UNIVERSIDAD NACIONAL DANIEL ALCIDES CARRION

UNIVERSIDAD NACIONAL DANIEL ALCIDES CARRION2015

UNIVERSIDAD NACIONAL DANIEL ALCIDES CARRIONFILIAL LA MERCEDFACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIASE. F. P. EN INGENIERIA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

RECONOCIMIENTO DE LA ACTIVIDAD BIOCATALITICA DE LAS ENZIMAS

CATEDRA:BIOTECNOLOGIA DE ALIMENTOS

CATEDRATICO: ING. OTAROLA GAMARRA, Antonio

INTEGRANTES: HURATDO MONTOYA, Raquel

SEMESTRE : VIII

LA MERCED CHANCHAMAYO

2015

I. INTRODUCCIN

Las enzimas han sido aplicadas a usos prcticos durante miles de aos, en forma de preparaciones crudas de plantas o de animales, o como consecuencia permitido por los microorganismos y han sido conscientemente aplicadas en operaciones industriales a lo largo del presente siglo. Sin embargo, la produccin controlada de enzimas derivadas de microorganismos es relativamente ms reciente y es un sector importante de la biotecnologa industrial. Goldstein (1991)

Algunos de los carbohidratos de los alimentos son polmeros, por ejemplo, celulosa, pectinas, almidones y pueden ser sujeto a una degradacin enzimtica, por lo que se debe sealar que existen dos maneras principales en que una enzima hidrolitica interacciona con un sustrato polimrico. La actividad o de las exoenzimas, remueve una unidad del polmero de alguno de sus extremos, mientras las endoenzimas tiene la capacidad de romper enlaces internos en cualquier punto de la cadena polmero. Badui, (2006)Dependiendo de la magnitud de la hidrolisis por la enzima empleada, resultan cadenas de diferentes longitudes, entre las que se encuentran dextrosa, maltosa, oligosacaridos y polisacridos de cadena corta.La -amilasa es una endohidrolasa que actual de manera aleatoria sobre los enlaces rnos -(1-4) de la amilosa y de la amilo pectina, con lo cual se producen dextrinas de 10 a 20 unidades de glucosa.La actividad de las amilasas hace que el almidn se convierta en malto dextrinas, que son de gran calidad en la industria alimentaria. Estas a su vez, sirven de sustrato para llevar a cabo tres transformaciones

II. OBJETIVOS

Evaluar la actividad biocatalitica de las enzimas de inters en los procesos agroindustriales.

Reconocer la especificidad amilolitica, pectinolitica y proteoltica de enzimas comerciales.

