Expressão de Antígenos

Recombinantes para

Aplicação em Imunologia

Bióloga Mariana Monezi Borzi

Mestranda em Microbiologia Agropecuária

Laboratório de Imunologia e Virologia

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS – FCAV

CAMPUS DE JABOTICABAL

• Cópia das sequencias de nucleotídeos de uma molécula de DNA parental de fita dupla em duas moléculas filhas de DNA de fita dupla.

• Semi-conservativa

Replicação

Fita molde

Fita nova

É o processo pelo qual uma molécula de RNA é sintetizada a partir da informação contida na sequência de nucleotídeos de uma molécula

de DNA de fita dupla (gene)

Transcrição

Núcleo

Informação genética

Citoplasma

Consiste na transformação da mensagem contida no mRNA, via tRNA, na sequência de

aminoácidos que constituem a proteína.

Tradução

Expressão gênica

Exemplo: Estrutura de um gene procarioto

Expressão gênica

Polímero de aminoácidos de massa molecular acima de 10.000 Da, com cada aminoácido unido ao seu vizinho por um tipo específico de ligação

covalente.

Proteína

Ligações peptídicas

Ligações peptídicas

Pontes de hidrogênio

Ligações peptídicas

Pontes de hidrogênio

Ligações dissulfeto

Interações eletrostáticas

Forças de Van der Walls

Produção em larga escala de proteínas recombinantes - a partir da expressão de uma

molécula de DNA recombinante em um sistema de expressão adequado.

Tecnologia do DNA recombinante

Uso terapêutico

Estudos bioquímicos

- Estrutura 3D

Dificuldades a partir do tecido original

Células de mamíferos, células de insetos, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis e

Escherichia coli

Taxa de crescimento celular;

Complexidade do meio de

cultura;

Custo do meio de cultura;

Nível de expressão;

Capacidade de expressão

extracelular.

Capacidade de produzir as

modificações pós-tradução tais

como:

- enrolamento correto;

- formação das pontes dissulfito;

- glicosilação;

- fosforilação;

- acetilação.

Sistemas de Expressão

• Crescimento rápido, em um período curto de tempo, requerem pouco espaço físico e possuem uma nutrição fácil de ser suplementada.

• Genética relativamente simples e bem compreendida

• Único cromossomo de aproximadamente 4,6 milhões de pares de bases e completamente sequenciado

• Código genético quase universal

Escherichia coli

Vetor: molécula de DNA usada como um veículo para carregar sequências de DNA estrangeiras dentro de uma célula hospedeira.

Plasmídeos:

• Mais simples

(1.000 a 2.000 pb)

• Circulares

• Independentes do cromossomo bacteriano

Vetores de expressão

Expressão de proteína recombinante em E. coli

Clonagem do gene em vetor de expressão

Vetor linearizado Preparo do inserto

Reação de ligação

Plasmídeo recombinante

Transformação de E. coli

competente

Plaqueamento e seleção

dos clones recombinantes

Extração do

DNAp e

Sequenciamento

Indução da expressão da proteína recombinante

Tampão

de lise

Sonicação Purificação

Análise da expressão da proteína recombinante

Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS PAGE)

• Separação de proteínas conforme o peso molecular, as quais migram pelos poros do gel de poliacrilamida

• Quanto menor for o peso molecular da proteína mais facilmente ela migrará em relação às outras proteínas

• Após a corrida das proteínas pelos poros do gel, estas poderão ser visualizadas com a aplicação do corante Coomassie Blue

Preparo da amostra: dodecil-sulfato de sódio e 2-mercapto-etanol

Confere carga negativa Separa as cadeias

260 kDa

72 kDa

52 kDa

42 kDa

10 kDa

Caracterização por SDS-PAGE da Nucleoprotéina recombinante do

Vírus da Influenza Aviária expressa em E. coli.

Western blotting

• Técnica bioquímica utilizada para determinar a quantidade relativa e o peso molecular de uma proteína dentro de uma mistura de proteínas ou outras moléculas.

• Detecção de antígenos proteicos - uso de anticorpos específicos

72 kDa

52 kDa

42 kDa

260 kDa

10 kDa

Caracterização por Western Blotting da Nucleoprotéina

recombinante do Vírus da Influenza Aviária expressa em E. coli.

• Substâncias (moléculas) estranhas ao SI que são reconhecidas por receptores específicos em linfócitos B e T e também por anticorpos.

Antígenos

Anticorpos

• Proteínas do tipo imunoglobulinas com sítios específicos para interação com os antígenos e que são sintetizadas por linfócitos B e plasmócitos.

• O Ac se liga somente a uma parte do Ag, denominada epítopo ou determinante antigênico.

• Quando o parátopo do Ac se liga ao epítopo do Ag

Interação Ag-Ac

Epítopo linear ou contínuo Epítopo conformacional ou

descontínuo

Análise (mapeamento) dos epítopos

Aplicações em Imunologia

Imunodiagnóstico

• Sorologia - detecção de Acs contra antígenos virais e bacterianos específicos

Preparações antigênicas:

Propagação viral em ovos

Ultra-centrifugação

Expressão de proteínas

Imunodifusão em gel de agarose

Inibição da

Hemaglutinação

ELISA

Diagnóstico da Influenza Aviária

• Clonagem e expressão da NP do VIA

• Aplicação em testes de ELISA

• 121 soros testados

• Positivos – Acs presentes no soro reagiam com a NP recombinante

• Negativos – não ocorria reação

ELISA indireto

• Apresentam sequencias do material genético do agente infeccioso que codificam antígenos

Vacinas de DNA

Clonagem e expressão do gene (propagação)

Administração ao indivíduo (transfecção)

Células produzem a própria proteína (antígeno)

Resposta imunológica com memória

AIDS

Malária

Dengue

Tuberculose humana e bovina

Hepatite B

Raiva

Leptospirose

Teníase

Exemplos: vacinas de DNA

Perguntas?

OBRIGADA! mmborzi@gmail.com

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