1

III - Informació Genètica Tema 17: Els àcids nucleics Estructura del DNA. Organització del DNA procariota i eucariota. Tipus de RNA, nivells d'estructuració.

Anell de ribosa o 2-desoxiribosa (RNA/DNA), els carbonis s’anomenen amb ‘. Grup fosfat

Citosina (DNA/RNA) Timina (DNA)

Pirimidíniques

Uracil (RNA) Adenina (DNA/RNA)

Estructura nucleòtids

Base nitrogenada

Púriques Guanina (DNA/RNA)

Estructura d’un nucleòtid

Esquelet de les bases nitrogenades

Els àcids nucleics són macromolècules d’aspecte filamentós, i amb un nombre important de ribonucleòtids o de desoxiribonucleòtids, segons es tracti de RNA o de DNA. - Estructura primària dels àcids nuclèics: està formada per la seqüència de nucleòtids. L’esquelet de riboses o desoxiriboses estan unides entre si per enllaços fosfodiéster entre el grup hidroxi en 3’ amb el 5’ del nucleòtid adjacent. Als extrems 5’ hi trobem un grup fosfat lliure i en el 3’, un grup hidroxi lliure. Per convenció anomenen i ordenem sempre els àcids nucleics des de 5’ fins a 3’.

Normalment també se sol ometre la estructura de l’esquelet sucre – fosfat quan parlem de la seqüència de bases nitrogenades, ja que són aquestes les que porten el missatge genètic.

2

- Estructura secundària del DNA: la doble hèlix, va ser descoberta per Watson i Crick l’any 1953. La doble hèlix està formada per dos cadenes helicoidals de polinucleòtids, enrotllats un sobre l’altre sobre un eix comú en sentit dextrògir. També cal destacar que són antiparalel·les, es a dir que una comença on la altra acaba.

Els plans que contenen les bases nitrogenades són pràcticament perpendiculars a l’eix de la molècula.

El diàmetre mitjà de la molècula és de 20 Å. Els plans que contenen les bases no estan directament uns sobre els altres, sinó que estan derivats un angle de 36º, si tenim en compte que la separació entre les bases és de 3,4 Å; podem dir que la seqüència es repeteix cada 10 bases ja que donen la volta als 360º, i per tant les seqüències es repeteixen cada 34 Å. El pla que conté les desoxiriboses i el que conté les bases nitrogenades formen un angle de 90º. Les bases nitrogenades de les dos cadenes es troben en complementarietat ja que si en un costat hi ha una purina a l’altre hi ha una pirimidina, aquest fet respon a raons estèriques ja que dos purines juntes desestabilitzarien la molècula al ser massa grosses o dos pririmidiniques també ho farien per falta de volum; amb la convinació d’una de cada tipus es pot mantenir de manera més estable. Entre les bases nitrogenades de les dos cadenes hi ha ponts d’hidrogen. En concret entre timina i adenina 2; i entre citosina i guanina 3.

Diferents representacions de la doble hèlix segons el model de Watson i Crick, DNA B:

En la doble hèlix podem distingir unes estructures que són els solcs, de 2 tipus, els grans i els petits. Elements de la doble hèlix del DNA.

El descobriment d’aquest model es va poder entendre les regles de Chargaff que deien que: A+T=C+G o que A/T=C/G=1

'5'3

'3'5

→

→

3

Les forces que estabilitzen la doble hèlix són: - Els enllaços per ponts d’hidrogen que s’estableixen entre les bases nitrogenades (A-T/C-G) de 2 i 3 Kcal/mol. - Hi ha unes forces d’apilament que consisteixen en les forces d’atracció que s’estableixen entre els parells de bases nitrogenades pel fet que els electrons deslocalitzats de les estructures ressonants es poden acumular en un moment donat en un extrem de la molècula creant un dipol instantani i provocant un dipol induït en la base nitrogenada que hi ha a sobre o a sota. Aquest tipus de força aporten 7 Kcal/mol d’estabilització. Aquestes dos forces que en si són febles tenen gran importància quan estem parlant de la repetició d’aquestes al llarg de tota la estructura de la macromolècula. Són més importants les forces d’apilament en conjunt. - Els grups fosfat dels extrems de cadascuna de les dues cadenes en condicions fisiològiques es troben ionitzats, però l’efecte repulsiu de la càrrega d’aquests es veu apantallada mitjançant ions divalents (Mg2+). Hi ha diferents formes de doble hèlix:

Els diferents models de doble hèlix es diferencien per la forma dels solcs, el diàmetre i la longitud. B-DNA (Watson i Crick) té un diàmetre intermig i una longitud intermitja. A-DNA té un diàmetre més gran i en conseqüència una longitud més curta. Z-DNA té un diàmetre més estret i per tant és més llarg. El A-DNA es diferencia del B-DNA pel fet que el canviar els solcs implica una diferencia en l’accessibilitat a les bases nitrogenades i també més inclinació entre els diferents plans. Els A-DNA i el B-DNA es diferencien en gran mesura dels Z-DNA pel fet que els dos primers tenen un sentit de gir dextrògir i l’altre el té levògir. Entre les tres formes del DNA també varia el nombre de bases nitrogenades per volta de hèlix que són 11 en el A-DNA, 10 en B-DNA, i 12 en Z-DNA. El DNA de la cèl·lula és majoritàriament B-DNA però algunes regions arriben a ser de A-DNA, Z-DNA o altres. Això serveix per indicar les regions on comencen alguns processos com la replicació o la transducció. Aquestes zones faciliten a les proteïnes encarregades de fer aquests processos l’accés i el reconeixement del DNA.

Desnaturalització del DNA: L’estructura de la doble hèlix del DNA es pot perdre per un procés de desnaturalització per diferents factors: - El calor, és a dir l’increment de la temperatura. - Els canvis de pH. Cal destacar que la desnaturalització per un pH bàsic és més fàcil de recuperar que una d’àcid ja que aquesta provoca la pèrdua de purines. Aquests factors canvien les propietats físiques del DNA, ja que aquest a part de perdre viscositat, també augmenta l’espectre d’absorció a diferents longituds d’ona. Al augmentar la temperatura s’incrementa la absorbància a totes les longituds d’ona un 40%, això es coneix com l’efecte hipercròmic. Si representem l’increment d’absorbància en funció de la temperatura, que es coneix com a corba de fusió del DNA, es veu com hi ha un estret marge de temperatura en que absorbància augmenta molt ràpid, això ens indica que la desnaturalització de la doble hèlix és procés cooperatiu, és a dir que la separació de les primeres bases ajuda a la separació de la resta. Dins aquest interval trobem una temperatura en que el 50% de l’estructura està desfeta, s’anomena temperatura de fusió (Tm). Aquesta és característica de cada DNA, i s’utilitza com a mesura de l’estabilitat ja que a temperatures més altes la estabilitat és major. La temperatura de fusió és proporcional al nombre de bases de guanina i de citosina ja que tenen més ponts d’hidrogen que estabilitzen la molècula.

