agentes tromboliticos recombinantes y factores coagulantes recombinantes
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AGENTES TROMBOLITICOS RECOMBINANTES Y FACTORES COAGULANTES RECOMBINANTES [Escribir el subtítulo del documento]
FACTORES COAGULANTES RECOMBINANTES
Introducción
Ante una herida a nivel vascular se reduce el flujo sanguíneo, las plaquetas cercanas al
lugar de la herida se adhieren a la pared vascular en el sitio. La activación y agregación de
plaquetas, junto con algunas reacciones enzimáticas entre las que destaca la actividad de
t-PA, produce la fibrina que forma el coágulo. La hemostasis es un proceso dividido en dos
partes, la extrínseca y la intrínseca, diseñado para mantener la integridad y buen
funcionamiento del sistema circulatorio. La ruta extrínseca es el iniciador primario de la
coagulación, mientras que la ruta intrínseca se encarga de la activación de los Factores IX y
X. La figura 1 muestra un esquema donde la hemostasis se divide en 3 partes, iniciación
del coágulo, formación del coágulo y fibrinólisis. Existen dos casos generales de
hemostasis anormal, cuando hay un exceso de coagulación y se producen los trombos que
obstruyen el flujo sanguíneo, y cuando hay carencias de factores de coagulación lo que
resulta en un sangrado excesivo, como en los pacientes con hemofilia.
La coagulación se lleva a cabo mediante una compleja serie de reacciones involucrando
aproximadamente 30 proteínas, se le conoce como la cascada de coagulación. Ésta
cascada de coagulación inicia cuando debido a una herida, la sangre entra en contacto con
células que contienen factor tisular (TF). La figura 2 muestra la compleja cascada de
coagulación, mostrando la mayoría de las reacciones, mientras que la figura 3 muestra un
esquema simplificado en torno a las proteínas a tratar.
Rol fisiológico
Factor VIII, es una proteína del plasma que funciona como cofactor al aumentar la máxima
velocidad de reacción del Factor X por el Factor IXa en la presencia de iones de calcio y
fosfolipidos con carga negativa. La ausencia congénita del Factor VIII se conoce como
Hemofilia A. Se puede realizar una terapia introduciendo concentrados del Factor VIII
extraídos del plasma, pero conlleva riesgos asociados a la transfusión. Mientras que el
Factor VIII obtenido mediante tecnologías recombinantes elimina ese riesgo.
Factor VII, se sintetiza en los hepatocitos y depende de la vitamina K. Factor recombinante
VIIa, circula en el plasma a la baja concentración de 0.5 µg/ml, a pesar de estar en su
forma activa tiene poca actividad proteolítica; sus efectos se enfocan en el sitio de la
herida tisular ya que solo el endotelio dañado expresa el factor tisular. Éste factor
recombinante elimina fallas y riesgos relacionados con el uso de Factor VIII y Factor X en el
tratamiento de la hemofilia.
Factor IX, es activado por el complejo de Factor VII-Factor tisular en la ruta extrínseca de
la hemostasis. El Factor IX en combinación con el Factor VIII activa el Factor X, resultando
en la conversión de protrombina a trombina, donde la trombina convierte el fibrinógeno
en fibrina formando el coágulo en el sitio de sangrado.
Clasificación del compuesto
Factor VIII es sintetizado como un polipéptido de una sola cadena de 2332 amino ácidos12.
Poco después de la síntesis, ocurre una escisión que hace que el Factor VIII circule en el
plasma como una asociación de una cadena ligera de 80kDa y varias cadenas pesadas de
210kDa en un complejo dependiente de iones metálicos. La cadena metálica se procesa
mediante una escisión proteolítica que reduce su tamaño a 90kDa, liberándose de los
residuos del dominio B, lo cual le brinda heterogeneidad. Cuenta con 25 sitios potenciales
de glicosilación con N y 22 cisteínas. Los Factores recombinantes VIII que se encuentran en
el mercado difieren en su estructura dependiendo de la compañía, los producidos por
Bayer™ y Baxter Healthcare™ son semejantes al factor en plasma, consisten del dímero
con una cadena de 80kDa y una cadena heterogénea de 90-210kDa 13; mientras que el
producido por The Genetics Institute ™ es un mutante con una delecion de casi todo el
dominio B.
Factor VII, es una serina proteasa glicosilada que depende de la vitamina K. Se sintetiza
como una proenzima que se vuelve activa y enganchada mediante la hidrólisis de Arg-152
e Ile-153. Tiene 406 amino ácidos y su masa molecular es de aproximadamente 50kDa. La
proteína no es activamente funcional a menos que esté γ-carboxilado. Tiene dos sitios
para glicosilación con N. Tiene tres dominios, uno interactua con el factor tisular en la
superficie de la célula, que es el dominio Gla, dos dominios tándem EGF y un dominio
serin-proteasa.
Factor IX recombinante es una glicoproteína de aproximadamente 55kDa que consiste de
una sola cadena de 415 amino ácidos. El Factor IX de plasma posee un dimorfismo Thr/Ala
en la posición 148 y 12 residuos de gamma-carboxlácido glutámico en su dominio Gla.
Mientras que el Factor IX recombinante es idéntico a la forma alélica Ala148. Las
diferencias estructurales no impactan en la actividad biológica de los compuestos, sólo en
la farmacocinética de los mismos.
Biosíntesis del compuesto
Factor recombinante VIII. Es de diverso origen dependiendo de la compañía que lo
produce, Baxter Healthcare™ y Genetics Institute™ lo producen en células CHO, mientras
que Bayer Inc™ lo produce mediante la transfección de células de riñón de hámster bebé.
