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  • Expresso de Antgenos

    Recombinantes para

    Aplicao em Imunologia

    Biloga Mariana Monezi Borzi

    Mestranda em Microbiologia Agropecuria

    Laboratrio de Imunologia e Virologia

    UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP FACULDADE DE CINCIAS AGRRIAS E VETERINRIAS FCAV

    CAMPUS DE JABOTICABAL

  • Cpia das sequencias de nucleotdeos de uma molcula de DNA parental de fita dupla em duas molculas filhas de DNA de fita dupla.

    Semi-conservativa

    Replicao

    Fita molde

    Fita nova

  • o processo pelo qual uma molcula de RNA sintetizada a partir da informao contida na sequncia de nucleotdeos de uma molcula

    de DNA de fita dupla (gene)

    Transcrio

    Ncleo

    Informao gentica

    Citoplasma

  • Consiste na transformao da mensagem contida no mRNA, via tRNA, na sequncia de

    aminocidos que constituem a protena.

    Traduo

    Expresso gnica

  • Exemplo: Estrutura de um gene procarioto

    Expresso gnica

  • Polmero de aminocidos de massa molecular acima de 10.000 Da, com cada aminocido unido ao seu vizinho por um tipo especfico de ligao

    covalente.

    Protena

  • Ligaes peptdicas

    Ligaes peptdicas

    Pontes de hidrognio

    Ligaes peptdicas

    Pontes de hidrognio

    Ligaes dissulfeto

    Interaes eletrostticas

    Foras de Van der Walls

  • Produo em larga escala de protenas recombinantes - a partir da expresso de uma

    molcula de DNA recombinante em um sistema de expresso adequado.

    Tecnologia do DNA recombinante

    Uso teraputico

    Estudos bioqumicos

    - Estrutura 3D

    Dificuldades a partir do tecido original

  • Clulas de mamferos, clulas de insetos, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis e

    Escherichia coli

    Taxa de crescimento celular;

    Complexidade do meio de

    cultura;

    Custo do meio de cultura;

    Nvel de expresso;

    Capacidade de expresso

    extracelular.

    Capacidade de produzir as

    modificaes ps-traduo tais

    como:

    - enrolamento correto;

    - formao das pontes dissulfito;

    - glicosilao;

    - fosforilao;

    - acetilao.

    Sistemas de Expresso

  • Crescimento rpido, em um perodo curto de tempo, requerem pouco espao fsico e possuem uma nutrio fcil de ser suplementada.

    Gentica relativamente simples e bem compreendida

    nico cromossomo de aproximadamente 4,6 milhes de pares de bases e completamente sequenciado

    Cdigo gentico quase universal

    Escherichia coli

  • Vetor: molcula de DNA usada como um veculo para carregar sequncias de DNA estrangeiras dentro de uma clula hospedeira.

    Plasmdeos:

    Mais simples

    (1.000 a 2.000 pb)

    Circulares

    Independentes do cromossomo bacteriano

    Vetores de expresso

  • Expresso de protena recombinante em E. coli

    Clonagem do gene em vetor de expresso

  • Vetor linearizado Preparo do inserto

    Reao de ligao

    Plasmdeo recombinante

    Transformao de E. coli

    competente

    Plaqueamento e seleo

    dos clones recombinantes

    Extrao do

    DNAp e

    Sequenciamento

  • Induo da expresso da protena recombinante

    Tampo

    de lise

    Sonicao Purificao

  • Anlise da expresso da protena recombinante

  • Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS PAGE)

    Separao de protenas conforme o peso molecular, as quais migram pelos poros do gel de poliacrilamida

    Quanto menor for o peso molecular da protena mais facilmente ela migrar em relao s outras protenas

    Aps a corrida das protenas pelos poros do gel, estas podero ser visualizadas com a aplicao do corante Coomassie Blue

  • Preparo da amostra: dodecil-sulfato de sdio e 2-mercapto-etanol

    Confere carga negativa Separa as cadeias

  • 260 kDa

    72 kDa

    52 kDa

    42 kDa

    10 kDa

    Caracterizao por SDS-PAGE da Nucleoprotina recombinante do

    Vrus da Influenza Aviria expressa em E. coli.

