AgrobiotecnologíaCurso 2007

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y CelularFacultad de Ciencias Exactas y Naturales

Universidad de Buenos Aires

Vacunas VeterinariasAndrés Wigdorovitz

Tipos de vacunas

Nuevas vacunas

Referencias

Sumario

Agrobiotecnología

Vacunasveterinarias

Tipos de vacunas

Agrobiotecnología

Vacunasveterinarias

Conceptosintroductorios

Agrobiotecnología

Vacunasveterinarias

• El objetivo de la vacunación es generar una respuesta inmune protectora de larga duración mediante la estimulación de una respuesta inmune adecuada.

• La vacunación reduce la cantidad de agente infectante ante una exposición. Usualmente no se logra inmunidad esterilizante.

• Las vacunas pueden ser preventivas o terapéuticas.

• El mercado mundial de vacunas veterinarias alcanza los 2000 millones de dólares anuales.

Característicasde una vacunaideal:

Agrobiotecnología

Vacunasveterinarias

• Segura

• Específica

• Protectora

• Inmunidad duradera

• Debe prevenir la dispersión del patógeno

• Aplicación en dosis única

• Bajo costo y estable

• Fácil de administrar

Vacunasen medicinaveterinaria

Agrobiotecnología

Vacunasveterinarias

• Convencionales:

- La gran mayoría de las vacunas licenciadas al presente pertenecen a esta categoría.

- Estas vacunas se desarrollan empíricamente y no se necesita un amplio conocimiento del

patógeno y de la respuesta inmune que induce.

• Modernas:- Incorporan para su desarrollo tecnologías del

ADN recombinante y de purificación de proteínas.

- Estas vacunas se basan en un desarrollo racional donde se utiliza la información derivada del estudio de la respuesta inmune que el agente patógeno genera así como de cuales son los antígenos principales.

Vacunasactuales

- Microorganismos muertos (inactivados).

- Microorganismos vivos atenuados.

- Toxoides bacterianos.

Agrobiotecnología

Vacunasveterinarias

Vacunasinactivadas

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(químico, calor,irradiación, etc.)

Tratamiento

Pató

geno

s Inac tiv ados

En lasvacunasinactivadasel agentebiológicono se replicaen elhospedador

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• Ventajas:

- Son fáciles de producir.- Son estables.- Son más seguras que las vacunas basadas en microorganismos atenuados.

• Desventajas:

- No generan una respuesta inmune de larga duración.- No generan reacciones adversas debidas al uso de adyuvantes.- Requieren gran cantidad de antígeno.- El agente vacunal puede no estar completamente inactivado.

Toxina bacterianaactiva

Vacunas a toxoides

Tratamientoquímico

Pasajes sucesivos en distintos hospedadores

Vacunas vivas atenuadas

Patógenos Atenuados

En las vacunasbasadas enmicroorganismosatenuadosel agentebiológico sereplica en elhospedador

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Vacunasveterinarias

• Ventajas:

- Son eficaces.

- Requieren una única dosis.

- Generan una respuesta inmune de larga duración.

- No requieren adyuvantes.

• Desventajas:

- El microorganismo puede revertir a una forma virulenta.

- La atenuación puede ser excesiva o insuficiente.

- Requieren cadena de frío para su conservación.

Desventajasde las vacunasconvencionales(patógenoinactivado/atenuado)

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Vacunasveterinarias

• Inactivación completa

• Reactivación de la patogenicidad

• No se diferencian vacunados de infectados

• Manipuleo del agente infectado durante el proceso de producción

• Reacciones inespecíficas con otros patógenos

• Reacciones de hipersensibilidad por los inactivantes usados

Nuevas vacunas

Agrobiotecnología

Vacunasveterinarias

¿Por quénuevasvacunas?

Agrobiotecnología

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• Enfermedades infecciosas donde los métodos tradicionales fallaron.

• Nuevas regulaciones de las autoridades sanitarias.

• Uso de la tecnología de ADN recombinante.

• Uso de técnicas genómicas y proteómicas.

• Aparición de patógenos emergentes.