4

Renaturalització del DNA:

El procés de renaturalització del DNA es hipocròmic ja que la absorbància torna a disminuir. - L’efecte del pH es contraresta tornant al pH original, és més fàcil si es tracta de pH bàsic. - L’efecte de la temperatura s’ha de fer tornant a la temperatura original suaument, perquè si es fa bruscament les seqüències de parells de bases es poden unir amb d’altres d’iguals de altres segments de la molècula. Per fer-ho s’ha de posar el DNA a una temperatura de renaturalització o hibridació que sigui igual a la de fusió menys 25ºC, així s’aconsegueix que si es formen malament algunes unions, el sistema tingui prou energia com per desfer-les i tornar a formar unions al lloc que els pertoca ja que la forma original és la més estable, mentre que si la reducció de temperatura es fa bruscament les unions mal fetes no es poden desfer per falta d’energia. - Estructura terciària del DNA: Per parlar de la estructura terciària del DNA cal distingir si estem parlant de DNA circular o DNA lineal. DNA circular: procariotes (doble cadena), mitocondri/cloroplast eucariotes; i en virus (cadena senzilla o doble). DNA lineal: eucariotes i virus (cadena senzilla o doble). Cal destacar que els virus també poden tenir RNA. Les estructures de d’organització del DNA són importants per tal de fer-lo cabre en el nucli o dins la cèl·lula. El DNA lineal té els extrems 5’ i 3’ lliures, mentre que el DNA circular no els té lliures ja es forma quan hi ha un nombre parell de bases que permeten un nombre de voltes de doble hèlix sencer. Aquest DNA circular té la capacitat d’enrotllar-se sobre si mateix donant lloc a un superenrotllament per formar un DNA més compacte. Aquest pot ser dextrògir (positiu) o levògir (negatiu) segons el sentit en que es cargoli. Les formes de DNA circular sense superenrotllament s’anomenen relaxades. La forma superenrotllada i la relaxada són topoisòmers. Es pot passar de la forma relaxada a la superenrotllada i viceversa a través de topoisomerases, que són uns enzims que regulen el pas d’una forma a l’altra. Hi ha dos tipus de topoisomerases: - Tipus I: catalitzen la interconversió dels topoisòmers fent un tall en una de les dos cadenes de la doble hèlix. - Tipus II: catalitzen la interconversió dels topoisòmers fent un tall en totes dos cadenes de la doble hèlix. El superenrotllament pot fer més d’una volta però té certs límits imposats per la llargada de la molècula. Tot i que les dos formes, la dextrògira i la levògira, fan la mateixa funció de compactar el DNA per tal que càpiga dins de la cèl·lula, a la natura predominen els superenrotllaments levògirs perquè faciliten la separació de les dos cadenes de la doble hèlix per processos on cal separar-les com són la replicació o la transducció. Les topoisomerases de tipus I relaxen el DNA superenrotllat negativament o levogirament. Les topoisomerases de tipus II introdueixen en el DNA superenrotllaments negatius o levògirs. En el DNA lineal (eucariotes) s’aconsegueix l’empaquetament en estructures superiors gràcies a la associació amb proteïnes bàsiques, que contenen aminoàcids com són la lisina (Lys) i l’arginina (Arg), anomenades histones. Aquesta associació de DNA i proteïnes forma la cromatina. Hi ha 5 tipus histones: H1, H2A, H2B, H3 i H4. Nivells d’estructuració de la cromatina:

1.- Nucleosomes: la unió d’uns 200 parells de bases del DNA, enrotllats a un octàmer d’histones format per (H2A)2, (H2B)2, (H3)2 i (H4)2 que formen una estructura arrodonida on les histones es troben a l’interior i el filament de DNA a l’exterior. En la part exterior també hi trobem la H1. La unitat formada per l’octàmer histones i 146 parells de bases formen el que es coneix com la partícula nucli del nucleosoma. Entre nucleosoma i nucleosoma hi trobem el DNA de connexió juntament amb proteïnes no histones. 2.- Estructura solenoidal: consisteix en el recargolament de l’estructura formada pels nucleòtids formant solenoides. Aquesta estructura té un gruix de 360Å. Hi ha 6 nucleosomes/ volta. Es creu que en la formció d’aquesta estructura hi té una gran importància la H1. 3.- Estructura cromatina: es el següent recargolament de l’estructura solenoidal sobre si mateixa. Cal tenir en compte que el DNA lineal es pot superenrotllar i que el DNA circular es pot associar a protreïnes però en els dos casos no ho fan per el mateix motiu.

5

Diferències entre el DNA procariota i el DNA eucariota:

La seva estructura és circular. La seva estructura és més complexa. Pràcticament tota la seqüència codifica per proteïnes. 5% de tota la seqüència codifica per proteïnes. DNA continu. DNA discontinu. En el DNA eucariota hi ha dos tipus de seqüències: les del DNA únic que corresponen a seqüències úniques que només es troben una vegada en tot el genoma i codifiquen per les proteïnes. Les seqüències de DNA repetitiu estan formades per seqüències de DNA repetides al llarg del genoma. Aquest DNA repetitiu pot ser de dos tipus segons la seva freqüència: altament repetitiu, seqüències curtes repetides moltes vegades i que tenen funció estructural; i el moderadament repetitiu que té seqüències una mica més llargues repetides en menor freqüència, solen ser RNA que han passat a DNA. Abans s’havia pensat que aquestes seqüències de DNA no servien per res i per això s’anomenava DNA basura, però actualment se sap que s’hi troben codificant RNA que no són traduïts a proteïnes però que afecten a la part dels DNA únics. També es diu que el DNA eucariota és discontinu ja que s’alternen seqüències que codifiquen (exons) amb seqüències que no (introns). Quan s’obté el DNA missatger llavors cal netejar-lo dels introns, llavors s’anomena RNA missatger madur, aquest ja pot ser traduït per a formar proteïnes.