III. REVISIN BIBLIOGRFICA3.1 DefinicinUna enzima es una protena que cataliza las reacciones bioqumicas del metabolismo. Las enzimas actan sobre las molculas conocidas como sustratos y permiten el desarrollo de los diversos procesos celulares.Es importante determinar adems de todo lo expuesto que las enzimas se caracterizan por contar con una serie de seas de identidad propias que las determinan en todos y cada uno de sus aspectos. En este sentido podemos exponer, por ejemplo, que poseen la capacidad para contar con unos tamaos muy diferentes de tal modo que hay desde las que tienen 2.500 aminocidos hasta las que, sin embargo, rondan los 50.Y adems poseen elementos fundamentales para su funcionamiento tales como el centro activo o la cadena de aminocidos, entre otros muchos ms.Es importante destacar que las enzimas no modifican el balance energtico ni el equilibrio de aquellas reacciones en las que intervienen: su funcin se limita a ayudar a acelerar el proceso. Esto quiere decir que la reaccin bajo el control de una enzima alcanza su equilibrio de manera mucho ms rpida que una reaccin no catalizada.Se estima que las enzimas catalizan cerca de 4.000 reacciones bioqumicas diferentes3.2. Revisin de enzimas de importancia en alimentos3.2.1. CarbohidrasasAlgunos de los carbohidratos de los alimentos son polmeros, por ejemplo, celulosa, pectinas, almidones y pueden ser sujeto a una degradacin enzimtica, por lo que se debe sealar que existen dos maneras principales en que una enzima hidrolitica interacciona con un sustrato polimrico. La actividad o de las exoenzimas, remueve una unidad del polmero de alguno de sus extremos, mientras las endoenzimas tiene la capacidad de romper enlaces internos en cualquier punto de la cadena polmero. Badui, (2006)3.2.2. AmilasasLa -amilasa son endoenzimas que catalizan la hidrolisis al azar de los enlaces -(1-4)glicosdicos de la regin central de las cadenas de amilosa y amilopectina excepto en las proximidades de los puntos de ramificacin.La -amilasa es una endohidrolasa que actual de manera aleatoria sobre los enlaces -(1-4) de la amilosa y de la amilo pectina, con lo cual se producen dextrinas de 10 a 20 unidades de glucosa; se le da el nombre de enzima licuante debido a que su presencia provoca la rpida reaccin de la viscosidad de las soluciones de almidn. Es capaz de romper las uniones glucosidicas adyacentes a ambos lados del enlace -(1-6) de la amilo pectina, aunque no ataca especficamente este enlace. Las -amilasa bacterianas proviene principalmente del genero (bacillus subtitis, B. licheniformis) son mtalo-enzimas dependientes del ion calcio que les ayuda a mantener su actividad y las estabiliza contra desnaturalizacin trmica y degradacin proteasas. Badui, (2006).3.2.3. PectinasaLas preparaciones de pectinas contienen al menos 6 enzimas que cortan la pectina en diferentes sitios en la molcula.La estructura bsica de la pectina es cido glucornico con uniones -(1-4) con hasta el 95% de sus grupos carboxilo esterificados con metanol.Las pectinasas se clasifican de acuerdo con el sitio de ataque sobre la molcula de pectina. David (1991)La textura de las frutas y las verduras se debe a la presencia de pectinas que forman parte de la red celular, por lo que la accin de las pectinasas altera las caractersticas de estos alimentos. Badui, (2006).3.3. Factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimticas

3.3.1 Efecto de la temperatura No sucede con cualquier otro reaccin qumica, la velocidad de las reacciones enzimticas se incrementa con la temperatura, al aumentar la energa cintica de las molculas, pero solo en el intervalo que la enzima es estable y retiene su capacidad cataltica; en casos extremos, cuando el incremento es muy grande, se favorece la desnaturalizacin y consecuentemente la protena pierde su capacidad cataltica. Existen varios factores que adems de la estabilidad conformacional, tambin afecta la actividad enzimtica al aumentar la temperatura, y son: la solubilidad de gases (oxigeno), el pH de la solucin amortiguadora, la afinidad de la enzima por el sustrato, por activadores o inhibidores, da como la presencia de reacciones de competencia. Por esta razn, cada enzima tiene un intervalo optimo de temperatura en el cual se logra la mayor actividad, para la mayora esta entre 30 y 45C que inactiva a mas de 60C, a esta temperatura la energa introducida en el sistema sobrepasa la energa de las fuerzas que mantiene la estructura activa de las enzimas. Badui, (2006).3.3.2 Efectos del PhLa actividad de las enzimas dependen fuertemente de la concentracin de iones hidronio del metil ya que esto afecta el grado de ionizacin de los aminocidos de las protenas, incluyendo a los sitio activo, del sustrato, de echo el fluye en la estructura tridimensional de la protena y a su vez, sobre la afinidad que tenga la enzima por el sustrato. Badui, (2006).3.3.3 Efecto de la concentracin de sustrato Una enzima funciona de manera ms eficiente cuando la concentracin de sustrato esta en exceso relacin con la concentracin de enzimas. Esto se debe a que las colisiones exitosas con el reactivo son ms frecuente, asegurando asique la mayor cantidad de enzima se encuentre activos. E n condiciones, el producto se obtiene a la mxima velocidad posible para la cantidad de enzimas. En caso que la concentracin sea menor, la velocidad de reaccin disminuye de acuerdo con el comportamiento. Es te aspecto es muy importante en la caracterizacin cintica de una enzima.3.3.4 Efecto de la actividad de aguaLos alimentos se deshidratan para evitar el crecimiento microbiano, sin embargo en estas condiciones perduran la accin de muchas enzimas. Las verduras y futas deshidratadas estn sujetas a reacciones de deterioro cuando no se inactivan sus enzimas con un tratamiento de escaldado.

