. Se calcula que existen unas 8.000 enfermedades hereditarias, pero hoy sólo se pueden detectar unas 200 antes del nacimiento y existen test genéticos para otros pocos centenares.

Para dar respuesta a estas preguntas que están más allá de los estudios genómicos se ha desarrollado lo que se conoce como “Post-Genómica” . Dentro de esta categoría “Post-Genómica” se puede incluir la genómica comparativa, la genómica individual, la proteómica y la transcriptómica entre otras. El desarrollo de todo este tipo de aproximaciones está inspirado en los estudios genómicos y en la posibilidad de contar con herramientas y tecnologías que permitan y soporten el desarrollo de abordajes masivos propios de las aproximaciones “-Ómicas”. Ha sido en este ambiente en el que las micromatrices de material biológico, microarrays o biochips han sido desarrollados, como una herramienta más para el análisis y obtención masiva de información biológica.

Genómica funcional. La Era Post-Genómica.

Si la genómica estructural es la rama de la genómica orientada a la caracterización y localización de las secuencias que conforman el DNA de los genes, permitiendo de esta manera la obtención de mapas genéticos de los organismos, la genómica funcional es la disciplina que se orienta hacia la recolección sistemática de información acerca de las funciones desempeñadas por los genes. Para llevar a cabo este trabajo se requiere la información procedente de la genómica estructural. Las metodologías experimentales empleadas han de combinarse con estudios computacionales de los resultados debido al gran volumen de información que se genera durante los estudios realizados a gran escala.

Con la genómica funcional el objetivo es llenar el hueco existente entre el conocimiento de las secuencias de un gen y su función, para de esta manera desvelar el comportamiento de los sistemas biológicos. Se trata de expandir el alcance de la investigación biológica desde el estudio de genes o proteínas individuales al estudio de todos los genes y proteínas al mismo tiempo en un momento determinado.

5. GENÒMICA I TRANSCRIPTÒMICA

"Abans pensàvem que el nostre futur estava en les estrelles. Ara sabem que està en els nostres gens". James Watson

Presentació del tema Recurs

Amb l’arribada de la genètica moderna s’ha vist que els diversos gens que poden regular i determinar l’envelliment s’associen amb una varietat de funcions que sovint abasten les diferents hipòtesis de l’envelliment. La Genòmica és la ciència encarregada de l’estudi global del genoma (conjunt de gens i els seus processos). El camp de la genòmica es divideix en Genotipificació (centrada en la seqüència del genoma), Transcriptòmica (centrada en l’expressió del genoma) i la Epigenòmica (centrada en la regulació epigenètica de l’expressió del genoma).

La genòmica s’ha desenvolupat com a conseqüència dels avanços en Biologia Molecular i Informàtica. La introducció i popularització de les tecnologies d’alt processament ha canviat dràsticament la manera que s’aborden els problemes biològics i es proven les hipòtesis.

Genotipificació Recurs

L’estudi científic del genoma comença amb la seqüenciació de l’ADN. Després aquesta seqüència és emprada per a identificar quins fragments o zones corresponen a gens i quina és la funció de cada gen. Aquesta informació permet generar l’estructura tridimensional de les proteïnes, i així tenir algun indici sobre les seves funcions. Així la genòmica estructural està orientada a la caracterització i localització de les seqüències que conformen l’ADN dels gens permetent d’aquesta manera l’obtenció de mapes genètics.

1. Extracció ADN.

El primer pas per a la seqüenciació de l’ADN és l'extracció d'ADN. L’extracció d'ADN requereix una sèrie d’etapes bàsiques. En primer lloc han de trencar-se la paret cel·lular i la membrana plasmàtica per a poder accedir al nucli de la cèl·lula. A continuació ha de trencar-se també la membrana nuclear per a deixar lliure l’ADN. Finalment cal protegir l’ADN d’enzims que puguin degradar-lo i per a aïllar-lo cal fer que precipiti en alcohol. Actualment existeix diversos kits o assajos comercials per a l’extracció d'ADN humà de mostres biològiques de qualsevol tipus. Sang, saliva, semen, teixits, ossos, restes biològics sobre roba i altres materials.

2. Amplificació de l’ADN o PCR

¿Com funciona la PCR?

Primer pas: S’escalfa la plantilla.

