producciÓn de proteÍnas recombinantes
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PRODUCCIÓN DE PROTEÍNASRECOMBINANTES
ELECCIÓN DEL SISTEMA DE EXPRESIÓN
Características Importantes a Tener en Cuenta en la Producción de proteínas
recombinantes
Complejidad de la molécula: estructura terciaria y cuaternaria, modificaciones postraduccionales
Uso: investigación, diagnóstico, farmacéutico, terapia
Cantidad de producto
Economía
Aspectos regulatorios
Convenientes para crecimiento en grandes fermentadores.
Se obtienen altos rendimientos (0,1-5 g/L).
En general las proteínas tendrán metioninaN-terminal.
Es frecuente la producción en forma de cuerpos de inclusión.
No produce eventos postraduccionales.
Endotoxinas
BACTERIAS
Conveniente para el crecimiento en grandes fermentadores.
Buenos rendimientos (0.01-1 g/L).
Introduce modificaciones postraduccionales.
La glicosilación es distinta de la de mamíferos: “high manosas”
La proteólisis suele ser un problema.
LEVADURAS
CÉLULAS DE MAMÍFEROS
Los cultivos en grandes escalas son difíciles de realizar y muy costosos.
Los rendimientos son generalmente bajos (0,001-0,1 g/L).
Se producen modificaciones postraduccionales.
Para ciertas proteínas puede ser el único sistema de expresión posible.
PLANTAS
Se producen modificaciones postraduccionales
Expresión localizada en diferentes órganos
Expresión en estadíos específicos del crecimiento
Crecimiento en campo barato
La glicosilación es distinta que la de mamíferos
Eficiencias bajas de transformación y expresión
Seguridad controvertida
Hay tres factores importantes que influencian la expresión de una proteína recombinante
Huésped
Condiciones de crecimiento
Vector
Por lo tanto la solución a los problemas de expresiónestará a nivel del vector, de las cepas y de las
condiciones de inducción.
EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN BACTERIAS
¿POR QUÉ BACTERIAS?
¿POR QUÉ BACTERIAS?
Simplicidad
Cultivo barato y de alta densidad en tiempos cortos
Genética bien conocida
Gran cantidad de herramientas disponibles para biotecnología (plásmidos, cepas mutantes…)
¿POR QUÉ NO BACTERIAS?
No producen modificaciones postraduccionales: glicosilación, puentes disulfuro (sólo en periplasma).
No secretan la proteína al medio de cultivo (E. coli)
Cuerpos de inclusión
Endotoxinas
Escherichia coli
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN BACTERIAS
2 Estrategias:
sirve para purificar
Proteína de fusión generalmente es más estable
más soluble
Expresión directa
VECTORES DE EXPRESIÓN PARA E. COLI
PLÁSMIDO
Secuencia Shine DalgarnoSecuencia en el ARNm, complementaria a una secuenciadel ARNr 16S de la subunidad pequeña del ribosoma : posiciona el ARNm en el ribosoma
AAGGAGGUUUCCUCCA
AUG5’ 3’ARNm
3’ 5’16S rRNA
Subunidad pequeña ribosomal
Efecto de una estructura secundaria en el extremo 5’ del mRNA
Extremo 5’ del mRNA, en la región del codón de inicioAUG, NO debe ser autocomplementaria, ya quese podría bloquear el movimiento del ribosoma e impedir la traducción del mensaje.
Inicio
TERMINADOR DE LA TRADUCCIÓN
Codón STOP + base siguiente
El más eficiente en E. coli: UAAU
Fuertes
simple químicoInducibles: Inductor
barato térmico
Regulables: Baja o nula expresión basal
OPERÓN LACTOSA
Alolactosa : isómero de lactosa. Isomerizado por β galactosidasa
6-O-β-D-Galactopyranosyl-D-glucose; β-D-Galactopyranosyl (1→6)-D-glucose
galactosa-(β1-4)-glucosa
REGULACIÓN
Mecanismo dual de control
1- Regulación negativa: represor Lac, expresión constitutiva. Es secuestrado por alolactosa e IPTG
2- Regulación positiva: por AMPc que se une a CAP: proteína activadora por catabolito = CRP: proteína aceptora de AMPc, en respuesta a glucosa.
