Apunts Enginyeria Genètica

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<p>TEMA 1 Conceptos bsicosPAG 6 F + = Donante F - = Receptora Cuando se forma un puente de conjugacin se adoopta sta nomenclatura. Si el puente se rompe ms tarde (no deja de ser una estructura proteica relativamente blanda, es parte de la membrana) entonces el fragmento transferido ser ms grande. Si se rompe antes, el fragmento ser pequeo. Por esta regla de tres, genes prximos sern transferidos (a la vez) con ms probabilidad que genes distantes. (=Qestin de probabilidad). El DNA una vez interiorizado dentro de la celula receptora se inserta dentro del material gentico quedando de forma circular. Hay 2 tipos de ciclos: - Lisognico: Se incorpora en "attach-sites" per no mata a la poblacin. Hay un reatardo en el crecimiento. -Ltico: Cuando se induce la transcripcin del gen. Se puede inducir mediante h (UV) A veces formas aberrantes de DNA son encapsidadas, si tienen un tamanyo propicio y ptimo para poder hacerlo. Llevan parte de DNA del fago y parte de la bacteria. (S'utilitza bastant) DESCUBRIMINETOS DE RELEVANCIA: (PAG 9) 1.- PLSMIDOS NATURALES. Sn episomas que confieren actividad antibacteriana. Verde = Sensible Rojo = Resistente. Al poner en contacto 2 bacterias de diferente cepa , entonces hay conjugacin. El plsmido confiere resistncia y F + entonces forma el puente de conjugacin. El factor F + lo lleva el mismo plsmido. (muy importante). 2.- ENZIMAS DE RESTRICCIN. Tenemos 2 cepas. E.Coli K i C. Infectamos K con fago . Luego trasladamos e infectamos la C a partir de la K. Al cultivar observamos calvas; cada una de las bacterias infectadas produce una calva. EOP = 1 (Tanto por uno de eficincia = 1; osea todas). Ahora infectamos C con . Luego trasladamos e infectamos K a partir de C. Se observa que al cultivar, las calvas disminuyen. Hay una restriccin de crecimiento. EOP = 10-4. Se observ que las particulas K eran distintas que las C. Estaban metiladas. El experimento consisti en: E.Coli K + K ( P32 ) + C ( H3 ). Hacemos sedimentacin. El resultado fue que el P 32 estaba pero el H3 NO. Se descubrieron las endonucleasas restrictasas. La K no reconoce el metilado y degrada el DNA forneo. 1 de cada 10.000 infecta; es por eso que el ndice de calvas disminuye. EX: Eco R1, ........</p> <p>TEMA 2 Recombinacin de DNA "in vitro".EXPERIMENTO DE CORTE (CUT &amp; PASTE) (Pagina 1) Cogemos un plsmido de dcDNA. Seleccionamos diana con una enzima de restriccin. Dejamos extremos con una seqencia concreta. En el DNA forneo hacemos lo mismo. Entonces los extremos pertuberantes sern los mismos. Ahora es el momento de desnaturalizar-los y juntarlos. Aleatoriamente se uniran por dnde queremos, aunque es evidente que tambin se unirn por donde sea (=es al azar). Habr de todo!!!!. Estar NO covalentemente unida, habr un nick, necesitaremos la ayuda de una ligasa para sellar el nick y concluir. ENZIMAS USADAS EN BIOLOGIA MOLECULAR (Pginas 2,3) ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIN (Tabla - Pgina 4) Tipo I : Reconocen dianas especficas. Hacen de restrictasas. Tipo II : Separadas en 2 actividades. Sn ms inespecficas. Hacen cortes ms "chungos", ms malos. Tipo III : Corte muy precso. Reconoce palndromos. Corta dentro de la diana.</p> <p>ECO R1: Endonucleasa de restriccin tpica de Tipo II. (Pagina 5,6,7)Reconoce GATTC (=diana). Dc DNA. Corta lugares concretos. Corta enlaces fosfodiester dejandolos fosforilados. Produce extremos cohesivos. Forma extremos 5' protuberantes AATT o complementarios. pG / pApApTpTpC. Reconoce un entorno de 10 pb aprox. 