S’escalfa un tros llarg d’ADN que contingui el petit fragment que ha de ser copiat. Els dues cadenes poden ser separades una de l'altra escalfant-les a elevades temperatures (i tornarien a unir-se lentament si es deixés refredar: "annealing"). Les dues cadenes ara separades són complementaris una de l’altra, i serveixen de plantilles o models per a què cadascuna sintetitzi una nova cadena.

Segon pas: S’afegeixen els «iniciadors o encebadors» ("primers")

Per al pròxim pas es precisa un element anomenat «iniciador» o “encebador”. Els encebadors són nucleòtids que constitueixen una curta seqüència de la nova cadena. Els encebadors estan dissenyats per a ser complementaris d’una seqüència coneguda que és part d’una altra més llarga, i així es sap en quin lloc de les seqüències llargues s’uniran (o hibridaran) aquests encebadors.

Els encebadors s’enganxen als extrems del segment d'ADN que ha de ser copiat. Els encebadors serveixen per a dues coses:

1. per a marcar els extrems del segment diana, de manera que solament aquest segment serà ampliat i no tota la cadena, i

2. iniciar el procés de duplicació. Les noves cadenas es construeixen bloc a bloc, nucleòtid a nucleòtid, per l’acció d’un enzim especial anomenat ADN-polimerasa. El treball d’aquesta polimerasa és construir una nova cadena d'ADN paral·lelament a l’altra cadena ja existent. La polimerasa no funciona si la cadena antiga (plantilla o model) no s’ha unit ja alguns nucleòtids (precisament l'encebedor) formant una curta seqüència de la nova cadena. En la naturalesa, quan es duplica el propi ADN d'una persona, un altre enzim anomenat ADN-primasa construeix l'encebador en les dues cadenas antigues o originals.

Una cop la polimerasa està en marxa, repta al llarg de la cadena d'ADN (la plantilla) afegint a l'encebador els nucleòtids complementaris. L'encebador acaba essent part (justament la part inicial) de la nova cadena formada. En la naturalesa, les polimerases separen les cadenas d'ADN al mateix temps que van construint la nova cadena d'ADN. Així és com les còpies duplicades d'ADN són formades, de manera que les cèl·lules (com les de la sang o les de la pell) puguin dividir-se donant lloc a noves cèl·lules, procés aquest essencial per a la vida.

Tercer pas: Amplificació Repetim el mateix procés: escalfem per a separar els dos dobles segments i convertir-los en quatre simples, afegim més encebadors i nucleòtids, i deixem refredar de nou. L’enzim polimerasa copia l'ADN començant pel l'encebador, que serveix per a fer una nova còpia de cada segment diana. Al final tindrem quatre fragments dobles de l'ADN que volem multiplicar.

Aquest procés es repeteix unes 30 o 40 vegades. Durant cada cicle, es dobla la quantitat de segments, de manera que dos segments es tornen quatre, aquests quatre segments es tornen vuit, després setze, etc. Al final del procés es poden haver fet milers de milions de còpies de l’original. Ara es té una gran acumulació d'ADN, quan al principi només es tenia una molt petita quantitat. Per això es diu de la PCR que és capaç de «trobar una agulla en un paller».

3. Seqüenciació de l’ADN o fragments d’ADN

La seqüenciació d'ADN és el procés pel qual s’estableix l’ordre precís de les bases al llarg d’una cadena d'ADN. Això es fa comunament al sotmetre els fragments d'ADN a electroforesis en gel, la qual cosa duu a la separació de l'ADN en fragments que difereixen en grandària només per una base. Depenent de la grandària de l'amplificació i la resolució que es desitja s'utilitza diferents tipus de gels (agarosa, poliacrilamida) a diferents concentracions.

3.1. Electroforesi

El fonament de l’electroforesi és basa en que quan una barreja de molècules ionitzades i amb càrrega neta són col·locades en un camp elèctric, aquestes experimenten una força d’atracció cap al pol que posseeix càrrega oposada. Deixant transcórrer cert temps les molècules carregades positivament es desplacessin cap al càtode (el pol negatiu) i aquelles carregades negativament es desplacen cap a l’ànode (el pol positiu).