6

Tema 18: Replicació del DNA El Dogma Central de la Biologia Molecular. Replicació semiconservativa del DNA. Replicació en organisme procariotes i eucariotes. Reparació del DNA. Dogma central del la Biologia

Últimament s’han anat descobrint possibilitats noves i complementaries funcions d’aquest dogma central de la biologia com són: - La transcripció inversa que passa de RNA a DNA. - La replicació del RNA. - La síntesi de proteïnes no lligades als ribosomes.

La replicació és el procés pel qual fem còpies idèntiques del DNA. La replicació és el procés pel qual a partir d’una molècula de DNA de doble hèlix que anomenem progenitora o parental, s’originen dues molècules filles idèntiques a ella. Té lloc cada vegada que hi ha una divisió cel·lular, ja que les cèl·lules filles reben la dotació genètica de la mare. Característiques de la replicació del DNA:

- És un procés semiconservatiu ja que cadascuna de les cèl·lules hereta una cadena íntegra de la cèl·lula mare i l’altra és totalment de nova síntesi. - És bidireccional ja que les cadenes noves s’extenen (es copien) en els dos sentits, 5’�3’ i 3’�5’. Cadascun dels punts per on es replica s’anomena forca de replicació. - Monofocal en procariotes i Multifocal en eucariotes, és a dir, en procariotes només es comença a replicar per un punt de la cromatina; mentre que en eucariotes hi ha múltiples punts de replicació fins que les forques es troben. Enzims que catalitzen la formació dels enllaços fosfodiéster “in vitro”:

- DNA polimerasa I: catalitza la formació de polímers de DNA. És el primer que es va trobar, el més estudiat però no és l’únic. Fa la adhesió pas a pas de desoxiribonucleòtids. Per funcionar requereix que hi hagi una cadena de DNA que estigui en creixement (cadena encebadora) , una cadena que faci de motlle, nucleòtids i Mg2+.

PpiDNAdCTPdTTPdGTPdATPdNTPDNA nn +↔+ +1)(),,,(4)(

La cadena encebadora cal que tingui un grup –OH en 3’ lliure, perquè faci l’atac nucleofílic al primer dels grups P. La cadena que fa de motlle el que fa que s’introdueixi el nucleòtid complementari a la cadena en formació. El creixement sempre és en 3’�5’, és una síntesi de DNA que pot produir errors. El DNA polimerasa té altre funcions com són les de exonucleasa 5’�3’ i 3’�5’. Les exonucleases 3’�5’ tenen activitat degradativa i per tant tenen la capacitat de corregir els errors eliminant els nucleòtids que no toquen en un determinat lloc. Les exonucleases 5’�3’ tenen com a funció tallar nucleòtid a nucleòtid des d’allà on hi ha l’encebador cada estructura de RNA. És dir que elimina els encebadors de RNA per després reomplir els forats amb DNA. Cada activitat té un centre actiu en l’enzim. El centre actiu de la funció polimerasa i la d’exonucleasa 3’�5’ estan molt propers mentre que el de l’exonucleasa 5’�3’ està més allunyada. Per això si fragmentem l’enzim podem obtenir dos parts que continuen essent funcionals, un d’ells és el fragment Klenow.

7

- DNA polimerasa III: fa la major part de la síntesi del DNA en la replicació. Té els mateixos requeriments que la DNA polimerasa I, i només fa la seva activitat en la cadena 5’�3’. - DNA polimerasa II: no fa replicació però si fa processos de reparació del DNA. Té els mateixos requeriments que la DNA polimerasa I i només fa la seva activitat en al cadena 5’�3’. - DNA polimerasa IV: fa processos de reparació del DNA. - DNA polimerasa V: fa processos de reparació del DNA. En la replicació veiem que tenim un cadena que se sintetitza de forma contínua, aquesta l’anomenem cadena guia; l’altra cadena es forma a partir de fragments de DNA units 5’�3’ d’unes 1000 bases que anomenem fragments d’Okazaki (Reiji Okazaki), aquests constitueixen la cadena de síntesi discontínua o cadena retardada.

El replisoma o sistema de la DNA replicasa és el conjunt de proteïnes involucrades en el procés de replicació. Etapes de la replicació (Inici, Elongació i Terminació):

1.- Inici: En procariotes només hi ha un únic lloc d’inici o origen de replicació (ori C). En aquest punt la doble hèlix de DNA se separa ja que té una seqüència específica que es repeteix moltes vegades en les quals hi ha present GATC. Per iniciar la replicació es necessiten un conjunt de proteïnes que fa les següents funcions: Dna A: reconeix la seqüència del origen de replicació (ori C). Dna B: té una activitat helicasa que desfà o separa la doble hèlix en l’ori C, ajudada per la hidròlisi d’ATP. Dna C: és una proteïna auxiliar perquè Dna B pugui unir-se al DNA. Proteïna HU: corba el DNA estimulant l’inici de la replicació. DNAgirasa: és una topoisomerasa de tipus I que serveix per relaxar el DNA dels superenrotllaments. Proteïna d’unió a DNA de cadena senzilla: mantenen separades les cadenes de DNA ja que la forma més estables és quan les cadenes estan unides. RNApolimerasa (Primaria o Proteïna Dna G): forma part d’un complex anomenat primosoma, la funció del qual és sintetitzar l’encebador necessari perquè puguin actuar les solucions formades pels fragments d’Okazaki i ***