5' 3' GA T TC C T AAG 3' 5' 5' G | A T T C 3' C T A A |G 3' 5'</p> <p>Hay pluralidad de enzimas de restriccin. Hay 400 reconocidas con 150 dianas especficas. Si cortan por el centro del palndromo entonces formar extremos rombos, NO cohesivos. Hay algunas de Tipo II que no precisan tanto pero las englobamos aqu ya que estructuralmente sn parecidas; no deja de ser una mera clasificacin!!. ISOESQUIZMEROS: s una relacin que se establece en ciertas enzimas. Sn enzimas que reconocen la misma diana pero que cortan por diferente sitio. Suma I 5 ' CCCGGG 3 ' 3 ' GGGCCC 5 ' 5 ' CCC | GGG 3 ' 3 ' GGG | CCC 5 '</p> <p>Xuma I</p> <p>5 ' CCCGGG 3 ' 3 ' GGGCCC 5 '</p> <p>5 ' C | CCGGG 3 ' 3 ' GGGCC | C 5 '</p> <p>* Star-activity: Condiciones en que la diana se hace menos restrictiva. Sn condiciones NO optimas que desestabilizan la enzima y hacen que el corte no sea tan preciso. Corta en otros sitios. No todoas tienen start-activity. A veces puede ser til si conocemos el grado de incertidumbre que tienen. * Puede pasar que distintas enzimas de restriccin reconozcan dianas parcialmente idnticas y produzcan extremos idnticos. La resultante puede ser reconocida por alguna de estas 2 o a veces ni siquiera por ninguna. Todo depende!!!! (Por lo general depende del nucletido que queda solo). EJ: Sol I 5' 3' ....G | TCGAC ..... 3 ' ... .CAGCT | G ...... 5 ' Xho I 5 ' .......C | TCGAG ..... 3 ' 3 ' .......GAGCT | C.......3 '</p> <p>Fem la suma: 5 ' ....G TCGAG ..... 3 ' 3 ' ....C AGCTC .......5 ' No es reconocida ni por "Sol I" ni por "Xho I" EJERCICIO. Enzima Xba I Xho I Kpn I Xba I + Xho I Xba I + Kpn I</p> <p>Cortes 24 , 24.5 15 , 33.5 1.5 , 17 , 30 9 , 15, 24.5 1.5 , 6 , 17 , 24</p> <p>* Al hacerlo vemos que nos encontramos con un problema. Con estos datos somos incapaces de ver como estan ubicados en el espacio los cortes 30 , 1.5 , 17....entonces..... Realizamos una digestin parcial.!!! Colocamos Kpn I y NO permitimos que se haga toda la reaccin. En algn fragmento se daran los 2 cortes, en otro quiz uno y en alguno, ningun corte. (=Es una qestin de tiempo). Ponemos Kpn I (limitado) se observa = 1.5 , 17 , 18.5 , 30 , 31.5 , 48.5 Total</p> <p>Aparecen 2 fragmentos ms: 31.5 y 18.5. Si nos fijamos tenemos : 18.5 = 17 + 1.5 Quiere decir que 1.5 va en medio de los dos . 31.5 =30 + 1.5 Freqentemente nos encontramos frente a un problema. Tenemos un inserto de interes dentro de nuestro vector. Conocemos nuestro vector y probablemente habra una diana del DNA de inters que ser comn con nuestro vector entonces.........entra en juego...</p> <p>(Fotocopia 10) EZIMAS DE TIPO II llamadas METILASAS. Las metilasas metilan bases. Entonces las endonucleasas de restriccin NO cortan.!!! Si las bases estan metiladas las endonucleasas de restriccin NO ejercen su funcin. Las dianas se pueden ocultar mediante metilaciones. Tambin podemos descubrir el estado de metilacin en algunas partes ya que hay isoesquizmeros que digieren las dianas metiladas que otros NO pueden. (Fotocopia 11) Usaremos Taq I cuando queramos cortar freqentemente (Corta dianas pequeas) Usaremos Sf I cuando queramos hacer cortes poco freqentes. (Corta dianas grandes) METODO SAUZER (??) NUCLEASAS: Las nucleasas cortan DNA o RNA. Hidrolizan enlaces fosfodiester. Segn corten sc/dcDNA o scRNA tendremos las variedades y segun su actividad tambien; pueden ser exonucleasas o endonucleasas. Exonucleasa: Degradan por los extremos Endonucleasa: Degradan por el medio. Pueden cortar: 5 ' pApCpTpG 3' 5 '....... pAp + HO-CpTpG..... 3 ' Mirar TABLA 4.1 5'...... pA-OH + pCpTpG....... 