Factor recombinante VIIa. Se produce en células de riñón de hámster bebé. El factor VII es
producido por acción del gen del Factor VII, que se encuentra en el cromosoma 13
(13q34).
Factor recombinante IX. Es producido en una línea celular CHO, las células secretan al
medio Factor IX recombinante. El gen del Factor IX se localiza en el cromosoma X (Xq27.1-
q27.2).
Enfermedades que mitigan/curan
El factor recombinante VIII se utiliza para el tratamiento de la hemofilia clásica (Hemofilia
A), enfermedad que se caracteriza por una deficiencia en la actividad del Factor VIII. La
forma recombinante provee un reemplazo temporal para corregir o prevenir episodios de
sangrado o en caso de que un paciente con hemofilia requiera una cirugía de emergencia.
Se corre el riesgo de que desarrollen anticuerpos al Factor recombinante VIII se
correlaciona con la severidad de la enfermedad y la intensidad de la exposición al Factor
VIII. Las dosis se determinan de forma individual para cada paciente en base a la severidad
de la deficiencia y de las hemorragias, la presencia de inhibidores y del aumento deseado
de actividad de Factor VIII. Se puede usar la siguiente ecuación:
El factor recombinante VIIa se utiliza para tratamiento de pacientes con episodios de
sangrado intenso en Hemofilia A o B en la presencia de inhibidores de Factor VIII y Factor
IX. Se recomienda una dosis de 90µg/kg cada dos horas hasta que se llegue a la
hemostasis. Para llegar a la hemostasis, los niveles de actividad del factor de coagulación
VII (FVII:C) deben mantenerse por encima de 6U/ml.
El factor recombinante IX se utiliza para el control y prevención de episodios hemorrágicos
en pacientes con hemofilia B, incluyendo el control y prevención de sangrado excesivo por
cirugía. La dosis depende de las mismas condiciones que el FrVIII.
Análisis químico de compuesto
Se realiza mediante un análisis de sangre. Las muestras por lo general llevan como aditivo
Citrato que impide la coagulación de la sangre. Se mide la capacidad de la sangre para
formar coágulos al medir el tiempo que tardan en formarse en función de unas sustancias
que se añaden a la sangre.
Pruebas de coagulación
Tiempo de protrombina (PT). Prueba del tiempo de coagulación que se obtiene a partir de
la agregación de un exceso de tromboplastina hística y calcio al plasma. Mide los niveles
de factor I (fibrinógeno), factor II (protrombina), y factores V, VII y X.
Tiempo de tromboplastina parcial (PTT). Detecta valores bajos de factores XII, IX y VIII.
Depende de la totalidad de factores de coagulación excepto calcio, plaquetas y factor VII.
Del plasma del paciente se obtienen todos los factores de coagulación, se somete la
muestra a un anticoagulante para remoción del calcio de la sangre y a una centrifugación
para remover las plaquetas. De forma que la muestra no provee el ión calcio y las
plaquetas. Al plasma se agrega un sustituto plaquetario (tromboplastina parcial) que
funciona como medida del sistema intrínseco de coagulación.
Hay pruebas especificas para los factores, como la prueba del factor VIII donde se separan
las células sanguíneas del plasma, posteriormente al plasma se le quita el factor VIII y se
toma el tiempo de coagulación para comparar con el tiempo de coagulación normal. Si el
resultado es bajo, el paciente sufre hemofilia A o tiene inhibidores del factor VIII10.
Farmacocinética y Farmacodinámica
La coagulación de la sangre puede inciarse ya sea por la ruta extrinsica o la ruta instrínsica.
La ruta extrínsica inicia por exposición de sangre o factor tisular y la ruta intrínseca inicia
por la activación de factores plasmáticos. Las dos rutas convergen en un solo camino que
resulta en la generación de trombina.8
Factor VIII
Factor antihemofílico, es una proteína plasmática que funciona como cofactor al
incrementar la Vmax en la activación del Factor X por medio del Factor IXa en presencia de
iones de calcio y fosfolípidos cargados negativamente.
La concentración del Factor VIII en el plasma es de 200 ng/ml aprox. Existe evidencia de
que el bazo, hígado y riñón participan en su síntesis pero es principalmente en el hígado
donde esta ocurre. El Factor VIII está asociado covalentemente al Factor de von
Willerbrand. Este factor protege al Factor VIII de cortes proteolíticos y permite su
concentración en sitios homeostáticos.8
Despues de su administración, el incremento en la concentración del Factor VIII es
proporcional a su dosis y su disposición es similar después de una dosis única o crónica. La
vida media terminal es de 14-16 horas y el volumen inicial de distribución se aproxima al
volumen del plasma. (Ver Tabla 1 Anexos)
La dosis de factor recombinante VIII (en unidades internacionales) debe de
individualizarse a las necesidades del paciente, la severidad de la deficiencia y de la
hemorragia, la presencia de inhibidores y también al incremento deseado de actividad del
Factor VIII.8
Riesgos
Se debe de tener cuidado al administrar el factor recombinante VIII a pacientes con
hipersensibilidad a antihemofílicos derivados del plasma o con hipersensibilidad a
preparaciones biológicas con rastros de murina o proteínas de hámster ya que pueden
quedar remanentes como contaminantes del sistema de expresión14.
FACTOR VIIa
Fue desarrollado ante la necesidad de que una pequeña parte de los pacientes con
hemofília A y B desarrollaban anticuerpos al Factor VIII y Factor IX.
El Factor VIIa es producido en células de riñon de hámster. Este factor se expresa en una
sola cadena y es activado espontáneamente a Factor VIIa durante purificación.
