UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO JOO DEL REICURSO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOSProtenas recombinantes para aplicaes teraputicas: uma reviso com nfase nos vetores e sistemas de expresso Gabriela Silveira dos SantosOrientadora: Isabel Cristina Braga Rodrigues

Ouro Branco

Junho/2015

Protenas recombinantes para aplicaes teraputicas: uma reviso com nfase nos vetores e sistemas de expresso Gabriela Silveira dos Santos

Trabalho de Concluso de Curso apresentado como requisito parcial s exigncias do curso de Bacharelado em Engenharia de Bioprocessos do Departamento de Qumica, Biotecnologia e Engenharia de Bioprocessos da Universidade Federal de So Joo Del Rei.

Orientadora: Isabel Cristina Braga Rodrigues

Ouro Branco

Junho/2015

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO JOO DEL REI

CURSO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOSProtenas recombinantes para aplicaes teraputicas: uma reviso com nfase nos vetores e sistemas de expresso Gabriela Silveira dos SantosA Banca Examinadora, composta pelos membros abaixo, avaliou este TCC:

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Isabel Cristina Braga Rodrigues - Orientadora______________________________________________________

Natlia Rocha Barboza Examinador 1

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Edson Romano Nucci Examinador 2Ouro Branco,___/___/____

RESUMO

Molculas formadas por polipetdeos ou protenas com sequncias de aminocidos idnticas protena humana nativa e com aplicaes no tratamento de doenas so chamadas biofrmacos. O uso dessas protenas como agentes teraputicos uma ideia relativamente nova, porm durante muitos anos a estrutura e as caractersticas das protenas vm sendo estudadas. A insulina e o hormnio do crescimento humano foram as primeiras protenas teraputicas a serem usadas. A insulina era extrada do tecido pancretico animal e o hormnio do crescimento humano obtido da hipfise de cadveres, preparaes estas de segurana reduzida em relao aos riscos de desenvolvimento de efeitos adversos, devido possibilidade de copurificao de patgenos. Atualmente, com o avano da biologia molecular, possvel manipular o material gentico das clulas e promover a expresso das protenas humanas em outros organismos, tornando, por exemplo, o processo de purificao mais eficiente e seguro. Um gene inserido em um sistema de expresso adequado (bactria, fungo, clula animal ou vegetal) juntamente com o veculo de clonagem, os chamados vetores, que permitem que os fragmentos de DNA a serem clonados sejam introduzidos e propagados em uma clula hospedeira adequada. Existem, no mercado mundial, mais de 350 medicamentos elaborados com o uso da biotecnologia e j esto sendo avaliados novos biofrmacos para o tratamento de mais de 150 doenas, como cancr, hepatites, diabetes mellitus, entre outras. O presente trabalho procurou discutir as diferentes plataformas de expresso e vetores utilizados na produo de protenas recombinantes para aplicaes teraputicas e, ainda, exemplificar a construo dos vetores e a seleo das clulas hospedeiras com a reviso de algumas pesquisas promissoras na produo de citocinas, insulina, eritropoietina e fator IX da coagulao sangunea.Palavras-chave: biofrmacos, DNA recombinante, vetores, sistemas de expresso.ABSTRACTMolecules formed of polypeptides or proteins having amino acid sequences identical to the native human protein and applications for treating diseases is called biopharmaceuticals. The use of these proteins as therapeutic agents is a relatively new idea for many years but the structure and characteristics of proteins have been studied. The insulin and human growth hormone were the first therapeutic proteins to be used. Insulin was extracted from animal tissue and pancreatic human growth hormone obtained from the pituitary of dead bodies, these security preparations reduced the risks of development of adverse effects due to the possibility of copurificao pathogens. Nowadays, with the advancement of molecular biology, it is possible to manipulate the genetic material of cells and promote the expression of human proteins in other organisms, eg making the process more efficient and safe purification. A gene inserted into a suitable expression system (bacterium, fungus, animal or plant cell) with the cloning vehicle, so-called vectors, which allow the DNA fragments to be cloned are introduced and propagated in a suitable host cell. There, in the world market, more than 350 drugs produced using biotechnology and are already being evaluated new biopharmaceuticals to treat more than 150 diseases like cancer, hepatitis, diabetes mellitus, among others. The present study sought to discuss the different expression platforms and vectors used to produce recombinant proteins for therapeutic applications, and also illustrate the construction of vectors and selecting host cells with the review of some promising research on the production of cytokines, insulin, erythropoietin and factor IX of blood coagulation.

Keywords: biopharmaceuticals, recombinant DNA, vectors, expression systems.SUMRIO71.INTRODUO

92. OBJETIVO

92.1 Objetivos Especficos

103. REVISO DA LITERATURA

133.1 - Aplicao de protenas recombinantes para a sade humana

163.2 A Tecnologia do DNA Recombinante

173.3 Vetores

273.4 - Sistemas de expresso para a produo de biofrmacos

333.5 - Estudos de Caso

333.5.1 - Citocinas

343.5.1.1 - Interferon cIFN-

343.5.2 - Fatores de crescimento hematopoitico

353.5.2.1 - Eritropoietina

373.5.3 - Hormnios

373.5.3.1 - Insulina

383.5.4 - Fatores de coagulao sangunea

393.5.4.1 - Fator IX da coagulao sangunea

403.6 - Aspectos de mercado

434. CONCLUSO

445. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

1. INTRODUOA tecnologia do DNA recombinante ou engenharia gentica consiste em processos de manipulao do DNA, podendo isolar sequncias de DNA e inseri-las em uma clula hospedeira, sendo possvel, posteriormente, separar e purificar as protenas produzidas nesse processo. Essa tecnologia abriu novos campos, no s de possibilidades teraputicas, como tambm no entendimento de diversas doenas e vem ganhando cada vez mais espao na economia (SOUSA, 2006; REIS, 2009). O DNA do doador extrado ter os genes de interesse isolados e estes, sero inseridos em vetores e transferidos para uma clula receptora, esta ir amplificar os fragmentos gnicos por replicao do DNA (clonagem) ou, mediante a montagem correta do vetor, com os sinais de expresso adequados, ir expressar a protena codificada pelo gene clonado (GRIFFITHS et al., 2000). Os vetores so molculas de DNA carregadoras que levam outra sequncia de DNA para o interior da clula hospedeira. Estes so capazes de amplificar, em centenas de cpias, a informao gentica que foi inserida. Isso ocorre devido presena de sinais moleculares que possibilitam que estes fragmentos de DNA sejam replicados dentro da clula hospedeira, produzindo cpias de DNA recombinante que sero passadas para as clulas filhas. Alm disso, existe a possibilidade da expresso de genes contidos em suas sequncias, a expresso ocorrer devido presena dos sinais moleculares pertinentes, como as sequncias promotoras. Os vetores devem ser de tamanho pequeno e possuir stios de clonagem onde sero inseridos os fragmentos de DNA estudados (ALBERTS et al., 2009; ZAHA et al., 2014). As principais aplicaes da biotecnologia moderna na rea de sade o uso da engenharia gentica para a produo de biofrmacos. Biofrmacos so biomolculas, como protenas (incluindo anticorpos) e cidos nucleicos (DNA ou RNA) utilizados para fins teraputicos ou de diagnstico in vivo. Diferem dos frmacos convencionais por sua estrutura complexa e, consequentemente, impossibilidade de sntese qumica (MADEIRA, 2013).Segundo Marques (2005), diversos processos utilizando diferentes sistemas de expresso, como clulas de bactrias (Escherichia coli, principalmente), leveduras, fungos filamentosos, clulas de insetos e de mamferos, animais e plantas transgnicos, so atualmente empregados na indstria biofarmacutica para produo de protenas teraputicas, como fatores de coagulao sangunea, anticorpos monoclonais, fatores de crescimento celular, hormnios, citocinas, entre outros.A escolha do sistema de expresso influencia o carcter, a quantidade e o preo do produto final. E a aplicao da protena a ser expressa deve ser sempre considerada, o sistema deve ser capaz de expressar a protena recombinante de modo a se obter o mximo de rendimento por clula cultivada, alm da gerao de protenas que tenham a atividade biolgica desejada, promovida, principalmente, pelas modificaes ps-traducionais corretas. A maioria dos produtos aprovados pela FDA (Food and Drug Administration) so produzidos usando sistemas procariticos (bactrias) ou eucariticos (leveduras ou cultura de clulas de mamferos) e que utilizam vetores plasmidiais (MARQUES, 2005).Embora o sistema de expresso de protenas heterlogas em E. coli seja bastante difundido e mais frequentemente utilizado do que outros, quando se pretende expressar alguma protena recombinante, o melhor sistema deve ser escolhido de acordo com as caractersticas da protena de interesse, por exemplo, as protenas que necessitam de glicosilao no so adequadamente expressas neste sistema. Alm do sistema de expresso, a escolha dos vetores tambm importante. O vetor utilizado deve ser construdo de acordo com as informaes especficas sobre a protena, como a sequncia extra de amina terminal, alm disso, deve existir tambm, compatibilidade entre o stio de restrio e a regio de leitura. Deve ainda conter os sinais moleculares para expresso e endereamento da protena e pode conter outras sequncias que facilitem a posterior purificao da protena heterloga (MONCLARO, 2013).De acordo com os diversos avanos da Engenharia Gentica, da importncia na produo de biofrmacos recombinantes que conferem menores riscos aos pacientes em relao a contaminaes oriundas do processo de preparao e da possibilidade de reduzir os custos de produo destas biomolculas utilizando organismos geneticamente modificados, o presente trabalho far uma breve reviso da literatura abordando os principais vetores e sistemas de expresso utilizados na produo de protenas recombinantes com aplicaes teraputicas.2. OBJETIVOEste trabalho tem como objetivo abordar as caractersticas dos principais vetores e sistemas de expresso utilizados na produo de protenas recombinantes com aplicaes teraputicas.

2.1 Objetivos Especficos

Apresentar as principais caractersticas dos vetores de clonagem e expresso utilizados em Engenharia Gentica.

Apresentar as principais caractersticas dos principais sistemas de expresso utilizados na produo de protenas recombinantes.

Abordar estudos de casos sobre a produo de protenas recombinantes com aplicaes teraputicas.