El moviment de les molècules està governat també per dues forces addicionals: la fricció amb la solució com a força que s’oposa al moviment de les molècules i la energia cinètica pròpia de les molècules. Aquesta energia augmenta amb la temperatura, per això a major temperatura major difusió. La suma de totes aquestes forces provoca que les molècules no migren d’una manera homogènia, de tal manera que, si les molècules són col·locades en un cert lloc de solució, els ions començaran a moure’s formant un front, l’amplària del qual augmentarà amb el temps.

Per a reduir l’amplària d’aquest front podem reduir el moviment de les molècules emprant un mitjà que oposi mes resistència a aquest moviment. Una forma comuna de fer això és formar un gel. El gel consisteix d’un polímer soluble de molt alt pes molecular que atrapa molècules d’aigua i forma un tamís que dificulta el moviment dels soluts, conseqüentment, la migració electroforètica de les molècules serà mes lenta, però l’eixamplament del front es vora reduït també.

L'agarosa és un polisacàrid amb dissolucions (típicament de 0.5 a 2 %) que poseeixen la propietat de romandre liquides per sobre de 50º C i formar un gel, semisólid al refredar-se. Aquest gel esta constituït per una matriu o trama tridimensional de fibres polimèriques embeguda en gran quantitat de mitjà líquid, que alenteix el pas de les molècules, i s’usa usualment per a separar molècules grans d'alt voltant 20.000 nucleòtids. Els gels de poliacrilamida es formen per polimerització de l'acrilamida per acció d'un agent entrecreuant, és químicament inert, de propietats uniformes, capaç de ser preparat de forma ràpida i reproductible. A més, forma gels transparents amb estabilitat mecànica, són insolubes en aigua, relativament no iònics i que permeten bona visualització de les bandes durant un temps perllongat. A més té l'avantatge que variant la concentració de polímers és pot modificar de manera controlada la grandària dels porus. Lamentablement cada vegada s'empra menys en diagnostic a causa de la seva neruotoxicitat.

L’ús de gels de poliacrilamida que tenen un gradient creixent de concentració de acrilamida + bisacrilamida, i en conseqüència un gradient decreixent en la grandària del porus, poden tenir avantatges sobre els gels de concentracions uniformes de acrilamida. Una dels avantatges d’aquest tipus de gels és que resol

millor les bandes ja que les concentra en regions mes estretes, a més d’incrementar el rang de pesos moleculars que es poden resoldre en un mateix gel comparat amb els d’una concentració fixa.

L’electroforesi capil·lar es basa en els mateixos principis de les tècniques electroforètiques convencionals, però utilitza condicions i tecnologia diferent, que ens permet obtenir una sèrie d’avantatges. La separació es realitza sobre un capil·lar de sílice fos a potencials elevats de 20 a 30 Kv en un camp de 400 a 500 v/cm refrigerats per aire. El corrent electroendosmotic generat pels grups silanol de la superfície interna del capil·lar dóna com resultat un corrent pla del front del líquid. L’avantatge d’aquesta tècnica és que el capil·lar de sílice fos que generalment es cobreix amb una capa de polimina per a donar-li major rigidesa i resistència, té l’avantatge de permetre el pas de la llum UV de tal manera que la visualització és on-line. Amb aquesta tècnica és possible separar cations, anions, proteïnes, macromolècules i substàncies no carregades en forma simultània.

La tècnica de isoelectroenfoc es basa en el desplaçament de les molècules en un gradient de pH. Les molècules amfotèriques, com els aminoàcids, es separen en un mitjà en el qual existeix una diferència de potencial i un gradient de pH. La regió de l’ànode és àcida i la del càtode és alcalina. Entre ambdós s’estableix un gradient de pH tal que les molècules que s’han de separar tinguin el seu punt isoelèctric dintre del rang. Les substàncies que inicialment es troben en regions de pH inferior al seu punt isoelèctric estaran carregades positivament i migraran cap al càtode, mentre aquelles que es troben en regions de pH superior al seu punt isoelèctric tindran càrrega negativa i migraran cap a l'ànode. Així que la migració conduirà les substàncies en una regió on el pH coincidirà amb el seu punt isoelètric, tindran una càrrega neta nul·la i es detindran. D’aquesta forma les molècules amfotériques se situen en estretes bandes on coincideix el seu punt isoelèctric amb el pH.

L'electroforesi bidimensional es basa a separar les proteïnes en una barreja segons dues propietats moleculars seves, una en cada dimensió. El procediment més usat es basa en la separació en una primera dimensió mitjançant isoelectroenfoc i la segona dimensió segons pes molecular mitjançant electroforesi en poliacrilamida.