Se estudió la farmacocinética de dosis única para el Factor VIIa en 15 pacientes con
hemofilia. Despues de la dosis intravenosa de 17.5, 35, y 70 microg/kg. La farmacocinética
obtenida fue lineal y no hubo diferencia en eliminación entre pacientes hemorrágicos y no
hemorrágicos.
La eliminación media fue de 31 mL/h en pacientes no hemorrágicos y 32.6 mL/h en
pacientes hemorrágicos.
La vida media fue de 2.9 h en pacientes no hemorrágicos y 2.3 en pacientes
hemorrágicos. Basándose en el estudio, una concentración de 8U/mL debería resultar en
hemostasis inmediata.8 (Ver Tabla 2 Anexos)
Y para que exista una hemostasis apropiada es necesario mantener los niveles arriba de 5-
6 U/mL.
El Factor recombinante VIIa está indicado para pacientes hemofílicos con episodios de
sangrado y con presencia de inhibidores para Factor VIII o Factor IX. La dosis
recomendada de factor VIIa para pacientes con hemofília A o B con inhibidores es 90
microg/Kg cada 2 horas hasta que la hemostasis sea lograda.
Riesgo
Factor recombinante VIIa no se debe de administrar a personas con hipersensibilidad a los
componentes del Factor VII o a proteínas de ratón, hámster o bovinas.
Factor IX
Es activado por el Factor VII en la via extrínsica y por el Factor XIa en la vía intrínseca. El
Factor IX activado, en combinación con el Factor VIII activado, activan al Factor X,
resultando en la conversión de protrombina en trombina. La trombina entonces convierte
fibrinógeno a fibrina para la formación de un coágulo de sangre en un sitio donde exista
hemorragia.
Factor IX recombinante es generado por línea celular CHO. La línea celular transformada
secreta Factor IX recombinante al medio de cultivo de donde se purifica por medio de
varias cromatografías.
El tratamiento con factor Recombinante IX disminuyó el tiempo parcial de la
tromboplastina de 135-150 segundos a 46-96 segundos. Estudios preclínicos indican que
el factor recombinante IX tiene bajo potencial trombogénico. También se reportó en
estudio stoxicológicos en ratones, ratas y perros que el Factor recombinante IX es bien
tolerado.
La vida media de eliminación ranqueó entre 10.9 y 15.8 horas y fue independiente de la
dosis. Estudios farmacocinéticos y farmacodinámicos mostraron que un incremento en la
concentración de Factor IX en el plasma está realacionado con la actividad del mismo.
Produccion Biotecnologica del Factor Recombinante VIII
El proceso encontrado se divide en dos etapas principales que se describen a continuación
así como en la Imagen en los anexos del documento. La primera consiste en una
producción continua que consiste en la producción del medio y el proceso de
fermentación. La otra etapa es la referente a la producción en el biorreactor, que es un
cultivo de tipo Batch.
Las consideraciones estequiometricas que se realizaron para el crecimiento celular, la
producción de la proteína y del producto fueron las siguientes:
Los sustratos principales son glucosa y glutamina. La base de cálculo utilizada fue 1 mol de
glucosa alimentado
La cantidad de biomasa producida por sustrato utilizado (Yx/s) se definió como 0.1 g
biomasa/g sustrato
La cantidad total de proteína producida (Yp/s) se definió como 5 g proteína total/ 13 g de
biomasa7.
Produccion del medio
De acuerdo a la bibliografía consultada, la formulación del medio debe contener lo
descrito en la Tabla, incluida en la sección de Anexos.
La producción del medio comienza disolviendo la mezcla del medio en WFI en un tanque
de 880L. Los componentes pueden ser agregados en su estado sólido o como líquidos
concentrados. Aquí se producen 83 L/h de medio.
Una vez elaborado al medio, este es pasado por un proceso continuo de esterilización el
cual puede causar una cierta degradación de los componentes del medio pero se asume
un 100% de presencia de los componentes del medio para simplificar los cálculos.
Recordemos que se alimenta continuamente medio esterilizado en 2 fermentadores en
perfusión
Fermentación en perfusión
La tecnología recombinante desarrollada por Genentech y licenciada a Bayer utiliza celulas
BHK. Como ya se menciono, se alimenta continuamente un par de fermentadores de 127
L, los cuales operan con un volumen constante de 100 L. A su vez, se implementa un
tercer fermentador para minimizar el riesgo de contaminación del medio.
Con estos volúmenes de alimentación y de operación se obtiene una cosecha de 1000 L
diarios en cada fermentador, de la cual se obtiene 0.957 mg/L del producto de titulo,
según el diseño del fermentador propuesto por Bayer.
Se introduce Oxigeno puro al sistema por el fondo del fermentador, el cual esta
comprimido a 6 bar y pasado por un filtro para asegurar su esterilidad. Los fermentadores
poseen una taza de aireación de 0.69 VVM. Por la parte superior del fermentador en
donde se obtienen CO2 y O2 , 6.7% y 93.3% respectivamente. Esta mezcla de gases es
pasada a través de un filtro antes de ser liberada a la atmosfera. La absorción de Oxigeno
del sistema es de 0.54 kg-O2/h.
Una vez realizado el proceso de ultrafiltración, la cosecha procesada llamada Cultivo de
Fluido de Tejido Clarificado y Ultra filtrado (UFTCF por sus siglas en ingles) posee la
composición descrita en la Tabla incluida en la sección de Anexos
Después de esta etapa, el UFTCF es almacenado y congelado.
Proceso en reactor Batch
Una vez obtenido el UFTCF por fermentación continua, este es congelado, y debe de ser
calentado antes de continuar con el proceso.
En este proceso, la primera alimentación al reactor Batch es de 2000 kg/Batch del UFTCF.