• Patógenos que no se pueden cultivar in vitro

• Vacunas que combinen las ventajas de las inactivadas (seguridad) y las de organismos vivos modificados (eficacia)

El desarrollo de nuevas vacunas es un áreaque se nutre de múltiples disciplinas

Nuevasvacunas:desafíos parala industria

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• Innovación:

- Identificar nuevos métodos para la producción de vacunas o mejorar los existentes.- Identificar nuevos métodos para la administración de vacunas.

• Seguridad:

- Evitar reacciones locales y/o sistémicas.- Evitar efectos negativos en el medio ambiente y otras especies.

• Eficacia:

- Proveer immunidad de por vida. - Proveer protección cruzada.

Etapas aseguir parael desarrollode nuevasvacunas

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• Identificación de los mecanismos efectores protectores de la respuesta inmune.

• Elección de antígeno(s) que induzca(n) una respuesta inmune en una amplia mayoría de los individuos a ser vacunados.

• Uso de un modo correcto de presentación del/de los antígeno/s al sistema inmune.

Estrategiaspara laobtenciónde nuevasvacunas

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• Basadas en bacterias y virus atenuados por modificación genética.

• Basadas en bacterias patógenas atenuadas por modificación genética que expresen antígenos heterólogos de otros patógenos.

• Basadas en subunidades de antígenos recombinantes.

• Basadas en baculovirus como vectores de presentación de antígenos heterólogos.

• Basadas en virus Vaccinia y Avipoxvirus recombinantes vivos.

• Basadas en ADN (génicas).

• Basadas en plantas recombinantes.

Nuevasvacunas

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• Replicativas:- Atenuadas por ingeniería genética:

No marcadas Marcadas (DIVA)

- Portadas por vectoresViralesBacterianos

• No replicativas:- Subunidades

RecombinantesProcariotasEucariotas Levaduras Plantas

No recombinantesPéptidos sintéticos

- Vacunas génicas (a ADN)

• La estrategia común involucra introducir mutaciones en uno o más genes. Los genes candidatos a ser mutados usualmente son:

- Codificantes para factores de virulencia (generalmente proteínas exportadas)

- Codificantes para proteínas de rutas metabólicas biosintéticas

• La metodología involucrada es el reemplazo alélico mediante la recombinación homóloga.

• Para su liberación al medio ambiente, la cepa vacunal no debe llevar marcadores de resistencia a antibióticos.

Vacunasreplicativasatenuadas

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• El 20% de las proteínas sintetizadas por bacterias se alojan fuera del citoplasma.

• Las proteínas exportadas cumplen diversas funciones: captación y transporte de nutrientes, biogénesis e integridad de membranas, motilidad, división celular, generación de energía, detoxificación, transducción de señales, comunicación celular, virulencia, etc.

• Identificación y caracterización molecular de genes que codifican proteínas exportadas.

• Análisis sistemático de la contribución de proteínas exportadas a la virulencia bacteriana.

Identificaciónde genesque codificanproteínasexportadas

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• Los genes que codifican proteínas exportadas pueden identificarse mediante fusiones traduccionales al gen de la fosfatasa alcalina (phoA) de Escherichia coli.

• La actividad de fosfatasa alcalina se manifiesta cuando la enzima se encuentra fuera del ámbito citoplasmático.

• El gen reportero phoA utilizado no posee su promotor ni la región que codifica el péptido señal amino terminal.

• La actividad PhoA se detecta fácilmente utilizando BCIP como sustrato.

Estrategíasutilizadaspara laidentificarproteínasexportadas

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Actividad de PhoA de acuerdo con la localización subcelular

Membrana externa

CITOPLASMA

MEDIO EXTERNO

PERIPLASMA

Membrana interna

NH2

NH2

NH2

NH2NH2

NH2

NH2

NH2

PhoA enzimáticamente inactiva

PhoA enzimáticamente activa

Segmento hidrofóbico de transmembrana

Búsquedade proteínasexportables

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Clonado y expresión de fusiones aPhoA en Escherichia coli CC118

Principio:

La vacuna perdió un gen específico quecodifica un antígeno inmunodominante. Sin embargo, sigue siendo protectiva.

El presupuesto es que los animalesvacunados no presentarán anticuerposcontra la proteína delecionada.