3 '</p> <p>EJEMPLOS:* S1 nucleasa: Actividad endonucleasa. Preferncia por monohebra. (sc RNA / sc DNA). (Mejor por DNA) La usamos para cortar i discernir entre dc DNA o sc DNA. Utiliza Zn como cofactor. - Tambien s capaz de acabar de separar una dc si tiene un mella en alguna cadena. La S1 reconoce la monohebra y corta; asi pues obtendremos una doble hebra cortada. - Tambien puede limar esxtremos protuberantes causados por una enzima de restriccin. - Corta horquillas - Corta regiones desapareadas, huecos, inserciones - Corta todo aquello que sea monohebra. * DNAasa I: Actividad endonucleasa. Hidroliza DNA (sc/dc). Corta en lugares adyacentes a pirimidinas. (C y T). Esta enzima tiene una particularidad y es que depende un poco del cofactor. Mg+2 : Corta las dos cadenas por lugares al azar. Introduce "nicks" en las 2 cadenas. Mn+2 : Corta las doas cadenas por lugares "idnticos", as pues se prduce la rotura covalente del dcDNA. - Se usa para introducir "nicks" al azar, para realizar "nick translation", para generar clones al azar, etc... * RNAasa A y RNAasa T1: Actividad endonucleasa. Hidroliza sc RNA.Ataca al enlace entre fosfato i extremo 5' -OH. .La RNAasa A = Hidroliza pirimidinas ( C y U ). . La RNAasa T1 = Hidroliza guaninas (G). - Elimina regiones no hibridadas entre DNA: RNA (=ideal para degradar "primers") - Detecta desapareamientos entre cadenas DNA : RNA.</p> <p>* BAL 31: Esta enzima tiene 2 actividades. Actividad exonucleasa y eactividad endonucleasa. Exonucleasa: Mirar fotocopia Endonucleasa: Mirar fotocopia * EXO III: Actividad 3' exonucleasa. No degrada extremos 3' protuberantes. Requiere extremos romos o 5' protuberantes (s decir, 3' "hacia adentro"). Utiliza Mg+2 como cofactor. Los productos que se obtienen son HOTambien tiene actividad 3 ' fosfatasa. DNA (dc/sc). Los enlaces fosfodiester internos no se hidrolizan. Tambien tiene actividad RNAasa H. Una aplicacin bastante curiosa s que puede hacer degradaciones anidadas; s decir 1 a 1. Nosotros decimos cuando queremos que pare!!!!. Va bien para observar que bases controla un gen. No degrada grupos tiofosfatos. * FOSFATASA ALCALINA: Desfosforila. DNA o RNA (sc / dc). Deja un grupo 5' desfosforilado. Produce una mella. Es capaz de degradar el extremo 5' pero NO del nick. Con un poco de desnaturalizacin alcalina entonces tambien ataca al extremo 5' del nick. * FOSFATASA QUINASA: Fosforila extremos 5' hidroxilos. DNA o RNA (sc / dc). Aadimos ATP + Mg y el producto s fosforilacin del extremo 5' + ADP. (=es quinasa) s facil de marcar con 32 P. Tiene que ser muy pura ya que hay muchas reacciones parasitrias. Podemos hacer intercanvio. Podemos marcar aunque est el extremo 5' fosforilado. Hacemos intercambio y ademas marcamos con 32 P. Ponemos exceso de ADP para que la reaccin est un poco desplazado a la izquierda; no tan a la derecha. Usos: - Marcar extremos - Visualizar diana (=los productos obtenidos sn pequeos) - Dirigir unin de fragmentos ya que se necessita que esten fosforilados. * T4 DNA LIGASAS: Liga extremos cohesivos y romos. Tiene mas eficiencia que E.Coli DNA ligasa. Necesita extremos 5' fosfatados. * E.Coli DNA LIGASA: Slo liga extremos cohesivos. Necesita extremos 5 ' fosforilados. s menos eficiente. * NOTA: Si tratamos con fosfatasa NO hay extremos 5' fosforilados; entonces la ligasa NO une. s ahora cuando ponemos nuestro DNA de inters y ligamos.!! Evitamos as concatenarios.!! CONECTORES: Fragmentos de sntesis que contienen una diana de inters. Sn fragmentos de dc con una diana y un poquito ms para facilitar el reconocimiento.</p> <p>* NOTA: Siempre y solo siempre que NO hayan dianas dentro de nuestro DNA de inters o si estn metiladas. Abrimos el plsmido y PUM !!! Lo metemos de forma orientada adems. Podemos minimizar los productos secundrios (=Logramos reducir los concatenrios) 1 / 3 / 04 * TRANSFERASA TERMINAL: Addicina nucletidos al extremo 3 ' pero tienen que ser protuberantes.. Utiliza DNA (sc/dc). No copia molde as que si aadimos T al medio genera una cola de poli T. Si ponemos 2 nucletidos los aade al azar.! Para utilizarla en dc DNA mejor hacer una desnaturalizacin con Ca+2 en vez de con Mg+2. Apriori funciona mejor con extemos 3 ' protuberantes.