L'electroforesi és una tècnica molt sensible i pot ser afectada per molts errors experimentals, com la temperatura durant la polimerització i la correguda del gel, velocitat de la polimerització, nivells de catalitzador, puresa del reactiu, temps de correguda i preparació de les mostres.3.2. Seqüenciació

Cada fragment d'ADN es detecta a causa de la presència d'un marcador radioactiu o fluorescent (o de plata). Els instruments usats més comunament per a establir les seqüències d'ADN empren ara un raig làser per a detectar l'ADN fluorescent. A partir del patró dels fragments d'ADN resultants es pot deduir la seqüència subjacent de l'ADN.

Actualment els mètodes més utilitzats per a obtenir la seqüència de nucleòtids de l’ADN són el mètode químic de Maxam i Gilbert, el mètode enzimàtic de terminació de cadena de Sanger també conegut pel mètode didesoxi i el mètode de seqüenciació automàtica.

Els dos protocols clàssics de seqüenciació (mètode químic i enzimàtic) comparteixen etapes comunes: 1) és necessari marcar les molècules a seqüenciar de forma radioactiva o amb fluorescència, 2) cada protocol genera una sèrie de cadenes senzilles d'ADN marcades, les grandàries de les quals es diferencien en una única base. Aquestes cadenes de diferents longituds poden separar-se per electroforesis en gels desnaturalitzats d'acrilamida-bisacrilamida-urea, on apareixen com una escala de bandes la longitud de les quals varia en un únic nucleòtid.

Mètode químic de Maxam y Gilbert

Originalment descrit per A. Maxam y W. Gilbert en 1977.

Un fragment d'ADN es marca radioactivament en els seus extrems amb gamma 32P o gamma 32S d'ATP per acció de la polinucleòtid quinasa. La tècnica consisteix a trencar aquestes molècules marcades amb reaccions químiques específiques per a cadascuna de les quatre bases. Quatre alíquotes de la mateixa mostra es tracten sota condicions diferents, posteriorment el tractament amb piperidina trenca la molècula d'ADN a nivell de la base modificada. Els productes d’aquestes quatre reaccions es resolen en funció de la seva grandària en gels de poliacrilamida on la seqüència pot llegir-se sobre la base del patró de bandes radioactives obtingudes. Aquesta tècnica permet la lectura d'unes 100 bases de seqüència.

Mètode enzimàtic de Sanger

El mètode està basat en l’ús de didesoxinucleòtids (ddNTP) que es diferencien dels desoxinucleòtids (dNTP) que manquen del grup OH en el carboni 3' de la ribosa. És en el grup OH en posició 3' on s’incorpora el següent nucleòtid de la cadena que s’està sintetitzant, formant un enllaç éster entre el 3' OH i el 5' OH del nou. Al no existir en els ddNTP el grup OH en 3', no permet la incorporació d’un nou nucleòtid i la replicació es paralitza.

En la tècnica es parteix d'ADN bicatenari que es vol seqüenciar, prèviament aïllat i amplificat per la tècnica de PCR. L'ADN es reparteix en 4 tubs, els quals a més contenen: 1) la Taq polimerasa, que és l’enzim que realitza la replicació de l’ADN, 2) els quatre tipus de deoxinucleòtids (A,G,T,C) un d’ells ha estat marcat amb 32P o 35S, 3) i un cebador que actua com substrat de l’ADN polimerasa. L'encebador és un oligonucleòtid sintètic d’unes 17-20 bases complementari de la cadena d'ADN que es vol seqüenciar i està situat a unes 20-30 bases de distància del començament de la seqüència que es vol llegir.

El mètode consisteix a afegir a cada tub una petita quantitat de cadascun dels ddNTP que manquen d’extrem 3'OH lliure. La incorporació a l’atzar d'un ddNTP en competició amb el dNTP corresponent, implica la formació d'una barreja de cadenes de diferents

longituds, totes elles començant en l’extrem 5´ i acabant en totes les diferents posicions possibles on un ddNTP pot incorporar-se en lloc d'un dNTP.

