resubido vacunas recombinantes

Vacunas de nueva generacinInforme de VigilanciaTecnolgica

Vacunasde nueva generacinInforme de Vigilancia Tecnolgica

4VACUNAS DE NUEVA GENERACIN

El presente informe de Vigilancia Tecnolgica ha sido

realizado en el marco del convenio de colaboracin

conjunta entre Genoma Espaa y la Fundacin General

de la Universidad Autnoma de Madrid (FGUAM), entidad

que gestiona el Crculo de Innovacin en Biotecnologa

(CIBT), perteneciente al Sistema de Promocin Regional

de la Innovacin MADRID+D.

Genoma Espaa y la Fundacin General de la Universidad

Autnoma de Madrid (FGUAM), agradecen la colaboracin

ofrecida por toda la comunidad cientfica y empresarial

para la realizacin de este informe, en especial a:

Dr. Mariano Esteban Rodrguez

(Centro Nacional de Biotecnologa, CNB-CSIC)

Dr. Jos Alcam Pertejo

(Centro Nacional de Microbiologa, CNM, ISCIII)

Dr. Francisco Borrs Cuesta

(Universidad de Navarra)

La reproduccin parcial de este informe est autorizada

bajo la premisa de incluir referencia al mismo, indicando:

Vacunas humanas de nueva generacin. GENOMA

ESPAA/CIBT-FGUAM

Genoma Espaa no se hace responsable del uso que se

realice de la informacin contenida en esta publicacin.

Las opiniones que aparecen en este informe

corresponden a los expertos consultados y a los autores

del mismo.

Copyright: Fundacin Espaola para el Desarrollo de la

Investigacin en Genmica y Protemica/Fundacin

General de la Universidad Autnoma de Madrid

Autores: Marta Lpez (CIBT)

Paloma Mallorqun (CIBT)

Rosario Pardo (CIBT)

Miguel Vega (Genoma Espaa)

Edicin: Silvia Enrquez (Genoma Espaa)

Referencia: GEN-ES04004

Fecha: Septiembre 2004

Depsito Legal: M-41812-2004

ISBN: 84-609-1993-5

Diseo y realizacin: Spainfo, S.A.


ndice de contenido

RESUMEN EJECUTIVO 7

1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS DEL INFORME 8

2. INTRODUCCIN A LAS VACUNAS 9

2.1. Principios bsicos en inmunologa 92.2. Mecanismo de accin de las vacunas 11

3. VACUNAS CLSICAS 13

3.1. Vacunas vivas atenuadas 133.2. Vacunas inactivadas 143.3. Vacunas de subunidades 15

4. NUEVAS VACUNAS 16

4.1. Vacunas atenuadas mediante modificacin gentica 174.2. Vacunas sintticas 174.3. Vacunas anti-idiotipo 184.4. Vacunas de protenas y pptidos recombinantes 204.5. Vacunas gnicas 234.6. Vacunas comestibles 30

5. APLICACIONES DE LAS VACUNAS 33

5.1. Enfermedades infecciosas 335.2. Enfermedades autoinmunes 485.3. Cncer 49

6. PERSPECTIVAS FUTURAS PARA EL DESARROLLO DE LAS VACUNAS 52

6.1. Nuevos sistemas de produccin de vacunas 526.2. Formulacin de nuevas vacunas 536.3. Inmunizacin mucosa 566.4. Vacunas teraputicas 56

67. EL MERCADO DE LAS VACUNAS 57

8. EVOLUCIN FUTURA DE LA INVESTIGACIN DE NUEVAS VACUNAS 58

9. BARRERAS AL DESARROLLO DE NUEVAS VACUNAS 59

10. EJEMPLOS DE GRUPOS DE INVESTIGACIN ESPAOLES EN NUEVAS VACUNAS 62

11. CONCLUSIONES 74

12. ANEXOS: 78

Anexo I: Estado actual de la investigacin en nuevas vacunas 78 Anexo II: Grupos de investigacin espaoles en nuevas vacunas 87 Anexo III: Empresas que comercializan vacunas humanas 97 Anexo IV: Patentes espaolas en tecnologas relacionadas con vacunas humanas 107

13. REFERENCIAS 108

14. GLOSARIO 112


Resumen ejecutivo

Es comnmente aceptado que las vacunassuponen uno de los mayores logros de labiomedicina, provocando un descenso de lamortalidad infantil, la disminucin de la incidenciade enfermedades infecciosas, e incluso laerradicacin de algunas de ellas en pases enteros.Los retos en este campo se encaminan no slo ala prevencin de enfermedades infecciosas, sinotambin a evitar patologas crnicas como lasenfermedades autoinmunes, o procesoscancerosos de diversa ndole. Otro de los desafosplanteados es el desarrollo de vacunasteraputicas cuyo objetivo no es prevenir laenfermedad sino tratarla. El objetivo de estosnuevos desarrollos, todava muy incipientes, eserradicar la enfermedad o al menos atenuarla enlos sujetos afectados, prolongando as lasupervivencia de los mismos.

El tipo de vacunas que se ha venido empleandotradicionalmente se basa en la utilizacin depatgenos atenuados, inactivados, protenas ofracciones de los mismos, que posean capacidadde desencadenar una respuesta inmuneprotectora, sin provocar la enfermedad. En lasltimas dcadas las tecnologas del ADNrecombinante, junto con un mejor conocimientode los mecanismos de patognesis y de respuestainmunitaria, han permitido el diseo de nuevasvacunas alternativas a las tradicionales. Entreestos nuevos tipos de vacunas cabe mencionar lasvacunas de protenas recombinantes y pptidos delas mismas, que hoy en da sustituyen a algunasde las vacunas compuestas por fracciones depatgenos que todava se emplean. Un grannmero de vacunas de ADN y vacunas vivasrecombinantes se encuentran en estos momentosen las ltimas etapas de ensayos clnicos, ascomo vacunas teraputicas frente a enfermedadespara las que actualmente no existe una alternativapreventiva. Asmismo, las vacunas comestiblessern una de las apuestas de futuro a largo plazoque no debe dejarse de lado.

Existe un gran nmero de enfermedades queactualmente no disponen de una vacuna efectiva.El presente informe realiza una reflexin sobreaquellas enfermedades que segn diversosestudios tienen mayores probabilidades dedisponer de una vacuna efectiva a corto y medioplazo. Segn los ensayos clnicos activos en

diversos tipos de vacunas, es posible hacerse una

idea sobre el tipo de vacunas que se estn

desarrollando y los problemas que an quedan por

resolver. Mediante el empleo de nuevas

tecnologas y un mayor conocimiento de las bases

genticas de los mecanismos de infeccin y

control de la respuesta inmune, se prev que en

los prximos 5 aos se disponga de vacunas

frente a enfermedades tales como las infecciones

provocadas por herpesvirus, as como varios tipos

de infecciones bacterianas del sistema respiratorio

cuyas vacunas actuales poseen escasa efectividad.

