Proteínas RecombinantesHistórico e vantagens

Origem• 1944 - Oswald Avery: transmissão de informações pelo DNA.

• 1961- François Jacob e Jacques Monod: síntese proteica apartir

do DNA.

• 1972- Paul Berg: Ligação de cadeias genéticas de animais

organismos diferentes.

• 1978- Werner Arber, Daniel Nathans e Hamilton Smith:

Enzimas de restrição (Nobel)

Sistemas de Expressão

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Desvantagem: Produz muitas proteases!!

Sistemas de Expressão

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Impacto das P.Rs no desenvolvimento de vacinas

17 vacinas em 137 anos.

31 vacinas em 40 anos

Objetivo:• Estabelecer uma abordagem eficiente frente a

proteínas de difícil expressão utilizando E.coli.

• Para estabelecer uma estratégia 71 proteínas foram escolhidas e cada uma expressa em 15 formas diferentes: (cepa x temperatura x plasmídeos x estresse)

Cepas de E.coli • BL21-Gold: deficiente em EndA1 nuclease

• BL21-Codon plus: obtida da BL21 Gold, apresenta mais copias de genes que codificam tRNAs.

• BL21-V2R1: Derivadas de cepas BL21 deficientes em lon (deficiente em proteases

dependentes de ATP) de e omT (deficiente em proteases de membrana).

• BL21-V2R1 pRARE2: introdução do plasmídeo pRARE2 que fornece tRNAs.

• BL21-Rosetta: códons raros, deficiente em protease e resistente a cloranfenicol.

• ArcticExpress: contém chaperonas que auxiliam no folding e possibilitam o funcionamento metabólico de 4° a 12°C.

• JM109: mutações em EndA1 e RecA1, indicado para clonagem de plasmídeos.

• W3110: mutação no gene gatA que responsável pela metabolização do C.

Plasmídeos

6 His-tags introduzidas em C-terminal ou N-terminal.

Purificação

• Os lisados e sobrenadantes são incubados com beads NI-NTA.

• A avaliação da expressão é feita por SDS-PAGE.