Estas vacunas vienen asociadasa un kit diagnóstico donde el antígenoes la proteína inmunodominante. Estasvacunas tienen ventajas diagnósticas.

Vacunasmarcadoras(differentiateinfected fromvaccinatedanimals;DIVA)

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Vacunasveterinarias

NUEVAS VACUNAS CONTRA HERPESVIRUS BOVINOTIPO 1: DESARROLLO DE UNA CEPA VIRAL CON

PATRÓN ANTIGÉNICO DIFERENCIAL CON RESPECTOAL DE LAS CEPAS CIRCULANTES EN EL CAMPO

Situación en la República Argentina:

• Cepa circulante de HVB-1 tipo Los Angeles

• Seroprevalencia general• 20-70% de animales y 8,9% de abortos

• Vacunación NO OBLIGATORIA

• Vacuna comercializada actualmente inactivada. en base al virus completo

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Vacunasrecombinantes

Vacunasmarcadoras(DifferentiateInfected fromVaccinatedAnimals;DIVA)

Importancia económica

Comunidad Europea:Suecia, Finlandia, Noruega y Austria - países libres de HVB-1Dinamarca y Suiza HVB-1-erradicado

Restricciones para la comercialización de productos derivadosCampañas de control y erradicación actualmente en marchaVacunación con vacunas marcadoras.

Mercosur:Brasil y Argentina existe un interés creciente en el desarrollo denuevas vacunas y evaluación de la situación epidemiológica.

Hasta el momento, no se realizan planes oficiales de control dela enfermedad.

Disposición de la Comunidad Europea (64/432, 86/566)-restricción para la comercialización de semen, embriones yganado en pie.

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Vacunasrecombinantes

Vacunasmarcadoras(DifferentiateInfected fromVaccinatedAnimals;DIVA)

Vectoresvirales

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Vacunasrecombinantes

SintomatologíaExcreción viral

HVB-1salvaje HVB-1 gE (-)

Transmisiónreducida dentrodel rodeo

Sintomatología reducida o nulaDiscriminación entrevacunados e infectados

Vacunasportadas porun vector

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• El gen que codifica el antígeno es portado por un vector (un virus o una bacteria) que lo presenta al sistema inmune.

• El vector puede presentar varios antígenos heterólogos de interés, constituyendo así una vacuna multivalente.

Vacunasmodernas noreplicativas.Vacunas asubunidades

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• Solamente un componente de un microorganismo es parte de la vacuna.• Existen vacunas tradicionales a subunidades que generalmente son componentes de una fracción subcelular.• Este componente puede estar definido (una proteína específica) o ser una fracción subcelular (membranas celulares).• Con las modernas tecnologías se puede expresar un antígeno definido y purificarlo por métodos convencionales.• Usualmente los vectores de expresión son eucariotas (levaduras o plantas).• Es necesario tener presente que se necesita conocer previamente cuales son lo antígenos que inducen una respuesta inmune protectora.

Vacunas asubunidades

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Antígenos de agentes patogénicos involucradosen la generación de respuestas inmunes protectoras

Vacunasrecombinantes

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Principales etapas en la obtenciónde una vacuna recombiante

Vacunasa ADN

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• Las vacunas a genes representan un novedoso medio para expresar antígenos in vivo para la generación de una respuesta inmune tanto humoral como celular.

• Consisten de un plásmido bacteriano que contiene un promotor eucariota fuerte (generalmente viral), el gen de interés que codifica el antígeno y una secuencia de terminación transcripcional y de poliadenilación.

Control positivoControl negativo

Expresión in vivo en tejido de ratones inoculadoscon plásmidos control y con plásmidos

portadores del gen de la β-galactosidasa

Desarrollode vacunasa ADN

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Vacunasa ADN

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Desarrollo de vacunas a ADN

Vacunas a ADN

Respuesta inmune citotóxica a vacunas a ADN

Desarrollo de construcciones genéticas que permitenacumular el antígeno en diferentes fracciones celulares