Expor as expectativas de mercado dos biofarmacuticos.3. REVISO DA LITERATURADesde os primrdios os microrganismos so utilizados na produo de alimentos e bebidas. Durante a dcada de 1940 vrios processos de cultivo em massa de micro-organismos, em condies estreis, desencadearam a produo comercial de antibiticos, vacinas, enzimas, aminocidos e esterides (VILLEN, 2002). Tambm a partir da dcada de 1940, foram firmadas evidncias diretas que o DNA fosse a molcula possuidora da informao gentica, sendo o cdigo que determina todas as caractersticas dos seres vivos, com os experimentos de Avery e seus colaboradores. Culminando, em 1953, com a formulao da estrutura desta macromolcula por James Watson e Francis Crick. Estes pesquisadores propuseram, utilizando os postulados de Erwin Chargaff (1940) e dados de difrao de raios X obtidos por Rosalind Franklin e Maurice Wilkins (1950), que a estrutura do DNA era formada por duas cadeias de nucleotdeos ligadas por ligaes fosfodister entre os nucleotdeos. Essas cadeias se encontram pareadas em uma orientao antiparalela e unidas por ligaes de hidrognio entre as bases nitrogenadas complementares (A/T e C/G). As duas cadeias formam uma hlice que lembra uma escada em espiral onde os degraus so as bases nitrogenadas e o corrimo formado pelas desoxirriboses e os grupos fosfatos. A partir da definio da estrutura do DNA, os cientistas tambm propuseram as bases para transmisso da informao gentica, na qual a replicao do DNA utilizaria um molde de DNA parental e ocorreria pela complementaridade de bases nitrogenadas (WATSON e CRICK, 1953; REIS, 2009). A partir de ento, vislumbrou-se grandes avanos nas tcnicas da biologia molecular.J na dcada de 1960, foi possvel verificar um grande progresso na decifrao do cdigo gentico, sendo esta considerada a descoberta mais importante do sculo, para a gentica molecular. A descoberta das enzimas de restrio, em 1978, por W. Arber, H. Smith e D. Nathans, possibilitou a construo de molculas de DNA recombinante, fazendo com que segmentos especficos de molculas de DNA de origens diferentes pudessem ser ligados. As enzimas de restrio so protenas bacterianas, de alta especificidade, capazes de reconhecer uma base especfica na dupla hlice do DNA e cort-las em fragmentos que sejam facilmente manipulados, tornando possvel recombinar ou criar organismos transgnicos (CARUSO 2007; ZAHA et al., 2014). Outro avano significativo foi o desenvolvimento da reao em cadeia da polimerase (PCR), por Kary Mullis em 1983. A PCR permite a amplificao in vitro de sequncias determinadas de DNA a partir de uma amostra de cido nuclicos e oligonucleotdeos iniciadores (primers) especficos para as regies do DNA que se deseja amplificao. Na presena de uma DNA polimerase termoestvel (Taq polimerase polimerase de Thermus aquaticus), do par de primers e dos desoxirribonucleotdeos (dNTPs) que compem a molcula de DNA, possvel amplificar a regio de interesse a partir de uma quantidade diminuta de DNA (MOLINA e TOBO, 2004; ZAHA et al., 2014).

Estes avanos impulsionaram a Tecnologia do DNA Recombinante, surgindo as perspectivas do incio da sntese de uma variedade de protenas heterlogas, possibilitando novas descobertas que permitiram a criao de vacinas, desenvolvimento de tcnicas de seleo e identificao de genes na transferncia gentica de um organismo para outro, produo de enzimas para aplicao industrial e a produo de molculas biolgicas com fins teraputicos (CARUSO, 2007; DA ROCHA e MARTIN, 2011). Protenas heterlogas, so protenas recombinantes obtidas a partir da insero de um gene de um organismo em outro organismo pela tecnologia de DNA recombinante. A produo de protenas recombinantes heterlogas envolve uma srie de passos, como (i) a identificao e caracterizao gentica da protena e das suas propriedades bioqumicas; (ii) a definio dos requisitos estruturais para a sua atividade funcional, como as modificaes ps-traducionais; (iii) a definio do sistema de expresso, ou seja, das clulas que iro expressar a protena recombinante e (iv) a definio do vetor que ir conduzir o gene ao sistema de expresso selecionado (WALSH, 2002; ABDI e CGEE, 2008; PATIO, 2011; AMB e INTERFARMA, 2013).A tecnologia do DNA recombinante permitiu a expresso de protenas heterlogas em micro-organismos e outras clulas hospedeiras, possibilitando o isolamento e a transferncia de um gene de um organismo para outro resultando em um indivduo geneticamente igual ao utilizado para receber a molcula de DNA recombinante, porm com uma nova caracterstica gentica, proveniente de outro, que no da mesma espcie, criando, desta forma, um organismo geneticamente modificado (OGM) (GANDER e MARCELLINO, 1997). Um OGM aquele que foi submetido a tcnicas que modificaram seu genoma. J o termo transgnico utilizado para nomear organismos que foram submetidos a tcnicas especficas de insero de uma parte do genoma de outra espcie, conferindo-lhes modificaono genoma original. Portanto, os transgnicos so um tipo de OGM, mas nem todo OGM um transgnico (COSTA e COSTA, 2009).O processo da tecnologia de DNA recombinante consiste basicamente na extrao do DNA do organismo contendo o gene de interesse, logo aps, por intermdio de enzimas de restrio, o DNA cortado em fragmentos menores. Os genes de DNA isolados so inseridos em pequenos fragmentos de DNA cortados pela mesma enzima de restrio, estes pequenos fragmentos so denominados vetores. A enzima DNA ligase, responsvel por unir as extremidades livres do DNA do vetor e do DNA doador, dando origem ao DNA recombinante. Em seguida, executa-se a fase de transformao, na qual o DNA recombinante inserido em uma linhagem celular (bacteriana, animal ou de leveduras). Por fim, ocorre o processo de seleo, as clulas so separadas em transformadas e no-transformadas. Uma nica clula recombinante selecionada para dar origem a outras atravs da diviso celular, todas as clulas filhas devem conter uma cpia do vetor portador do gene inserido. Agora, as clulas so ento induzidas a expressar o novo gene. Dependendo de qual o sistema celular selecionado ou da montagem do DNA recombinante, a protena heterloga poder ser encontrada dentro das clulas ou fora destas, no meio circundante (GRIFFITHS et al., 2000; SOUSA, 2006).A expresso de protenas heterlogas em organismos geneticamente modificados apresenta, sob o ponto de vista econmico, uma vantagem considervel em relao aos processos clssicos de produo de protenas, pela purificao das mesmas de rgos animais ou do sangue de doadores. Esses sistemas podem ser induzidos, sob condies controladas, a sintetizar protenas em grandes quantidades. Alm disso, a produo de protenas a partir de micro-organismos mais facilmente controlada em biorreatores, a produo contnua e o controle de processo facilitado. Assim, a tecnologia do DNA recombinante representou uma revoluo na cincia e permitiu que genes especficos pudessem ser isolados de um genoma, ou do ambiente, e manipulados. Os avanos cientficos e tecnolgicos tm ampliado o emprego de micro-organismos ou clulas modificadas geneticamente visando produo de protenas de interesse em diversas reas e, em especial, na rea clnica (ABDI e CGEE, 2008).

3.1 - Aplicao de protenas recombinantes para a sade humanaSegundo VILLELA (2008), os biofrmacos podem ser definidos como frmacos cujos princpios ativos so protenas teraputicas recombinantes obtidas por processo biolgico, normalmente apresentam estrutura molecular complexa de difcil caracterizao e replicao. Alm disso, so molculas diversas e muito mais pesadas do que as molculas que compem os medicamentos tradicionais e apresentam peso molecular cem a mil vezes maiores do que as molculas sintticas. Geralmente, a expresso biofrmaco refere-se a protenas obtidas por engenharia gentica (REIS, 2009; AMB e INTERFARMA, 2013). At o desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante, muitas protenas eram obtidas a partir do isolamento de fontes naturais, porm essas formas de obteno apresentavam alguns riscos ligados segurana do produto final. Por exemplo, o hormnio do crescimento, obtido a partir da glndula pituitria de cadveres e o fator VIII, protena fundamental na cascata de coagulao sangunea, obtido a partir de sangue humano, nestes casos, os riscos de contaminao com doenas infecciosas provenientes do doador so significativos. Alm disso, havia tambm limitao da quantidade produzida. Os primeiros biofrmacos surgiram para substituir esta produo convencional de protenas e tm revolucionado as opes de tratamento para muitas doenas, como hemofilia, diabetes mellitus e hepatite (BENAVIDE, 2013).Durante os ltimos 30 anos, a indstria de biotecnologia lanou mais de cem protenas recombinantes e atualmente, mais de trezentos e cinquenta medicamentos esto sendo avaliados para o tratamento de diversas doenas, desde cncer at desordens genticas raras (ABDI e CGEE, 2008).As protenas teraputicas podem ser classificadas em dois grupos, as protenas que no requerem modificaes ps-traducionais e as que requerem modificaes ps-traducionais, como N-glicosilao. As modificaes ps-traducionais so alteraes de resduos de aminocidos que ocorrem nas proteinas aps a sua sntese, podem ocorrer por excluso de resduos ou adio de molculas a um ou mais aminocidos. Estas modificaes podem alterar o tamanho, a composio, a atividade das protenas, alm das interaes com outras protenas e consequentemente afetam a funo que desempenham (MARQUES, 2008). Protenas no glicosiladas so tipicamente expressas em Escherichia coli ou na levedura Saccharomyces cerevisiae. J as protenas recombinantes que requerem modificaes ps-traducionais, na maioria dos casos, so expressas em clulas de mamferos, que tm a capacidade de imitar a glicosilao humana. Sistemas de expresso eucariticos inferiores, tais como clulas de levedura e de insetos so normalmente incapazes de proporcionar glicosilaes de mamfero (GERNGROSS, 2004; MADEIRA, 2013). Os principais tipos de biofrmacos esto representados pelas citocinas (interferons e interleucinas); fatores de crescimento hematopoitico (eritropoietina); hormnios (hormnio do crescimento, insulina, gonadotrofinas); fatores da coagulao sangunea recombinantes (fator VIII, fator IX); agentes trombolticos (estreptoquinase); enzimas (fator ativador de plasminognio, glucocerebrosidase); vacinas (vacina recombinante contra a hepatite B); imunoconjugados e anticorpos monoclonais (anticorpos semelhantes queles produzidos no corpo e adaptados para reagir especificamente sobre alvos selecionados). A Tabela 1 apresenta as principais protenas recombinantes teraputicas disponveis no mercado mundial (AMB e INTERFARMA, 2013; BENAVIDE, 2013).Tabela 1 - Classes de biofrmacos e seus principais representantes disponveis no mercado (BENAVIDE, 2013).CLASSEPRODUTOINDICAO TERAPUTICAANO APROVAO

Fatores sanguneosFator VIIIHemofilia A1992

Fator VIIaAlgumas formas de hemofilia1996

Fator IXHemofilia B1997

Anticoagulantes e trombolticosFator ativador de plasminognioInfarto do miocrdio e infarto agudo do miocrdio1996

HirudinaTerapia anticoagulante e preveno de trombose venosa1997

Protena C ativadaSepticemia2001

HormniosInsulinaDiabetes Mellitus1982

Insulina anlogaDiabetes Mellitus1996

Insulina inalvelDiabetes Mellitus2006

Hormnio do crescimento humanoAlgumas formas de deficincia de crescimento1985

Hormnio folculo estimulanteInfertilidade, anovulao e superovulao1995

CalcitoninaOsteoporose ps-menopausa e doena de Paget1999

GlucagonHipoglecemia1998

Fatores de crescimentoEritropoietinaAnemia1989

Eritropoietina anlogaAnemia2001

GM-CSFNeutropenia induzida por quimioterapia1991

Interferon e InterleucinasInterferon alfaHepatite B e C e vrios tipos de cncer1986