Esta cantidad es el equivalente aproximado a lo que se obtiene en 30 horas de
fermentación continua del producto.
Al terminar el proceso en el reactor, el 25% del UFTCF se envía a la corriente de
desperdicio debido a que este representa el porcentaje de UFTCF se contamina y debe de
disponerse de él. El otro 75% del UFTCF (1500 kg/Batch) se envía a purificación.
Aproximadamente se producen 245 Batches/anio con este proceso.
Purificación
En esta etapa se llevan a cabo dos operaciones unitarias que son el uso de columnas de
cromatografía y filtros “Dead end”.
Después de calentar el UFTCF se carga en una columna cromatografica de intercambio
iónico utilizando dietilaminoetil (DEAE) para realizar el intercambio iónico. Esto se realiza
con el propósito de remover la mayor cantidad posible de contaminantes en el UFTCF. El
tamaño de la columna debe ser de 110 L con una eficiencia de ligación de 95% y un
rendimiento del 85% refiriéndonos a la proteína activa. Después de realizar este paso, el
producto se reduce de 1500 kg/Batch a 230 kg/Batch con 19.3% de pérdida de la proteína
activa. Cabe resaltar que este es el paso en el cual se tiene la mayor pérdida de la proteína
activa durante la etapa de purificación.
El filtro Dead-end se usa para estimular la inactivación viral en el UFTCF.
A continuación, el producto se carga en una columna de Cromatografía de Afinidad a
Iones Metálicos de Cobre Inmovilizados (CuIMAC) debido a que posee una gran afinidad
por la proteína activa (100% ligación, 98% eficiencia) y permite una mejor separación de
los contaminantes y del producto de interés. En este paso se disminuye la corriente de
producto de 230 kg/Batch a 196 kg/Batch con 1.7% de pérdida de la proteína activa. Una
segunda columna cromatografica de afinidad se usa para concentrar aun más el producto,
y en este paso se reduce la corriente del producto de 196 kg/Batch a 64 kg/Batch con un
2.5% de pérdida de la proteína activa.
A continuación, se pasa la corriente obtenida al final por una unidad de ultrafiltración para
preparar el producto para su formulación.
Formulación
Una vez purificada la proteína, se requiere agregar una serie de nuevos materiales o
crudos, para activar la mezcla de la proteína activa en la formulación final. Este proceso se
logra a través de una serie de pasos de mezcla, almacenamiento e intercambio de buffers.
Durante la purificación se agrego albumina, con el fin de estabilizar la proteína de interés
durante los tratamientos químicos y de calor, a pesar de que esta pueda representar un
riesgo de contaminación para el producto de interés ya que para eso utilizamos el filtro
Dead-end para eliminar todos los virus o fagos que puedan estar presentes en nuestra
proteína de interés.
A continuación se realiza un intercambio de buffer en una unidad de diafiltracion con CaCl
y NaCl para ajustar el pH y remover la albumina.
El siguiente paso es congelar la formulación a -15C con el fin de enfriar el producto y
asegurar la calidad de este (obtener la aprobación QA).
El producto es descongelado y la formulación final se simula haciendo un intercambio de
buffer. Se agregan glicina, Histidina y sucrosa a la formulación en las cantidades
apropiadas para obtener la composición adecuada del producto liofilizado. Después de
este paso la concentración del producto es apta para ser suministrada en dosis a
pacientes.
Liofilización y Almacenamiento Final
Cada vial se rellena con 2.75 mL de producto, y después liofilizado y empacado. En la
simulación, la liofilización se debe de realizar antes del llenado de los viales. En la
liofilización el 97% del agua se evapora del producto y el ciclo para liofilizar dura 17 horas.
Cabe recordar que un ciclo normal de liofilización dura entre 48 y 72 horas. El producto
final contiene un vial de 1000 IU rFVIII y una jeringa. El Factor VIII es etiquetado de
acuerdo a las indicaciones y requerimientos establecidos y empacado. Al final del Batch se
producen aproximadamente 3705 cajas y cada caja tiene un costo de $1000 en el
mercado8
AGENTES TROMBOLITICOS RECOMBINANTES
Introducción
Ante una herida, comienza el proceso de hemostasis, donde el fibrinógeno (proteína
soluble de la sangre) se convierte en la proteína insoluble fibrina, que se entrelaza con las
plaquetas y forma el coágulo. Véase Figura 1 que muestra la Hemostasis dividida en tres
partes
Por lo general, en el organismo hay un balance entre el proceso de coagulación y la
fibrinolisis, lo cual está regulado por mecanismos endógenos que aseguran un óptimo
funcionamiento, de forma que el coágulo se forme en el lugar correcto y esté bien
controlado, evitando efectos trombogénicos, es decir coágulos fuera de lugar que
obstruyan el flujo sanguíneo.
Cuando el coágulo ya no es necesario, comienza el proceso de fibrinólisis, donde para
evitar la formación de trombos, se degradan las redes de fibrina, donde el plasminógeno
es transformado a su forma activa plasmina, compuesto que ataca la fibrina recién
formada.
La activación del plasminógeno a plasmina es estimulada por, entre otros compuestos, el
activador tisular del plasminógeno o t-PA. Para mejorar la producción, se desarrolla t-PA
recombinante (rt-PA) también conocido como alteplasa. La velocidad de eliminación de la
rt-PA por función del hígado, da espacio al desarrollo de otros fármacos variantes de rt-
PA, como son: Reteplasa, Tenecteplasa y Lanoteplasa.