3.4. Clasificacin de las enzimasLa comisin de Enzimas de la Unin Internacional de Bioqumica introdujo en 1964, para uniformar la nomenclatura, la siguiente clasificacin sistemtica, en la cual se consideran 6 grupos principales de enzimas de acuerdo al tipo reaccin implicada: Oxidorreductasas: Catalizan una amplia variedad de reacciones de xido-reduccin, empleando coenzimas, tales como NAD+y NADP+, como aceptor de hidrgeno. Este grupo incluye las enzimas denominadas comnmente como deshidrogenasas, reductasas, oxidasas, oxigenasas, hidroxilasas y catalasas. Transferasas: Catalizan varios tipos de transferencia de grupos de una molcula a. otra (transferencia de grupos amino, carboxilo, carbonilo, metilo, glicosilo, acilo, o fosforilo). Ej.: aminotransferasas (transaminasas). Hidrolasas: Catalizan reacciones que implican la ruptura hidroltica de enlaces qumicos, tales como C=O, C-N, C-C. Sus nombres comunes se forman aadiendo el sufijo -asa al nombre de substrato. Ejs.: lipasas, peptidasas, amilasa,maltasa, pectinoesterasa, fosfatasa, ureasa. Tambin pertenecen a este grupo la pepsina, tripsina y quimotripsina. Liasas: Tambin catalizan la ruptura de enlaces (C-C, C-S y algunos C-N, excluyendo enlaces peptdicos), pero no por hidrlisis. Ejs.: decarboxilasas, citrato-liasa, deshidratasas y aldolasas. Isomerasas: Transforman sus substratos de una forma isomrica en otra. Ejs.: Epimerasas, racemasas y mutaras. Ligaras: Catalizan la formacin de enlace entre C y O, S, N y otros tomos. Generalmente, la energa requerida para la formacin de enlace deriva de la hidrlisis del ATP. Las sintetasas y carboxilasas estn en este grupo.