La substitució d'un dels dNTPs pel mateix nucleòtid marcat radioactivament permet la visualització, per autoradiografia de les bandes de diferent longitud en un gel de poliacrilamida on cadascuna de les reaccions es carrega en un carril. En el gel la separació de les diferents bandes es produeix en funció de la seva grandària i la seqüència pot determinar-se llegint les bandes dels quatre carrils. En aquest tipus de gels poden llegir-se fins a 300 bases.

Secuenciaciò automàtica

Consisteix a marcar el oligo encebador o els terminadors amb un compost fluorescent i activar la reacció de seqüència. Els productes de la reacció es detecten directament durant l'electroforesi al passar per davant d'un làser que a excitar els fluorofors permet detectar la fluorescència emesa.

La principal diferència entre el mètode enzimàtic de terminació de cadena i el mètode automàtic de seqüenciació radica, en primer lloc en el tipus de marcatge. En el mètode automàtic en comptes de radioactivitat s’utilitza fluorescència i l'habitual és realitzar quatre barreges de reacció, cadascuna amb nucleòtid trifosfat (dTTP) marcat amb un fluorocrom diferent. Al finalitzar les quatre reaccions es barregen en un únic tub. Aquest sistema permet automatitzar el procés de manera que és possible llegir al mateix temps els ADNs de nova síntesi producte de les quatre barreges de reacció.

La segona diferència radica en el sistema de detecció dels fragments d'ADN. La detecció del tipus de fluorescència corresponent a cada reacció es porta a terme al mateix temps que l’electroforesi, de manera que els fragments d'ADN de menor grandària que ja han estat detectats es deixen escapar del gel, permetent aquest sistema augmentar el nombre de nucleòtids que es poden determinar en cada electroforesi i, per tant, en cada seqüenciació.

Sequenciadors automàtics (ABI PRISM 310).

Els instruments d'electroforesi capil·lar proporcionen una alternativa clara al sistema basat en gels d'acrilamia/bisacrilamidaà on aquest suport ha estat substituït per un polimer que s'injecta de forma automàtica en un capil·lar abans de carregar la mostra de seqüenciació; les mostres es van analitzant una a una. Aquest tipus de sequenciadors s'utilitzen per a lectures no superios a uns 450pb. L'equip funciona de forma completament automàtica injectant les mostres (que es preparen exactament igual que durant la seqüenciació en gels i es col·loquen en un placa de 96 pous), en un capil·lar prèviament carregat amb un cert polímer que funciona com ho fa la matriu d'acrilamida/bisacrilamida/urea en els gels de seqüènciació, permetent resoldre fragments d'ADN de cadena senzilla que es diferencien en una única base. A una altura determinada el laser detecta la fluorescència emesa per cada cadena senzilla d'ADN fluorescent i tradueix aquest emissió de fluorescència en la seqüència corresponent. Una vegada desenvolupada l'electofores de la primera mostra, el capil·lar es buida emplenant-lo novament amb polímer fresc.

4. PCR cuantitativa o PCR a temps real.

Aquesta tècnica està basada en la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) i

s’usa per a amplificar i al mateix temps quantificar molècules d'ADN o ADN complementari (ADNc) específiques. Una de les més importants avantatges de la PCR a temps real és que el procés complet es realitza en el termociclador.

En la PCR a temps real s’empren sondes marcades amb fluorocroms. El procés es basa en la transferència d’energia fluorescent mitjançant ressonància entre dues molècules. Les més utilitzades són les sondes d’hidròlisis, denominades també sondes TaqMan, les sondes moleculars Beacons i les sondes FRET.

Les sondes d’hidròlisi, freqüentment emprades en aquesta tècnica, són oligonucleòtids que presenten fluorocroms en ambdós extrems i tenen una seqüència complementària a part del fragment d'ADN que es vol amplificar. Un dels fluorocroms actua com donador de fluorescència en l’extrem 5’ i l’altre com acceptor d’aquesta fluorescència en l’extrem 3’. L'ADN polimerasa es desplaça sobre la cadena d'ADN sintetitzant la cadena complementària a partir d’un fragment d'ADN que serveix de motlle (encebador).

Arribat a l’instant en el qual la sonda s’ha hibridat, la hidrolitza. El fluorocrom de l’extrem 5’ de la sonda (el donador) és alliberat. El fluorocrom acceptor no pot llavors absorbir la fluorescència del donador per estar allunyat d’ells espacialment.