  • Western blotting

    Tcnica bioqumica utilizada para determinar a quantidade relativa e o peso molecular de uma protena dentro de uma mistura de protenas ou outras molculas.

    Deteco de antgenos proteicos - uso de anticorpos especficos

  • 72 kDa

    52 kDa

    42 kDa

    260 kDa

    10 kDa

    Caracterizao por Western Blotting da Nucleoprotina

    recombinante do Vrus da Influenza Aviria expressa em E. coli.

  • Substncias (molculas) estranhas ao SI que so reconhecidas por receptores especficos em linfcitos B e T e tambm por anticorpos.

    Antgenos

    Anticorpos

    Protenas do tipo imunoglobulinas com stios especficos para interao com os antgenos e que so sintetizadas por linfcitos B e plasmcitos.

  • O Ac se liga somente a uma parte do Ag, denominada eptopo ou determinante antignico.

    Quando o partopo do Ac se liga ao eptopo do Ag

    Interao Ag-Ac

  • Eptopo linear ou contnuo Eptopo conformacional ou

    descontnuo

  • Anlise (mapeamento) dos eptopos

  • Aplicaes em Imunologia

  • Imunodiagnstico

    Sorologia - deteco de Acs contra antgenos virais e bacterianos especficos

    Preparaes antignicas:

    Propagao viral em ovos

    Ultra-centrifugao

    Expresso de protenas

    Imunodifuso em gel de agarose

    Inibio da

    Hemaglutinao

    ELISA

  • Diagnstico da Influenza Aviria

    Clonagem e expresso da NP do VIA

    Aplicao em testes de ELISA

    121 soros testados

    Positivos Acs presentes no soro reagiam com a NP recombinante

    Negativos no ocorria reao

  • ELISA indireto

  • Apresentam sequencias do material gentico do agente infeccioso que codificam antgenos

    Vacinas de DNA

    Clonagem e expresso do gene (propagao)

    Administrao ao indivduo (transfeco)

    Clulas produzem a prpria protena (antgeno)

    Resposta imunolgica com memria

  • AIDS

    Malria

    Dengue

    Tuberculose humana e bovina

    Hepatite B

    Raiva

    Leptospirose

    Tenase

    Exemplos: vacinas de DNA

  • Perguntas?

  • OBRIGADA! mmborzi@gmail.com

  • ABBAS, A. K.; LICHTMA, A. H. Imunologia Celular e Molecular. Rio de Janeiro: Elsevier, 2005, 5 ed.

    BRAMMER, S. P. A tcnica de eletroforese: importncia e aplicaes em anlises genticas. 2001. Disponvel em: . Acesso em: 14 de Abril de 2013.

    BROWN, T.A. Clonagem gnica e anlise de DNA: Uma introduo. 4 ed., Porto Alegre, Ed Artmed, 2003.

    LIMA, T. Western Blotting Immunoblotting. Imunologia & Hematologia. 2010. Disponvel em: . Acesso em: 07 de Maio de 2013.

    MICKLOS, D. A.; FREYER, G.A.; DNA Science: A First Course. 2ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003, 575 pg.

    NELSON, D. L.; COX, M.M. Princpios de bioqumica de Lehninger. 5 edio. Porto Alegre: Artmed, 2011

    PELCZAR JR., M. J.; CHAN, E.C.S.; KRIEG, N. R. Microbiologia: conceitos e aplicaes. 2. ed. So Paulo: Makron Books, 1996. v. I.

    SAMBROOK, J., RUSSEL, D.W. Molecular Cloning: a laboratory manual (3-Volume Set), 3ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, 1531 pg.

    SOUZA, A.A.U. Separao de protenas por eletroforese desnaturante descontnua na presena de SDS (SDS-PAGE). Universidade Federal de Santa Catarina. 2010. Disponvel em: Acesso em: 14 de Abril de 2013.

    SRENSEN, H. P.; Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. Journal of Biotechnology 115 (2005) 113128.

    http://www.cnpt.embrapa.br/biblio/p_do06.htmhttp://www.imunologiahematologia.wordpress.com/category/imunologia/http://www.enq.ufsc.br/disci/eqa5517/pratica_eletroforese.doc

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