Interferon betaEsclerose mltipla1993

Antagonista de receptor de interleucina 1Artrite reumatide2001

Interleucina 2Carcinona de clulas renais1992

EnzimasGlicosidaseDoena de Pompe2006

L-iduronidaseMucopolissacaridose I2003

N-acetilgalactosamina

4-sulfataseMucopolissacaridose IV2005

Alfa galactosidaseDoena de Fabry2001

Chamados de biofrmacos de primeira gerao, os medicamentos como insulina, hormnio de crescimento e fatores de coagulao, consistem em protenas com sequncias de aminocidos idnticas protena humana nativa, so obtidos pela transfeco do gene humano para um sistema adequado (sistema de expresso celular) e aps a sntese, essas substncias recombinantes so isoladas e purificadas. Os biofrmacos de segunda gerao so aqueles sintetizados de forma a apresentar propriedades teraputicas diferenciadas em relao s naturais, ou seja, o gene alterado antes da transfeco, de tal forma que a estrutura da nova protena expresse as caractersticas pretendidas. Geralmente essas alteraes so realizadas para melhorar algum aspecto da atividade da protena ou do polipeptdio, como a alterao do tempo de meia-vida (REIS, 2009; AMB e INTERFARMA, 2013; BENAVIDE, 2013; NUNES 2014).Diferente dos frmacos qumicos que so obtidos por meio da sntese qumica do seu princpio ativo, os biofrmacos so geralmente, produzidos pela tecnologia do DNA recombinante. Pela biossntese em clulas vivas que necessitam modificao para a produo (expresso) de substncias em condies controladas (REIS, 2009; INTERFARMA, 2012). Alm das diferenas quanto origem, os medicamentos tambm se diferem quanto ao tamanho das molculas, os medicamentos provenientes de sntese qumica so em geral pequenas molculas estveis e podem ser replicadas de forma idntica. J os medicamentos biolgicos, so formados por molculas grandes e complexas e quando submetidas a pequenas variaes das condies de conservao e armazenamento apresentam instabilidade (INTERFARMA, 2012).

3.2 A Tecnologia do DNA RecombinanteTambm chamada Engenharia Gentica, consiste nas tcnicas de manipulao do DNA que permitem introduzir um gene de um organismo em uma clula hospedeira. DNA recombinante refere-se uma sequncia de DNA artificial resultante da combinao de diferentes sequncias. A tcnica central destas metodologias a clonagem molecular, que consiste na transformao de uma clula receptora com o DNA recombinante e a propagao destas molculas no interior da clula, gerando cpias idnticas (CARUSO, 2007; CESCA, 2011). Esta tecnologia foi responsvel por uma revoluo nas pesquisas na dcada de 80 e a partir da tem contribudo muito para compreenso do genoma, bem como o conhecimento da estrutura e da funo dos genes (BORGES-OSRIO, 2013). O DNA do doador extraido e cortado em fragmentos que contm vrios genes, esses fragmentos de DNA so inseridos em um vetor. As molculas de vetor com as inseres so chamadas de DNA recombinante, porque consistem em novas combinaes de DNA a partir do genoma do dador (que pode ser proveniente de qualquer organismo) com DNA do vetor a partir de uma fonte completamente diferente (GRIFFITHS et al., 2000).Nos tpicos que se seguem, ser feita uma reviso sobre os principais vetores e sistemas de expresso, utilizados na tecnologia do DNA recombinante, para expresso de protenas heterlogas com finalidades teraputicas.3.3 VetoresSo molculas de DNA carregadoras que levam uma sequncia de DNA (o gene) para o interior da clula hospedeira possibilitando que este fragmento de DNA seja replicado. O vetor parte principal para a expresso do gene, pois permite que os fragmentos de DNA a serem clonados sejam introduzidos e propagados na clula hospedeira, por conterem sinais moleculares que so reconhecidos pelas mesmas (ALBERTS et al., 2009). Estes vetores devem ser relativamente pequenos, se possvel, de tamanho inferior a 10kb. Isso se deve ao fato de que as molculas pequenas so mais fcies de manipular e mais difceis de sofrerem fragmentao durante a purificao. Geralmente os vetores so derivados de DNA de bacterifago, DNA viral eucaritico ou plasmdeo e os mais utilizados so caracterizados por serem bons veculos de clonagem (BROWN, 2003; ALBERTS et al., 2009). Todos os vetores de clonagem devem conter sequncias que permitam sua replicao autnoma dentro da clula hospedeira, possuir ao menos um stio nico de clonagem que um stio de restrio que no se repete na molcula e permitir a insero stio-especifica de outra molcula de DNA (insertos). Alguns vetores possuem stios para vrias endonucleases de restrio posicionados lado a lado, em um segmento denominado de stio mltiplo de clonagem (ZAHA et al., 2014).Em algumas ocasies as clulas procariticas so incapazes de produzir protenas funcionais a partir de gene eucarioto, as expresses desses genes necessitam de vetores que possuem os sinais para expresso gnica que so reconhecidos pelas clulas selecionadas como sistemas de expresso (BROWN, 2003). Possuem sequncias de DNA que direcionam a sntese da protena codificada no inserto gnico, ou seja, possuem sequncia promotora reconhecida pela RNA polimerase do sistema de expresso, bem como stios de ligao ao ribossomo e sequncias terminadoras tambm reconhecidas pela clula hospedeira (ALBERTS et al., 2009). So, portanto, destinados a ativar um gene clonado e produzir cpias da protena codificada em uma clula dita recombinante (KLUG et al., 2010).Os plasmdeos so molculas circulares de DNA e existem independentes da clula bacteriana e em alguns organismos eucariticos unicelulares, como leveduras. Quase sempre portam um ou mais genes responsveis por caractersticas teis exibidas pela bactria hospedeira. Alm disso, todos os plasmdeos possuem pelo menos uma sequncia de DNA capaz de atuar como origem de replicao sendo apto a multiplicar-se no interior da clula independentemente do cromossomo bacteriano principal (BROWN, 2003; ZAHA et al., 2014). Os plasmdeos utilizados como vetores so os mais simples e combinam a facilidade de purificao com a alta eficincia de transformao, devem possuir basicamente uma origem de replicao (ORI), um marcador de seletividade e o stio de clonagem. A origem de replicao consiste em uma sequncia especfica do plasmdeo com cerca de 1.000 pares de bases (pb). Neste local, h um conjunto de elementos regulatrios envolvidos no controle do nmero de cpias do plasmdeo que sero produzidas em uma nica bactria. Reconhecida a origem, a replicao do DNA se inicia e segue continuamente, independentemente do restante da sequncia de nucleotdeos, fazendo com que qualquer sequncia inserida no plasmdeo seja replicada. O marcador de seletividade, normalmente um gene de resistncia a antibitico confere a capacidade de identificao da bactria que recebeu o plasmdeo. Alm disso, os plasmdeos quase sempre so portadores de um ou mais genes que atribuem caractersticas fenotpicas apresentadas pela bactria hospedeira e estes genes marcadores contm stios de restrio nicos ou mltiplos que sero utilizados para clonar o fragmento de DNA de interesse. Neste local, o plasmdeo ser clivado por endonucleases, tornando-se linear, de forma a permitir a insero do fragmento de DNA (BROWN, 2003; MACEDO et al., 2015). A Figura 1 mostra o mapa do vetor plasmidial de clonagem pGEM - T Easy, da marca Promega, disponvel no catlogo do fabricante. Neste mapa possvel observar os principais componentes de um vetor plasmidial utilizado para clonagem, a origem de replicao (ori), o marcador de seleo representado por um gene de resistncia a antibitico, no caso resistncia ampicilina (Ampr) e o stio mltiplo de clonagem (SMC), o qual se encontra inserido no interior do gene lacZ. No SMC so encontrados diversos stios para enzimas de restrio nos quais o vetor plasmidial pode ser aberto (PROMEGA, 2010). Na Figura 1, destacado que o SMC se encontra no interior do gene lacZ, sendo este mais um sistema para seleo das clulas recombinantes. Caso o inserto de DNA seja corretamente ligado a esta regio, o gene interrompido e a enzima -galactosidase no expressa. Caso o inserto de DNA no seja ligado a esta regio e as extremidades do plasmdeo sejam ligadas entre si, haver expresso da referida enzima. A expresso da -galactosidase visualizada pela utilizao de um substrato, semelhante lactose, ligado a um cromforo (X-Gal). Este substrado quando hidrolisado gera um pigmento azul, colorindo as colnias. Caso a clula hospedeira receba o plasmdeo vazio ela, ainda sim, ir se desenvolver em um meio com antibitico, mas suas colnias sero azuis, indicando que estas clulas no possuem o DNA recombinante corretamente montado (BROWN, 2003).

Figura 1: Vetor plasmidial de clonagem pGEM - T Easy da Promega, destacam-se os principais componentes de um vetor de clonagem: ori, origem de replicao bacteriana; Ampr, gene de resistncia ampicilina e stio mltiplo de clonagem (SMC) inserido no gene lacZ e com destaque para os diversos stios de restrio (Adaptado de PROMEGA, 2010).A Figura 2 mostra o mapa do vetor plasmidial de expresso pQE-30 Xa, da marca Qiagen, disponvel no catlogo do fabricante (QIAGEN, 2015). Como dito anteriormente, este tipo de vetor possui os componentes essenciais de um vetor de clonagem, importantes para a replicao do plasmdeo. Uma origem de replicao (ColE1), o marcador de seleo representado por um gene de resistncia a antibitico, no caso resistncia ampicilina (Ampicillin) e o stio mltiplo de clonagem (MCS). Ainda, neste vetor, so observadas as sequncias sinalizadoras para a expresso heterloga de protenas, como a sequncia promotora (PT5) e o stio de ligao ao ribossomo (RBS).Figura 2: Vetor plasmidial de expresso pQE-30 Xa da Quiagen, destacam-se os principais componentes de um vetor de expresso: PT5, sequncia promotora; lacO, elemento operador; RBS, stio de ligao ao ribossomo; 6xHis, peptdeo de fuso; FXa, stio de reconhecimento de protease; MCS, stio mltiplo de clonagem; Stop cdons, cdons de terminao para a sntese de protenas; ColE1, origem de replicao e Ampicillin, gene de resistncia ampicilina (Adaptado de QIAGEN, 2015).Outro tipo de vetor utilizado para expresso e clonagem so aqueles baseados no genoma de bacterifagos. Bacterifagos so vrus que infectam especificamente bactrias, possuem estruturas simples, DNA envolvido por um capsdeo e uma cauda formada por molculas proteicas. Como o DNA dos fagos tem capacidade de replicao autnoma, eles podem ser utilizados como vetores. As molculas de DNA dos fagos em geral, possuem vrios genes essenciais replicao e que codificam componentes do capsdeo (BROWN, 2003; ZAHA et al., 2014). As protenas so produzidas separadamente a partir do DNA viral que est sendo replicado, posteriormente, o capsdeo e o DNA se renem para formar nova partcula viral (ZAHA et al., 2014). O fago um exemplo, parasita obrigatrio da Escherichia coli, o qual necessariamente injeta seu DNA na bactria hospedeira para a sua multiplicao. Aps a infeco da E.coli o genoma do fago pode seguir duas vias: uma o estado ltico (Figura 3a), em que o DNA do fago permanece na bactria como uma molcula independente e ocorre a ativao de alguns genes do fago em conjunto com a inativao de outros. Como resultado, o cromossomo do fago replicado e a sntese das protenas do capsdeo ocorre imediatamente aps a replicao formando-se novas partculas virais. Minutos aps a infeco, a clula hospedeira lisada e ento ocorre a liberao de cerca de 100 novos fagos (BROWN, 2003; NASCIMENTO et al., 2003). A outra via que o cromossomo do fago pode seguir denominada de estado lisognico (Figura 3b). O DNA do fago integrado ao genoma da bactria hospedeira, por um processo de recombinao stio-especfica. Todos os genes do profago, que a forma integrada do DNA do fago, ficam inativos, com exceo do gene que produz a protena repressora do ciclo ltico. O profago pode ser liberado do genoma da bactria e o fago reverte para o modo ltico, principalmente em situaes de leso do DNA da clula hospedeira (BROWN, 2003). A bactria carregando o profago multiplica-se e este replicado e distribudo para as bactrias descendentes (NASCIMENTO et al., 2003).Apesar de existir mais de um tipo de fago, todos eles possuem o mesmo padro de infeco. O processo inicia-se com a fixao da partcula do fago na superfcie externa da bactria e em seguida o seu material gentico injetado no interior da clula, um processo denominado transfeco (Figura 3). Ento, enzimas especficas replicam a molcula de DNA do fago que ento codificada por genes do seu prprio cromossomo. Por fim, outros genes do fago dirigem a sntese dos componentes proteicos do capsdeo fazendo com que novas partculas virais sejam montadas e liberadas da bactria (BROWN, 2003).