Curva bifásica de crecimiento de Monod: Diauxia
I: crecimiento por glucosa
II: crecimiento por lactosa
IPTGisopropil-β-D-tio-galactósido
No metabolizado por βgal. Y no usa la permeasa
ONPGorto-nitrofenil-β-D-galactopiranósido
Sustrato de βgalproduce o nitro fenol (amarillo)
X-gal5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-
galactósidoSustrato de βgalproduce indoxil
(azul)
SISTEMA DE EXPRESIÓN pET
• Promotor híbrido T7/lac sólo funciona con ARN polimerasa del fago T7, no con la de E. coli
• Cepa bacteriana BL(DE3): E. coli lisogenizada con un fragmento del fagoDE3 que codifica para la ARN polimerasa T7
• Inductor: IPTG
• Los niveles basales de expresión pueden ser disminuídoscon lisozima T7, inhibidor de T7ARN pol. Plásmidos pLysSy pLysE
• La glucosa en el medio aumenta la represión del promotor.
Lisogenizada con un fragmento de fago DE3 que codifica para la T7 RNA polimerasa bajo el control del promotor lacUV5 inducible por IPTG. También posee una copia del gen lacI.
Células huésped para expresión
IPTG
Genoma de E.coli
lacI monómero
LacI tetrámero
LacI tetrámero
Plásmido pET
Transcripción
pET
SISTEMA DE EXPRESIÓN pET (plasmid for expression by T7 RNA pol)
Promotor: T7 RNA polimerasa o promotores híbridos (T7-lac) Gen lacI o lacIqSitios de clonadoPéptidos de fusión (cola de poliHis)Sitios de corte para proteasasGen βlactamasa
pET-11 aVendor:StratageneVector Type: BacterialPromoter: T7/lacOExpression Level: Tightlycontrolled (use IPTG toactivate)Backbone size: 5700Sequencing Primer: T7 FwdBacteria Resistance: AmpicillinComments:Tighter control ofexpression level than pET-3; a,b,c,d vary by MCS
Plasmid map of pET-11_a
pET-22b(+)-HpENRGene/insert name: noyl-acyl carrier protein reductaseAlternative names: ENRInsert size (bp): 825GenBank/Entrez ID of insert: AAD05765Gene/insert aliases: fabISpecies of gene(s): Helicobacter pyloriVector backbone: pET-22b(+) (Search Vector Database)Backbone manufacturer: NovagenType of vector: Bacterial expressionBackbone size (bp): 6238Cloning site 5': NdeISite destroyed during cloning: NoCloning site 3': BamHISite destroyed during cloning: No5' Sequencing primer: T7 (List of Sequencing Primers)3' Sequencing primer: T7Bacteria resistance: AmpicillinHigh or low copy: Low CopyGrow in standard E. coli @ 37C: YesPlasmid Provided In: DH5aPrincipal Investigator: Se Won SuhArticle: Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis ofenoyl-acyl carrier protein reductase from Helicobacter pylori. Lee HH et al. (Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2002 Jun . 58(Pt 6 Pt 2):1071-3. Pubmed)
Plasmid map of pET-22bPlus
SISTEMA DE EXPRESIÓN pBAD
Expresión muy regulada Arabinosa: niveles altos de expresiónSin arabinosa + glucosa: no expresión
Inducción dosis dependiente (aumento lineal en la expresión con el incremento del inductor)
Buen rendimiento proteico
Cepas de E. coli con genes ara mutados, alta expresión con bajos niveles de arabinosa (no metabolizan la arabinosa)
OPERÓN ARABINOSA
O1 I
SISTEMA DE EXPRESIÓN pBAD
ArabinosaDímero AraC
Transcripción
Dímero AraCpBAD
Para la máxima activación de la transcripción se requieren dos eventos
Unión de arabinosa a araC
Unión de AMPc a CRP que estimula la unión de araC a O1 (I1)
