produção proteínas recombinantes

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Health & Medicine

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  • 1. Produo de Protenas Recombinantes

2.

  • O que so protenas recombinantes?
  • So protenas produzidas artificialmente a partir de genes clonados. Isto , advm da tcnica de DNA recombinante.
  • Para que servem?
  • A produo de protenas recombinantes permite obter benefcios em vrias reas:
  • - sade;
  • - biologia;
  • - bioqumica;
  • - microbiologia;
  • - gentica;
  • - biotecnologia;
  • - agricultura;
  • - etc.

3.

  • Terapia gnica
  • Possibilidade de introduo de um gene num organismo e
  • consequente correo de doenas genticas.
  • Melhoramento animal e vegetal
  • Plantas resistentes a pragas e a
  • diferentes meios nutritivos.
  • Animais de maiores dimenses,
  • mais frteis e carne com maior qualidade.
  • Criao de modelos animais
  • Ideais para o estudo da estrutura, funo e regulao de um gene, alm de facilitar a compreenso da fisiopatologia da doena.

Algumas aplicaes www.dqb.fc.ul.pt 4. Tcnica de produo de protenas recombinantes

  • Isolar e preparar o DNA;
  • Escolher o vetor apropriado;
  • O fragmento de DNA a clonar introduzido em vectores de clonagem, formando-se o DNA recombinante.
  • O DNA recombinante inserido na clula hospedeira transformao,que possui mecanismos enzimticos para a replicao do DNA e para a sntese protica;
  • Seleco e identificao de clulas que incorporam o DNA recombinante;
  • Verificar se a protena foi expressa;
  • Remoo e purificao das protenas.

TheCell- A Molecular Approach; Cooper, Geoffrey M.. 5. Algumas enzimas envolvidas no processo

  • Enzimas de restrio- Endonucleases
    • Os fragmentos de DNA usados para criar molculas recombinantes so normalmente gerados por digesto atravs de endonucleases de restrio ou PCR
    • . Conhecem pequenas sequncias especficas com 4 a 6 pares de bases.
    • . So designadas por trs letras: EcoRI, HindIII.

Produz uma molcula de DNA atravs de uma molcula de RNA. Transcriptase reversa Adiciona os nucleotdeos na extremidade 3 da cadeia de DNA. Taq DNA polimerase Juntam duas molculas de DNA ou fragmentos. DNA ligase Cortam os DNAs em sequncias de bases especficas. Tipo II (endonuclease de restrio) Funo Enzimas 6. Vetores de clonagem

  • Capaz de transportar uma seqncia de DNA estranha dando origem a um DNA hbrido ou recombinante.
  • Capacidade de se auto-replicar.
  • Conter pelo menos um gene que confira resistncia a antibiticos.
  • Possuir locais de restrio nicos,polylinker .
  • Fcil de purificar.
  • Tipos de vectores de clonagem
  • Plasmdeos (pBR322)
  • Fasmdeos ou fagemdeos
  • Cosmdeos
  • Bacterifagos
  • YACs, BACs e PACs

www. biologianaweb .com/ Livro2/C11/pbr322.html 7. Vetores de expresso

  • Promotor
  • Cdon de iniciao seguido de polylinker
  • Local de ligao ao ribossoma

www. icampus . ucl .ac. be /. ../ expression . html Promotor Local de ligao ao ribossoma Stio de clonagem e sequncia codificante de 6 histidinaswww. icampus . ucl .ac. be /. ../ expression . html 8. Vetores para clonagem gnica 9. O que precisa um vetor para servir de molcula carreadora?

  • A escolha de um vetor depende do design do experimento e de como o gene/protena clonados sero pesquisados posteriormente
  • Alguns vetores contm uma origem procaritica de replicao o qual permite sua manuteno em bactrias.

10.

  • Alguns vetores contm uma origem eucaritica de replicao permitindo replicao autnoma e epissomal em clulas eucariticas.
  • Stios de clonagem mltiplos so geralmente includos para versatilidade e construo de bibliotecas genmicas.

11.