Figura 3: Fixao do bacterifago na superfcie externa da bactria, seguido da demonstrano dos ciclos ltico (a) e lisognico (b) (PASSARGE, 2012).Para o empacotamento natural do DNA do fago necessria a presena das sequncias cos, que so sequncias de 12 pb, posicionadas nas extremidades do DNA linear. Estas sequncias devem estar distantes cerca de 35 a 50 kb para que o empacotamento dentro do capsdeo do fago ocorra. Se a distncia entre dois stios cos no for apropriada, o DNA no ser empacotado na forma de vrus infectivo (ZAHA et al., 2014).

O DNA dos fagos pode ser modificado, pela tecnologia do DNA recombinante, originando vetores para clonagem e expresso muito versteis, como ocorre com as modificaes efetuadas no DNA do bacterifago , um dos fagos mais utilizados em clonagem molecular. Uma poro do genoma viral, que no necessria para que o fago infecte uma clula e replique seu DNA, removida e substituda por um DNA exgeno. Esta poro do genoma viral flanqueada por stios para enzimas de restrio, os dois fragmentos remanescentes (braos) compreendem agora uma pequena parcela do genoma viral e no podem ser empacotados, a no ser que molculas adicionais de DNA sejam ligadas a esses fragmentos, originando genomas que podem variar de 75 a 105% do comprimento do genoma viral original, dessa forma, so permitidos que insertos de 9 at 23 kb possam ser clonados. Estas partculas so empacotadas in vitro e introduzidas na clula hospedeira por transfeco, como ilustrado na figura 4 (ZAHA et al., 2014).

Figura 4: Representao esquemtica da utilizao de vetor derivado de bacterifago . O processo de empacotamento do DNA no capsdeo vazio seleciona molculas de DNA do tamanho adequado, podendo o fragmento central de 14 kb, neste exemplo, ser substitudo por insertos de DNA de 9 a 24 kb (Adaptado de ZAHA et al., 2014).

Cosmdeos so molculas de DNA circulares extracromossomais originados da juno de um plasmdeo com um bacterifago, possuem origem de replicao, marcador de seleo (gene de resistncia a antibitico), uma sequncia cos do fago e um ou mais stios de clonagem. Dentro da clula hospedeira, os cosmdeos so replicados como um plasmdeo, e as clulas infectadas so selecionadas pela resistncia adquirida para algum antibitico. Esses vetores podem ser usados como veculos de clonagem molecular, empregando o sistema de empacotamento in vitro que reconstitui a estrutura do fago (cabea e cauda), e assim so utilizados para infectar a clula hospedeira, como relatado anteriormente para os vetores baseados em bacterifagos. O DNA do cosmdeo injetado no interior da clula e ento se replica como um plasmdeo normal, sem expresso de qualquer funo do fago (NASCIMENTO et al., 2003; ZAHA et al., 2014; MACEDO et al., 2015).

Diferente dos plasmdeos bacterianos pequenos, os cromossomos artificias de bactrias (BAC) possuem uma mdia de tamanho de insertos de 120 kb, podendo alguns insertos chegarem a 300kb. So similares a outros plasmdeos, porm sua origem de replicao derivada do plasmdeo F de E. coli., que permite que os BAC sejam transferidos clula hospedeira por conjugao. Estes cromossomos so molculas de DNA circulares que carregam uma marca de seleo (resistncia a antibiticos) e marcadores que permitem a discriminao dos clones vazios e cheios, como mencionado anteriormente. (BROWN, 2003).Os vetores de clonagem para eucariotos foram desenvolvidos sob circunstncia desejvel da utilizao de um hospedeiro diferente da E. coli para um experimento de clonagem. A descoberta iniciou-se com um plasmdeo presente na maioria das linhagens de Saccharomyces cerevisiae, o plasmdeo de 2m. Este possui 6kb de tamanho que o torna ideal para um vetor, alm disso, o mesmo existe na clula de levedura de 70 a 200 cpias e a replicao desses plasmdeos utiliza a origem de replicao. Alguns vetores de clonagem para levedura contm genes que conferem resistncia a inibidores como o metotrexato e o cobre (MOREIRA e MENDES, 1998; BROWN, 2003).Vrios tipos de vetores de clonagem utilizados com S. cerevisiae, e que so derivados do plasmdeo 2m, foram desenvolvidos, como os plasmdeos epissmicos para leveduras (YEps) que possuem uma origem de replicao que se comporta como sequncia de replicao autnoma por meio de um segmento de plasmdeos natural de S. cerevisiae. Alm disso, possui o gene LEU2 que permite seleo de recombinantes pela utilizao de mutantes auxotrficos para leucina e, tambm, a sequncia de pBR322 que faz com que haja replicao e seleo em E.coli tambm (BORGES, 2009; AMORIM 2011). Os plasmdeos integrativos (YIps), basicamente so plasmdeos bacterianos que contm um gene de levedura, porm no se replicam como plasmdeos e sim integram-se ao DNA cromossmico da levedura. Um YIp no pode replicar-se como um plasmdeo uma vez que no contm qualquer parte do crculo de 2m, a expresso a partir destes vetores baseada na integrao da informao gentica ao cromossomo da levedura hospedeira atravs da recombinao homloga (BORGES, 2009). Outro exemplo, so os plasmdeos replicativos (YRps), vetores extracromossomais que contm uma sequncia de replicao autnoma que funciona como origem de replicao fazendo com que sejam capazes de se multiplicar como plasmdeos independentes (BORGES, 2009; AMORIM 2011). E por fim, os cromossomos artificiais de leveduras (YAC) que so cromossomos utilizados para a clonagem de longos fragmentos de DNA em levedura. O YAC pode aceitar segmento de DNA exgeno de at 1.000 kb (quilo-bases) e so construdos para conter um centrmero que o responsvel pela distribuio dos cromossomos para as clulas filhas durantes a diviso celular, dois telmeros, que se localizam nas extremidades de um cromossomo e faz com que essas extremidades sejam replicadas corretamente e impedem a degradao do cromossomo por exonucleases. Outra caracterstica a presena de origens de replicao que so os locais ao longo do cromossomo onde a replicao do DNA se inicia (BROWN, 2003, KARP, 2005).Para a deciso de qual tipo de vetor para levedura o mais adequado, deve-se levar em conta alguns fatores como a frequncia de transformao, que indica o nmero de transformantes possveis de serem obtidos por micrograma de DNA plasmidial. O nmero de cpias, quanto maior o nmero de cpias do gene, maior ser o rendimento do produto proteico e a estabilidade dos recombinantes, clulas recombinantes de levedura devem reter o gene clonado por longos perodos em cultura (NASCIMENTO et al., 2003). Alm dos vetores para leveduras e fungos existem tambm os vetores de clonagem para plantas superiores. So trs sistemas de vetores mais empregados, os vetores baseados nos plasmdeos que ocorrem naturalmente em Agrobacterium tumefaciens, a transferncia direta utilizando diversos tipos de DNA plasmidial e os vetores baseados em vrus de plantas. A A. tumefaciens um micro-organismo do solo que infecta regies lesionadas do caule das plantas, induzindo a proliferao cancerosa do tecido do caule. O plasmdeo Ti (indutor de tumor), presente nesta bactria, um plasmdeo grande, superior a 200 Kb que est associado capacidade de induo da doena dentro das clulas vegetais. Este plasmdeo transporta diversos genes envolvidos no processo de infeco. Uma das principais caractersticas do plasmdeo Ti que, aps a infeco, uma parte da molcula integrada no DNA cromossomal da planta, o chamado T-DNA, esse mantido na clula da planta e copiado para o genoma das clulas filhas. Desta forma, esta propriedade explorada para inserir DNAs exgenos em clulas vegetais (BROWN, 2003; ZAHA et al., 2014). Para a clonagem em clulas de mamferos, podem ser utilizados os retrovrus que possuem a capacidade de insero de sequncias gnicas no genoma hospedeiro ou pode ser realizada a microinjeo de plasmdeos bacterianos diretamente no ncleo das clulas de mamferos (BROWN, 2003).3.4 - Sistemas de expresso para a produo de biofrmacosSistemas de expresso so designados como clulas hospedeiras que recebem o gene recombinado, com o objetivo de expressar este gene (INTERFARMA, 2012; MADEIRA 2013).Diversos so os sistemas de expresso para a sntese de protenas heterlogas, como bactrias (procariotos), fungos leveduriformes (leveduras), fungos filamentosos, plantas, clulas de mamferos, clulas de insetos e, at mesmo, animais transgnicos. Contudo, o sistema mais frequentemente utilizado para expresso heterloga o que utiliza a E.coli como clula hospedeira (STRYER, 1988; LEWIN, 1994; LEWIN, 1997; ZAHA et al., 2014). Para a escolha do sistema devem ser avaliados alguns fatores como (i) a aplicao final da protena a ser expressa, (ii) o custo da produo e purificao do produto de interesse, (iii) a capacidade de controlar o produto final incluindo o seu processamento ps-traducional, (iv) o tempo necessrio para expresso do gene at a protena purificada e (v) a aprovao pelas agncias regulamentadoras (GERNGROSS, 2004; MADEIRA, 2013). Embora o sistema de expresso de protenas heterlogas em E. coli seja bastante difundido e largamente utilizado devido facilidade e o baixo custo de cultivo, pela reprodutibilidade e abundncia de protenas que a mesma produz e devido gentica j bem conhecida deste micro-organismo. Este sistema no vantajoso para expresso de protenas que necessitam de modificaes ps-traducionais, principalmente a glicosilao, que muitas vezes necessria para o dobramento correto das estruturas secundrias, tercirias ou quaternrias das protenas de interesse (YIN et al., 2007; CUNHA, 2008; MADEIRA 2013). Quando as protenas heterlogas no so modificadas corretamente elas acumulam em E. coli na forma de corpos de incluso. Corpos de incluso so agregados insolveis de protenas mal enroladas. O uso de chaperonas moleculares pode aumentar a solubilidade das protenas e ajudar na dobragem correta da protena recombinante. Segundo, Cardeal (2013) estas molculas reconhecem as superfcies hidrofbicas dos polipptidos a fim de evitar a sua agregao, e de se ligarem a protenas desconfiguradas, interagem seletivamente com algumas sequncias e elementos estruturais proteicos e limita as possibilidades conformacionais e favorecendo algumas conformaes particulares. As chaperonas mais importantes na E. coli so GroEL, GroES, DnaK, DnaJ, GrpE. Estas chaperonas podem ser utilizadas isoladamente, ou em combinao para melhorar a solubilidade das protenas em E. Coli (CARDEAL, 2013; BAESHEN, 2014).Um sistema de expresso alternativo so as clulas de leveduras, o mais antigo sistema de expresso eucarioto, a Saccharomyces cerevisiae apresenta um dos maiores rendimentos de produo de protenas heterlogas, porm hiperglicosilam as protenas recombinantes. Para suprir esta deficincia, a levedura Pishia pastoris tem sido um hospedeiro frequentemente utilizado para a produo recombinante de uma variedade de protenas procariticas e eucariticas, mais de 200 protenas a partir de vrus, bactrias, fungos, animais, plantas e seres humanos foram expressos com sucesso em P.pastoris (TWYMAN et al., 2003; YINYIN et al., 2007). A expresso em clulas de leveduras carrega as vantagens de serem eucariotos e, portanto, mais prximas evolutivamente dos seres humanos, aliado ao baixo custo de cultivo, equivalente ao das clulas procariticas.A utilizao de clulas de mamferos como veculos de expresso tem se mostrado eficiente, estas tm capacidade de imitar a glicosilao humana o que faz com que estas clulas sejam bons hospedeiros para a produo de protenas recombinantes que so N-glicosiladas em seu estado nativo. Porm, um sistema com baixos rendimentos e longo tempo de produo. Alm disso, necessita de condies especiais de cultivo como meios de cultura complexos e a utilizao de sofisticados reatores e tendo, portanto, custo elevado de produo (CUNHA, 2008; MADEIRA 2013). Outra possibilidade de sistema de expresso so as clulas de insetos que oferecem sistemas de modificaes ps-transcricionais e ps-traducionais de eucariotos superiores. As clulas comportam-se da mesma maneira que as clulas de mamferos, porm tem como vantagem a caracterstica de produzirem protenas recombinantes com alto rendimento. Os vetores so baseados nos baculovrus, um grupo de vrus comum em insetos e que no infectam vertebrados, porm as protenas resultantes no so glicosiladas corretamente, o que faz com que esse sistema no oferea vantagem em relao a S. cerevisae ou P. pastoris (BROWN, 2003; MADEIRA 2013).Em animais transgnicos tambm pode ocorrer a expresso de protenas teraputicas. Atravs da microinjeo do DNA recombinante em vulo fecundado o gene clonado introduzido em todas as clulas do animal transgnico (BROWN, 2003).Conforme Fonseca (2006), para que um animal possa atuar como um biorreator ele deve obedecer algumas caracterstica como (i) capacidade de produzir a protena de interesse em grandes quantidades sem comprometer o funcionamento normal de suas clulas, (ii) capacidade de passar esta nova caracterstica para as prximas geraes, (iii) capacidade de produzir a protena em um rgo especfico; (iv) capacidade de secreo da protena em fluidos, como o leite, que facilitem a purificao da mesma e no comprometam a sobrevida do animal; (v) aceitabilidade do organismo do animal quanto insero do transgene e (vi) a garantia de recuperao considervel da protena com o grau de pureza exigido.A utilizao de plantas transgnicas para a expresso de protenas vem sendo uma estratgia atrativa para a produo de biofrmacos. Quanto maior o conhecimento do genoma das espcies agronmicas, maior a possibilidade de aplicao das plantas pela manipulao gentica. As clulas vegetais compartilham algumas semelhanas arquitetnicas e funcionais com clulas animais e constituem um timo sistema para expressar protenas heterlogas que requerem modificaes ps-traducionais complexas, tais como a formao de glicoprotenas. A capacidade das plantas em promover o processamento ps-traducional representa uma grande vantagem em relao aos sistemas de expresso estabelecidos em bactrias. As plantas, alm de permitirem a produo de protenas com estrutura similar das protenas nativas, apresentam baixo custo de produo quando comparados com outros sistemas de expresso eucariticos, como cultura de clulas de insetos e de mamferos, ou ainda animais transgnicos, pois necessitam apenas de solo, gua e luz para crescimento e produo (YIN et al., 2007, MEDEIROS, 2008 e CUNHA, 2012).