Para el resto de enfermedades de alta incidencia

en la poblacin incluido el sndrome de

inmunodeficiencia adquirida, se estima que como

mnimo se necesitan alrededor de 10 aos para

poder disponer de vacunas efectivas.

Como parte de la realizacin de este informe se ha

contado con la colaboracin de grupos de

investigacin espaoles relacionados con las

nuevas tecnologas de diseo de vacunas. La

participacin de expertos espaoles en vacunas

animales es de relevancia, debido a que en

Espaa los grupos de investigacin en este campo

son muy activos. Como conclusin se ha obtenido

una serie de valoraciones acerca de las

tecnologas clave, as como de los factores

limitantes en Espaa en cuanto a investigacin en

el diseo de vacunas humanas. Los problemas

ms urgentes son los relativos a la falta de

financiacin especfica destinada a proyectos de

I+D en vacunas humanas, junto con los costes y

complicaciones derivadas de la complejidad de los

ensayos clnicos, y la necesidad de disponer de

modelos animales adecuados. Respecto a los

ensayos pre-clnicos de eficacia y toxicologa,

existe una carencia en cuanto a la necesidad de

disponer de instalaciones centralizadas para el uso

de primates. La colaboracin con empresas de

biotecnologa para el desarrollo, escalado y

fabricacin de vacunas en condiciones GMP (Good

Manufacturing Practices) o Normas de Correcta

Fabricacin mediante procedimientos

estandarizados, tambin ha sido identificado como

otro de los aspectos que debe mejorar. Por ltimo,

la falta de informacin e infraestructuras

necesarias para la produccin de vacunas en

condiciones GMP es un claro factor limitante en el

desarrollo de vacunas humanas en Espaa.

El objetivo del presente informe consiste enrealizar una recapitulacin de los distintos tipos devacunas que se pueden emplear en la prevencinfrente a diversas patologas en humanos. Por otraparte, se describen las enfermedades msfrecuentes y las vacunas disponibles en laactualidad, as como los nuevos desarrollos devacunas en estado clnico.

La ltima parte del informe pretende estudiar porun lado las perspectivas de futuro de lastecnologas clave en el desarrollo de vacunas denueva generacin, y por otro, analizar el estadode la investigacin en vacunas humanas enEspaa, mediante la participacin de expertos eneste campo.

8

1. Introduccin y objetivos del informe

El desarrollo de vacunas ha supuesto una de las mayores contribuciones de la inmunologa a la medicina. Laprimera vacuna contra una enfermedad infecciosa, la viruela humana, fue desarrollada por Jenner en 1796.Sin embargo, fue Pasteur quien a finales del siglo XIX estableci la relacin entre grmenes yenfermedades, y realiz grandes avances en inmunoterapia tras realizar numerosos experimentos envacunas animales. El mecanismo inmunitario de la vacunacin fue finalmente aclarado en 1957 por FrankBurnet mediante la teora de la seleccin clonal y con el posterior descubrimiento del papel de los linfocitosen 1965.

9

VACUNAS DE NUEVA GENERACIN

2. Introduccin a las vacunas

Qu es una vacuna?

Una vacuna, segn la definicin tradicional, es una sustancia formada por un microorganismo completoatenuado o muerto, o bien fracciones del mismo, capaces de inducir una respuesta inmune1 protectora yduradera frente al dicho microorganismo virulento. La finalidad de las vacunas es la de prevenir y controlarfuturas infecciones.

2.1. Principios bsicosen inmunologa

El objetivo final del sistema inmunolgico esproteger al organismo de la agresin demicroorganismos patgenos. Este objetivo loalcanza desarrollando distintos sistemas dereconocimiento y accin frente a antgenos2

extraos. Los antgenos son determinantes demolculas, habitualmente protenas, que seencuentran en la superficie de las clulas, virus,hongos, bacterias y sustancias como toxinas,sustancias qumicas, frmacos y otras partculas.Estas molculas son reconocidas por el sistemainmunolgico, desencadenando la respuestainmune protectora frente a la infeccin queconduce a la neutralizacin, destruccin yeliminacin del agente patgeno.

El sistema inmune acta a travs de unadiversidad de sistemas, algunos inespecficos,otros altamente especficos que se encuentraninterrelacionados entre s y que representanbarreras sucesivas frente a la infeccin. El sistema

inmune acta a travs de barreras fsicas (piel,

secreciones de las mucosas, pH cido del

estmago, enzimas proteolticas, etc.), aunque no

pueden considerarse propiamente como

componentes del sistema inmune ya que cumplen

muchas otras funciones.

Dentro de los componentes del sistema inmune

podemos distinguir dos grandes grupos, los

sistemas de inmunidad innata y los sistemas de

inmunidad adquirida. La inmunidad innata se

caracteriza por ser un tipo de respuesta que no

requiere de un contacto previo con el antgeno

para ser desencadenada, y es activada de forma

inmediata cuando entra en contacto con un

antgeno extrao (respuesta primaria). Sin

embargo, frente a determinadas infecciones esta

respuesta es insuficiente, por lo que se necesitan

otros sistemas para controlar el germen invasor.

La inmunidad adquirida confiere al sistema cierta

memoria frente a dicho antgeno por lo que en

caso de un segundo contacto con el antgeno

extrao la respuesta es mucho ms rpida y

potente (respuesta inmune secundaria).

1 Respuesta inmune: forma en que el cuerpo se defiende contra los microorganismos, clulas cancergenas y sustanciaspotencialmente perjudiciales.

2 Antgeno: cualquier molcula capaz de inducir una respuesta inmune. Se denomina eptopo o determinante antignico a laparte ms pequea de un antgeno capaz de inducir y ser reconocido por un clon linfocitario. Cada clula inmune reconoceun eptopo (Fuente: Snchez-Vizcano, J. M. Curso de introduccin a la inmunologa porcina,http://www.sanidadanimal.info/inmuno/octavo1.htm

10

INMUNIDAD ACTIVA

INN

ATA

AD

QU

IRID

A

INMUNIDAD PASIVA

Proteccin producida por la activacin delsistema inmune.

Requiere la exposicin al antgeno paradesarrollar la inmunidad.

Inmunidad a medio plazo. Larga duracin (memoria inmunolgica).

Inmunidad debida a la infeccin con un agentepatgeno.

Inmunidad debida a la administracin de unantgeno conocido (Ej. Anticuerpos inducidospor vacunacin).

Proteccin debida a la transferencia deanticuerpos.

No requiere la exposicin al antgeno paradesarrollar la inmunidad.