8

2.- Elongació: La DNA polimerasa III que té propietats semblants a la DNA polimerasa I, en aquesta etapa simplement addiciona nucleòtids fins que s’acaba el procés de replicació. També hi participen altre proteïnes que estan en l’inici de la replicació. Com són les proteïnes d’unió a cadena senzilla, la Dna B (helicasa), les topoisomerases i la RNA polimerasa que forma part del complex del primosoma. La DNA polimerasa III es fica a la forca de replicació, al ser una proteïna dimèrica cadascuna dels dominis afegeix nucleòtids a la seva cadena, per fer-ho en la cadena 3’�5’, cal aconseguir la mateixa orientació que la cadena 5’�3’, ja que la DNA polimerasa forma les noves cadenes en el sentit 5’�3’. Per aconseguir-ho el que es fa es enrotllar la cadena discontínua a la DNA polimerasa de tal manera que un fragment de la cadena quedi en la orientació adequada per tal de ser copiada en la mateixa direcció que la cadena guia i en el sentit 5’�3’. Llavors amb aquest sistema ens queden tot de trossos de RNA que ha anat posant l’encebador per tal de anar formant els fragments d’Okazaki. Per tal d’obtenir la nova cadena de DNA, en primer lloc cal eliminar aquests fragments de RNA, això s’aconsegueix amb la funció exonucleasa 5’�3’ de la DNA polimerasa I. Després cal que la DNA polimerasa I passi a reomplir amb desoxiribonucleòtids els talls que han quedat buits amb la seva funció polimerasa 5’�3’. Finalment, cal que la DNA lligasa passi a unir els fragments de DNA posats per la DNA polimerasa I a la resta de la cadena.

9

3.- Terminació: La replicació acaba quan les dos forques es troben en un punt diametralment oposat a l’origen de replicació. Hi ha unes seqüències que s’anomenen Ter (de terminació), que són el lloc d’unió d’una proteïna anomenada Tus. Aquesta proteïna (Tus) ajuda a aturar el procés de replicació. El procés acaba també amb el tancament de la cadena de nova síntesi amb la lligasa (DNA circular). Replicació en eucariotes:

La replicació en eucariotes és molt similar, però cal tenir en compte que els cromosomes són lineals i no circulars. La replicació en eucariotes compleix les propietats de ser semiconservatiu, bidireccional i multifocal. Les DNA polimerases en eucariotes són diferents però la DNA polimerasa α és l’equivalent de la DNA polimerasa III en procariotes. Les DNA polimerases eucariotes no tenen activitat correctora, la majoria. En la replicació eucariota qui fa l’activitat correctora són les nucleases associades a les polimerases. En la replicació del DNA lineal cal tenir en compte que en la síntesi de la cadena retardada els extrems 5’ en que inicialment s’hi posa l’encebador de RNA, quan passa la exonucleasa que els elimina queden sense poder afegir-s’hi bases ja que no tenen al seu costat cap cadena prèviament existent tal com requereixen les polimerases. S’hi no hi hagués cap mecanisme per evitar-ho cada vegada que es repliqués el DNA s’anirien perdent fragments d’informació. Per evitar-ho als extrems hi ha unes seqüències repetides que s’anomenen telòmers. Aquestes seqüències són afegides per les telomerases. Les telomerases són enzims amb uns fragments de RNA que els serveixen com a patró per sintetitzar aquestes seqüències de DNA repetitives.

10

Tema 19: Transcripció i regulació de l'expressió gènica Mecanisme de la transcripció en procariotes. Transcripció i processament en eucariotes. Regulació de l'expressió gènica en procariotes: operons. La transcripció és la primera etapa del procés de síntesi de proteïnes. Característiques del RNA:

És de cadena senzilla. L’estructura primària està formada per el ribonucleòtids. L’estructura secundària està formada per l’autoaparellament de bases, que s’adopta en molt alt grau.

Hi ha tres tipus de RNA molt importants:

- RNA missatger (m-RNA): porta el missatge genètic. - RNA de transferència (t-RNA): serveix d’adaptador entre la seqüència de nucleòtids del missatger i els aminoàcids de la proteïna que s’està formant. - RNA ribosòmic (r-RNA): forma els nucleòtids que constitueixen els ribosomes. Inicialment es va creure que aquest RNA només tenia una funció estructural però ara se sap que també pren part en el procés de síntesi d’enllaços peptídics. Tot i així tant en procariotes com en eucariotes hi ha molts altre tipus de RNA. - hn-RNA (pre-mRNA, transcrit primari): sintetitzar el procés de transcripció (exons + introns). Aquest un cop es processat per tal d’eliminar els introns i fusionar els exons per el procés anomenat spicing (procés d’eliminació i unió) per obtenir m-RNA. Procés de maduració. - SnRNA (RNAs nuclear petits): participen en el procés de maduració formant part d’un complex anomenat espliceosoma que fa la eliminació dels introns. La transcripció és el procés mitjançant el qual a partir d’una molècula de DNA de doble cadena se sintetitza un molècula de RNA complementaria d’una de les cadenes del RNA. Per la transcripció cal la separació de la doble hèlix. La cadena que és copiada a RNA rep el nom de cadena motlle. La cadena que no és copiada i que porta la informació s’anomena cadena codificadora. La cadena de RNA que surt és antiparal·lela a la cadena motlle i la mateixa que la cadena codificadora canviant la timina per uracil i els desoxiribonucleòtids per ribonucleòtids. Propietats de la transcripció:

1.- És un procés selectiu ja que no es transcriu tot el DNA sinó determinats segments compresos entre senyals d’inici i finalització de la transcripció. 2.- És un procés monocatenari ja que de les dos cadenes només es copia la cadena motlle. 3.- És un procés reiteratiu ja que el mateix fragment de DNA pot ser copiat a RNA moltes vegades a diferencia de la replicació que només es fa quan la cèl·lula s’ha de dividir. En procariotes l’enzim que duu a terme el procés de la síntesi de RNA és la RNA polimerasa. La RNA polimerasa és exclusiva dels procariotes. Els requeriments de la RNA polimerasa són una cadena motlle de DNA per copiar que tant pot ser de cadena doble com senzilla; els quatre tipus de nucleòtids trifosfats (ATP, GTP, UTP i CTP); i un ió divalent com el Mg2+.

)2()()( 1 PîPpiRNANTPRNA nn →+↔+ +

La reacció és la mateixa que la de la DNA polimerasa però amb ribonucleòtids. Una diferència amb la DNA polimerasa és que la RNA polimerasa no necessita un encebador i per tant el motlle es comença íntegrament. Una altra diferència amb la DNA polimerasa és que la RNA polimerasa no té activitat correctora al no tenir la funció exonucleasa. Per aquest motiu la taxa d’errors en la síntesi del RNA és més altra que en la replicació del DNA. Encara que no es tracta de produir errors, això té sentit pel fet que la molècula de RNA és una molècula transitòria que té un temps de vida mitja dins de la cèl·lula molt curt; a diferencia del DNA en que un error es transmet a les cèl·lules filles i a totes les filles d’aquestes. Un error en el RNA el que fa és que se sintetitzin proteïnes que no són del tot funcionals en tot cas. La RNA polimerasa és un enzim format per les següents subunitats:

Subunitat Nº Funció α 2 Iniciar la cadena i interaccionar amb proteïnes reguladores del procés de transcripció. β 1 Formar enllaços fosfodiéster durant l’inici i la elongació de la cadena. β' 1 Unir la cadena codificadora.