Alm disso, muitas plantas so excelentes acumuladoras de protenas e se constituem em fonte de biomassa abundante e de baixo custo. Adicionalmente, o controle adequado das condies de cultivo pode maximizar a produo. Cunha (2012) ressalta diversas outras vantagens sobre estes sistemas de expresso como (i) cadeia produtora j bem estabelecida para certos cultivares como a soja; (ii) rgos especializados no armazenamento de protenas, como sementes, tubrculos e rizomas; (iii) tempo de gerao mais curto que o de animais transgnicos e (iv) ausncia de patgenos comuns para plantas e seres humanos. Este mesmo autor destaca que o desafio em utilizar este tipo de sistema de expresso est no aumento de rendimento na expresso heterloga, bem como a preservao da integridade da protena recombinante no organismo vegetal. Para resolver esta questo, o autor reala a possibilidade de utilizao de promotores tecido especficos, principalmente para as sementes, bem como de sequncias sinalizadoras que direcionem a protena heterloga para vacolos de armazenamento no interior da clula, retirando a protena das possveis condies adversas do citoplasma. Alm disso, interessante a integrao do transgene ao genoma do hospedeiro para que haja sntese contnua da protena como caracterstica fenotpica estvel e herdvel (CUNHA, 2012).De maneira ideal, para a escolha do sistema de expresso de biofrmacos deve-se levar em conta (i) o custo de produo e de purificao; (ii) a capacidade de controlar o produto final, incluindo o seu processamento ps-traduo; (iii) a quantidade de tempo necessria para produzir a protena purificada a partir do gene e (iv) as exigncias das agncias de aprovao regulatria. Alm disso, quando se pensa em expresso heterloga, espera-se que a protena de interesse seja estvel, no txica, solvel e expressa em grandes quantidades (CARUSO, 2007; YIN et al., 2007). A Tabela 2 traz uma comparao entre os diversos sistemas de expresso utilizados na produo de biofrmacos.Tabela 2 - Comparao entre os sistemas de expresso utilizados na produo de biofrmacos (Adaptado de DA ROCHA e MARTIN, 2011).SISTEMASVANTAGENSDESVANTAGENSAPLICAES

BactriasRegulamentao definida; gentica conhecida; manipulao fcil e de baixo custoProtenas no so secretadas usualmente; podem produzir endotoxinas; no ocorrem modificaes ps-traducionaisInsulina (E. coli - Ely Lilly), hormnio de crescimento (Genentech), fatores de crescimento, interferon

LevedurasConhecido como seguro; bom histrico de uso; crescimento rpido; baixo custo de manipulao; modificaes ps- traducionaisGlicosilao excessiva pode prejudicar a bioatividade; pode conter imunognicos e

antgenosVacinas recombinantes para hepatite B viral; insulina humana

Clulas de insetoModificaes ps- traducionais; alto rendimentoRegulamentao incompleta; crescimento lento; meio de cultura caro; infeco por baculovirus (etapa extra de purificao); vrus humanos podem infectar estas clulasMtodo relativamente novo: Novavax produz partculas virais aplicadas na produo de vacinas

Clulas de mamferosModificaes ps

traducionais; bom histrico de regulamentao; boa opo no caso de protenas grandes e complexasMtodo caro; crescimento lento; pode conter alergnicos e contaminantes, purificao complicadaAtivador plasmognico de tecido; fator VIII; anticorpos monoclonais (Hercepin)

Animais transgnicosProcessamento de protenas complexas; excelentes nveis de expresso Pouca experincia em regulamentao; potencial para contaminao viralHormnio de crescimento

(cabras - Genzyme); fator VIII (gado e sunos - PPL Therapeutics)

Plantas transgnicasCiclos de desenvolvimento pequenos; fcil armazenagem das sementes; no existe conhecimento do vrus de planta que tenha contaminado humanosApresenta potencial para novos contaminantes (fungos do solo, bactrias e pesticidas); possibilidade de conter alergnicosVacina clera (tabaco - Chorogen, Inc.); lpase gstrica (milho - Meristem); vacina para hepatite B (batatas - Boyce Thompson)

3.5 - Estudos de CasoDiversos distrbios metablicos so causados pela deficincia na produo de certas protenas e o tratamento destas doenas, muitas vezes, implica na reposio da protena deficiente. Dessa forma, a produo em larga escala e com custo reduzido de diversas protenas humanas pode aumentar a acessibilidade destes biofrmacos, melhorando a qualidade de vida de muitas pessoas (AMB e INTERFARMA, 2013).Nesta seo sero apresentados alguns exemplos de estudos de expresso heterloga de protenas recombinantes utilizadas na prtica clnica.