Inmunidad inmediata. Inmunidad transitoria.

Transferencia de inmunidad materna a travsde la placenta y la leche materna.

Inmunidad debida a la administracin deelementos del sistema inmune que sonespecficos para un antgeno (Ej. Anticuerposanti-tumores).

TIPOS DE INMUNIZACIN

El sistema inmune especfico o inmunidad adquirida dispone de diferentes poblaciones celulares ymolculas que de forma coordinada son capaces de responder ante la entrada de un agente extrao.Como consecuencia de la infeccin de un patgeno, se pueden desencadenar dos tipos de respuestasinmunes, la respuesta humoral, inducida por anticuerpos3 y la inmunidad celular o mediada porclulas, fundamentalmente linfocitos citotxicos. Ambos tipos de respuesta se producen generalmentede forma coordinada y conjunta, aunque dependiendo del agente extrao, puede ser ms relevanteun tipo de respuesta que el otro.

RESPUESTA HUMORAL RESPUESTA CELULAR

Los linfocitos B producen anticuerpos, loscuales se unen de forma especfica a unantgeno del agente patgeno, produciendouna serie de eventos que conducen a laneutralizacin y/o la eliminacin del agentepatgeno.

Una categora de linfocitos T, las clulascitotxicas (CTL), reconocen pequeosfragmentos (pptidos) de antgenosprocedentes del agente patgeno que selocalizan en la superficie de las clulasinfectadas, destruyndolas. La respuestacelular elimina las clulas infectadas por elagente infeccioso.

TIPOS DE RESPUESTA INMUNE-ADQUIRIDA

3 Anticuerpos: protenas especializadas producidas por el sistema inmunolgico que ayudan a la destruccin de clulasinvadidas por virus, bacterias o sustancias nocivas, ayudando al organismo a deshacerse de dichos agentes. Losanticuerpos (llamados igualmente inmunoglobulinas) se fijan sobre las partculas extraas (llamadas antgenos) paraneutralizar el efecto txico.

2.2. Mecanismo de accinde las vacunas

La inmunizacin activa o vacunacin es el

proceso que permite generar resistencia a una

enfermedad infecciosa. El objetivo de la

vacunacin o inmunizacin consiste en prevenir la

aparicin de enfermedades, e incluso erradicarlas

a escala mundial, como es el caso de la viruela. La

vacunacin consiste en imitar una infeccin por

medio del agente patgeno contra el cual se desea

proteger.

El principio general de todas las vacunas consiste

en inducir una respuesta inmune adquirida

especfica frente al agente infeccioso. Para ello las

vacunas inyectan en el hospedador grmenes

atenuados, inactivados o fracciones de los mismos

que simulan el proceso de primer contacto. Las

vacunas deben utilizar determinantes antignicos

que induzcan una potente respuesta de

anticuerpos y clulas citotxicas frente al agente

patgeno para as aumentar su eficacia. A partir

de este momento el sujeto quedara sensibilizado

adquiriendo memoria inmune, por lo que en

caso de un contacto con el agente patgeno se

producira una respuesta inmune especfica de tipo

secundario. De esta manera, al inducir una

respuesta inmediata, las vacunas obvian la

principal desventaja de la respuesta inmune

adquirida, es decir, el tiempo que se requiere para

su puesta en marcha.

El mecanismo de accin de las vacunas sigue unos

pasos generales que se pueden aplicar a la

mayora de las vacunas. El primer paso consiste

en la caracterizacin y la purificacin o sntesis de

los componentes que confieren inmunogenicidad a

la vacuna, los antgenos. Estos componentes

formarn la base para el diseo de la vacuna, la

cual ser administrada al torrente sanguneo

generalmente mediante una inyeccin. Tras la

inoculacin, las clulas derivadas de la mdula

sea, los linfocitos B, sern activados y

sintetizarn anticuerpos capaces de reconocer y

neutralizar los antgenos procedentes de la

vacuna. Al mismo tiempo, se induce la formacin

y proliferacin de clulas de memoria que

permanecern en el torrente sanguneo con el

objeto de estar preparadas para desencadenar

una respuesta inmune rpida en el caso de que

ocurra una nueva infeccin.

11


1. Vacunacin

3. Liberacin de clulasde memoriainmunolgica

2. Reconocimiento antgeno-anticuerpo y eliminacindel patgeno

Anticuerpo

Patgeno rodeadode antgenos

Figura 1. Mecanismo de accin de las vacunas (Fuente: Access Excellence, National Health Museum Review:http://www.accessexcellence.org/AE/AEC/CC/making_vaccines.html

12

Las dos grandes propiedades que deben reunir las vacunas son la eficacia y la inocuidad. La eficaciadepende de que la vacuna posea capacidad antignica, es decir, que desencadene una respuesta inmuneprotectora en el paciente vacunado, mientras que la inocuidad supone que la vacuna debe estar desprovistade capacidad patognica capaz de desencadenar reacciones adversas, pero sin modificar sustancialmentelos elementos que le confieren la proteccin.

Caractersticas de la vacuna ideal

Reproducir (mimetizar) una respuesta inmunolgica similar a la de la infeccin natural.

Efectiva (ms del 90% de proteccin).

Mnimos efectos secundarios y completamente segura.

Inmunidad persistente a largo plazo.

Dosis nica y compatible con otras vacunas.

Administracin no invasiva (va oral preferentemente).

Administracin precoz en los primeros meses de la vida.

Estable a temperatura ambiente.

Fcil produccin y econmicamente asequible.

La clasificacin de vacunas del presente informe se ha realizado teniendo en cuenta las tecnologasempleadas en su diseo y produccin. Por este motivo, las vacunas humanas se han clasificado en vacunasclsicas, es decir, aquellas cuya tecnologa se conoce desde hace tiempo, y nuevas vacunas, desarrolladaspor medio de nuevas tcnicas de biotecnologa e ingeniera gentica.

Se denominan vacunas clsicas a las vacunas inactivadas, compuestas por bacterias, virus o partes de ellos,vacunas vivas atenuadas, formadas por bacterias o virus cuya virulencia ha sido reducida, y vacunas desubunidades que consisten en fragmentos de protenas antignicas pertenecientes a patgenos.

13


3. Vacunas clsicas

4 Salleras, L. (2002). Tecnologas de produccin de vacunas I: vacunas vivas atenuadas. Vacunas; 3:29-33.

Vacunas clsicas atenuadas

Patgenos animales:

Empleo de patgenos de animales que causan enfermedades parecidas en los humanos, y proporcionaninmunidad frente al agente infeccioso que causa la variante humana. Ejemplo: Viruela.

Atenuacin por pases sucesivos de cultivos celulares:

Cultivo sucesivo del microorganismo en clulas hasta la prdida de la patogenicidad. Ejemplo:Tuberculosis, Polio, Sarampin, Rubola, Parotiditis y Varicela.