Les sondes beacons son molt similars a les anteriors però presenten una estructura secundària de nansa, en la qual resideix la seqüència d’unió especifica amb l'ADN diana. Els extrems romanen plegats quan la sonda no està hibridada, el que comporta que donador i acceptor estiguin molt a prop una de l'altre. En aquesta conformació la fluorescència emesa pel donador és absorbida per l'acceptor i no és captada pel lector de l'equip.

No obtant això, a l'hibridar amb l'ADN diana la sonda s'obre, allunyant-se donador i acceptor, podent ser detectada la fluorescència emesa pel primer.

El sistema FRET es compon de 2 sondes que s’uneixen a seqüències adjacents de l'ADN diana. Una de les sondes duu un donador en l'extrem 3' i l'altre un acceptor a l'extrem 5'. Quan les sondes estan hibridades, els dos fluorocroms estan pròxims. Al ser excitat, el donador transfereix la seva energia a l'acceptor que, al seu torn, emet la fluorescència que detecta el lector de l'equip.

El termociclador té capacitat d’incidir sobre cada mostra un feix de llum d’una longitud d’ona determinada i detectar la fluorescència emesa pel fluorocrom excitat. Un detector realitza la mesura d’aquesta emissió de fluorescència, que és proporcional a la quantitat d'ADN present, i la representa gràficament. A més de proporcionar informació quantitativa, la PCR a temps real presenta una sèrie

d’avantatges enfront de la PCR tradicional. La fonamental és la seva major sensibilitat el que disminueix el risc de falsos negatius. El fet que les dades siguin preses en la fase exponencial del procés assegura que cap component pugui estar limitant el procés d’amplificació. També és més ràpida i té menys probabilitat de contaminació, amb el que disminueixen els falsos positius. Són moltes les aplicacions d’aquesta tècnica en el camp de la medicina. Cal destacar la quantificació viral, la quantificació de l’expressió de gens, el control de l’eficàcia de fàrmacs, la detecció d’agents infecciosos, el diagnòstic de tumors i la detecció de polimorfismes.

5. Southern blot

Hi a diferents tècniques que empren la separació en gel per electroforesi com primer pas per a identificar la presència de determinades "molècules" dintre d’una mostra. Una d’elles va ser inventada per Edward M. Southern en 1975 per a la detecció d'ADN.

La tecnica de Southern blot és una tècnica emprada per a detectar seqüències específiques d'ADN. Per a portar a terme hibridacions d’aquest tipus, s’aïlla l'ADN d’un teixit o línia cel·lular, després es purifica, i es digereix amb enzims de restricció específics. Els fragments generats es separen mitjançant electroforesi i

després són transferits a la membrana que serveix de suport (gel de agarosa). Aquest procés es porta a terme col·locant el gel de agarosa sobre paper filtre prèviament remullat en una solució anomenada de transferència (solució salina concentrada). A continuació es situa la membrana sobre el gel i damunt d'aquesta una pila de paper de filtre sec, i per capil·laritat la solució de transferència és atreta a la pila de paper filtre, arrossegant amb si l'ADN cap a la membrana, on queda immobilitzat conservant la mateixa posició relativa que ocupava en el gel. Després, l'ADN pot ser hibridat en la membrana amb una sonda marcada.

Degut al fet que la transferència de l'ADN del gel a la membrana es produeix per capil·laritat, amb el mateix principi utilitzat durant anys per a netejar taques amb paper assecant, el procés es coneix en anglès com blotting; Southern va proposar utilitzar el terme blot (assecat) o blotting per a referir-se a aquesta tècnica i actualment es coneix com Southern blot (Comprat & Gamba, 1997).

6. Altres tipus de PCR

La PCR estandard pot ser acompanyada d’altres tecniques i variacions de la mateixa com és: DOP-PCR, REP-PCR, RFLP-FCR, Nested-PCR, PCR-SSPS, in situ PCR, Megaprimer-PCR etc..... No s’explicara aquestes tecniques en aquest curs.