3.5. Aplicaciones industrialesDurante la germinacin de cereales las actividades de - y -amilasa se incrementan considerablemente. Esta es una funcin importante en la produccin de malta a partir de la cebada, el proceso llamado de malteo, etapa esencial en la elaboracin de cerveza. Este cereal contiene en el endospermo una cantidad abundante de -amilasa y en el momento de iniciarse la germinacin del grano se sintetiza la -amilasa por accin de las hormonas giberelinas. Las dos enzimas degradan el almodn producen dextrinas, maltosas, maltosas, glucosa y malto triosa, sustratos que aprovechan las levaduras empleando el la fabricacin de la cerveza. Si hubiera una hidrlisis de almidn insuficiente, se reflejaran en la fermentacin lenta o en la produccin de bajo contenido de alcohol. Para evitar estos defectos se encomienda agregar -amilasa exgena. Tambin se puede agregar pululanasa o glucoamilasa para realizar la hidrlisis total del almidn, en la produccin de cervezas ligeras, ya que todo el carbohidrato puede transformar en etanol. Badui, (2006).A. Panificacin El gluten de trigo Las protenas del gluten pueden separarse en virtud de sus diferentes solubilidades. Las mas solubles, las gliasinas se extrae al 100% las gliadinas dan aproximadamente 1/3 del gluten. Los otros dos tercios estn formados por gluteninas extremadamente difciles de disolver. Una disolucin de 0.1mol dm-3 de acido etanoico, tres moles dm-3 de urea y 0.01moldm-3 de bromuro de cetiltrimetilamonio (centrimida) disuelve el 5% de las gluteninas. Los conocimientos actuales sobre la estructura molecular de las protenas del gluten nos permiten explicar, en parte, las peculiares caractersticas de solubilidad y capacidad de masa que ofrecen. Mediante elaboradas tcnicas electroforticas, se han podido demostrar que una sola variedad pueden tener mas de 40especies molecular distintas de gliadina. La mayor parte de ellas tiene masa molecular relativas de 30.000-40.000 son muy parecidas, aunque todas ellas difieren un poco, en composicin aminoacida. Su contenido en glutamiona (36-45mol%) y prolina (15-30mlo%) son epcepcionalmente alto, en comparacin con los otros protenas. El elevado contenido en estos dos aminocidos y la riqueza de los mismos nitrgenos ofrecen una numerosa ventaja para su utilizacin, por la semilla en germinacin, como fuente de nitrgeno y carbono. Coultate, (1996).B. Produccin de edulcorantesA una solucin de almidn gelatinizado se le aade una -amilasa bacteriana termiresistente (B. licheniformis) que este poco contaminada con proteasas para que la protena que contiene este polisacrido no se convierta parcialmente en aminocidos que propician reacciones de oscurecimiento no enzimtico, dado una mala apariencia al producto final. Comercialmente existen preparaciones amilasas con una accin proteoltica baja.La actividad de las amilasas hace que el almidn se convierta en malto dextrinas, que son de gran calidad en la industria alimentaria. Estas a su vez, sirven de sustrato para llevar a cabo tres transformaciones: a) si se incuba con una amiloglucosidasa (en ocaciones combinada con una pululanasa), rece la hidrlisis prcticamente total (97-98%) y se produce D-glucosa; este azcar se transforma en fructosa por mediacin de la glucosa isomerasa, generalmente en forma inmovilizada; b) las trinas en presencia de una amiloglucosidasa y la -amilasa se convierte en jarabes glucosados equivalentes de dextrosa de 42 a 63, y c) la sola actividad de la -amilasa sobre las dextrinas genera una mezcla rica en maltosa. Coultate, (1996).IV. MATERIALES Y MTODOSa. Materiales Olla Termmetro Fiolas de50 ml Tubos de ensayo Gradilla Cuchillob. Insumos Gluten de trigo Alfa-amilasa Enzima proteasas Enzima pectinasasc. Procedimiento

Preparacin de las enzimas Preparamos una solucin de Alfa-amilasa al 1% en volumen de 50 ml.

Preparacin de los sustratos Apartir de 175 gr de harina de trigo extraimos el gluten mediante lavados sucesivos del almidn. Preparar una solucin de fcula al 10% en un volumen de 100ml. Preparamos una solucin de pectina comercial al 11% en volumen de 100ml.

Despolimerizacin del almidn Colocamos en tubos de ensayo de 5ml (6 tubos) de almidn y colocamos en una gradilla. Introducimos la gradilla en bao maria a 70 C Llegado a dicha temperatura adicionamos 1ml de solucin de enzima alfa-amilasa, y mantuvimos durante 0,2,4,6,8,15,20 min Enfriamos los tubos y registramos los Grados Brix Luego adiionamos 2ml de agua destilada y 2ml de la solucin coloreada de acido 3,5-dinitrisalislico y lo pusimos en reaccin durante 8 min Realizamos la comparacin de la varacion del color de las muestras Despolimerizacin del gluten del trigo Pesamos cantidades iguales de gluten y colocamos en lunas de reloj Adicionamos 10ml de la solucin de papana, incluyendo un testigo sin la enzima Registramos los cambios fsicos realizados (textura,ablandamiento, etc.)para comprobar si existe o no actividad proteoltica