ρ 1 Reconèixer els promotors, seqüències presents en el DNA on s’inicia el procés de la transcripció.

ω 1 Desconeguda.

11

Quan el complex està complet s’anomena holoenzim α2ββ'ρω; quan ja ha reconegut els promotors s’allibera la subunitat ρ i llavors passa a anomenar-se nucli de l’enzim. Globalment la DNA polimerasa fa les següents funcions:

1.- Localitzar els promotors (centre d’inici de la transcripció). 2.- Desfer la doble hèlix en un tram concret per deixar un motlle de cadena senzilla que serà transcrita a RNA. 3.- Seleccionar el ribonucleòtid correcte (complementari) i catalitzar la formació de l’enllaç fosfodiéster. Aquest procés es fa n vegades fins que s’ha transcrit tot el gen que calia . En el procés la RNA polimerasa llisca per sobre del DNA sintetitzant la cadena de RNA. 4.- Localitzar les regions que marquen el final de la transcripció, les senyals de terminació. 5.- Interaccionar amb determinades proteïnes que tant poden ser activadores del procés de transcripció com repressores d’aquest. És a dir que fan el control de l’expressió gènica. Etapes del procés de transcripció:

Iniciació: 1.- Localització del promotors, seqüències dins del DNA que marquen l’inici del procés de transcripció. En procariotes el promotors són característics pel fet que la cadena del DNA codificadora hi trobem una seqüència formada únicament per adenina i timina que s’anomena seqüència Pribnow o regió -10. Una mica més enllà es troba al regió -35. Es considera que el primer parell de bases del gen que es transcriu és la regió +1, per tant les regions -10 i -35 es troben abans d’aquesta. Entre la regió -10 i la -35 hi ha aproximadament unes 17 bases nitrogenades. Aquestes seqüències es localitzen amb la subunitat ρ, lliscant per sobre de la doble hèlix del DNA sense desfer la hèlix. En el procés de reconeixement es formen ponts d’hidrogen transitoris entre els aminoàcids de la RNA polimerasa i els nucleòtids del DNA. Quan es localitza el promotor permet que la RNA polimerasa s’uneixi de manera molt més eficient i amb més afinitat a aquesta cadena. Aquesta localització és molt ràpida ja que no cal desfer la cadena de DNA, només cal lliscar-hi per sobre. 2.- separació de la doble hèlix en una regió relativament curta, d’uns 18 + - 1 base (que venen a ser unes 1,6 voltes de doble hèlix de Watson i Crick), formant el que es coneix com a “bombolla de transcripció”. 3.- En aquests punt té lloc la síntesi del primer enllaç fosfodiéster. 4.- S’allibera la subunitat ρ fent que la resta de l’enzim s’uneixi més fortament al filament de DNA. Elongació: S’addicionen nucleòtids en el sentit 5’�3’. La cadena de RNA forma un híbrid amb la cadena motlle del DNA que consta de 8-9 parells de bases. L’extrem 3’ del a cadena de RNA s’ha de situar en el centre catalític on es duu a terme la síntesi de l’enllaç fosfodiéster. Per tal que es pugui donar l’atac nucleofílic del OH al grup fosfat del nucleòtid. Els 18 + - 1 parells de bases es mantenen sempre, al igual que els 8-9 parells de bases que formen amb l’híbrid amb el DNA. Per tant això significa que la velocitat amb que es desfà la doble hèlix és la mateixa amb que es torna a formar aquesta i també amb la que sintetitzen les bases. La velocitat és de 50 nucleòtids/s. El RNA que s’acaba de sintetitzar s’allibera per un costat i una mica corbat per tal que no interaccioni amb les cadenes separades del DNA. Al no haver-hi correcció hi ha una taxa d’errors més alta que en el DNA. Aquesta és d’un error cada 104 – 105 bases sintetitzades mentre que en el DNA és d’un error cada 109 o 1010. Aquest procés es repeteix fins que s’ha acabat de sintetitzar la cadena de RNA.

12

Terminació: Terminació de la transcripció de la ρ independent.

En la cadena de DNA hi ha unes seqüències que marquen el final de la transcripció. S’anomenen senyals de terminació i estan constituïts per seqüències palindròmiques, seqüències que no importa el sentit en que es llegeixin, i van seguides d’un tram d’adenines. El que fan aquestes seqüències és: 1.- Aturar la formació d’enllaços fosfodiéster. 2.- Separar l’híbrid format pel DNA i el RNA. 3.- Es refà la doble hèlix. 4.- S’allibera la RNA polimerasa. Aquest tipus de transcripció s’anomena ρ independent perquè no depèn d’una proteïna o factor ρ hexamèrica (formada per 6 unitats). El mecanisme de terminació fa que quan la RNA polimerasa sintetitza les adenines que hi ha després de les seqüències palindròmiques, aquestes quan es traslladen a RNA generen un autoaparellament de bases provocant una estructura secundària i juntament amb el tram de uracils. Esquema de la terminació de la transcripció ρ independent. Terminació de la transcripció de la ρ dependent.

El RNA sintetitzat s’enrotlla a partir d’una seqüència d’aquest a la proteïna ρ, això activa l’hidròlisi d’ATP. La proteïna ρ s’apropa a la cadena DNA, la desestabilitza debilitant la unió entre el motlle i el transcrit fent que es dissociï tot el complex.

Esquema del procés de terminació de la transcripció dependent del factor rho (ρ).