Atenuacin por pases sucesivos en medios de cultivo:

Cultivo sucesivo del microorganismo en medios de cultivo hasta la prdida de la patogenicidad.Ejemplo: Tuberculosis.

Atenuacin por mtodos qumicos:

Atenuacin mediante agentes mutagnicos qumicos (nitroso-guanidina). Ejemplo: Fiebre tifoidea.

Atenuacin por reasortado o recombinacin:

Coinfeccin de dos virus con genomas diferentes en cultivos celulares, hasta formar un virusrecombinado. ste se compone de la mayora de los genes de un virus animal no patgeno para elhombre, y genes que contienen la informacin del antgeno inmunizante. Ejemplo: Rotavirus.

Atenuacin por mutagnesis:

Seleccin de mutantes en funcin de su capacidad de multiplicarse a temperaturas diferentes de ladel cuerpo humano. Estos mutantes se replican con menor intensidad que las variantes salvajes,con lo que sern menos virulentos sin perder su inmunogenicidad (mutantes sensibles a latemperatura o TS). Ejemplo: Rotavirus, Gripe.

A pesar del alto grado de atenuacin que se consigue en las vacunas de estetipo, su aplicacin se encuentra contraindicada en pacientes coninmunodeficiencias primarias o secundarias o bien que tengan un estado deinmunosupresin provocado por frmacos o enfermedades oportunistas,asimismo, estas vacunas estn contraindicadas en mujeres embarazadas.

3.1. Vacunas vivas atenuadas

La principal caracterstica de las vacunas vivas

consiste en que los agentes inmunizantes pueden

replicarse en el organismo sin causar la

enfermedad. Estas vacunas proporcionan en teora

una vacunacin ideal de larga duracin y muy

intensa, ya que dan lugar a una infeccin similar a

la natural4. Sin embargo, plantean un riesgo al

estar formadas por microorganismos vivos, ya que

es posible que stos mantengan su actividad

patgena y desencadenen la enfermedad. La

atenuacin de los microorganismos debe ser por

tanto lo suficientemente fuerte para que no se

produzca la enfermedad, pero sin llegar a destruir

los componentes inmunognicos desencadenantes

de la respuesta inmune.

3.2. Vacunas inactivadas

Las vacunas inactivadas son aquellas que contienen microorganismos enteros o toxinas, inactivadosmediante diversos mtodos fsicos y qumicos.

14

Mtodos de inactivacin de patgenos empleados en la elaboracin de vacunas5

Inactivacin por medios fsicos (calor) o qumicos (formol, b-propiolactona) de bacterias o virus.Ejemplos: Vacunas contra tifoidea, clera, polio tipo Salk, y gripe inactivada.

Inactivacin por calor y formaldehdo de antgenos secretados (toxoides o anatoxinas): ttanos, difteria.

5 Alfabeta. Net http://www.alfabeta.net/vacunas-tipos.xtp Oct. 2003). Salleras, L. (2002) Tecnologas de Produccin deVacunas II: Vacunas inactivadas. Vacunas 3:78-84.

6 Adyuvante: sustancia que incrementa de manera inespecfica la respuesta inmunitaria a un antgeno.7 y 8 Salleras, L. (2002). Tecnologas de Produccin de Vacunas II: Vacunas inactivadas. Vacunas 3:78-84.

En comparacin con las vacunas atenuadas, la

principal ventaja de las vacunas inactivadas es

que no existe el riesgo de desencadenar la

enfermedad tras la vacunacin. Esto es debido a

que los microorganismos que forman parte de la

vacuna estn muertos, y tan slo se mantienen

intactas las subunidades proteicas responsables

de la inmunidad.

A diferencia de las vacunas vivas atenuadas, la

respuesta inmunitaria provocada por las vacunas

inactivadas suele ser menos intensa y duradera,

prevaleciendo la respuesta de tipo humoral, es

decir, la produccin de anticuerpos. Otra

desventaja de estas vacunas consiste en la

necesidad de administrar varias dosis de recuerdo

para conseguir una inmunizacin completa. Por

otra parte, es frecuente la adicin de adyuvantes6

en las vacunas inactivadas, que actan a modo de

potenciadores. En el caso de las vacunas

bacterianas inactivadas, dado que no son

sometidas a ningn tipo de purificacin, contienen

todos los componentes bioqumicos de las

bacterias, lo que hace que por lo general sean

ms reactgenas que las vacunas de subunidades,

es decir, provocan ms efectos secundarios7. Las

vacunas virales inactivadas son menos

sensibles a cambios de temperatura que las

vacunas vricas atenuadas, sin embargo, son ms

caras que las vacunas virales vivas atenuadas, ya

que al no replicarse el virus en el paciente se

requiere ms cantidad de antgeno y dosis de

refuerzo para conseguir una respuesta inmune

duradera8.

15


Vacunas clsicas de subunidades

Toxoides o anatoxinas:

Toxinas procedentes de patgenos, a las que se ha modificado mediante calor y compuestosqumicos para eliminar su toxicidad conservando la capacidad inmunizante. Ejemplo: Tos ferina.

Protenas virales naturales:

Purificacin del exceso de protenas de la superficie del virus a partir del plasma de un donante.Ejemplo: Hepatitis B.

Fracciones virales:

Fraccionamiento con disolventes orgnicos o purificacin con detergentes. Ejemplo: Gripe.

Fracciones bacterianas:

Fraccionamiento con disolventes orgnicos o purificacin con detergentes. Ejemplo: Tos ferina.

Polisacridos capsulares:

Purificacin de polisacridos de bacterias encapsuladas. Ejemplo: Enfermedad neumoccica ymeningoccica.

Polisacridos capsulares conjugados con protenas:

Purificacin de polisacridos de bacterias encapsuladas, conjugados con protenas antignicas.Ejemplo: Enfermedad neumoccica, meningoccica, H. influenzae tipo b.

3.3. Vacunas de subunidades

Las vacunas de subunidades son aquellas quecontienen un preparado de subunidadesantignicas que pueden ser de distinta naturaleza,lipopolisacridos, extractos ribosmicos, oprotenas purificadas o sintetizadas qumicamente.Estas vacunas se suelen emplear cuando han sidoaislados los componentes responsables de lapatogenicidad de agente infeccioso, ya que deesta forma se evita el riesgo de desencadenar laenfermedad tras la vacunacin.

Aunque la mayora de las vacunas actualesconsisten en las vacunas clsicas mencionadasanteriormente, las investigaciones que se llevan acabo actualmente apuestan por vacunas msseguras y capaces de desencadenar una respuestainmune eficaz y duradera. Los avances en biologamolecular y en concreto el desarrollo de latecnologa del ADN recombinante, han permitidoel diseo de nuevas vacunas capaces de ofrecerestas caractersticas.