Rol fisiológico
T-PA es una enzima que cataliza la conversión de plasminógeno en plasmina durante la
fibrinólisis, mediante una hidrólisis del enlace peptídico de la estructura del
plasminógeno. T-PA activa un plasminógeno altamente específico para la fibrina, lo cual
disminuye la cantidad de efectos secundarios sistémicos. Los activadores de plasminógeno
son inhibidos por la acción de los inhibidores de activador de plasminógeno PAI 1 y PAI 2,
que circulan a una concentración de entre 5 y 20 µg/L en el plasma16.
Los cambios en el plasma en el nivel de t-PA surgen a partir del endotelio mediante dos
mecanismos (a) uno rápido, de liberación a corto plazo, que ocurre a pocos minutos,
donde se libera por el endotelio como respuesta a una estimulación, desempeñando un
papel importante en la disolución de fibrina desde la formación y así previniendo la
formación de trombos. Mecanismo (b) un cambio a largo plazo en el flujo de síntesis y
secreción de t-PA, que es determinante de los niveles de t-PA bajo condiciones basales y
estimuladas.
El t-PA no se asocia con los efectos alegricos e hipotensivos reportados para los
activadores de plasminógeno endógenos (estreptoquinasa y complejo activador
plasminógeno acetilado – estreptoquinasa).
El t-PA recombinante (rt-PA) (alteplasa) es idéntico al t-PA natural del humano. Se utiliza
para tratamiento de pacientes hemofílicos, con infarto agudo al miocardio (AMI),
pacientes con embolia pulmonar masiva, para el control de paro cardíaco isquémico
agudo (en un margen de 3 horas post-infarto) y post hemorragia intracraneal. Reteplasa y
Tenecteplasa se utilizan para el control de infarto agudo al miocardio (AMI), mejorando el
funcionamiento ventricular y reduciendo el índice de mortandad. Lanoteplasa se
encuentra en desarrollo pero por ser derivado de rt-PA al igual que Reteplasa y
Tenecteplasa se espera un rol fisiológico semejante.
Clasificación del compuesto
El activador tisular del plasminógeno (t-PA) es una serina proteasa sintetizada por las
células vasculares endoteliales (células aplanadas que forman el endotelio vascular que
recubre la cara interna de los vasos sanguíneos y el corazón) como un polipéptido de una
sola cadena, con una longitud de 527 amino ácidos y una masa molecular de
aproximadamente 64kDa15. La figura presenta un esquema de la estructura primaria de t-
PA. Cuenta con 17 enlaces disulfito , 4 glicosilaciones enlazadas con N en los residuos 117,
184, 218 y 448 15. Hay dos formas de t-PA, Tipo I, esta glicosilado en Asp 117, 184 y 448,
mientras que Tipo II carece de la glicosilación de Asn 184.
Rt-PA también existe en dos formas que varían por la presencia/ausencia de un C residual
Asn184. Fuera de eso, su estructura es semejante a la de t-PA. Reteplasa es una variación
de t-PA, péptido de una cadena, no glicosilada, con masa molecular de 39.6kDa.
Tenecteplasa tiene sustitución de amino ácido en tres regiones de t-PA, lo que resulta en
la incorporación de un complejo polisacárido (T103N), la remoción de un carbohidrato
alto en manosa (N117Q), un aumento en la especificidad de fibrina (KHRR496-499AAAA)8.
Biosíntesis de Compuesto
Alteplasa (rt-PA) originalmente se producía a partir de células de ovario de hámster chino
(CHO), que son transfectadas con cDNA del producto humano natural, utilizando un
proceso de agitación de botella (Roller Bottle, RB), la mayoría de los estudios
farmacoquinéticos y clínicos fueron conducidos usando rt-PA a partir de este proceso.
Posteriormente se desarrollo con fines comerciales un proceso a partir de un cultivo en
suspensión (suspensión cultura, SC) a gran escala cuyo producto es aproximadamente un
80% rt-PA de una sola cadena. El rt-PA del proceso SC desaparecía de la sangre 30% más
rápido que el obtenido del proceso RB. Aunque ambos productos tenían propiedades
farmacodinámicas y terapéuticas similares. Tenecteplasa, se produce a partir de la
transfección de células de hámster chino (CHO) con un plásmido que contiene el gen t-PA
amplificado en presencia de metotrexato, fueron cultivadas en un medio libre de suero
durante 6 días, el producto fue purificado utilizando una cromatografía de afinidad de
lisina. Mientras que Reteplasa se expresa en Escherichia coli como una sola cadena no
glicosilada.
Enfermedades que mitigan/curan
La deposición de fibrina y plaquetas en el sistema vascular conlleva a padecimientos
trombolíticos, es decir, cuando los coágulos de sangre obstruyen las venas o las arterias,
impidiendo o dificultando el flujo sanguíneo normal, lo que se conoce como trombosis11.
Puede ser trombosis arterial, cuando el coágulo obstruye vasos sanguíneos que llevan la
sangre oxigenada del corazón al resto del cuerpo; O trombosis venosa, cuando el coágulo
obstruye los vasos sanguíneos que devuelven la sangre del cuerpo al corazón. Es un
padecimiento que dependiendo de la severidad del caso puede llevar a fallas cardiacas o
embolia pulmonar y con ello a la muerte.
Por lo general la coagulación y la fibrinogenolisis existen en un estado de balance en el
organismo mediante mecanismos regulatorios endógenos que aseguran el óptimo
funcionamiento del proceso de hemostasis y de coagulación de sangre, de forma que el
coágulo se forme en el lugar correcto y esté bien controlado, evitando los efectos
trombogénicos.