  • Genes de resistncia a antibiticos e/ou marcadores selecionados permitem a identificao de clulas que adquiriram o vetor.
  • Alguns vetores possuem promotores induveis ou tecido-especficos que permitem a expresso controlada dos genes introduzidos em clulas transfectadas ou animais transgnicos.

12.

  • Vetores mais modernos possuem elementos multi-funcionais que permitem uma combinao de clonagem, seqenciamento de DNA transcrio e replicao epissomal.

13. Muitos tipos de vetores

  • Plasmdeos, bacterifagos, cosmdeos, cromossomo artificial bacteriano (BAC), cromossomo artificial de fungos (YAC), retrovrus, vetor de baculovrus...

14. Escolha do vetor

  • Depende da natureza e do protocolo de experimento
  • Tipo de clula que vai receber o vetor
    • Procaritica
    • Eucaritica

15. Vetor de Plasmdeo

  • Fechado, circular, DNA dupla fita, ocorre naturalmente em bactrias e replica extracromossomalmente
  • Muitos conferem resistncia a drogas para cepas bacterianas
  • Origem de replicao presente (ORI)

16.

  • Examplos
    • pBR322
      • Um dos primeiros plasmdeos utilizados
      • Dois marcadores (resistncia a Amp and Tet)
      • Vrios stios de restrio espalhados atravs do plasmdeo
      • ColE1 ORI

17.

    • pUC18
      • Derivado do pBR322
      • Vantagens sobre pBR322:
        • Pode acomodar fragmentos de DNA maiores durante a clonagem (5-10kbp)
        • MAior nmero de cpias por clula (500 per cell = 5-10x mais que pBR322)
        • Mltiplos stios de clonagem = polylinker

18. Esquema geral de clonagem

  • O vetor e o gene a ser clonado so purificados separadamente e depois ligados entre si
  • Produtos ligados so introduzidos em clulas competentes por tcnicas de transformao. As colnias so analizadas individualmente.

19.

  • Os vetores que vm de bactrias que sobreviveram seleo por antibiticos so amplificados em outras bactrias
  • O plasmdeo contendo DNA purificado em larga escala

20. F.Vetores cosmdeos

  • Molculas hbridas contendo DNA de plasmdeos e de bacterifagos lambaLambda components:COS sequences (required for in vitro packaging into phage coats)
    • Componentes do plasmdeo: ORI + Gene de resistncia aos antibiticos
    • Os stios de clonagem vm do lambda

21. F.Vetores cosmdeos 22.

  • Aps a transformao da bactria, o rDNA replica como plasmdeo.
  • Insertos bem grandes podem ser acomodados por cosmdeos (mais de 35-45 kbp)

23. Bacterial artificial chromosomes (BACs)

  • Pode acomodar mais de 1 Mb de DNA (= 1000kbp)
  • Vrios componentes de replicao e de controle de nmero de cpias esto presentes
  • Marcadores e stios de clonagem em diferentes lugares
  • Outras caractersticas:
    • Prmotores SP6 and T7
      • Sntese de RNA mais eficiente
      • Sondas de RNA para hibridizao

24. Bacterial artificial chromosomes (BACs) 25. I.Yeast artificial chromosomes (YACs)

  • Molcula hbrida contendo componentes de fungos, protozorios e bactrias (plasmdeos)
      • ORI = ARS (autonomously replicating sequence)
      • MArcadores (TRP1 and URA3)
      • Centrmero de fungos
    • Protozoa= Tetrahymena
      • Sequncias de telmeros
      • Plasmdeos bacterianos
      • Polylinker
  • Pode acomodar>1Mb (1000kbp = 10 6bp)

26. I.Yeast artificial chromosomes (YACs) 27. I.Yeast artificial chromosomes (YACs) 28. Human artificial chromosomes

  • Devenvolvidos em 1997 sintticos, auto-replicantes
  • 1/10 do tamanho de um cromossomo normal
  • Microcromossomo que passa para as clulas durante a mitose
  • Contm:
    • ORI
    • Centrmero
    • Telmero
    • Cap protetor de DNA repetitivo no fim do cromossomo
    • Histonas dadas pela clula hospedeira

29. J.Human artificial chromosomes 30. Transforma

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