Hasta hace pocos aos, la sntesis qumica delantgeno y el aislamiento de la protena antignicaa partir de su fuente natural eran los nicosmtodos disponibles para la obtencin decomponentes inmunizantes en las vacunas. Lasntesis qumica slo es aplicable cuando la protenade inters es muy pequea o poco compleja, yaque este mtodo supone un elevado coste deproduccin. Las metodologas de purificacin deprotena a partir de su fuente natural se encuentrana menudo con el problema de que el rendimientode la extraccin es muy bajo9.

16

4. Nuevas vacunas

Nuevas vacunas

Vacunas atenuadas mediante modificacin gentica:

Patgenos modificados genticamente de manera que sus genes relacionados con la patogenia seencuentren mutados, o bien que posean antgenos modificados que desencadenen la respuestainmune protectora (en desarrollo).

Vacunas de pptidos sintticos:

Copia de la secuencia aminoacdica de las protenas antignicas procedentes de patgenos.Ejemplo: Malaria.

Vacunas anti-idiotipo:

Anticuerpos que reproducen la morfologa del antgeno, induciendo inmunidad. Ejemplo: Malaria.

Vacunas de protenas y pptidos recombinantes:

Produccin de grandes cantidades de la protena por medio de la insercin de ADN en sistemas deexpresin (bacterias y plantas).

Expresin en plantas: en desarrollo.

Expresin en bacterias: Ejemplo: Hepatitis B.

Vacunas gnicas:

Administracin de material gentico procedente del patgeno.

Vectores vricos y bacterianos vivos (en desarrollo).

Vacunas de ADN desnudo (en desarrollo).

Vacunas comestibles:

Produccin de protenas antignicas en plantas comestibles (en desarrollo).

9 ADN recombinante. Amgen S.A. http://biotec.amgen.es/cgi-bin/wdbcgi.exe/amgen/pak_biotec.muestradoc?p_item=8

La tecnologa del ADN recombinante permite el aislamiento de un gen de un organismo para introducirlo enotro. Esta tecnologa se emplea como herramienta para la introduccin de ADN procedente de patgenos en elinterior de bacterias, virus, o plantas, en las vacunas de nueva generacin. Estos organismos pueden utilizarsecomo fbricas de produccin de grandes cantidades de protena antignica para su uso como vacuna.

4.1. Vacunas atenuadasmediante modificacingentica

La tecnologa de la gentica reversa10 ha

permitido el desarrollo de vacunas recombinantes

mediante la identificacin en el genoma de zonas

relacionadas con fenotipos virulentos y mutantes.

De esta forma se han desarrollado virus y

bacterias modificados genticamente de manera

que sus genes relacionados con la patogenia se

encuentren delecionados o modificados. Aunque

las tcnicas de ingeniera gentica son las mismas

para la modificacin de virus y de bacterias, la

modificacin de estas ltimas es ms compleja

debido al gran tamao de su genoma. Las vacunas

atenuadas mediante modificacin gentica se

encuentran actualmente en fase experimental.

17


1. Aislamientodel fragmentode ADN del patgeno (gen)

2. Secuenciacin y expresin de partedel ADN del patgeno, y posteriorcaracterizacin de las propiedadespatognicas de la protena

3. Diseo de un patgeno sin el fragmento de ADNresponsable de la patogenia

Figura 2. Vacunas atenuadas mediante modificacin gentica (Fuente: elaboracin propia).

Figura 3. Vacunas sintticas (Fuente: elaboracin propia).

4.2. Vacunas sintticas

Las vacunas sintticas consisten en la copia de la

secuencia genotpica que contiene informacin

acerca de las protenas antignicas procedentes

de patgenos, y su posterior sntesis por medio de

mtodos qumicos. Las protenas bacterianas o

virales con capacidad antignica presentan

mltiples fragmentos (eptopos) que determinan

su especificidad y actividad, pero slo un nmerolimitado de ellos est relacionado con unarespuesta protectora eficaz. Mediante ingenieragentica y la utilizacin de anticuerposmonoclonales11, es posible identificar fragmentoscon capacidad inmunolgica y posteriormentesintetizarlos qumicamente, hacindoles queadopten una configuracin espacial adecuada(mimotopos) para poder ser reconocidos por elsistema inmunolgico del individuo.

10 Gentica reversa: empleo de herramientas de gentica para identificar genes y sus funciones a partir de la seleccin demutaciones. Una vez caracterizado el gen de inters, se pueden emplear tcnicas de ADN recombinante para desarrollarnuevas vacunas.

11 Anticuerpos monoclonales: anticuerpos producidos en laboratorio especficamente dirigidos contra un tipo de antgeno.Permiten identificar fcilmente el tipo de microorganismo que afecta a un enfermo.

1. Aislamiento del fragmento de ADNdel patgeno

2. Secuenciacindel fragmento de ADNdel patgeno

3. Sntesis qumicadel pptido

La sntesis o produccin de pptidos complejos es una estrategia que permite aumentar la inmunogenicidadde fracciones proteicas antignicas, que ha sido empleada con la malaria12 y el pptido gp120 del virus delsida13. Aunque se ha avanzado mucho en la qumica de las protenas, la principal desventaja de esta tcnicaconsiste en los pptidos sintetizados poseen una configuracin estructural lineal en el espacio, caractersticaque raramente se da en los pptidos que estn presentes en la naturaleza. Los anticuerpos suelen reconocerestructuras tridimensionales y tienen menor avidez por estructuras lineales. Por este motivo, lascaractersticas antignicas de los pptidos sintetizados qumicamente pueden no ser las mismas que losantgenos naturales, resultando en una prdida de actividad de la vacuna.

18

4.3. Vacunas anti-idiotipo

La idea bsica de las vacunas anti-idiotpicas es la

de utilizar en lugar de un antgeno, un anticuerpo

que reproduzca la morfologa del antgeno y que

por lo tanto induzca inmunidad, pero que sea de

por s inocuo. Para producir una vacuna de este

tipo el primer paso es obtener un anticuerpo

contra el antgeno. Este anticuerpo denominado

anticuerpo idiotpico, se inyecta en un animal que

responde produciendo anticuerpos contra l, los

anticuerpos anti-idiotpicos. Este ltimo anticuerpo

puede actuar como vacuna puesto que contiene

un determinante antignico similar al del antgeno

original.

Este tipo de vacunas confiere inmunidad adquirida

de tipo pasivo, ya que se administran anticuerpos

en vez de antgenos procedentes del patgeno.

Las vacunas que se han comentado hasta el

momento proporcionan una inmunidad de tipo

activo ya que son los antgenos del propio

patgeno los que desencadenan la respuesta

inmune protectora14.