Tratamientos con agentes trombolíticos recombinantes se utilizan para fomentar la
disolución de los coágulos y disminuir el índice de mortandad ayudando al cuerpo a llegar
al balance entre coagulación y fibrinogenólisis. Alteplasa, se utiliza para tratamiento de
hemofilia, infarto agudo al miocardio (AMI), embolia pulmonar masiva, para el control de
paro cardíaco isquémico agudo (en un margen de 3 horas post-infarto) y post hemorragia
intracraneal. Reteplasa y Tenecteplasa se utilizan para el control de infarto agudo al
miocardio (AMI), mejorando el funcionamiento ventricular y reduciendo el índice de
mortandad. Lanoteplasa se encuentra en desarrollo pero por ser derivado de rt-PA al igual
que Reteplasa y Tenecteplasa se espera un rol fisiológico semejante.
Análisis químico del compuesto
Análisis farmacocinético fue hecho en conejos a los que se les administró una dosis vía
intravenosa de 0.3mg/kg y se obtuvieron muestras de sangre de 0.2ml cada 2 horas, las
muestras fueron recolectadas en EDTA con Phe-Pro-Arg clorometil cetona y cuantificadas
en una ELISA utilizando dos anticuerpos monoclonales. Dando mayor capacidad de
rendimiento para Tenecteplasa que para Alteplasa.
La unión a la fibrina fue probada con Tyr-Pro-Arg clorometil cetona como agente
especifico para variantes de t-PA. Donde la Tenecteplasa mostró una Kd (constante de
disociación) de 0.35 nmol/L, comparable con la Alteplasa con una Kd de 0.21 nmol/L.
El rango de inhibición por PAI1 se midió en base a la pérdida de actividad amidolítica en
base al tiempo. Donde se observó que Tenecteplasa es 80 veces más resistente a la
inhibición por PAI1 que t-PA.
Se midió la especificidad en comparación de t-PA y sus derivados, Tenecteplasa y
Reteplasa, en base a la actividad catalítica en cuanto a fibrina y fibrinógeno, siendo 15
veces superior la de rt-PA que la de t-PA17.
El efecto inmunológico fue probado en conejos blancos, tomando muestras de sangre en
tubos que contienen una solución de EDTA al 8.5%, y 50µM D-Phe-Pro-Arg (PPACK) que
bloquea la actividad de t-PA. La concentración de inmuno reactividad se determinó
usando una prueba Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)18
Farmacocinética y Farmacodinámica del compuesto
La farmacocinética de rt-PA ha sido estudiada en ratones, ratas, Conejos, primates y en
humanos. Después de la administración intravenosa, las concentraciones en el plasma
descienden rápidamente con una vida media inicial dominante de menos de 5 minutos en
todas las especies.
Los rangos de disminución en el plasma van desde 27 mL/min en conejos hasta 620
mL/min en humanos. Los t-PA recombinantes exhiben una farmacocinética no linear en
concentraciones altas en el plasma. Es en concentraciones que no exceden del 10% al 20%
de Km cuando se presentan de forma lineal. (Vease Tabla 5 en Anexos)
Esta información muestra que los t-PA recombinantes tienen un volumen inicial de
distribución aproximado al volumen en plasma y un rápido aclaramiento plasmático. No
hubo diferencia en la farmacocinética con las siguientes infusiones.
La ruta primaria de eliminación de alteplasa es mediada por los receptores de mecanismos
en el hígado. Tres tipos de células en el hígado son responsables de estos procesos: células
parenquimales, células endoteliales y células Kupffer. Las células Kupffer y las células
endoteliales median eliminación de t-PA via receptores de manosa. Las células
parenquimales los hacen vía LRP (low-density lipoprotein receptorrelated protein).
La alteplasa t-PA se usa para el tratamiento de enfermedades como el AMI y embolia
pulmonar masiva en adultos. Para su administración se han estudiado dos regímenes, un
régimen acelerado de 90 minutos y un régimen de tres horas. Para el régimen acelerado la
dosis recomendada se basa de acuerdo al peso del paciente, sin exceder los 100 mg de
alteplasa.
Para pacientes que pesen más de 67 kg, el régimen recomendado es 100 mg distribuidos
en 15 mg de inyección intravenosa en bolo , seguidos por 50 mg administrado por 30
minutos, y posteriormente 35 mg por los próximos 60 minutos.
Para pacientes que no sobrepasan los 67 kg de peso, se recomienda un régimen de 15 mg
de inyección intravenosa en bolo, seguido por 0.75 mg/kg por 30 minutos y después 0.5
mg/kg por los próximos 60 minutos pero no excediendo los 35 mg.
Para el régimen de 3 horas, la dosis recomendada es de 100 mg administrados como 60
mg en la primera hora y 20 mg durante cada una de las siguientes dos y tres horas.
Reacciones adversas.
La terapia trombolítica incrementa el riesgo de sangrado, por lo que la alteplasa está
contraindicada para pacientes con una historia de accidentes cerebrovasculares, o
pacientes que tengan algún tipo de hemorragia interna, neoplasma intracranial,
malformación arteriovenosa o aneurisma o que hayan tenido algún trauma reciente.
Segunda generación.
Reteplasa
Reteplasa es una variante de t-PA que consiste de los dominios humanos de proteasa y
kringle 2. Se expresa en células de E. Coli como un péptido no glicosilado de cadena
simple. Como la alteplasa, la reteplasa es un activador fibrino-específico de
plasminógeno.
La reteplasa tuvo eficiencia máxima in vitro similar a la alteplasa, sin embargo, la
concentración molar requerida para producir un 50% de lisis coagular fue 6.4 veces mayor
para reteplasa que para alteplasa. (Ver Tabla 6 en Anexos)
Reteplasa es indicado para el tratamiento de AMI en adultos para el mejoramiento del
funcionamiento ventricular después de un infarto agudo al miocardio, la reducción de la
incidencia de problemas cardiacos y la reducción de mortalidad relacionada con AMI. La
potencia de este agente se expresa en unidades usando un estándar de referencia que es
específico para reteplasa y no puede ser comparado con unidades usadas para otros
agentes trombolíticos.