3.5.1 - Citocinas

Citocinas so molculas proteicas produzidas por clulas do sistema imunolgico e utilizadas na comunicao intercelular, so glicosiladas ou no e enviam diversos sinais estimulatrios para diferentes clulas, apresentando papel fundamental na regulao da resposta imune e inflamatria (DE OLIVEIRA, 2011). As mais importantes so: os interferons, o fator de crescimento de granulcitos e as interleucinas. O interferon- foi um dos primeiros biofrmacos a ser produzido pela tcnica de DNA recombinante, indicado para o tratamento das Hepatites B e C, no carcinoma renal e certas formas de leucemia (PFIZER, 2015). Na hepatite C O IFN- age diretamente contra o vrus e tambm aumenta a resposta imune. Quando a clula infectada pelo vrus, esse vrus fica alojado dentro dela. O interferon estimula a exposio dos antgenos virais na superfcie das clulas infectadas, reconhecendo esses antgenos, o sistema de defesa do organismo passa a atacar essas clulas. Nesse caso, o interferon age especificamente contra o antgeno viral que estiver na clula (CAMPOS, 2003).3.5.1.1 - Interferon cIFN-De acordo com Varellal (2001), o IFN- produzido por moncitos, macrfagos, clulas linfoblsticas, fibroblastos e clulas infectadas por vrus. O IFN- e o IFN- possuem semelhana na sequncia de aminocidos e apesar de agirem, nos mesmos receptores, tm atividade biolgica diferenciada, se ligam a um receptor comum composto por duas cadeias distintas IFNAR1 e IFNAR2 (receptor IFNAR) (VILLELA, 2008; DE OLIVEIRA, 2011). O IFN-, produzido por leuccitos quando so expostos a vrus, apresenta atividade antiviral e antiproliferativa em vrios tipos de clulas. O cIFN- um interferon sinttico que tem sido utilizado no tratamento de pacientes com hepatite C crnica que no respondem terapia com IFN- convencional (VILLELA, 2008; EL-BAKY, 2015).El-Baky (2015) utilizou o plasmdeo pET101/D-TOPO para expressar o IFN- recombinante em Escherichia coli. A sequncia de codificao do gene de cIFN- foi montada com base em PCR e o produto do gene cIFN- clonado no plamdeo para se obter o novo vetor de expresso, pET-cIFN. O plasmdeo pET101/D-TOPO foi desenhado para conter a sequncia, promotora de T7 na extremidade 5' do iniciador, precedendo um cdon de iniciao ATG. Um cdon de parada (TAA) foi includo e o plasmdeo resultante pET-cIFN foi transformado em clulas de E.coli BL21-CodonPlus (DE3) para a expresso da protena regulada pelo promotor de T7. O sistema pET possui, ainda, o indutor do operon lac. Neste trabalho, a E. coli foi um sistema de expresso com alta produtividade, evitando o uso de indutores qumicos, alm disso, mostrou-se um sistema facilmente escalonvel.

3.5.2 - Fatores de crescimento hematopoiticoOs fatores de crescimento hematopoiticos compem uma famlia de glicoprotenas produzidas na medula ssea por clulas endoteliais, fibroblastos, macrfagos e linfcitos. Essas protenas juntamente com os hormnios e os neurotransmissores, desempenham uma importante funo na comunicao intercelular, regulam a proliferao e diferenciao das clulas hematopoiticas e a funo das clulas sanguneas maduras. Atuam localmente onde so produzidos ou entram na circulao, os mais conhecidos so os hematopoiticos, que so essenciais para a formao e diferenciao das clulas sanguneas (MELLADO e CASTILHO, 2008; MADEIRA, 2013). A eritropoietina uma protena globular complexa de estrutura glicosilada. utilizada para o tratamento de anemia associada a doenas crnicas dos rins e estimula a produo de eritrcitos, alm de outras aplicaes no renais (MELLADO e CASTILHO, 2008).3.5.2.1 - Eritropoietina

A eritropoietina (EPO) um hormnio glicoprotico que regula a proliferao e a diferenciao das clulas hematopoiticas, como os glbulos vermelhos. Ela estimula as clulas tronco jovens da medula ssea, os eritroblastos, a aumentar sua atividade mittica e se diferenciarem em eritrcitos. um hormnio produzido naturalmente nos seres humanos e nos animais pelos rins e fgado. A eritropoietina recombinante tem a mesma funo do hormnio natural. uma protena de grande interesse comercial, devido ao seu amplo uso teraputico, como nas prevenes de diversas formas de anemias, na insuficincia renal crnica, doenas hematolgicas, cnceres, entre outras, porm precisa ser glicosilada corretamente para apresentar atividade biolgica (FONSECA, 2006; MENDES, 2009).A produo de EPO em culturas de clulas eucariticas um processo de alto custo e baixo rendimento, alm disso, as modificaes ps-traducionais em culturas de clulas no so adequadas, gerando uma protena recombinante com tempo de meia vida curto, o que encarece o tratamento, por necessitar de mais aplicaes dirias. Assim, a melhor alternativa a expresso desta protena em animais transgnicos. Porm, diversas tentativas j foram realizadas em camundongos, coelhos e sunos, mas diversos problemas com estes animais foram detectados devido falta de especificidade das sequncias promotoras utilizadas para as glndulas mamrias (MENDES, 2009). A glndula mamria escolhida como biorreator, uma vez que as protenas do leite so expressas especificamente neste local, sem escape para a circulao sangunea, e tambm apresentam altos nveis de expresso de protenas. Alm disso, o leite facilmente colhido sem prejudicar o animal (CLARK, 1998).

Elementos regulatrios dos genes para as protenas do leite (promotores) podem ser usados para dirigir a expresso de genes exgenos no tecido mamrio, como os promotores para as protenas -casena; S1-casena; -lactalbumina; BLG (-lactoglobulina bovina) e WAP (whey acidic protein) (CLARK, 1998).

Segundo Mendes (2009), somente em sunos a EPO recombinante foi obtida com a glicosilao necessria para a atividade biolgica. Alm disso, os promotores WAP de coelhos ou de camundongos e o promotor de -casena de cabras no foram capazes de dirigir a expresso somente para a glndula mamria, resultando em alteraes nos animais transgnicos, como esplenomegalia, hepatomegalia, alterao de hematcrito, oligospermia e reduo do nmero de filhotes e morte prematura dos animais por exausto da medula ssea. Na tentativa de reverter esse impasse a autora construiu vetores plasmidiais para expresso de EPO recombinante no leite de camundongas transgnicas, com a finalidade de posterior utilizao da tecnologia em bovinos. Foram construdos dois vetores utilizando o promotor da -lactalbumina bovina e o promotor de BGL (-lactoglobulina bovina). As regies promotoras e as regies codificadoras de ambas as protenas foram amplificadas por PCR a partir de DNA extrado do sangue de fmeas bovinas e a regio codificadoras para o gene da EPO humana foi amplificada, tambm por PCR, a partir de DNA extrado de sangue humano. Posteriormente, foram montados dois cassetes de expresso, aps repetidas digestes com enzimas de restrio: (i) promotor -lactalbumina, seguido da regio codificadora para EPO humana, seguido da regio codificadora para -lactalbumina e (ii) promotor BGL, seguido da regio codificadora para EPO humana, seguido da regio codificadora para BGL. A autora, ento, introduziu estes cassetes no vetor plasmidial pGEM-T-Easy (figura 1). O vetor foi introduzido em clulas tronco por eletroporao e estas foram incubadas com embries para formao de quimeras, estas quimeras foram transferidas para o tero de camundongas receptoras. Neste estudo, a autora obteve xito na construo do vetor de expresso, mas no foi possvel testar a hiptese de produo de EPO recombinante exclusivamente na glndula mamria, pois os animais transgnicos no foram gerados.3.5.3 - HormniosHormnios so substncias especficas produzidas pelo sistema endcrino ou por neurnios e so responsveis pela regulao da produo de diversas molculas no organismo. Os hormnios teraputicos mais conhecidos so a insulina, o glucagon, o hormnio de crescimento e as gonadotrofinas. A insulina um agente que combate o diabetes mellitus diminuindo o nvel de glicose no sangue (AMB e INTERFARMA, 2013).3.5.3.1 - Insulina

A insulina humana um hormnio proteico, constitudo por 51 aminocidos. produzida nas clulas pancreticas e localizada nas Ilhotas de Langerhans, considerada como principal regulador da homeostase metablica tem como funo a reduo da glicemia (taxa de glicose no sangue). O processo se d atravs do mecanismo de transduo de sinal que ativa os receptores de insulina presentes na membrana plasmtica que estimula a expresso dos transportadores de glicose, capazes de captar molculas para serem utilizadas como fonte de energia ou estocadas como glicognio (DA CUNHA, 2008; BAESHEN, 2014). A insulina utilizada no tratamento de um grupo de diferentes tipos de doenas do metabolismo que levam ao aumento dos nveis de acar no sangue, como o diabetes mellitus que caracterizado pela deficincia de secreo de insulina. A pr-insulina o resultado da converso da pr-pr-insulina e diferente da insulina que composta por dois peptdeos, a pr-insulina composta por trs peptdeos, a cadeia A, a cadeia B e um peptdo C, alm da sequncia sinal para endereamento da protena ao retculo endoplasmtico e posterior secreo (LOPES et al., 2012).A pr-insulina foi expressa por Cunha (2012) em plantas transgnicas de soja. Este autor construiu um vetor plasmidial com sequncias regulatrias que direcionassem a pr-insulina heterloga para a semente da soja e que a mesma fosse armazenada em vacolos no interior das clulas, impedindo a degradao da mesma por proteases presentes no citoplasma. Para alcanar este objetivo o autor construiu um cassete de expresso composto pelo promotor -kafirina, promotor tecido especfico para sementes de sorgo, por um peptdio sinal de -coixina, protena de reserva energtica direcionada para vacolos de armazenamento nas sementes e o gene da pr-insulina humana. O autor construiu o plasmdeo pRT-GK-PSC-PIh, este vetor foi construdo com a insero de um fragmento contendo a sequncia codificante do peptdeo sinal de -coixina retirado do vetor pRT-PSC-prINS e inserido no vetor pRT-GK, que j continha a sequncia promotora de -kafirina, previamente digerido com as enzimas Ncol e BamHI. As sementes foram preparadas por aplicao de biobalstica nos eixos embrionrios. A seleo dos recombinantes foi feita por gene de resistncia a herbicida. A confirmao da presena do gene foi feita por PCR convencional, a confirmao da expresso heterloga foi feita por western blot e o acmulo de protena nos vacolos foi comprovado por imunocitoqumica e microscopia eletrnica de transmisso. A tcnica se mostrou promissora, pois a pr-insulina foi ainda detectada nas prognies destas plantas mesmo aps sete anos de cultivo.

3.5.4 - Fatores de coagulao sangunea

No processo de coagulao sangunea o complexo no qual o sangue forma cogulos slidos constitudo por vrios fatores, como os fatores VII, VIII e IX. De modo geral, os fatores de coagulao so protenas com sntese heptica circulando sob forma inativa (RESENDE e SILVA, 2015). A desordem na coagulao pode levar a hemorragia ou a trombose, sendo que a falta dessas protenas constitui a doena gentica conhecida como hemofilia. Atualmente, estes fatores sanguneos so tambm produzidos atravs da tecnologia de DNA recombinante (MELLADO e CASTILHO, 2008).3.5.4.1 - Fator IX da coagulao sangunea O Fator IX desempenha papel essencial na coagulao sangunea. uma protena complexa da classe das serino proteases, com cerca de 461 aminocidos e massa molecular de aproximadamente 55 kDa, dependente de vitamina K. sintetizado e armazenado no fgado para posteriormente ser secretado no sangue (DA CUNHA, 2008; LIU, 2014). A deficincia do Fator IX leva ao quadro conhecido como hemofilia B, que um distrbio hemorrgico hereditrio. Essa deficincia congnita causada por mutaes no gene F11, que controla a produo do Fator IX plasmtico que resulta em sintomas hemorrgicos moderados, ocorrendo normalmente aps traumatismo ou cirurgia (MELLADO e CASTILHO, 2008; LIU, 2014).