Transcripció en eucariotes

En procariotes la transcripció i la traducció són simultànies en l’espai (nucli) i el temps. En canvi en eucariotes en el nucli hi ha els diferents cromosomes que són transcrits a pre-mRNA (introns + exons), a continuació hi ha un procés de maduració per la eliminació de les regions intròniques per tal de donar mRNA. Llavors a fora del nucli es dóna la traducció. Per tant la transcripció i la traducció són dos processos que estan separats en l’espai i el temps. En eucariotes hi ha tres tipus de RNA polimerases: - El tipus I: utilitzada en la transcripció dels rRNA 18s, 5,8s i 28s. - El tipus II: s’utilitza per a la síntesi de pre-mRNA i alguns snRNA. - El tipus III: s’utilitza per a la síntesi de tRNA, l’ rRNA 5s i altres snRNA. Les regions promotores dels promotors procariotes ja que tenen seqüències diferents. Hi podem trobar diferents possibles seqüències la qual cosa fa que hi hagi més variabilitat que en procariotes. Les regions promotores que podem trobar són: - Caixa TATA: aquesta és la regió promotora més pròxima a l’inici del gen i és sempre present. - Caixa CAAT: aquesta és la regió promotora que pot estar abans de la caixa TATA - Caixa GG: aquesta és la regió que es pot trobar abans de la CAAT.

13

Aquestes regions són reconegudes per la RNA polimerasa i altres proteïnes que és coneixen com a factors de transcripció. Alguns poden variar d’un gen a un altre. Les modificacions del pre-mRNA:

1.- En el seu extrem 5’ s’hi addiciona una estructura anomenada CAP que és un GTP unit mitjançant un enllaç fosfodiéster 5’�5’. 2.- En l’extrem 3’ s’hi afegeix una molècula de poli(A), que són una sèrie de nucleòtids d’adenina per un mecanisme molt complex. 3.- En el transcrit primari hi ha seqüències no codificants o introns que cal eliminar. Aquesta eliminació ha de fer-se amb un tall precís entre els extrems 3’ i 5’ del introns. Hi ha unes seqüències concretes en que es troben tots els introns. L’exó 1 acaba amb AG i l’intró que el segueix comença amb GUDAGU, en el centre conté un conjunt de bases pirimidiniques (Py)n. Al final de l’intró trobem una seqüència que comença amb un nucleòtid qualsevol seguit de CAG. En el exó 2 trobem la seqüència inicial amb G.

Al mig de l’intró hi ha una seqüència amb una adenina al centre que s’anomena punt de ramificació, i és molt important per la eliminació dels introns. La eliminació i unió dels introns (splicing) es fa en dos etapes: - En la primera etapa es fa un tall en 5’ de l’intró. Llavors l’extrem 5’ de l’intró forma un enllaç fosfodiéster 2’�5’ amb la alanina del punt de ramificació, tot alliberant el primer exó. - En la segona etapa es fa un tall en l’extrem 3’ de l’intró, és a dir allà on acaba l’intró i comença l’exó, fent que s’alliberi totalment l’intró i els dos exons s’uneixin formant el mRNA madur.

14

Els elements que participen en l’splicing són:

Els snRNA (RNA nuclear petits) que s’associen a proteïnes específiques i tot plegat formen un conjunt de 5 partícules que es coneixen en el nom de partícules ribonucleiques nuclears petites (snRNP). Aquesta associació de partícules diferents formen un conjunt anomenat espliceosoma o maquinària de tall i unió. Regulació de la transcripció en procariotes:

La regulació de la transcripció aconsegueix augmentar o disminuir la concentració d’una proteïna a la cèl·lula.

[ ]proteïnamRNAGen traduccióiótranscripc ↑↓ → → ↑↓

Això es pot fer gràcies a que en tots els gens hi ha unes regions reguladores al davant. Hi ha gens de regulació coordinada que s’agrupen en el DNA en el que s’anomenen operons. Operó lac:

lasestransacetipermeasesasagalactosiddesíntesiCdefontlactosacoliECultiu ++−→↑↑+ β..)...(..

La β-galactosidasa catalitza el trencament del disacàrid de la lactosa en galactosa i glucosa.

asagalactosiddesíntesiCdefontsaltrescoliECultiu −→↓↓+ β.......

Si no hi ha lactosa no hi ha cap necessitat de sintetitzar β-galactosidasa. La lactosa indueix la síntesi de la β-galactosidasa, aquesta és la hipòtesi de l’operó del Jacob i Monod. La síntesi dels tres enzims és induïble en resposata a l’inductor que en aquest cas és la lactosa, per tant hi ha una regulació coordinada de l’operó lac.

Regulació de l’expressió gènica de l’operó lac.

L’i mRNA es transcriu en una proteïna dimèrica, anomenada repressor lac, aquesta és capaç d’unir-se a una regió que està entre el promotor i els tres gens, anomenada operador. Llavors quan la RNA polimerasa va a transcriure els tres gens lliscant per sobre el DNA, queda bloquejada al trobar-se el repressor unit sobre la molècula de DNA. Aquest bloqueig fa que no sigui possible transcriure els tres gens i per tant tampoc no és poden sintetitzar. Si en el medi hi ha l’inductor, que en aquest cas és la lactosa, aquesta s’uneix al repressor donant lloc a un complex que no té afinitat per unir-se a la cadena de DNA bloquejant el procés de la transcripció ni tampoc el de la traducció, permetent que es sintetitzin els tres enzims.

L’operó lac està d’un conjunt d’operons que s’anomenen operons catabòlics, ja que intervenen en la síntesi de les proteïnes que intervenen en els processos de catàlisi.

[ ] [ ][ ] [ ]catabòlicsenzimscAMPcoliE

cAMPcatabòlicsenzimsaglucoliE

..

.cos.

→↑+

↓+→↓+

L’cAMP indueix la transcripció d’enzims catabòlics. L’cAMP és capaç d’unir-se a una proteïna anomenada proteïna receptora d’cAMP, llavors són capaços d’interaccionar amb els promotors dels operons catabòlics. Quan s’hi uneixen, faciliten el reconeixement dels promotors a la RNA polimerasa, activant així la reacció. Per tant ens operons catabòlics es caracteritzen per estar sota un control doble, el de l’operó específic de cadascun dels enzims, format per l’ inductor i el repressor, i també per un control genèric ja que val per tots els operons catabòlics, format per l’cAMP i la proteïna receptora d’cAMP. La màxima expressió gènica es dóna quan hi ha l’inductor específic i l’cAMP genèric.