La glucosa puede reprimir la expresión basal al disminuir el AMPc
Otros promotores
• Promotor tac: Promotor híbrido: región -35 del promotor trp + región -10 del promotor/operador lacUV5.La expresión es reprimida por lacI (inactivado por IPTG).Más fuerte que promotor lac (5-10 x) y trp (3x)
• Promotores de fagos: Promotor lambda PL regulado por el represor cI. cI857: temperatura sensible 30ºC 42ºCcI: bajo el control del promotor lac (regulado por IPTG)
Regulación del promotor λpL
La temperatura induce genes de heat shock (proteasas)Desnaturalización térmica de la proteína expresada Desventajas
Los niveles de expresión de un gen son determinados fundamentalmente por:
La eficiencia de transcripción
La estabilidad del ARNm
La frecuencia de la traducción del ARNm
ESTABILIDAD DEL ARNm
RNasa II exonucleasas
Los ARNm son degradados por PNPasa
RNasa E endonucleasa (cepa BL21 star)
La protección del ARN de las RNasas depende de:
Plegamiento del ARN
Protección por ribosomas: Imp. iniciación de la traducción eficiente, evitar estructuras 2as
inhibitorias en RBS
Modulación de la estabilidad por poliadenilación PAPI y PAPII poliadenilación polimerasas
facilita la degradación por RNasaII y PNPasa
FRECUENCIA DE TRADUCCIÓN
Diferentes organismos pueden usar losdiferentes codones a una frecuencia
distinta.
UsoUso de de codonescodones en en E. coliE. coli y y humanoshumanos
Uso de codones poco frecuentes
errores traduccionales
Sustitución de aminoácidos Terminación de la traducción prematura
Uso de Codones: Estrategias de Optimización
Uso de cepas que sobreexpresan tRNAs de bajaabundancia (ej cepas Rossetta de Invitrogen).
Co- transformación del huésped con plásmidos queexpresen tRNAs de los codones problemáticos
Síntesis química de un nuevo gen.
Mutagénesis.
Destino de la proteína recombinante
Citoplasma
Periplasma
Medio extracelular
¿Por qué citoplasma?
Mayor producción
CUERPOS DE INCLUSIÓN
Agregados proteicos amorfos
Se generan como respuesta al estrés debido a la alta expresión de proteínas recombinantes
Figure 2. Transmission electron microscopic photographs of (a) R. sphaeroides ES16; (b) R. sphaeroides N20; and (c) R. sphaeroides U7 in GM medium containing malate as a carbon source at the stationaryphase (72 hrs). Bacterial cells packed with poly-β-hydroxybutyrate inclusion bodies. Bar = 2.0 μm.
Mecanismo de generación ¿?
Alta velocidad de síntesis impide el plegamientoapropiado ?.
Ambiente citoplasmático en E. coli más reductor queoxidante, lo que desfavorece la formación de puentesdisulfuro apropiados??
LA AGREGACIÓN PUEDE MINIMIZARSE
Temperatura….20-25ºC
Velocidad de expresión
Metabolismo del huésped
Ingeniería de la proteína recombinante………proteínasde fusión
Co- expresión de chaperonas
Uso de cepas huésped deficientes en tioredoxina y/otioredoxina reductasa para mantener un potencial redoxfavorable (cepas de E. coli “Origami”).
Sorensen, Mortensen. J. Biotechnol. 115 (2005) 113-128
Ventajas de los cuerpos de inclusión
Se acumulan en el citoplasma en mayor nivel (> del 25%) que la proteína en su forma soluble.
Son purificados por un procedimiento de centrifugación.
No tienen actividad biológica. En la producción de proteínas tóxicas en E. coli, ésta puede ser la únicaestrategia posible.
