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Disciplina de Mét. Purif. e Anál. Proteínas
Curso de Ciências Biológicas
Métodos de Purificação
de Proteínas Recombinantes
Prof. Marcos Túlio de Oliveira [email protected]
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Disciplina de Mét. Purif. e Anál. Proteínas
Curso de Ciências Biológicas
Agradecimentos à Flávia
(Depto. Tecnologia) por alguns slides
Prof. Marcos Túlio de Oliveira [email protected]
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Estratégia Geral para Obtenção da
Proteína Purificada
• Extração Isolamento
1. Material de Partida ------ Extrato Bruto
2. Desintegração celular
Fracionamento
•Solubilidade
•Tamanho
•Carga
•Afinidade Ligação
Separação
Diálise
Ultra filtração
Coluna Cromatografica
Cromatografia em coluna
Gel-Filtração • A separação é feita de acordo com o tamanho molecular
Cromatografia de troca iônica
Cromatografia de
Afinidade
Pequenas proteínas são ligadas aos suportes e a mistura complexa de proteínas é aplicada
Proteínas ligadas
podem ser eluídas com moléculas pequenas ou reagentes
Blue-Sepharose
C+ Ind S FT W1
0.25 M NaSCN Gradient 0.4-1.2 M NaSCN 1.5 M NaSCN
Fosfocelulose
S FT W1 W2
Gradient 60-100 mM KPO4 150 mM KPO4
1 2 3 4
Como analisar o resultado da
purificação?
(como visualizar proteínas e determinar a
pureza da amostra?
Absorbância
280nm
SDS-PAGE
Como analisar o resultado da
purificação?
(como visualizar proteínas e determinar a
pureza da amostra?
Western Blot
Coloração com Prata
Yuxun Wang et al. J. Biol. Chem. 1997;272:13640-13646
©1997 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology
Western Blot
Cromatografia de Afinidade
Fonte:V. Gaberc-Porekar, V. Menartr, 2001.
Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA
Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA
Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA
Coloração com
Coomassie Blue Western Blot
Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA
Coloração com
Coomassie Blue Western Blot
Anticorpos que
reconhecem
Poli-histidina!!!
Como produzir a proteína contendo
a cauda de poli-histidina?
Como produzir a proteína contendo
a cauda de poli-histidina?
Representação Esquemática de um
Vetor de Expressão Procariótico
Fonte: Hanning e Makrides, 1998.
Representação Esquemática de um
Vetor de Expressão Procariótico
Fonte: Hanning e Makrides, 1998.
Representação Esquemática de um
Vetor de Expressão Procariótico
Fonte: Hanning e Makrides, 1998.
6 códons para His (CAT ou CAC)
ou
Inclusão dos códons de His
Expressão
Heteróloga de
Proteínas
Representação Esquemática de um
Vetor de Expressão para Células Sf9
Representação Esquemática de um
Vetor de Expressão para Células Sf9
Representação Esquemática – Vetor de
Expressão para Células Humanas
Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão Procariótico – pET SUMO
Promotor forte IPTG induzido
Operador lac
Repressor lac Proteína
fusionada à sequência de SUMOilação
Sítio de clonagem
Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão Procariótico – pEX-C-GST
Proteína fusionada à
Glutationa S-Transferase
Purificação usando cromatografia de
afinidade (glutationa-agarose)
Tags de Fusão de Proteína Comuns
Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão Procariótico – pEX-C-GST
Sítio para a TEV protease
Eliminação da cauda de GST após
purificação...
Eliminação da
cauda (nem sempre
necessário)
Proteínas Recombinantes então
resolvem dois problemas comuns da
purificação de proteínas nativas:
1 - Abundância
2 - Especificidade pela Coluna
Cromatográfica
Exemplo: a DNA polymerase γ de
Drosophila melanogaster
Nativa Recombinante
Expressão em Sf9
Extrato Celular
Coluna de Fosfocelulose
Precipitação com (NH4)2SO4
Sedimentação em Gradiente de Glicerol
Coluna de Ni-NTA
Quilos de ovos de D. melanogaster
Centrifugação diferencial
Coluna de Fosfocelulose
Precipitação com (NH4)2SO4
Sedimentação em Gradiente de Glicerol
Coluna de DNA-celulose
Extrato Celular Coluna de Octil-sefarose
Coluna de Blue-agarose
Exemplo: a DNA polymerase γ de
Drosophila melanogaster
Nativa vs
Recombinante
Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.
Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.
Fonte?
Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.
Fonte? Extração de humanos?
Voluntários? Ética?
Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.
Animais modelos
Que tecido? Por quê?
Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.
Animais modelos
Cérebro (Substância negra)
Que tipo de extração?
Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.
Animais modelos
Cérebro (Substância negra)
Tampão hipotônico e
homogenizadores para tecidos moles
Onde parkin se encontra nas
células?
Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.
Animais modelos
Cérebro (Substância negra)
Tampão hipotônico e
homogenizadores para tecidos moles
Onde parkin se encontra nas
células? Qual sua função?
Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.
Animais modelos
Cérebro (Substância negra)
Tampão hipotônico e
homogenizadores para tecidos moles
Componente do proteassomo –
degradação de proteínas
Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.
Centrifugação diferencial?
Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.
Citoplasmática, em sua maioria
Gel filtração? Separação por
tamanho?
Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.
Citoplasmática, em sua maioria
~52 KDa – média proteínas: 53 KDa
Cromatografia de troca iônica?
Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.
Citoplasmática, em sua maioria
~52 KDa – média proteínas: 53 KDa
pI = ~6.9
Cromatografia de afinidade?
Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.
Citoplasmática, em sua maioria
~52 KDa – média proteínas: 53 KDa
pI = ~6.9
E3 ubiquitina ligases se ligam a Lys
Troca iônica? Uma ou duas colunas?
Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.
Citoplasmática, em sua maioria
~52 KDa – média proteínas: 53 KDa
pI = ~6.9
E3 ubiquitina ligases se ligam a Lys
Duas colunas aniônicas: forte e fraca
Exercícios
Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as
propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene
parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em
humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.
E isso tudo será que é suficiente?
Exercícios
Situação hipotética: Considerando que a purificação da Parkin
nativa tem se mostrado extremamente trabalhosa, monte uma
estratégia para expressar e purificar uma versão recombinante da
Parkin humana.
Para casa...
Disciplina de Métodos Purif. e Anál. de Proteínas
Curso de Ciências Biológicas
Próxima aula: Prática LDCII- Simulação de Purificação
de Proteínas