Despolimerizacin de la pectina Colocamos 10 gr dela solucin de pectina (gelificada)en vasos de 50ml Adicionamos la enzima biopectinasa en las concentraciones de 2,4,8,10 ml e hicimos reaccionar durante 5 min Llevamos a bao maria a la temperatura de 40 C con agitacin constante y lenta Comprobamos el grado de despolimerizacin (viscosidad, textura, apariencia)comparando con el testigo sin enzima

V. RESULTADOS Y DISCUSIONES5.1. RESULTADOSA. Despolimerizacin del almidn:

MedicinTiempo de reacciones (alfa amilasa)

0min2min 4min8min15min20min

Brix inicial0brix

Brix finales 01344.85

Pudimos observar la destrinizacion del almidn, podemos observar que mas minutos a bao mara a 70C se puede ver mayor grados brix, ya que el almidn se a convertido en azcar con la accin de la enzima alfa-amilasa

5.2. Despolimerizacin del gluten de trigo:

formaTestigomuestra

texturadurosuave

ablandamientoelsticoblando

Despus de verter la enzima proteasa (papana) en el gluten del trigo, lo dejamos por 30minutos, y vimos los cambios fsicos.

B. DISCUSIN

Segn David (1991). Menciona que el hidrolizado del almidn afecta el gusto, la dulzura y la textura de los productos alimenticios.Para producir hidrolizado del almidn, el almidn debe ser convertido primero en pasta a 60-90C. En la prctica se pudo observar que el almidn que contiene el chuo se hidrolizo con la accin de la enzima de alfa-amilasa despus de haberlo llevado a temperaturas de 70C

Segn Badui (2006). Menciona que las enzimas proteasas o protenas hidrolizan el enlace pptidico de las protenas. Existen proteasas de origen vegetal (papana, fisina, bromelina). En la prctica obtuvimos la papana de la papaya, lo vertimos en las placa que contienen gluten y pudimos observar que hidrolizaron a las protenas, pues la textura del gluten era blanda y se deshacan, en cambio del testigo era duro y elasticoSegn Badui, (2006). Menciona que, existen varios factores que adems de la estabilidad conformacional, tambin afecta la actividad enzimtica al aumentar la temperatura, y son: la solubilidad de gases (oxigeno), el pH de la solucin amortiguadora, la afinidad de la enzima por el sustrato, por activadores o inhibidores, da como la presencia de reacciones de competencia. Por esta razn, cada enzima tiene un intervalo optimo de temperatura en el cual se logra la mayor actividad, para la mayora esta entre 30 y 45C que inactiva a mas de 60C, a esta temperatura la energa introducida en el sistema sobrepasa la energa de las fuerzas que mantiene la estructura activa de las enzimas. En la prctica pudimos observar en la despolimerizacin del Almidn, lo llevamos los tubos de ensayo con la solucin de almidn a bao mara a una temperatura de 70C y se introduso 1 ml de enzima Alfa- amilasa la enzima activada lo inactivamos a ebullicin durante5 minutos.

VI. CUESTIONARIO1. Cual es el principio del modo de reaccin del acido 3.5-dinotrosalisilico.El reactivo consiste en una disolucin formada por los siguientes compuestos: cido 3,5-dinitrosaliclico, que acta como oxidante, tartrato sdico-potsico, que impide la disolucin de oxgeno en el reactivo e hidrxido sdico, que aporta el medio requerido para que se produzca la reaccin rdox. De esta forma, el cido 3,5-dinitrosaliclico se reduce, en presencia del grupo reductor del almidn, formando el cido 3-amino-5-nitrosaliclico, mientras que el grupo aldehido reductor se oxida, para formar un grupo carboxlico. En este mtodo analtico el cido 3,5-dinitrosaliclico est en exceso frente a los grupos reductores y en todas las muestras se adiciona la misma cantidad, de tal forma que mayores concentraciones de azcares reductores provocan una mayor coloracin de la muestra. Estas diferencias de coloracin pueden determinarse por espectrofotometra visible a, la longitud de onda mxima absorbancia de 540 nm.2. Como se explica las faces de la cintica enzimtica durante su accin biocataltica.La cintica enzimtica tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas, as como los factores que en ella influyen y los mecanismos por los cuales transcurren en la cual se distinguen en tres fases.