12 Tam, J. P., et al. (1990). Incorporation of T and B epitopes of the circumsporozoite protein in a chemically definedsynthetic vaccine against malaria. J Exp Med. 171:299-306.

13 Wang, C. Y., et al. (1991). Long-term high-titer neutralizing activity induced by octomeric synthetic HIV-1 antigen.Science 254:285-8.

14 McCarthy, H., et al. (2003). Anti-idiotype vaccines. Review. Br J Haematol. Dec; 123(5):770-81.

Bacteria patgenaAntgeno

Anticuerpo

Anti-anticuerpo

1. Antgeno bacteriano 2. Produccin de anticuerpoidiotpico

3. Produccin de anticuerpoanti-idiotpico

Figura 4. Vacunas de anticuerpos anti-idiotpicos (Fuente: elaboracin propia).

19


ORGANISMO ANTICUERPO IDIOTPICO HUSPED

Streptococcus pneumoniae Monoclonal

Monoclonal

Policlonal

Policlonal

Policlonal

Monoclonal

Policlonal Monoclonal

Monoclonal

Policlonal Monoclonal

Policlonal

Escherichia coli

Listeria monocytogenes

Trypanosoma rhodesiense

Trypanosoma cruzi

Schistosoma mansoni

Hepatitis B

Poliovirus tipo II

Rabia

Herpes simplex

Ratn

Ratn

Ratn

Ratn

Conejo

Rata

Conejo, Ratn

Ratn

Conejo, Ratn

Conejo

MODELOS EXPERIMENTALES EN VACUNAS IDIOTPICAS

Tabla 1. Modelos experimentales en vacunas idiotpicas [Fuente: Tregnaghi, Miguel (2002) Presente y futuro de lasvacunas. Arch. argent. pediatr. 100(1)].

Las vacunas anti-idiotpicas son de utilidad en casos en los que el agente patgeno sufre un gran nmero demutaciones, como el caso del virus de la gripe, por lo que resulta extraordinariamente difcil encontrar unavacuna eficaz frente a la infeccin. Sin embargo, estas vacunas presentan grandes limitaciones debidofundamentalmente a su carcter experimental, y a que suponen un tipo de inmunoterapia pasiva querequiere la administracin de frecuentes dosis.

4.4. Vacunas de protenasy pptidos recombinantes

La tecnologa del ADN recombinante permite aislar determinados genes que llevan la informacin para lasprotenas que se encuentran en la superficie del patgeno contra el que queremos obtener una vacuna. Elgen en cuestin se introduce en bacterias, levaduras, u otras clulas, donde se producen grandes cantidadesde la protena antignica. A continuacin esta protena es purificada y utilizada directamente como vacuna.

20

1. Identificacin de la protenade intersinmunolgico.

2. Aislamiento del fragmento de ADN que codifica la protena.

3. Insercin del fragmentode ADN en un plsmido.

4. Introduccin del plsmidoen un vector de expresin(ej. bacteria)

5. Seleccin de vectoresde expresin que hanincorporado el fragmentode ADN y expresanla protena antignica.

Figura 5. Vacunas de pptidos recombinantes (Fuente: elaboracin propia).

15 Vector de expresin: sistema biolgico que permite la transferencia, la expresin y la replicacin de un ADN extrao enclulas husped, para que este sea traducido a protenas.

16 Eucariota: clula con ncleo que alberga el material gentico a diferencia de las clulas procariotas, sin ncleo. Soneucariotas todas las clulas animales y vegetales. Las modificaciones de protenas que tienen lugar en estas clulas sedenominan modificaciones postraduccionales, como por ejemplo la glicosilacin.

17 Ma, J. K-C., et al. (2003). The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nature Reviews GeneticsOctober, Vol 4 No 10.

Los sistemas biolgicos como las bacterias,levaduras o plantas, que se emplean paraexpresar los antgenos, se denominan vectoresde expresin15. Los microorganismos empleadoscon mayor frecuencia en la produccin deantgenos recombinantes son las bacterias,especialmente E. coli, aunque tambin es posiblela produccin de protenas recombinantes enlevaduras y plantas. Aunque las primeraspresentan menor complejidad ya que su genomaes muy sencillo y crecen rpidamente, no soncapaces de llevar a cabo algunas de lasmodificaciones necesarias para que las protenassean activas, transformaciones que por el

contrario s realizan las clulas eucariotas16. En elcaso de las levaduras, si bien son capaces derealizar dichas modificaciones, no crecen tanrpido y presentan mayores complicaciones demanejo, elevando los costes de produccin de lasprotenas recombinantes. Las plantas sonsistemas de produccin de muy bajo coste, y conuna alta capacidad de escalado, adems depermitir ciertas modificaciones en las protenas17.Las vacunas recombinantes que se estndesarrollando en estos momentos empleanplantas y bacterias como sistemas biolgicos deproduccin, que a continuacin se describen conmayor detalle.

Produccin de protenas antignicasrecombinantes en bacterias

Existe una amplia variedad de bacteriaspotencialmente tiles para poder ser empleadascomo vectores. El material gentico que contieneinformacin acerca del antgeno se introduce enlas bacterias mediante plsmidos18. Estos soncapaces de permanecer en el interior de labacteria o vector de expresin, y expresarposteriormente el antgeno.

Mediante las modernas tecnologas de ADNrecombinante se han obtenido numerososantgenos inmunizantes por recombinacingentica. La vacuna recombinante contra lahepatitis B es una de las primeras vacunasdesarrolladas por medio de esta tcnica.Recientemente se ha conseguido desarrollarvacunas recombinantes para varias patologascomo la enfermedad de Lyme. Otrasenfermedades que actualmente poseen vacunascompuestas de protenas recombinantes son latos ferina y el clera19.

Produccin de protenas antignicasrecombinantes en plantas

La tecnologa del ADN recombinante se puedeemplear para introducir en el genoma deplantas el gen que codifica una protena deinters para su uso como antgeno en vacunas,y conseguir que la protena se exprese endichas plantas.

La mayora de las protenas recombinantes deplantas empleadas en vacunas se obtienenmediante la tecnologa de transgnesis. La

produccin de protenas recombinantes en

plantas ofrece muchas ventajas potenciales

para generar compuestos farmacuticos de

importancia en medicina clnica, frente a los

mtodos empleados hasta la fecha, que

consistan en la produccin microbiana

mediante biorreactores. Las principales ventajas

de la produccin de antgenos recombinantes en

plantas son una mayor eficacia frente a los

sistemas clsicos de produccin mediante

microorganismos, la facilidad de cultivo de las

plantas como sistemas de expresin de

protenas, y la posibilidad de dirigir la expresin

del antgeno en ciertas partes de la planta,

facilitando la purificacin del mismo.