Son agregados amorfos resistentes a proteasas de E. coli.
Fotografías hechas al microscopio confocal de bacterias recombinantes que producen una proteína verde fluorescente que agrega. La zona más fluorescente corresponde a los cuerpos de inclusión (imagen izquierda). El gradiente de colores indica la intensidad de fluorescencia que presentan estas células, siendo el color lila la zona menos fluorescente y la blanca la que lo es más (imagen derecha
02/2007 -Los cuerpos de inclusión bacterianos tienen proteínas funcionalesUn grupo de investigadores de la UAB acaba de hacer un descubrimiento importante en el campo biotecnológico: han localizado proteínas funcionales en el interior de los cuerpos de inclusión bacterianos, lo que permite utilizarlos como biocatalizadores cuando están formados por enzimas y aumentar el espectro de producción de estas proteínas.-Garcia-Fruitos, E., A. Aris, and A. Villaverde. "Localization of functional polypeptides in bacterial inclusion bodies". Appl.Environ.Microbiol. 73.1 (2007): 289-94.- Garcia-Fruitos, E., et al. "Aggregation as bacterial inclusion bodies does not imply inactivation of enzymes andfluorescent proteins". Microb.Cell Fact. 4 (2005): 27.
Activador de plasminógeno en E. coli
Desnaturalización: 6 M clorhidrato de guanidinio/urea
Remoción de los agentes desnaturalizantes:diálisis, dilución, cromatografía
Separación de restos celulares por Filtración del flujo tangencial o normal
¿Por qué periplasma?
Disminución de proteínas contaminantes en el material a purificar
Mayor probabilidad de tener la PR con N terminal auténtico
Menor proteólisis
Fácil liberación de la proteína por shock osmótico
Disminución de efectos negativos de proteínas tóxicas sobre el crecimiento celular.
Proteínas solubles, activas: por formación de puentes S-S facilitadapor ambiente menos reductor.
Secuencia de exportación o secuenciaseñal de exportación
Secuencia de un péptido Señal en la PR, para ir a la membrana plasmática y pasar a través de ella. Se agrega al extremo NH2 de la proteína (extremo 5’ del gen).
signal protein of interestNH2 COOH
Secuencias señal de genes ompA , pelB, βlactamasa, malE…
Secuencia señal
NH2 COOH
aa. hidrofóbicos: ala, val, leu.aa.q+ aa menos hidrofóbicosAla-X-Ala box
Dominio N Dominio H Dominio C
aa 1: debe tener una cadena lateral pequeña neutra: ser, ala, gly
Signal sequences Amino acid sequences
PelB (pectate lyase B) from Erwinia carotovora MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAOmpA (outer-membrane protein A) MKKTAIAIAVALAGFATVAQAStII (heat-stable enterotoxin 2) MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYAEndoxylanase from Bacillus sp. MFKFKKKFLVGLTAAFMSISMFSATASAPhoA (alkaline phosphatase) MKQSTIALALLPLLFTPVTKAOmpF (outer-membrane protein F) MMKRNILAVIVPALLVAGTANAPhoE (outer-membrane pore protein E) MKKSTLALVVMGIVASASVQAMalE (maltose-binding protein) MKIKTGARILALSALTTMMFSASALAOmpC (outer-membrane protein C) MKVKVLSLLVPALLVAGAANALpp (murein lipoprotein) MKATKLVLGAVILGSTLLAGLamB (λ receptor protein) MMITLRKLPLAVAVAAGVMSAQAMAOmpT (protease VII) MRAKLLGIVLTTPIAISSFALTB (heat-labile enterotoxin subunit B) MNKVKCYVLFTALLSSLYAHG
Appl Microbiol Biotechnol. 2004 Jun;64(5):625-35. Epub 2004 Feb 14.