Reteplasa es administrado como una inyección doble en forma de bolo de 10 U cada una y
con una diferencia entre inyecciones de 30 minutos. De la misma forma que con otros
trombolíticos, Reteplasa esta contraidicado de la misma forma que Alteplasa. No se debe
de suministrar en pacientes con historiales de sangrado interno, accidente intracrianal o
cualquier trauma o cirugía.
Tenecteplasa
La tenecteplasa es una variante t-PA que tiene sustituciones de amino ácidos en tres
regiones de t-PA. La eliminación de la tenecteplasa en el plasma de conejos fue de 1.9
mL/min/kg comparado con los 16 mL/min/kg para la alteplasa. Estudios de distribución
tisular muestran que el hígado es el órgano involucrado principalmente en la eliminación.
La forma de los carbohidratos en la tenecteplasa son parte del tipo oligosacárido complejo
y sin la presencia de estructuras de manosa. Es por esto que la eliminación rápida mediada
por el receptor de mannosa observada para la alteplasa no ocurre con la tenecteplasa. Se
cree que la tenecteplasa es eliminada por receptores de galactosa presentes en las células
sinusoidales del hígado. Una segunda via de eliminación de tenecteplasa es un mecanismo
mediado por lipoproteínas de baja densidad relacionadas a la LRP.
La dosis total de tenecteplasa no debe exceder los 50 mg y se basa en el peso del
paciente. (Ver tabla 7 Anexos)
El tratamiento debe ser iniciado lo más pronto posible después de los síntomas de un AMI.
La tenecteplasa está contraindicada en pacientes con diátesis hemorrágica conocida, o
sangrado interno, historia de accidente cerebrovascular, cirugía intracraneal reciente o
aneurisma.
Se realizaron dos estudios (TIMI10A y TIMI10B) para examinar la farmacocinética de la
tenecteplasa. La concentración en el plasma de Tenecteplasa disminuyen de forma
bifásica con una vida media inicial de 11 a 20 minutos y una vida media terminal de 41 a
138 minutos. La eliminación media de tenecteplasa quedó en rango de 125 a 216 mL/min
y decrecía incrementando la dosis. (Ver Tabla 8 Anexos)
Se pretende que la tenecteplasa sea suministrada por inyección intravenosa en forma de
bolo después de una reconstitución con agua esteril. La actividad de la tenecteplasa se
expresa en unidades específicas para la misma y se ha definido en 200 unidades/mg de
proteína.
Lanoteplasa
La lanoteplasa está actualmente en desarrollo. Es una variante de t-PA en la que los
dominios de la fibronectina y los factores de crecimiento epidermal han sido removidos.
Además de que una sustitución de aparagina por glutamina en el amino acido 117
produce eliminación reducida.
Formulaciones
Estreptoquinasa (Sk): Streptase
La molécula de Sk se ha modificado debido a que sus propiedades terapéuticas se ven
limitadas a causa de su inmunogenicidad y su corta vida media en la sangre, ya que es
degradada por la plasmina. Razón por la cual los trabajos de modificación se han centrado
en extender la vida media y/o reducir la inmunogenicidad mediante la mejora de la
activación del plasminogeno.
La primera de estas modificaciones presente en el mercado fue el complejo activador
equimolar no covalente formado por la Sk y el lis-plasminogeno humano, cuyo centro
catalítico se acilo de forma reversible para incrementar la vida media de la molécula en
reacción con la Sk.
PM: 46 000 Daltons
Administración intravenosa de 1.5 millones de IU por un periodo de 1 hora. La vida media
del complejo activador (estreptoquinasa-plasminogeno y/o estreptoquinasa-plasmina) es
de 23 min1.
Estreptoquinasa recombinante: Heberquinasa
La Sk recombinante producida por la levadura Pichia pastoris es glicosilada y esto le
confiere determinada resistencia a la proteólisis. Se han realizado polímeros con el
polietilenglicol (PEG) con la finalidad de incrementar la vida media. La inmunogenicidad de
los dominios de la Sk es diferente y se han obtenido mutantes recombinantes de Sk con
inmunogenicidad reducida.
Es obtenida del aislamiento y clonación de el gel de Estreptoquinasa de la cepa de
Streptococcus equisimilis grupo C (ATCC 9542). En cuanto a la estructura primaria de la
proteína, se ha caracterizado por la molécula de N-terminal de la secuencia, el análisis de
aminoácidos y espectrometría de masa con el fin de demostrar la identidad, integridad y
consistencia de la Heberquinasa.
La Heberquinasa contiene 5 aminoácidos mutados en comparación con la Estreptoquinasa
de S. equisimilis del grupo C. El punto isoeléctrico teórico del producto es 0.06 unidades
más bajo que el de la estreptasa, lo que quiere decir que la proteína es mas acida. La
molécula de Heberquinasa tiene dos Argininas sustituidas por Histidina y Acido Glutamico,
lo que provoca que cambie su densidad de carga, modificando su movilidad en el gel de
electroforesis S-PAGE, migrando significativamente más rápido que la Estreptoquinasa
natural2.
El mapeo de la proteína se realiza frecuentemente para permitir la verificación de su
estructura completa primaria al 100%. A su vez, la determinación de la masa molecular de
la proteína intacta que da un valor menor a 1 Da asegura la integridad de la proteína.