Actualmente existen tres vacunas que han

comenzado recientemente la fase I de los ensayos

clnicos, la vacuna contra la Enteritis por E. coli,

vacuna contra infecciones causadas por el virus

Norwalk, ambas expresadas en patatas, y la vacuna

contra el virus de la Hepatitis B expresada en la

planta del tabaco. Las tres vacunas han sido

desarrolladas por la misma institucin dependiente

del sistema de salud estadounidense20. Adems de

estas vacunas ya en fase clnica, existen numerosos

ejemplos de antgenos recombinantes producidos

en plantas. Aunque este informe se centra en las

vacunas destinadas a enfermedades humanas,

vacunas contra ciertas patologas propias de

animales, como la Encefalopata Espongiforme

Bovina o la Enfermedad Hemorrgica de los

Conejos en animales de granja, y el Parvovirus

canino en animales domsticos, tambin persiguen

estrategias basadas en la produccin de antgenos

recombinantes en plantas21.

21


Estrategias de introduccin del material gentico forneo en el genoma de la planta:

Transgnesis en plantas: integracin de forma estable en el genoma de la planta, en el que quedaestablecido de forma permanente y es heredado por la siguiente generacin de plantas.

Transferencia de genes por virus que infectan a las plantas: el gen se introduce en la plantamediante uno de los virus que infectan a las plantas, y es expresado en su interior de formatransitoria sin integrar su material gentico en el genoma. La expresin de la protena inmunizanteslo ocurre mientras dure la infeccin y no es heredada por la generacin siguiente.

18 Plsmidos: molculas de ADN circular que se emplean como vehculo transportador de genes procedentes de otrosorganismos, con el objeto de conseguir su expresin en las clulas donde se introduce.

19 Salleras, L. (2002). Tecnologas de produccin de vacunas I: vacunas vivas atenuadas. Vacunas; 3:29-33.20 National Institutes of Health (NIH) http://www.nih.gov21 Ma, J. K-C., et al. (2003). The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nature Reviews Genetics

October, Vol 4 No 10.

22

APLICACIN ANTGENOPLANTA O SISTEMA

DE PRODUCCIN

E. coli enterotoxignica

Clera

Hepatitis B

Hepatitis C

Virus Norwalk

Rotavirus

Sarampin

VIH tipo I

Citomegalovirus

Rhinovirus tipo 14

Virus Sincitial Respiratorio

Staphylococcus aureus

Pseudomonas auruginosa

Malaria

Virus del papilomahumano tipo 16

Linfoma de las clulas B

Bacillus anthracis

Virus de la rabia

Subunidad B toxina E. coli

Subunidad B toxina del clera

Antgeno de superficie

Antgeno de superficiey subunidad B toxina del clera

Protena de la cpside


Protena hemaglutinina

Pptido gp41

Pptido de la regin V3 de lagp120

Protena p24 de la nucleocpsida

Glicoprotena B

Pptido de la protena VP1

Pptidos de la protena G

Protena de fusin

Pptido D2 de la protena FnBP

Pptidos de la protena F

Pptidos de la protena delcircunsporozoito

Oncoprotena E7

Fragmento FV de inmunoglobina

Antgeno protector

Glicoprotena

Pptidos de glicoprotenay nucleoprotena

Tabaco, patata, maiz

Patata, tabaco

Patata, tabaco, lechuga, altramuz

Virus del mosaico del tabaco(tabaco)

Tabaco, patata

Patata

Tabaco

Virus del mosaico del frijol(hojas del frijol)

Virus de la patata (tabaco)

Virus del Enanismo Ramificado delTomate (hojas de tomate)

Virus del mosaico de la alfalfa (tabaco)


Semillas del tabaco

Virus del mosaico del frijol (hojasdel frijol)

Virus del mosaico de la alfalfa (tabaco)

Tomate



Virus del mosaico del tabaco (tabaco)




Tabaco

Tomate (hoja y fruto)

Virus del mosaico del tabaco y de laalfalfa (tabaco y espinaca)

PROTENAS ANTIGNICAS RECOMBINANTES EN PLANTAS ACTUALMENTE EN DESARROLLO

Tabla 2. Protenas antignicas recombinantes en plantas actualmente en desarrollo (Fuente: Streatfield, S. J.; Howard, J. A. (2003). Plant-based vaccines. International Journal for Parasitology 33, 479-493).

Produccin de anticuerpos en plantastransgnicas

Adems de permitir la produccin de protenas

antignicas, las plantas han demostrado ser

sistemas verstiles de produccin para muchas

formas de anticuerpos, principalmente los

llamados IgG e IgA. A los anticuerpos

recombinantes producidos en plantas se les

denomina generalmente planticuerpos, y

tienen aplicaciones directas en la produccin de

vacunas humanas22. La mayora de los

planticuerpos se expresan en plantas que

pueden ser cosechadas varias veces al ao,

como el tabaco, las patatas, la soja, alfalfa,

arroz y trigo.

La desventaja ms destacada de la utilizacin

de plantas transgnicas para la produccin de

anticuerpos radica en el proceso de purificacin

de la protena, que puede encarecer el proceso

de produccin. Por otra parte, los anticuerpos

pueden no tener capacidad inmunognica si en

su estado natural sufren modificaciones que de

forma natural se producen en las clulas

eucariotas. La posible actividad alergnica de

los anticuerpos producidos en plantas para los

seres humanos es otro de los problemas que se

estn estudiando actualmente.

Aunque existen numerosos ejemplos de

planticuerpos producidos en plantas e incluso

en algas, tan slo uno de ellos, producido en la

planta del tabaco, ha demostrado su eficacia en

seres humanos23.

4.5. Vacunas gnicas

La principal caracterstica de las vacunas gnicas

es que el antgeno inmunizante no se administra

directamente en el paciente a vacunar, sino el gen

que lo codifica, el cual dirige la sntesis de este

antgeno por parte de las clulas del husped. El

antgeno sintetizado desencadena, a su vez, la

correspondiente respuesta inmunitaria, que es de

tipo humoral y celular igual que en las vacunas

vivas atenuadas.

Los primeros estudios relativos a la transferencia

de material gentico como mtodo teraputico

tuvieron lugar a comienzos de los aos 9024. Pocos

aos despus, comenzaron los estudios con

vacunas gnicas contra el virus del SIDA y

hepatitis B en ratones25. Los primeros estudios en

humanos se publicaron en el ao 1998 por

diferentes autores26. Desde entonces, las

publicaciones en vacunas gnicas se han

multiplicado exponencialmente.

23


22 Gmez Lim, M. A. (2001). Produccin de vacunas y compuestos farmacuticos en plantas transgnicas. Avance yperspectiva. Vol 20, 365-375.