</p> <p>2 / 3 / 04</p> <p>TEMA 3 PLSMIDOS</p> <p>Conceptos Bsicos: Vector: Vehculo de clonacin. Aporta un origen de replicacin y aporta un gen marcador. Podemos observar entonces qu cel.lula ha recibido plsmido y cual NO. (Lleva implcito la supervivncia). Hay una transformacin de aquella cl.lula que lo ha recibido. E.Coli como clula husped: - Generalidades: De E.Coli se utiliza la cepa K-12. Es muy conocida gentica y bioqumicamente. El DNA recombinante s estable dentro de E.Coli y puede llegar a acceptar varios plsmidos. Adems E.Coli permite producir muchas protenas. s un hesped "hospitalario" NO modifica los plsmidos ni los estropea; los replica fielmente. *NOTA: Para que E.coli accepte un plsmido hay que volverla COMPETENTE. Se hace un tratamiento a base de CaCl2 y luego un tratamiento de xoque trmico; as se logra que E.coli accepte el plasmido en qestin. Hay ciertas desventajas tambin. E.Coli produce una toxina (=lipoprotena) que contamina. En eucariotas los RNA son sometidos a ciertas modificaciones pre o post-taducionales (=SPLICING) (Se eliminan intrones, se metilan o glucosilan, etc....). Esto E.Coli NO lo puede hacer, as pues hay que tenerlo en cuenta tambin a la hora de trabajar con ellas. Podemos eliminar intrones artificialmente o buscar rutas alternativas. - Discriminacin entre cl.lulas transformadas y NO transformadas. De la cepa K-12 hay muchas sub-cepas. Se utilizan cepas mutadas con problemas de restriccin de DNA (degradacin), o de metilacin. Depende de el protocolo ( = via de sntesis) que vayamos a utilizar.</p> <p>MARCADORES DOMINANTES: Dan resistncia a la clula a ciertos antibiticos. En cuanto entra junto al plsmido manda!!. AMPR: (Degrada la paret bacteriana). B-lactamasa destruye la AMP (=ampicilina) CAMR: Sintetiza una CAT (transferasa). sto metila al antibitico y deja de ser nocivo para ella. TETR: (Bloquea la sntesis de pared). Fabrica un transportador que bombea al exterior la tetraciclina. KANR: (Bloquea la sntesis de pared). Esto metila al antibitico y deja de ser nociva para ella.</p> <p>SELECCIN DIRECTA: Utilizamos sub-cepas mutadas, para que tengan que utilizar algn sustrato que nosotros aadamos al medio. Pro AB: Cepas que necessitan prolina para vivir. Se llaman auxotrofas para prolina. Pro AB + : Ellas mismas fabrican prolina. En un medio SIN prolina son capaces de crecer.!!!</p> <p>Otra manera de seleccin , s con el OPERON LAC. (PAG 2-3) El opern lac transcibe para la B-glactosidasa. Generalmente est inhibido; hay una protena que hace "saltar" a la polimerasa y no deja transcribir el gen. En presncia de lactosa, sta inhibe el inhibidor de tal manera que el opern lac ahora si que se transcribe!!!. Fabrica B-galactosidasa, sta enzima degrada la lactosa. La B-galactosidasa consta de 2 sub-unidades. La y la . Solas no funcionan, es decir, se necesitan las 2 para que la B-galactosidasa sea funcional. Sabemos que B-gal y X-gal (5,Br - 4,Cl - 3,indol - B-D-galactosa ) forman un cromforo de color azul. Se suelen utilizar cepas que contengan 1 subunidad; por ejemplo la . El plsmido que aadimos contiene la informacin para codificar la sub-unidad y adems nustro vector. As pues , en un medio que contenga X-gal se puede discernir entre cepas transformadas y cepas NO transformadas. Las transformadas sern azules. (=se observaran a simple vista). 3 / 3 / 04 dam: Metila adeninas. dcm: Metila citosinas GATC --&gt; G mATC. CC(AT) GG --&gt; C mC(AT) GG.</p> <p>*NOTA: Muchas enzimas de restriccin NO cortan DNA's metilados. Es mejor buscar cepas de E.Coli que NO tengan metilasas que interfieran en la diana que queremos !! Plsmidos: Cerrados covalentemente; sn elementos genticos accesorios que se replican y se heredan de manera independiente al cromosoma bacteriano. Para replicarse necesitan la maquinria apropiada, y para transcribirse tambin. Muchos plsmidos confieren beneficios para l...</p>