Segundo Carlos (2007), a coagulao sangunea acontece sempre que um vaso se rompe e ocorre o sangramento, essa coagulao responsvel por diversas reaes qumicas. uma srie complexa de interaes nas quais o sangue perde suas caractersticas de fluido, formando um cogulo irreversvel, pela interao do tecido lesado, plaquetas e fibrina. Existem dois mecanismos relacionados intimamente que quando estimulados podem gerar fibrina. O mecanismo intrnseco refere-se sequncia de reaes enzimticas que iniciam quando o sangue entra em contato com a superfcie lesada. O mecanismo extrnseco refere-se sequncia de reaes que ocorrem quando a leso de um vaso sanguneo resulta na liberao de extratos teciduais. Estas duas vias convergem para a ativao do fator X na via comum, o que leva, formao de fibrina. O Fator IX atua na via intrnseca e quando ativado, em combinao com fator VIII tambm ativado, ativa o fator X que converte protrombina trombina e ento a trombina converte fibrinognio em fibrina formando o cogulo.O tratamento da hemofilia B consiste no fornecimento de fator IX ao indivduo deficiente. Esta protena produzida atravs do fgado de cadveres humanos ou derivada do sangue de doadores saudveis. Apesar dos riscos associados contaminao destas preparaes, esta ltima ainda predominantemente utilizada em pases em desenvolvimento. O primeiro fator IX recombinante comercializado foi produzido em culturas de clulas de mamferos. Animais transgnicos tambm tm atrado ateno para a produo desta protena, mas ambas as plataformas de expresso ainda possuem preos proibitivos para serem comercializadas em certos pases. Dessa forma, sistemas de expresso que reduzam o custo de produo esto sendo pesquisados (CUNHA, 2012).

Cunha (2012) prope a expresso de fator IX recombinante em sementes transgnicas capazes de acumular o frmaco devido ao seu alto percentual protico. O autor construiu um cassete de expresso contendo o promotor da subunidade da -conglicina de soja, uma protena abundante nas sementes de soja, uma sequncia para o peptdeo-sinal de -coixina, que direciona esta protena a vacolos de reservas nas clulas da semente e a sequncia codificadora do fator IX amplificada de uma biblioteca de cDNA de fgado humano. O autor preparou o DNA recombinante a partir do vetor pcong3, contendo as sequncias promotoras e terminadoras da subunidade da -conglicinina, por digesto com as enzimas NcoI e BamHI. Estes mesmos stios de restrio foram inseridos nos primers que amplificaram o cDNA para o fator IX e a sequncia do peptdeo-sinal de -coixina. Assim, estes fragmentos foram inseridos no vetor, gerando o vetor de expresso pcong3FIX. Este foi transformado por biobalstica nos eixos embrionrios retirados das sementes de soja e a seleo dos recombinantes foi feita pela resistncia a herbicida. Estes experimentos produziram protena com atividade biolgica considervel e a protena foi encontrada nas sementes estocadas por seis anos e tambm nas prognies da planta.3.6 - Aspectos de mercadoO setor biofarmacutico baseado na inovao tecnolgica e na propriedade de pesquisa e desenvolvimento de patentes. As grandes empresas farmacuticas e as empresas de biotecnologia que surgiram nos ltimos anos concentram a produo de biofrmacos (BENAVIDE, 2013). O mercado de biofrmacos vem ganhando destaque devido aos grandes avanos cientficos e ao grande volume de investimentos (FARDELONE, 2006). As empresas responsveis pela produo dos biofrmacos e todo processo de pesquisa e desenvolvimento se concentram nos pases desenvolvidos, sendo os Estados Unidos o maior produtor mundial, seguido por Alemanha e Japo. Contudo, nos ltimos anos o Brasil desponta como uma das maiores apostas do mercado mundial de biotecnologia (REIS et al., 2011).Em 1998, o mercado mundial de protenas recombinantes teve uma taxa de crescimento de 14% ao ano, enquanto a taxa mdia de crescimento de todo mercado farmacutico foi de apenas 6% (PALOMARES et al., 2004). No ano 2000, as vendas do setor de biofrmacos representavam 6,4% do total do mercado de medicamentos (22,7 bilhes de dlares). J no perodo de 2001 a 2002 ocorreu um crescimento superior a 19% ao ano (7,6% do total do mercado mundial). E em 2004, j movimentava o mercado anual de cerca de 50 a 60 bilhes de dlares em todo o mundo, ganhando cada vez mais espao (SOUSA, 2006). Segundo MADEIRA (2013), o mercado mundial gastou cerca de 160 bilhes de dlares, sendo 10 bilhes de reais no Brasil, e cerca de 350 biofrmacos estavam em fase de testes clnicos neste ano.Atualmente, muitos produtos biofarmacuticos esto em ensaios clnicos e vrios deles so esperados para chegar ao mercado dentro desta dcada (TANAKA, 2014). Vale ressaltar que dentre os dez medicamentos mais vendidos no mundo, cinco so biotecnolgicos. Segundo Reis et. al (2011), estima-se que os medicamentos biotecnolgicos passem de cinco para sete entre os 10 produtos mais vendidos no mundo. Entre eles, destacam-se os anticorpos monoclonais (Humira-adalimumabe, Avastin-bevacizumabe, Rituxan-rituximabe, Herceptin-trastuzumabe, Remicade-infliximabe), a protena teraputica Enbrel-etanercepte e a vacina antipneumoccica Prevnar13 (SCHNIEKE et al., 1997; REIS et al., 2011).Nos ltimos anos vrias agncias federais financiam projetos em bioprospeco, que esto sendo desenvolvidos por grupos de pesquisa nas universidades brasileiras e tambm empresas farmacuticas na fase de inovao. Muitas molculas j identificadas foram levadas para as bancadas dos laboratrios nas universidades e at mesmo na indstria, sendo alvos de testes toxicolgicos e de atividade. Contudo, as dificuldades das instituies cientficas e tecnolgicas de realizarem parcerias e atuarem na prestao de servios para a indstria acabam tornando restrita a gerao de inovaes (ABDI & CGEE, 2008).Ainda segundo Reis et al. (2011), as estimativas de vendas para os prximos anos apontam destaque para os anticorpos monoclonais. Porm os biofrmacos de primeira gerao, como insulina, interferons e hormnios do crescimento (hGH) tambm continuaro liderando o mercado mundial. A figura 4 apresenta a diviso do mercado de medicamentos biotecnolgicos por tipo de medicamento em 2009 (REIS et al., 2011)

Figura 4: Participao no mercado de medicamentos biolgicos por tipo de medicamento em 2009 (REIS et al., 2011).

Em vista do exposto, possvel afirmar que os medicamentos biotecnolgicos vem ganhando cada vez mais espao no mercado mundial e podem ser considerados como ponto central da estratgia de diversos pases e empresas na prestao de servios de sade e na gerao de lucros. Alm disso, importante ressaltar que o Brasil no est distante dessa discusso, pelo contrrio, muitos avanos em pesquisa e desenvolvimento tm surgido no pas e, dessa forma, a possibilidade de ampliao do arsenal teraputico disponvel para diversas doenas e das oportunidades de tratamento para nossa populao evidente.4. CONCLUSO

Nesta reviso foi possvel expor as caractersticas essenciais dos vetores e sistemas de expresso utilizados em Engenharia Gentica, mostrando a importncia da seleo destas molculas e clulas na produo de protenas recombinantes para aplicao teraputica. Os estudos de caso apresentados mostram que mesmo para biofrmacos j consolidados no mercado ainda possvel buscar sistemas de expresso alternativos que possam reduzir os custos de produo e tornar os mesmo mais acessveis populao. Para isso, imperativo efetuar a construo do cassete de expresso de modo aumentar os rendimentos de produo e selecionar o sistema de expresso de modo a evitar perdas com a expresso de protenas sem funo biolgica. A determinao e caracterizao da estrutura de protenas comea a ganhar maior ateno devido possibilidade de expresso e purificao em larga escala, permitindo o lanamento de novas drogas e estratgias teraputicas. Alm do mais, o mercado desses biofarmacos torna-se promissor frente busca contnua e crescente por produes mais rentveis e otimizadas. Sendo necessrio um rgido controle das etapas de processo, e purificao. A tendncia de crescimento de mercado das protenas, expostas neste trabalho, est relacionada aos excelentes resultados obtidos em pesquisa e desenvolvimento. Assim, em um cenrio brasileiro e mundial acredita-se que a indstria de biofrmacos continuar a ter um expansivo crescimento. 5. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ABDI & CGEE. Biotecnologia: iniciativa nacional de inovao estudo prospectivo de inovao viso de futuro e agenda 2008-2025. Braslia: INI Biotecnologia, 2008. 265p.

ALBERTS, B., JOHNSON, A., LEWIS, J., RAFF, M., ROBERTS, K., WALTER, P. Biologia molecular da clula. 5ed. Porto Alegre: Editora Artmed, 2009. 1396p.

AMB Associao Mdica Brasileira e INTERFARMA Associao da Indstria Farmacutica de Pesquisa. Medicamentos Biolgicos na Prtica Mdica. So Paulo: Interfarma, 2013. 442p.

BAESHEN, N. A.; BAESHEN, M. N.; SHEIKL, A.; BORA, R. S.; AHMED, M. M. M.;

RAMADAN, H. A. I.; SAINI, K. S.; REDWAN, E. M. Cell factories for insulin production. Microbial Cell Factories, v.13, p.14, 2014.

BENAVIDE, V. G. Panorama sobre alguns entraves e desafios na produo nacional de biofrmacos. 2013. 44f. Monografia (Ps-Graduao em Tecnologias Industriais Farmacuticas) Instituto de Tecnologia em Frmacos Farmanguinhos, Rio de Janeiro. 2013.

BORGES, T. F. B. Construo de um vetor integrativo em mltiplas cpias para Saccharomyces cerevisiae utilizando seqncias delta. 2009. 83f. Dissertao (Mestrado em Biologia Molecular) - Universidade de Braslia, Braslia, 2009.

BROWN, T. A. Clonagem Gnica e Anlise de DNA. Porto Alegre: Editora Artmed, 2003.

CARDEAL, I. C. M. A.; Uso teraputico de chaperones em doenas conformacionais. 2013. 61f. Dissertao (Mestrado em Cincias Farmecuticas) - Universidade Fernando Pessoa, Porto, Portugal, 2013.

CARLOS, M. M. L.; FREITAS, P. D. F. S. Estudo da cascata de coagulao sangnea e seus valores de referncia. Acta Veterinria Braslica, v.1, n.2, p.49-55, 2007.

CARUSO, C. S. Clonagem, expresso e caracterizao de protenas recombinantes de Xylella fastidiosa. 2007. 187f. Tese (Doutorado em Cincias) - Universidade de So Paulo, So Carlos, 2007.

CESCA, K. Estudo da produo de poli-hidroxialcanoatos escherichia coli recombinante a partir de soro de queijo. 2011. 103f. Dissertao (Mestrado em Engenharia de Alimentos) Universidade Federal de Santa Catarina, Florianpolis, SC, 2011.