15

Tema 20: El codi genètic i la Síntesi de Proteïnes Establiment i característiques del codi genètic. Mecanisme de la traducció. Regulació. Modificacions post-traduccionals de les proteïnes. El codi genètic és la relació que hi ha entre la seqüència del DNA, o del m-RNA que en el fons és transcrit a partir del DNA; i la seqüència d’aminoàcids d’una proteïna. Característiques del codi genètic:

1.- La relació de codificació és de tres bases per cada aminoàcid, ja que és el mínim necessari per tal de codificar pels 20 aminoàcids. Altrament si féssim amb 1 base només podríem fer 4 combinacions i per tant només 4 aminoàcids, amb 2 bases podriem codificar només per 16 aminoàcids, mentre que amb 3 podem fer 64 combinacions que resulten més que suficients pels 20 aminoàcids pels quals han de codificar. 2.- No hi ha solapaments. Si la seqüència és ABCDEF, es traduirà només ABC i DEF, i no pas BCD ni CDF. 3.- Hi ha una pauta de lectura seqüencial ja que es comença per l’extrem 3’ del m-RNA i es va traduint de 3 bases en 3 bases fins al final. 4.- El codi genètic és diu que és degenerat ja que hi ha 64 combinacions que codifiquen per només 20 aminoàcids, per tant hi ha aminoàcids que estan codificats per més d’un triplet o codó. Els triplets que codifiquen per un mateix aminoàcid s’anomenen sinònims. No tots els triplets codifiquen per aminoàcids ja que n’hi ha que marquen allà on s’acaba la traducció, com són UAA, UGA i UAG. Però també n’hi ha d’iniciació com són UUG, AUU, GUG i principalment AUG. AUG que es tradueix per metionina, juntament amb UGG que es tradueix per triptòfan, són els únics que no estan degenerats. Per tal que AUG sigui el triplet d’inici calen més senyals ja que també es pot trobar al centre. 5.- Es tracta d’un codi pràcticament universal ja que aquesta relació de codificació és vàlida per gairebé tots els organismes. Hi ha alguns canvis en el DNA dels mitocondris i en el d’alguns protozous.

Característiques de la traducció:

1.- Es va des de l’extrem N-terminal fins l’extrem C-terminal. 2.- Necessita m-RNA, aminoàcids i t-RNA. Els t-RNA juguen un doble paper ja que adapten la seqüència del m-RNA amb la seqüència d’aminoàcids i també activen els aminoàcids unint-se a ells després que aquests s’hagin unit a un AMP; això serveix per superar la barrera termodinàmicament desfavorable que hi ha per formar l’enllaç peptídic. 3.- Cada aminoàcid té el ser t-RNA, i la reacció d’unió d’aquests dos està catalitzada per un enzim específic per cada t-RNA i aminoàcid, que s’anomena aminoacil-t-RNA-sintetasa. 4.- Hi participen els ribosomes

16

Descripció dels elements de la traducció:

- t-RNA: són molècules relativament petites ja que mesuren entre 70 i 90 bases. També es caracteritzen pel fet que formen part de la seqüència de bases del RNA ribonucleòtids poc comuns. Alguns d’aquests nucleòtids poc comuns es formen per metilacions en l’estructura de les bases normals. Com a conseqüència d’aquestes metilacions aquestes molècules són més hidrofòbiques, i això facilita la interacció entre el t-RNA i algunes proteïnes com són les aminoacil-t-RNA-sintetases i les proteïnes dels ribosomes. Aquestes metilacions també fan que algunes d’aquestes bases no puguin establir enllaços per ponts d’hidrogen. Un 50% de les bases formen enllaços per autoaparellament per ponts d’hidrogen. Però també hi ha grups de bases no aparellades: 1.- Braç d’unió del aminoàcids: en l’extrem 3’ on s’uneixen els aminoàcids. 2.- Braç TψC: hi participen ribotimines (T), pseudouracil (ψ) i citosina normal (C). 3.- Braç extra: és el braç més variable entre els diferents t-RNA. 4.- Braç D: hi ha present especialment la dihidrouridina. 5.- Braç anticodó: hi ha la seqüència complementaria als triplets del missatger. Si la mirem de 5’�3’ hi ha la seqüència següent: pririmidina – U – X – Y – Z (anticodó) – purina modificada – base qualsevol. Aquest model descrit s’anomena model fulla de trèvol i constitueix la estructura secundària del t-RNA.

Visió del model fulla de trèvol en forma de cintes i en forma de distàncies de Van Der Waals:

L’estabilitat d’aquesta estructura secundària del t-RNA no està únicament constituïda per l’autoaparellament de bases ja que també hi intervé l’apilament del les bases que estan formant l’autoaparellament. El punt d’unió dels aminoàcids presenta interaccions menys fortes amb el que és la resta de la estructura de la molècula. Això li dóna una mobilitat conformacional que la fa més adaptable a la unió amb els aminoàcids. En cadascuna de les regions d’autoaparellament hi ha uns 10 parells de bases.

17

Reconeixement del codó del m-RNA en el t-RNA:

Es podria pensar que aquest reconeixement es fa simplement per la complementarietat entre l’anticodó del t-RNA i el codó del m-RNA, però no és tant simple ja que hi ha t-RNA que són capaços de reconèixer més d’un codó ja que el codi genètic és degenerat. En el procés de reconeixement es dóna posicionament antiparal·lel entre les dos cadenes, és a dir 5’�3’ i 3’�5’. Els enllaços per pont d’hidrogen no són tant forts en la tercera base del codó amb la primera de l’anticodó. Si 1ª base de l’anticodó és C o G � reconeix 1 codó. Si 1ª base de l’anticodó és U o G � reconeix 2 codons. Si 1ª base de l’anticodó és I � reconeix 3 codons. Aquest mecanisme ve explicat per la hipòtesi del balanceig o trontolleig, que diu que hi ha un reconeixement imprecís entre la primera base de l’anticodó i la tercera del codó, la qual cosa fa que si les altres dos bases coincideixen sigui suficient per unir-se el codó a l’anticodó que tradueix per un cert aminoàcid.

Activació dels aminoàcids:

La forma activada dels aminoàcids s’aconsegueix per la unió amb el t-RNA, donant lloc a els aminoacil-t-RNA. L’aminoàcid s’uneix a l’extrem 3’ del t-RNA per un grup OH d’aquest a través d’una reacció d’esterificació amb el grup COOH de l’aminoàcid, formant un enllaç éster. Però prèviament cal un aminoacil adenilat amb l’AMP.