Transcriptòmica Recurs

La transcriptòmica estudia i compara transcriptomes que són els conjunts de transcriptors (RNAs) presents en una cèl·lula, teixit o organisme com són els ARNm, RNAr, RNAt, RNAs (RNAnc). Els transcriptòmes són molt variables, ja que mostren quins gens s’estan expressant en un moment donat. Existeixen diferents aproximacions per a determinar i quantificar l'expressió dels transcriptòmes entre les quals hi ha:

1. Northern Blot

És una variant del Southern blot en el qual en lloc d'utilitzar ADN com substrat d'estudi, s'empra ARN. El procediment que es segueix és similar al Southern blot. Aquesta tècnica s'ha aplicat en anàlisis de mutations i alteracions de ARNm d'enzims, i en la regulació de l'expressió génica de marcadors moleculars neoplàstics i molècules del reconeixement immunològic.

2. Microarrays

Com la genòmica, la transcriptòmica es val de la bioinformàtica i les micromatrius (microarray en anglès). El mètode permet l’anàlisi simultània de l’expressió de milers de gens. La idea bàsica de les micromatrices és construir, sobre una membrana o làmina de vidre, arranjaments de mostres que contenen fragments d'ADN. D'altra banda es marca l'ARN o l'ADN còpia (cDNA) d'una població cel·lular amb fluorescència o radioactivitat, i s’usa aquesta preparació per a hibridar amb l'ADN de la micromatriu. Generalment es hibrida simultàniament la mateixa micromatriu amb una mostra d'ARN o ADN còpia de referència, per a facilitar la comparança.

<object id="ieooui" classid="clsid:38481807-CA0E-42D2-BF39-B33AF135CC4D"> </object >

<object id="ieooui" classid="clsid:38481807-CA0E-42D2-BF39-B33AF135CC4D"> Així els microarrays d'ADN consten de milers de conjunts ordenats de molècules d'ADN de seqüència coneguda dipositats en un soporte sòlid com a cristall, niló o silici. Permeten la mesura simultània dels nivells d’expressió de milers de gens (sondes) en un sol experiment

d’hibridació amb una barreja d'ADN o RNA (dianes). Els microarrays d'ADN estan formats per 100-1 milions de sondes d'ADN sobre una superfície de 1 cm per 1 cm (chip d'ADN). Permeten medir el nivell de transcrits (ARNm) d’un gran nombre de gens simultàniament per a determinar quins gens s’estan expressant en la cèl·lula. Si l'ADN i l'ARN hibridat està marcat fluorescentment pot ser quantificat mitjançant escanejat del chip. </object >

Els microarrays poden ser dividits en dos tipus principals, els quals difereixen en la seva construcció i en el nombre de condicions que es poden monitorar en cada cas:

• cDNA : Stanford Microarrays (arrays de cDNA) .

• cRNA : Affymetrix (arrays d'oligonucleotids) .

2.1. Metode Stanford

En el mètode Stanford , la mostra del test es marca en verd (Cy 3) i la mostra control en vermell (Cy 5).

Les mostres hibridades sobre la micromatriu s’il·luminen successivament amb llum làser de dos colors diferents per a estimular la fluorescència d’un o altre fluorocrom. La quantitat de ARNm unit a una mostra es pot medir per la intensitat de la fluorescència emesa al ser il·luminada pel làser del color corresponent.

Per a la detecció es considera que si la mostra 1 es marca amb vermell i la mostra 2 amb verd s'obtindrà en cada punt de la micromatriu que:

- Si l'ARN de la mostra 1 abunda més que el de l'altra mostra es detecta com un punt vermell.

- Si l'ARN de la mostra 2 abunda més que el de l'altra mostra es detecta com un punt verd.

- Si ambdós s'excpressen per igual es detecta com un punt groc.

- Si en cap de les dues mostres hi ha mRNA es detecta com un punt negre.

Epigenòmica Recurs

6. PROTEÒMICA

"És paradoxal que la idea de viure una vida llarga crida a cadascun. Però la idea d'envellir no crida a ningú." Andy Rooney

Presentació del tema RecursLa proteomica o “genómica funcional” Recurs

7. METABOLÒMICA

"Tot el món desitja viure molt temps, però ningú voldria ser vell." Jonathan Swift.

Presentació del tema RecursMetabolomes i metabòlits Recurs

8. CIÈNCIES ÒMIQUES I ENVELLIMENT

"Envellir és encara l'únic mitjà que s'hagi trobat de viure molt temps." Charles Augustin Sainte Beuve.

Presentació del tema RecursVisions òmiques actuals sobre envelliment RecursA current genetic and epigenetic view PDFThe evolutionary theories of aging