Secreción de la proteína al medio extracelular
Post cosecha: shock osmóticocongelamieto/descongelamientolisozimashock con cloroformo
Durante el crecimiento: agregar glicina o tritón X100 al mediofusión a proteína transportadora como hemolisina o de membrana como OmpFuso de cepas defiecientes en pared
Estrés en E coli recombinantes
Causas
•Mantenimiento del plásmido: Nº de copias……..genes constitutivos (R a ATB)
•Expresión elevada de la proteína recombinante
gasto E x sint. Proteína rec.
vel. de crecimiento biomasa. Sint. de proteínas de estrés
respiración
RESPUESTA AL ESTRÉS
•“Stringent response”: reprogramación en el patrón de expresión de genes y disminución en la expresión de genes de transcripción, traducción y síntesis de aa. como consecuencia de la disminución en la disponibilidad de nutrientes, fundamentalmente aa.
Adición de aminoácidos
RESPUESTA AL ESTRÉS
•Proteólisis de la proteína recombinante
cepas deficientes en proteasasIngeniería cepas deficientes en proteínas heat shock del huésped coexpresión de chaperonas
coexpresión de inhibidores de proteasas
síntesis de proteína de fusiónIngeniería mutagénesis dirigida al sitio de corte de proteasadel producto redireccionamiento por péptido señal
Los sistemas de chaperonas son cooperativos y las estrategias más favorables involucran la co expresión de combinaciones de chaperonas pertenecientes a las familias de GroEl, DnaK, ClpB y del factor disparador asociado a ribosoma (trigger factor)
Reducción de estrés: x adaptación de las células
¿Cómo?
gradual del inductor
lento del Nº de copias del plásmido durante el cultivo
La formación de los puentes disulfuro en E. coli es catalizada activamente en el periplasma por el sistema Dsb
La mutación de los genes trx y gor en E coli permite la formación de puentes disulfuro en citoplama
Cepa trxB - AD494 Novagen
Cepa trxB-/gor- Origami Novagen
Proteínas de Fusión y purificación de PR
Fusión a fragmentos polipeptídicos o “tags” (etiquetas) que confieren a la PR una cierta marca.
La unión incluye el sitio de reconocimiento específicopara una proteasa
¿Para qué?Purificación por afinidadProtección de proteólisisAumento de solubilidadDetección de expresión
ETIQUETAS = TAGs
Secuencias de antígenos, reconocidas poranticuerpos específicos.
Moléculas con afinidad a resinas cromatográficas: His, GST (glutatión transferasa), MBP (maltosabinding protein)
Proteínas que aumentan la solubilidad: MBP, NusA, IF2 (www.biotech.ou.edu)
“Colas” de 6 histidinas, fusionadas a la proteína, ya sea en el extremo amino o carboxilo
H-H-H-H-H-HH2N
IMAC: Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography
H-H-H-H-H-H COO-
Elución
ImidazolBajo pHEDTA
MetalNiCoCu
Proteasas
Factor Xa IEGR/X (X cualquier aa menos P o R)
Trombina LVPR/G
Enteroquinasa DDDDK/X (cualquier aa menos P)
HSPP (Amersham) LEVLFQ/GP
TEV ENLYFQ/G
Corte con Factor Xa
Es la cepa de Escherichia coli más comunmenteusada para la producción de proteínas recombinantes
BL21
Produce mayor biomasa que que E.coli K12 con menor producción de acetato
Deficiente en proteasas Lon y OmpT
E. coli B F- dcm ompT lon hsdS(rB- mB-) gal
Estrategias para reducir la formación de acetato en E. coli
Biochemistry, Geneticsand Molecular Biology"Advances in AppliedBiotechnology", 2012
Tightly regulated gene expression from T7 promoter
pLysS is normally plasmid borne. It harbors T7 lysozyme, whichdestroys T7 polymeraseproduced from DE3. Used toreduce basal expression in T7-driven expression systems by inhibiting basal levels of T7 RNA polymerase
pLysS
Required for expressionfrom the T7 promoter in E.coli
Lysogen that encodes T7 RNA polymerase. Used to induce expression in T7-drivenexpression systems
DE3
Tightly regulated gene expression from lacpromoter
