Produção de Proteínas

Recombinantes

Faculdade de Medicina Dentária da Universidade do PortoFaculdade de Medicina Dentária da Universidade do Porto

Regente:Prof. Dra. Deolinda LimaRegente:Prof. Dra. Deolinda Lima

Orientadora: Dra. Alexandra GouveiaOrientadora: Dra. Alexandra Gouveia

Discentes: Andreia PiresDiscentes: Andreia Pires

Benedita AguiarBenedita Aguiar

Bruna GonçalvesBruna Gonçalves

Catarina OliveiraCatarina Oliveira

O que são proteínas recombinantes?São proteínas produzidas artificialmente a partir de genes

clonados. Isto é, advêm da técnica de DNA recombinante.

Para que servem? A produção de proteínas recombinantes permite obter benefícios

em várias áreas: - saúde; - biologia; - bioquímica; - microbiologia; - genética; - biotecnologia; - agricultura; - etc.

Terapia génicaPossibilidade de introdução de um gene num organismo e

consequente correcção de doenças genéticas.

Melhoramento animal e vegetalPlantas resistentes a pragas e a

diferentes meios nutritivos.Animais de maiores dimensões,

mais férteis e carne com maior qualidade.

Criação de modelos animaisIdeais para o estudo da estrutura, função e regulação de um gene,

além de facilitar a compreensão da fisiopatologia da doença.

Algumas aplicações

www.dqb.fc.ul.pt

Técnica de produção de proteínas recombinantes

• Isolar e preparar o DNA;• Escolher o vector apropriado;• O fragmento de DNA a clonar é introduzido em vectores de clonagem, formando-se o DNA recombinante.• O DNA recombinante é inserido na célula hospedeira – transformação, que possui mecanismos enzimáticos para a replicação do DNA e para a síntese proteica;• Selecção e identificação de células que incorporam o DNA recombinante;• Verificar se a proteína foi expressa;• Remoção e purificação das proteínas.

The Cell- A Molecular Approach;Cooper, Geoffrey M..

Algumas enzimas envolvidas no processo

Enzimas Função

Tipo II (endonuclease de restrição) Cortam os DNAs em sequências de bases específicas.

DNA ligase Juntam duas moléculas de DNA ou fragmentos.

Taq DNA polimerase Adiciona os nucleotídeos na extremidade 3´ da cadeia de DNA.

Transcriptase reversa Produz uma molécula de DNA através de uma molécula de RNA.

● Enzimas de restrição- EndonucleasesEnzimas de restrição- Endonucleases Os fragmentos de DNA usados para criar moléculas Os fragmentos de DNA usados para criar moléculas recombinantes são normalmente gerados por digestão através de recombinantes são normalmente gerados por digestão através de endonucleases de restrição. endonucleases de restrição.

. Conhecem pequenas sequências específicas com 4 a 6 . Conhecem pequenas sequências específicas com 4 a 6 pares de bases.pares de bases.

. São designadas por três letras: EcoRI, HindIII.. São designadas por três letras: EcoRI, HindIII.

Vectores de clonagem Capaz de transportar uma sequência de DNA estranha dando

origem a um DNA híbrido ou recombinante. Capacidade de se auto-replicar. Conter pelo menos um gene que confira resistência a antibióticos. Possuir locais de restrição únicos, polylinker. Fácil de purificar.

Tipos de vectores de clonagem• Plasmídeos (pBR322)• Fasmídeos ou fagemídeos • Cosmídeos• Bacteriófagos λ• YACs, BACs e PACs

www.biologianaweb.com/ Livro2/C11/pbr322.html

Vectores de expressão

Promotor Codão de iniciação seguido de polylinker Local de ligação ao ribossoma

www.icampus.ucl.ac.be/. ../expression.html

Promotor

Local de ligação ao ribossoma

Sítio de clonagem e sequência codificante de 6 histidinas

www.icampus.ucl.ac.be/. ../expression.html

Transformação

Ocorre quando uma célula incorpora e exprime um fragmento de material genético.

Para a introdução do DNA recombinante podem ser utilizados vários métodos:

• Células competentes;• Electroporação;• Bombardeamento de DNA

revestido de Tungsténio;• Microinjecção;• Transfecção.

Modern Genetic Analysis.