PCMV

PCMV

PCMV

Citoplasmática

Secretada

Anclada amembrana

Secuencia de anclaje a membrana

Secuencia de exportación

Promotor de citomegalovirus

Vacunas a ADN

• Ventajas:- Simplicidad metodológica- No requieren el cultivo de agentes infecciosos para su producción- Pueden desarrollarse aunque el microorganismo no pueda cultivarse- No requieren cadena de frío- Pueden inducir la generación de linfocitos T citotóxicos- Se pueden generar vacunas multivalentes

• Desventajas:- Generan una respuesta inmune de baja intensidad- Existe riesgo de integración del ADN vacunal al genoma del receptor.- Existe riesgo de generar tolerancia inmunológica.- Riesgo de integración al genoma de células germinales.- Aplicable solamente a antígenos proteicos.

Desarrollode vacunasa ADN

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• La “vacunología reversa” es una estrategia derivada de la secuencia de los genomas de microorganismos patogénicos.

• En esta estrategia, todos los marcos de lectura abiertos son clonados y expresados, y las proteínas evaluadas como vacunas, o bien clonados en vectores para vacunas a ADN e inoculados en este formato.

Impactode lastécnicasgenómicas yproteómicasen eldesarrollode vacunas

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Vacunologíareversa

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• Ventajas:• Se pueden identificar antígenos de escasa abundancia.• Se pueden identificar antígenos no expresados in vitro.• Es aplicable a agentes no cultivables.

• Desventajas:• Es necesario disponer de la secuencia genómica completa del agente en estudio.• No es aplicable a antígenos no proteicos.

Vacunas noconvencionalesparaincrementarla producciónanimal

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• Neutralización de la hormona liberadora de gonadotrofina (GNRH) en vacunos

• Inmunización de vacunos contra miostatina

• Regulación de la fertilidad en animales de compañía

Requisitospara laaprobaciónde vacunasrecombinantes

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• Resultados de pureza, seguridad, potencia y eficacia

• Efectos en el ambiente y en humanos- Caracterización bioquímica del agente recombinante.- Estabilidad genética (in vitro e in vivo).- Cambios en el tropismo o virulencia del microorganismo en el hospedador.- Evaluar la posible diseminación (shedding) del organismo a partir del hospedador vacunado y su esparcimiento a especies blanco y no blanco- Evaluar la persistencia en el ambiente.- Evaluar la posibilidad de recombinación con cepas de campo que son similares al microrganismo.

Conclusiones

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Vacunasveterinarias

• En medicina veterinaria, más del 90% de las vacunas licenciadas son obtenidas mediante métodos convencionales y se asume que esta situación se mantendrá en la próxima década. Sin embargo, durante este período también comenzaran a comercializarse vacunas de nueva generación.

• Razones:• Muchas de las vacunas actuales son efectivas.• Los costos para registrar los nuevos desarrollos

son muy elevados.• Las agencias regulatorias son cautelosas.• La sociedad es generalmente conservadora.

• Las nuevas tecnologías de generación de organismos vivos modificados (OVM) son un método eficaz en el desarrollo de. vacunas en medicina veterinaria

• Los documentos necesarios para el registro de OVM buscan fortalecer la bioseguridad y eficacia de las nuevas vacunas

• Los futuros desarrollos incluyen: vacunas de ácidos nucleicos, nuevos adyuvantes y vías de administración (oral, epidermal)

• La tendencia actual se orienta a la producción de vacunas no replicativas.

Conclusiones

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Vacunasveterinarias

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Referencias 1. Babiuk, L.A. Vaccination: a management tool in veterinarymedicine. Veterinary Journal, 164:188-201, 2002.

2. Arnon, R. and Ben-Yedidia, T. Old and new vaccine approaches.International Immunopharmacology, 3:1195-1204, 2003.

3. Rappuoli, R. Reverse vaccinology, a genome-based approach tovaccine development. Vaccine, 19:2688-2691, 2001.

4. Grandi, G. Antibacterial vaccine design using genomics andproteomics. Trends in Biotechnology, 19:181-188, 2001.

5. Green, B. A. and Baker, S.M. Recent advances and novelstrategies in vaccine development. Current Opinion inMicrobiology, 5:483-488, 2002.

6. Ada, G. Overview of Vaccines. Molecular Biotechnology, 8:123-134, 1997.