El cambio de los aminoácidos no afecta en lo absoluto la seguridad, pureza y efectividad
del producto obtenido por la tecnología de DNA recombinante
Alteplasa: Actilyse
Se obtiene de la serina proteasa, que contiene 527 aminoácidos, y es producido por ADN
recombinante usando el ADN complementario (ADNc) para el activador natural del ser
humano del plasminogeno tisular obtenido a partir de una línea de celulas de melanoma
humano.
PM: 68 000 Daltons4.
Estreptoquinasa recombinante
Fosfato de sodio dibásico y monobásico: reguladores de pH
Glutamato de sodio:
Albumina humana
Produccion Biotecnologica de ALTEPLASA: PLASMINASA®
La línea celular utilizada fue Celulas de Ovario de Hámster Chino (CHO) que producen
activador tisular del plasminogeno humano (t-PA). La línea celular se produjo
transfectando celulas CHO con un plásmido que contenía el gen que codifica para t-PA y la
investigación la realizo la empresa Genentech al final de la década de los ochenta. Las
celulas se encuentran a la venta en la ATCC.
El medio de cultivo usado es el Dulbecco Modified Eagle’s Medium (DMEM) y F12 (1:1). La
inoculación de un biorreactor con la línea celular implica el escalamiento de los volúmenes
que se usaran. Con este propósito se usan frascos en forma de T especiales para el cultivo
de las celulas humanas. Estos frascos son rectangulares y están hechos de policarbonato.
Con el volumen adecuado, se inocula el reactor que funcionara de forma de proceso Fed-
batch. Constantemente se alimentara medio fresco, y en otro recipiente se recolectara
medio de cultivo con el producto. Las celulas estarán libres y para evitar el lavado de la
biomasa se utilizara la técnica de cromatografía de afinidad. Se concentrará el producto
aun más por diálisis. El fundamento de esta técnica es retener las proteínas en una
membrana semipermeable y dejar pasar los solutos de bajo peso molecular. Se obtendrá
la proteína pura en solución que se conservara por liofilización. La forma farmacéutica en
que se venderá al publico será en viales para lo cual primero se mezclaran los
componentes de la formula en una mezcladora y posteriormente se liofilizaran para
obtener el producto terminado6.
REFERENCIAS
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ANEXOS:
Fig. 1 Esquema de Hemostasis dividida en 3 partes, Iniciación, formación de coágulo y
Fibrinólisis.
Fig. 2 La compleja cascada
de coagulación con todos
los factores de coagulación
que involucra.
Fig. 3 Esquema simplificado de la cascada de coagulación en torno a las enzimas tratadas
en este documento.
Fig. 4 Presentación comercial
de rFVIII Kogenate FS ™ de
Bayer ™
Fig. 5 Diagrama de flujo del proceso de producción del Factor VIII para Kogenate™ (2003).
Fig. 6 Presentación comercial de la Heberquinasa
Fig. 7 Presentación comercial de Alteplasa Recombinante. “Actilasa”™
Alteplase, recombinant package insert (Activase, Genentech—US)
Fig. 8 Diagrama de flujo del proceso de producción biotecnológica de Alteplasa
Fig. 9a(arriba): Proceso para
Kogenate™ versión 2010.
Producción celular
Fig. 9b (abajo): Proceso para
Kogenate™ versión 2010.
Purificación e introducción al
mercado.
Tabla 1. Farmacocinética de Factor VIII recombinante. Parámetros tomados después de
administración intravenosa a pacientes con hemofilia A
Tabla 2. Farmacocinética clínica de Factor recombinante Vía
Tabla 3. Ingredientes del medio de cultivo para la producción del rFVIII
Ingredient Name Flow Rate (kg/hr Mass Comp. (%)
Sulfato de amonio 0.33200 0.3978
Cloruro de calcio 0.08300 0.0995 Glucosa 12.45 14.9194 Glutamina 12.45 14.9194 Insulina humana recombinante 0.00001 0.00001 Cloruro de potasio 0.08300 0.0995 Fosfato de potasio 0.2075 0.2487 Sulfato de magnesio 0.166 0.1989 Murina IgG 0.032 0.0383 Polisorbato 0.00064 0.0008 Citrato de sodio 0.083 0.0995 Fosfato de sodio 0.1245 0.1492 WFI 57.437 68.8292
Tabla 4. Composición del UFTCF empleado en la producción biotecnológica de rFVIII
Nombre del Ingrediente Taza de Flujo (kg/h) Composición Másica
Sulfato de amonio 0.30286 0.4511 Cloruro de calcio 0.07567 0.1128 Factor VIII 0.00007 0.0001 Glucosa 10.84989 16.8418 Glutamina 11.30047 16.8418 ADN de célula hospedera 0.02282 0.0340 Insulina humana recombinante 0.00001 0.000015 Cloruro de potasio 0.07567 0.1128 Fosfato de potasio 0.18917 0.2819 Sulfato de magnesio 0.15134 0.2255 Murine IgG 0.02917 0.0435 Proteína que no es de interés 0.04464 0.0665 Polisorbato 0.00058 0.0009 Citrato de sodio 0.07567 0.1128 Fosfato de sodio 0.1135 0.1692 Agua (incluyendo WFI) 43.86642 63.3768
Tabla 5. Parámetros famacocinéticos para alteplasa. Parámetros obtenidos después de
administración intravenosa en pacientes saludables y pacientes con AMI (infarto agudo de
miocardio).
Tabla 6. Parámetros farmacocinéticos de Reteplasa. Parámetros obtenidos de estudio en
fase II en pacientes con AMI.
Tabla 7. Relación entre peso del paciente y dosis de Tenecteplasa.
Tabla 8. Parámetros farmacocinéticos de Tenecteplasa. Obtenidos de la fase II de un
estudio en pacientes con MIA