Extracção e purificação de proteínas• Extracção lise celular

• Purificação

Cromatografia de afinidade

Lehningher Principles of Biochemistry

Tags moleculares de fusão

Fusion Tag Immobilized Ligand

Binding Conditions Elution Conditions Available Formats

Glutathione (S-transferase(GST)

Reduced glutathione

Neutral (physiologic) pH, and non-denaturing; glutathione must be reduced and GST must be active

Free reduced glutathione at neutral pH (competitor)

Prepacked column kits, spin cup column kits, SwellGel Discs, coated microplates

Histidine-tagged Chelated Nickel or Cobalt

Neutral (physiologic) pH without reducing or oxidizing agents; small tag must be accessible in fusion protein structure; high ionic strength and denaturants (chaotropes such as 8 M urea) compatible.

>200 mM Imidazole, low pH, or strong chelators

Prepacked column kits, spin cup column kits, SwellGel Discs, Swell- Gel Discs in 96-well filter plates, coated microplates

Maltose Binding Protein (MBP)

Dextrin Neutral (physiologic) pH and non-denaturing; NaCl added to reduce nonspecific binding

Maltose at neutral pH (competitor)

Gel slurry, coated microplates

Green Fluorescent Protein (GFP)

Anti-GFP antibody Neutral (physiologic) pH and non-denaturing

Usual antibody/antigen elution buffers (e.g., low pH or chaotropic salts)

Coated microplates

Proteínas Recombinantes

Exemplos de Proteínas Recombinantes

Hormona de crescimento humano – a administração desta hormona durante a infância permite a correcção dos casos de nanismo.

Anticoagulantes – activadores de tecido plasminogénio que por sua vez activam a plasmina, enzima que dissolve os trombos (evita ataques cardíacos).

Dismútase do superóxido – previne danificação de tecidos quando este é exposto à falta de oxigénio.

Anticorpos monoclonais – são usados em testes diagnósticos; transporte direccionado (drogas, toxinas, componentes radioactivos utilizados na terapia cancerígena), assim como outras aplicações.

ioh.medstudents.com.br/ humoral.htm

Referência cronológica

1922 - Frederick Grant Banting descobre a insulina.

1978 - É produzida insulina humana recombinante.

1982 - Esta insulina é disponibilizada no mercado.

Insulina

Insulina- Duas cadeias peptídicas- cadeia A e cadeia B.

- Duas pontes dissulfureto entre as cadeias A e B e outra na própria cadeia A.

Insulina recombinante

Insulina lispro

http:\\bio.chm.nu.edu\resources\webproject\rasHol\tutorial\isulina4.htm

http:\\bio.chm.nu.edu\resources\webproject\rasHol\tutorial\isulina4.htm

Monómeros- Insulina é activa na forma de monómeros.

Dímeros – pontes de hidrogénio entre as extremidades C da cadeia B.

Hexameros – na presença de Zn 2+

Produção de insulina Insulina proveniente de suínos e bovinos

Insulina humana biossintética

Introduction to Genetic Analysis.

Β-gal

Β-gal peptide

Purify β-gal- insulin fusion proteins

X-PROT

Unidade de investigação e desenvolvimento na área da

biotecnologia molecular.

Produção de proteínas recombinantes de interesse para

a saúde humana.

Desde 2003, 5 novas proteínas.

Descoberta de proteína com enorme potencial para

terapia do cancro.

Prémio da Comissão Europeia em 2004.

Bibliografia "The Cell. A Molecular approach."- 3nd ed. G.M. Cooper, AMS Press, U.S.A.

2004. "Molecular Biology of the Cell." - 4 nd ed., Alberts, Bray, Lewis, Raff,

Roberts and Watson, Garland Publishing, Inc. New York, 2002. Nelson D.L., Cox M.M.: Lehningher Principles of Biochemistry (4th Ed.).

W.H. Freeman and Company, New York. 2005. http://www.fortunecity.com/campus/biology/752/dnarec.htm http://www.novodordisk.pt/documents/article_page/document/insulina.asp www.biotecnologia_na_escola.up.pt www.terravista.pt/FerNoronha/5802/genetica.htm www.institutovirtual.pt www.dqb.fc.ul.pt www.mces.pt www.aidscongress.net http://acl.com.sapo.pt/naodoping.htm http://www.saudenainternet.pt/guia/?file=guia-artigo&cod=76 www.piercenet.com