This mutated version of LacIgives high levels of lac repressorexpression. This allows tighterregulation of gene expressionfrom the lac promoter
lacIq
BenefitDescriptionGenotype
CEPAS BACTERIANAS PARA EXPRESIÓN PROTEICA
Improves folding ofheterologous proteinsrequiring disulphide bonds
Mutation in glutathione reductase, which enhances disulphide bondformation
gor
Improves folding of someheterologous proteins
dnaJ encoded chaparonin isinactivated
dnaJ
Enhances expression fromaraB promoterCannot metabolize arabinosearaD/ara
-14
Reduced degradation ofrecombinant proteins
Defficiency in an outer membraneprotease.ompT
Reduced degradation ofrecombinant proteins
Defficiency in the Lon ATPase-dependent protease. Decreasesthe degradation of recombinantproteins; all B strains carry thismutation
lon
No sólo Escherichia coli
Bacilli: bacterias Gram positivas
Secretan proteínas directamente al medio
No tienen LPS en la membrana externa no ENDOTOXINAS
Expresión en cepas de Bacilli
No / Low Protein Production
•Start from freshly transformed bacteria
•Add Glucose to suppress leaky expression
•Use recA- strains
(HMS174; BLR)
•Tightly suppress gene expression prior to induction•Use low-copy origin of replication plasmid
Your gene induces
rearrangement and loss of the DE3 lysogen
RNA degradation
Rare codons
Initiationproblems
Toxic protein
Reason
Use RNAse deficient strain (BL21Star)
Change vector to structured RNA vector
Slow translation by reducing temperature or grow in poor media
Use stains supplementing rare codons (Rosetta, Codon +)
Mutate gene for codonoptimization
•Start induction at higher OD •Shorten induction time
•Add Glucose to suppress leaky expression
•Use BL21AI orBL21(DE3)pLysS/E
•Use T7 promoter-based vectors (also arabinose)•Tightly regulate induction with lac operator
•Re-clone with more A residues at 5’
•Shorten distance between RBS and first ATG (2-8 nt )
Growth ConditionsHost StrainVector
Membrane rich (C41/C43)
Use mistic fusion protein.
Generate truncated forms of protein (soluble domains)
Membrane proteins
Induce at low temp. Membrane rich(C41/C43)
Replace with bacterial signals (secretion) or omit signals
Sub-cellular localization signals
Protein is part of a complex
No appropriate chaperones
Hydrophobic protein
Protein is misfolded due to lack of correct disulfide bond formation
Reason
Heat shock with
chemical chaperones
Transform with a partner :combination of 2-4 vectors for max 8 proteins
Heat shock with chemical chaperones
Screen various expressing strains
Add vectors for various chaperone co-expression
Lowaring induction temperature usually helps
Use Trx(-)/gor(-) strains (e.g. Origami) for creating oxidative conditions in cytosol
Use thioredoxin, DsbA, DsbCfusion partners
Clone in a vector containing secretion signal to the periplasm (pelB, OmpA)
Slow expression rate (low temp; low [inducer]; short induction time; poor media)
Heat shock with
chemical chaperones
Membrane rich strains(C41/C43)
Solubility enhancing fusion proteins (MBP, NusA, GST, etc.)
Growth ConditionsHost StrainVector
Aggregation
Truncated protein
Degradation
Faster, uncoordinated-translation of fusion protein
Rare codons
Reason
Grow and induce at low temp, useprotease inhibitors when breaking the cells on ice
Induce at higher OD and reduce induction time
Low protease strains (BL21 derivatives, M15)
Detect and replace specific protease sites
Slow elongation by low temp.; low inducer; poor media
Use rare codonstrains (rosetta , codonPlus)
Optimize codonusage
Slow expression rate with low temp.; low inducer; short harvest; poor media
Sub-clone with another fusion partner or avoid N-terminus fusion protein
Growth ConditionsHost StrainVector