En la cintica enzimtica se distinguen tres fases: Para una concentracin baja de sustrato: La velocidad de la reaccin es directamente proporcional a la concentracin del sustrato (relacin lineal), la cintica es de primer orden. Para una concentracin alta de sustrato: La velocidad de la reaccin se hace prcticamente constante e independiente de la concentracin de sustrato, la cintica se considera de orden cero. Para concentraciones de sustrato intermedias: Lla velocidad del proceso deja de ser lineal, y a esta zona se la denomina de cintica mixta.

3. Explicar el mecanismo de accin biocataltica de las enzimas en sus respectivos polmeros.

Accin de la alfa-amilasa en el sustrato de almidn:

La alfa amilasa, o 1,4-alfa-D-glucano hidrolasa, es una enzima que pertenece al grupo de las hidrolasas. Este tipo de enzimas se caracterizan por romper de romper enlaces o-glucosdicos mediante la introduccin de una molcula de agua. La alfa amilasa en concreto, ataca las uniones entre los monmeros que constituyen el almidn siempre y cuando la cadena de almidn contenga tres o ms unidades lineales de glucosas unidad por enlace alfa- 1,4. Los productos resultantes de la hidrlisis del almidn por parte de la alfa-amilasa se denominan dextrinas, compuestos de gran utilidad como adhesivos y como agentes espesantes de alimentos preparados. Accin de la papana en el sustrato de gluten:

La papana bruta, contiene un poco de agua, glcidos, cidos orgnicos y una mezcla de enzimas, donde destacan las denominadas proteasas que actan rompiendo los enlaces peptdicos en cualquier lugar de la cadena peptdica en la que se hallen situados (endopeptidasas). Dentro de estas enzimas proteolticas, la que se encuentra en mayor cantidad es la papana, de la que se distinguen la papana I o papana propiamente dicha y la papana II o quimopapana, que es ms estable en medio cido, pero su actividad proteoltica es cuantitativamente menos marcada que la de la anterior, pus slo coagula la leche. Adems tambin contiene pequeas cantidades de otros enzimas: papaya peptidasa A, lipasa y lisozima (enzima que rompe las paredes de las clulas bacterianas).

VII. CONCLUSIN

Se Conoci la actividad biocatalitica de las enzimas de inters en los procesos agroindustriales. Se conoci la especificidad amilolitica, pectinolitica y proteoltica de enzimas comerciales.

VIII. BIBLIOGRAFA

Badui, Dergal, Salvador, (2006). Qumica de los alimentos. Cuarta edicin. Pearson educacin, Mxico. T. P. Coultate, (1996). Manual de qumica y bioqumica de los alimentos. Editorial Acribia, S.A. 2da edicin. Zaragoza (Espaa). Badui, D. (2006). Qumica de los alimentos. 4ta. edicin. Mxico, Ed. Addison Wesley Longman de Mexico, S.A. de C.V. pp 716. David S. Robinson(1991).Bioqumica valor nutritivo de los alimentos.Editorial Acriba S.A. Zaragosa (Espaa) J. Bulock B. Kristien Biotecnologia Basica (1991) editorial acriba S.A Espaa Biotecnologa de lafermentacion (1989) OWEN P. WARD editorial acriba S.A

IX. ANEXOS

Preparado solucion de papainaPreparando el gluten de trigo

Obtencin el gluten del trigo

Lavando el gluten Solucion del almidonPreparando la biopectinasa

Llevado a bao mara Adicionando 1ml de enzima alfa amilasa

Resultado del almidn Pesado partes iguales de gluten

Adicionando la papana Resultados del gluten de trigo

juan cinthia2