CLARK, A. J. The mammary gland as a bioreactor: Expression processing and production of recombinant proteins. Journal of Mammary Gland and Neoplasia, v.3, n. 3, 1998.

COSTA, M. A. F., COSTA, M. F. B. Biossegurana de OGM: uma viso integrada. Rio de Janeiro: Publit, 2009. 384p.

CUNHA, N. B. Expresso recombinante e caracterizao molecular e funcional de pr-insulina humana, do hormnio de crescimento humano e do fator IX de coagulao sangunea em plantas transgnicas de soja [Glycine Max L. (Merril)]. 2012. 130f. Tese (Doutorado em Biologia Molecular) Programa de Ps-Graduao em Biologia Molecular do Departamento de Biologia Celular, Universidade de Braslia, Braslia.

DA ROCHA, R., MARTIN, A.V. Transgnicos Plantas Produtoras de Frmacos (PPF). Cincia e sade coletiva, v.16, n.7, 2011.

EL-BAKY, N. A.; LINJAWI, M. H.; REDWAN, E. M. Auto-induction expression of human consensus interferon-alpha in Escherichia coli. BMC Biotechnology, v.15, p. 1-10, 2015.

FARDELONE, L. C.; BRANCHI, B. A. O setor de biofrmacos e as oportunidades para o Brasil. Revista FAE, v.9, n.2, p.29-38, jul./dez, 2006.

FONSECA, K. F. A produo de biofrmacos a partir de animais transgnicos: um estudo sobre a eritropoetina alfa humana recombinante. 2006. 59f. Monografia (Curso Tcnico em Sade, com habilitao em Laboratrio em Biodiagnstico em Sade) Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio, Rio de Janeiro. 2006.

GANDER, E. S.; MARCELLINO, L. H. Plantas Transgnicas. Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento, v. 1, n. 1, p. 34-37, 1997.

GERNGROSS, T. U. Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi. Nature Biotechnology, v.22, n.11, p.1409-1414, 2004.

GRIFFITHS, A. J. F., MILLER, J. H., SUZUKI, D. T., LEWONTIN, R. C., GELBART,

W. M. An Introduction to Genetic Analysis. 7ed. Nova York: W. H. Freeman, 2000.

INTERFARMA. Entendendo os medicamentos biolgicos, 2012. Disponvel em: . Acesso em: 17/06/2015.

KARP, G. Biologia Celular e Molecular - Conceitos e Experimentos. 3ed. So Paulo: Editora Manoele, 2005. 832p.

KLUG, W. S.; CUMMINGS, M. R; SPENCER, C. A.; PALLADINO, M. A. Conceitos de gentica. 9ed. Porto Alegre: Editora Artmed, 2010. 896p.

LEE, M. H.; LIN, Y. S.; TU, C. F.; YEN, C. H. Recombinant human factor IX produced from transgenic porcine milk. BioMed Research International, v.2014, p. 1-8, 2014.

LIU, J.; JONEBRING, A.; HAGSTRM, J.; NYSTRM, AC.; LVGREN, A. Improved Expression of Recombinant Human Factor IX by Co-expression of GGCX, VKOR and Furin. The Protein Journal. v.33, n.2, p.174-183, 2014.

LEWIN, B. Genes. 5ed. Oxford University Press and Cell Press, 1997. 1260p.

LOPES, D. S. A.; PESSOA, M. H. N.; SANTOS, R. S.; BARBOSA, M. S. A produo de insulina artificial atravs da tecnologia do DNA recombinante para o tratamento de diabetes mellitus. Revista da Universidade Vale do Rio Verde, Trs Coraes, v. 10, n. 1, p. 234-245, 2012.

MACEDO, J. N.; LOPES, J. L. S.; DAMALO, J. C. P. Tcnicas de biologia molecular e clonagem. Braslia: W Educacional Editora e Cursos Ltda. Disponvel em: Acesso em: 19/06/2015.

MADEIRA, L. S. Prospeco tecnolgica atravs de depsitos de patentes para produo de protenas teraputicas de interesse brasileiro. 2013. 237p. Tese (Doutorado em Cincias) Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2013.

MARQUES, C. H. Aspectos fundamentais implantao da tecnologia de produo de anticorpos monoclonais humanizados com potencial aplicao teraputica. 2005. 126f. Dissertao (Mestrado em Tecnologia de Imunobiolgicos) - Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2005.

MARQUES, R. M. D. S. Modificaes ps-traducionais de protenas na amiloidognese: Glicao e agregao da transtirretina in vivo em Saccharomyces cerevisiae. 2008. Dissertao (Mestrado em Biologia Celular e Biotecnologia) Universidade de Lisboa, Lisboa, 2008.

MEDEIROS, M. G. F.; CARNEIRO, S. M. P.; DINIZ, F. M. Plantas como potenciais biorreatores na produo de vacinas e frmacos. Teresina: Embrapa Meio-Norte, 2008 (Pesquisa & Desenvolvimento - Srie Documentos No. 180).

MELLADO, M. C. M, CASTILHO, L. R. Protenas recombinantes teraputicas. In: Moraes AM, Augusto EFP, Castilho LR. (Org.) Tecnologia do Cultivo de Clulas Animais de Biofrmacos a Terapia Gnica. So Paulo: Editora Roca, 2008. p.384- 402.

MENDES, C. M. Produo de eritropoietina recombinante humana no leite de camundongas transgnicas. 2009. 50f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinria) Programa de Ps-Graduao em Reproduo Animal da Faculdade de Medicina e Zootecnia, Universidade de So Paulo, So Paulo.

MOLINA, A. L.; TOBO, P. R. Uso das tcnicas de biologia molecular para diagnstico. Einsten, v.2, n.2, p. 139-142, 2004.

MONCLARO, A. V. Expresso de Protenas Recombinantes: Sistema Vetor - Hospedeiro. Materiais e Mtodos, Universidade de Braslia, 2013. Disponvel em: . Acesso em: 17/06/2015.

MOREIRA, C.; MENDES, D. Engenharia Gentica - Clonagem de DNAs em Bactrias (Mdulo I). Universidade de Evora, 1998. Disponvel em: . Acesso em 17/06/2015.

NASCIMENTO, A. A. C.; ESPREAFICO, E. M.; LARSON, M. L. P.; MONESI, N.; ROSSI, N. M. M; RODRIGUES, V. Tecnologia do dna recombinante. 2003. 87p. Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo, Ribeiro Preto, 2003.

NUNES, A. R. A. Medicamentos biolgicos: situao actual e prespectivas futuras. 2014. 85f. Dissertao (Mestrado Integrado em Cincias Farmacuticas) Universidade Lusfona de Humanidades e Tecnologias, Lisboa, 2014.

OLIVEIRA, C. M. B.; SAKATA, R. K.; ISSY, A. M.; GEROLA, L.R.; SALOMO, R.

Citocinas e dor. Revista Brasileira de Anestesiologia v. 61, n.2, p. 260- 265, Maro - Abril, 2011.

PALOMARES, L. A.; KUBRI-BRENA, F.; RAMREZ. O. T. Industrial Recombinant Protein Production. Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols, 2ed. Arglia: Springer, 2004.

PASSARGE, E. Color Atlas of Genetics, 4ed. Essen: Thieme, 2012. 488p.

PATIO, S. F. S. Avaliao da expresso transiente do gene do gene da glicoprotena do vrus da raiva (RGVP) em clulas de inseto da linhagem Drosophila melanogaster S2. 2011. 121f. Dissertao (Mestrado em Biotecnologia) Universidade Federal de

So Carlos, So Carlos, 2011.

PFIZER. Medicamentos Biolgicos e Biossimilares. Disponvel em: . Acesso em: 18/06/2015.

PROMEGA Corporation. Technical Manual pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems Instructions for use of products. Madison, 2010. 28p. Disponvel em: . Acesso em: 17 jun. 2015.

QIAGEN. Catlogo de produto pQE30 Xa Vector Map. Disponvel em:

. Acesso em: 17 jun. 2015.

REIS, C. Biotecnologia para sade humana: tecnologias, aplicaes e insero na indstria farmacutica. Rio de Janeiro: BNDES Setorial, n. 29, p. 359-392, 2009.

REIS, C.; LANDIM, A.; PIERONI, J. P. Lies da experincia internacional e propostas para incorporao da rota biotecnolgica na indstria farmacutica brasileira. Rio de Janeiro: BNDES, n. 34, p. 5-44, 2011.

RESENDE, M. A. C.; SILVA, E. V. Administrao de fatores da coagulao: quais as evidncias?. Medicina perioperatria. Servio de Anestesiologia, Joinville, SC. Disponvel em: Acesso em: 19/06/2015.

SCHNIEKE, A. E.; KIND, A. J.; RITCHIE, W. A.; MYCOCK, K.; SCOTT, A. R.; RITCHIE, M.; WILMUT, I.; COLMAN, A.; CAMPBELL, K. H. Human Factor IX Transgenic Sheep Produced by Transfer of Nuclei from Transfected Fetal Fibroblasts. Science v.278, p. 21302133, 1997.

SOUSA, T. M. M. Produo de protenas de interesse teraputico em clulas de mamferos em cultura. 2006. Dissertao (Mestrado em Biologia Molecular) - Universidade de Braslia, Braslia, DF, 2006.

STRYER, L. Biochemistry. Nova York. W.H. Freeman and Company, 1988, p.881.

TANAKA, R. L.; AMORIM, M. C. S. O mercado e as possibilidades da indstria de biofrmacos no brasil. Revista da Faculdade de Cincias Mdicas de Sorocaba, v. 16, n.2, 2014.

TWYMAN, R. M.; STOGER, E.; SCHILLBER, S.; CHRISTOU, P.; FISCHER, R. Molecular farming in plants: host systems and expression technology. TRENDS in Biotechnology, V.21, n.12, Dezembro, 2003.

VARELLA, P. P. V.; FORTE, W. C. N. Citokines: A review. Revista Brasileira de Alergia e Imunopatologia, v.24, p. 146154, 2001.

VILLELA, A. D. Superproducao do Interferon 1 Humano Recombinante em Escherichia coli. 2008. 75f. Dissertao (Mestrado em Biologia Celular e Molecular) Pontfica Universidade Catlica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, 2008.

VILLEN, R. A. Biotecnologia - Histrico e Tendncias. Revista de Graduao da Engenharia Qumica do Centro Universitrio do Instituto Mau de Tecnologia, Escola de Engenharia Mau, n. 10, 2002.

WALSH, G. Biopharmaceuticals and biotechnology medicines: an issue of nomenclature. European Journal of Pharmaceutical Sciences, v.15, n. 2, p.135-138, 2002.

WATSON, J. D.; CRICK, F. H. C. Molecular Structure of NucleicAcids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature, v.171, n. 4356, p. 737738, 1953.

YIN, Q. Q.; ZHENG, Q. H.; KANG, X.T. Biochemical characteristics of phytases from fungi and the transformed microorganism. Animal Feed Science and Technology 132 (2007) 341350. (2007).ZAHA, A.; FERREIRA, H. B.; PASSAGLIA, L. M. P. Biologia Molecular Bsica. 5ed. Porto Alegre: Artmed, 2014. 424p.