18

Funcionament de les aminoacil-t-RNA sintetases

En primer lloc cal que aquestes siguin capaces de diferenciar entre els aminoàcids. Ho fan per impediments al·lostèrics en el centre actiu, però en el cas que el aminoàcid que s’hi fiqui sigui més petit que el que realment hi ha d’anar, llavors ha de passar una mesura correctora que comprova si l’aminoàcid és el correcte. Aquest mecanisme garanteix la fidelitat en la traducció del mRNA fins a proteïna. Aquest sistema es basa en el fet que si l’aminoàcid activat esta unit a una aminoacil-t-RNA sintetasa que no li correspon quan s’hi uneix el t-RNA corresponent a la aminoacil-t-RNA sintetasa, el centre hidrolític de l’enzim separa els components.

IleIleRNAtIleE ERNAtAMPValPpiEAMPValATPValIleIle

+−++ →+−−→+ −}

Ribosomes

Són el punt on conflueixen el m-RNA i els aminoàcids unita al t-RNA. Els ribosomes estan constituïts per dos subunitats, anomenades subunitats gran i petita. Comparació entre els RNA eucariota i el procariota Estructura secundària dels r-RNA

La centrifugació en gradient de densitat en equilibri hi ha una separació de macromolècules i estructures moleculars en funció del seu coeficient de sedimentació (relacionat amb la massa), està expressat en unes unitats anomenades Svedvergs (S) que no són aditives. Tots aquests components dels ribosomes tenen capacitat d’autoensamblatge, és a dir que quan estan separats i es troben en les condicions fisiològiques adequades tenen capacitat per formar un ribosoma. Traducció en procariotes:

1.- La síntesi de la proteïna té lloc en el sentit N-terminal cap al C-terminal. 2.- El m-RNA es traduït unidireccionalment en el sentit 5’�3’, permeten així que es doni simultàniament amb la transcripció. 3.- La transcripció és un procés reiteratiu ja que un únic missatger pot ser traduït per més d’un ribosoma alhora, formant un conjunt m-RNA i ribosomes que s’anomena poliribosoma i polisoma. 5.- El procés de la traducció té lloc en tres etapes: iniciació, elongació i terminació. Iniciació de la traducció:

La traducció del m-RNA no comença directament des de l’extrem 5’, sinó que és una mica més enllà ja que hi ha una regió no traduïda de la proteïna que conté una seqüència de bases que s’anomena Seqüència de Shine – Delgano o lloc d’unió als ribosomes (RBS). Aquesta regió d’unió als ribosomes es caracteritza per ser rica en purines, i tenir una tros de seqüència complementària al r-RNA 16S (pertany a la subunitat 30S) amb el qual forma aparellament de bases. - En eucariotes el que es codifica com a la metionina es la formil-metionina, és a dir, una metionina que té un grup formil unit per esterificació. Els missatgers procariotes són policistrònics, és a dir, que porten codificada més d’una proteïna separades per seqüències de iniciació i de termiació com és el cas de l’operó lac, en els eucariotes són m-RNA monocistrònics.

19

Per començar la traducció calen les unitats de ribosoma que prèviament han d’estar separades (50S i 30S), unes proteïnes conegudes com factors d’iniciació (IF1, IF2, IF3), una cadena de m-RNA, la formilmetionina unida al seu t-RNA (f-Met-t-RNAi), Mg2+ i GTP.

En els ribosomes hi ha tres llocs: el lloc de sortida (E), el lloc peptidil (P) i el lloc aminoacil (A). Els factors d’iniciació 1 i 3 s’uneixen en punts diferents de la subunitat 30S del ribosoma. Entre l’extrem 5’ i el primer codó hi ha la interacció amb el ribosoma. El factor d’iniciació 2 que participa en la unió del primer anticodó porta unit un GTP, que en hidrolitzar-se en la unió de l’altra subunitat del ribosoma s’ha de recuperar. Elongació:

En la etapa d’elongació hi participen factors de elongació com són EF-Tu, EF-Ts i EF-G (translocasa). En el pas 1 de la elongació cal regenerar el Tu cal que sigui regenerada per tornar a funcionar, i per això cal que cada vegada que s’afegeix un aminoàcid es consumeixi un GTP. En la unió del segon aminoàcid en el ribosoma si l’anticodó del t-RNA no es el correcte pel triplet que s’està traduint (codó), l’autoaparellament no es gaire fort i la hidròlisi del GTP fa que el canvi de conformació de la proteïna Tu faci que el t-RNA salti del a seva posició. Això garanteix la fidelitat en la síntesi proteica ja que te una taxa d’errors baixa.

20

L’enllaç peptídic es forma a partir de l’atac nucleofílic del grup amino d’un aminoàcid al grup carboxílic de l’altre, aquest atac està catalitzat no per un enzim sinó pel r-RNA 23S. La translocació és el moviment de la distància d’un triplet en la direcció 5’�3’ del ribosoma catalitzat per EF-G. Termiació:

RF és un factor de terminació que està unit a un GTP i que és reconegut per un factor d’alliberament. L’energia que es desprèn en la hidròlisi del GTP serveix per separar l’últim aminoàcid de la cadena i iniciar la dissociació dels components. Balanç energètic de les diferents etapes:

1.- Activació de cada aminoàcid � 2ATP. 2.- Iniciació traducció: 1 GTP (1ATP). 3.- Elongació: 2 GTP (2 ATP) per aminoàcid. 4.- Terminació: 1 GTP (1ATP). Per una proteïna de 100 aminoàcids es consumeix: Activació 100 aminoàcids � 200 ATP Iniciació 1 ATP Elongació de 99 aminoàcids � 198 ATP Terminació 1 ATP En total 400 ATP Traducció en eucariotes:

Els ribosomes són diferents. El t-RNA porta metionina. No hi ha l’equivalent de la seqüència Shine – Delgano, sinó que la iniciació ve determinada per la estructura anomenada CAP (nucleòtid unit 5’-5’), interacciona amb el ribosoma eucariota fent que es comenci a traduir al primer AUG de la cadena de m-RNA.

El complex d’iniciació en eucariotes és molt més complex ja que hi ha 9 proteïnes que fan de factors d’iniciació.

21