23 Planticuerpo quimrico de IgG/IgA, que provoca una respuesta inmune contra un antgeno superficial de Streptococcusmutans, el agente causal de la caries dental.

24 Wolff, J.A, et al. (1990). Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science 247:1465-1468.Tang, D., et al. (1992) Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature 356: 152-154Ulmer, J. B., et al. (1993). Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. Science 259:1745-1749.Fynan, E. F., et al. (1993). DNA vaccines: protective immunization by parenteral, mucosal, and gene gun inoculations. Proc Natl.Robinson, H. L., et al. (1993). Protection against a lethal influenza virus challenge by immunization with a hemagglutinin-expressing plasmid DNA. Vaccine 11:957-960.Wang, B., et al. (1993). Gene inoculation generates immune responses against human immunodeficiency virus type 1.Proc Natl Acad Sci USA 90:4156-4160.Davis, H. L., et al. (1993). DNA based immunization for hepatitis B induces continuous secretion of antigen and highlevels of circulating antibody. Hum Mol Genet 2: 1847-1851.

25 Wang, B., et al. (1993). Gene inoculation generates immune responses against human immunodeficiency virus type 1.Proc Natl Acad Sci USA 90:4156-4160.Davis, H. L., et al. (1993). DNA based immunization for hepatitis B induces continuous secretion of antigen and highlevels of circulating antibody. Hum Mol Genet 2: 1847-1851.

26 Calarota, S., et al. (1998). Cellular cytotoxic response induced by DNA vaccination in HIV-infected patients. Lancet351:1320-1325.MacGregor, R. R., et al. (1998). First human trial of a DNA-based vaccine for treatment of human immunodeficiency virustype 1 infection: safety and host response. J Infect Dis 178:92-100.Ugen, K. E., et al. (1998). DNA vaccination of HIV-1 expressing constructs elicits immune responses in humans. Vaccine16:1818-1821.Wang, R., et al. (1998). Induction of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes in humans by a malaria DNA vaccine.Science 282: 476-480.

Insercin o clonaje de genes de intersen vectores vivos

Entre las estrategias que se estn estudiandocon vistas al desarrollo de nuevas vacunas, eluso de vectores vivos es una de las msdestacadas. Un vector vivo se puede definircomo un microorganismo atenuado que puedeser portador de la informacin gentica de unagente infeccioso. Dicha informacin setranscribe, se traduce y se presenta al sistemainmunolgico como una protena.

Aunque numerosos microorganismos han sidopropuestos como posibles vectores vivos envacunas, tales como virus y bacterias deprcticamente todas las familias, lasinvestigaciones actuales se centran en ciertasfamilias que renen las caractersticas adecuadaspara portar la informacin gentica e inducir larespuesta inmune de forma adecuada.

Una de las principales ventajas de las vacunas de tipo gnico es la posibilidad de administrar varios antgenosa la vez, por medio de secuencias que determinan ms de un gen antignico. Las vacunas gnicas sin embargono poseen por el momento la capacidad de generar respuestas humorales tan intensas como las de lasvacunas clsicas inactivadas y nuevas vacunas a partir de protenas inmunizantes obtenidas por recombinacingentica. Otro de los problemas por resolver se centra en la posibilidad de inducir respuestas inmunitariasfrente al ADN y la aparicin de autoinmunidad debido a la expresin continuada del antgeno. Por otra parte, latransfeccin in vivo de clulas es todava un proceso ineficiente, ya que las clulas que capturan y expresan laprotena codificada en el plsmido con mayor eficiencia son las clulas musculares, que son un tipo celular queen condiciones normales no participa en la generacin de respuesta inmune. Sin embargo, las ltimasinvestigaciones en vacunas gnicas sealan que las clulas musculares son capaces de transferir de algunaforma el antgeno a clulas responsables de la estimulacin de la respuesta inmune27.

Para conseguir la expresin de un gen en otro organismo es necesario recurrir a una serie de vehculosbiolgicos llamados vectores. El desarrollo de nuevas vacunas basadas en los avances en la tecnologa delADN recombinante est directamente relacionado con el descubrimiento y perfeccionamiento de estosvectores.

24

27 Gregersen, J-P (2001). DNA vaccines. Naturwissenschaften 88:504-513.

Tipos de vacunas gnicas

Insercin o clonaje de genes de inters en vectores vivos: bacterias o virus atenuadosportadores de los genes que codifican para los antgenos inmunizantes de los microorganismosfrente a los que se quiere proteger al sujeto vacunado. Los genes en cuestin se insertan en elgenoma del virus o bacteria portadora mediante tcnicas de recombinacin gentica.

Vacunas de ADN desnudo: ADN no recubierto de ninguna formulacin qumica, envuelta viral, u otro tipo de estructura. El material gentico se introduce en vehculos transportadores biolgicosllamados plsmidos.

25


BACTERIAS VIRUS

Salmonella spp Vaccinia (virus de la vacuna de la viruela)

Poxvirus aviares (Canarypox)

Picornavirus

Varicela-zoster

Herpesvirus

Influenza

Adenovirus

Virus hepatitis B

Flavivirus

Bacilo Calmette-Gurin (BCG)

Bacillus

E. coli

Listeria

MICROORGANISMOS UTILIZADOS EN VACUNAS DE VECTORES

Tabla 3. Microorganismos utilizados en vacunas de vectores (Fuente: Tregnaghi, M. (2002) Presente y futuro de lasvacunas. Arch. argent. pediatr., 100(1). Plotkin, S.A. (2002) Vacunas en el Siglo XXI. Vacunas 3:18-28).

La eleccin del tipo de vector vivo empleado en vacunas gnicas depender en gran medida del tamaode su genoma, de la capacidad replicativa, estabilidad gentica y la patogenicidad del vectorrecombinante28.

Vacunas de vectores virales

Los virus son organismos especializados eninsertar su material gentico en clulas, utilizandola maquinaria de stas para multiplicarse. Losvirus vacunales permiten la insercin de variosgenes en su propio genoma, por lo que seraninstrumentos ideales para la vacunacin de ampliorango de microorganismos infecciosos en una solavacuna.

El principal inconveniente de las vacunasformadas a partir de virus vacunales, y engeneral vectores vivos, es que lainmunogenidad del vector recombinante estrelacionada con su capacidad de replicarsedentro del organismo, y por esta razn losvectores ms inmunizantes son aquellos queposeen un mayor potencial patognico. Unsegundo inconveniente es que la respuestainmune generada frente al vector puedeneutralizarlo, con lo que disminuye su capacidadde generacin de protenas recombinantes. Esta

situacin se produce especialmente cuando seutiliza como vector el virus Vaccinia, ya queaquellos sujetos vacunados contra la viruelamantienen una memoria inmune tan potentefrente a este virus que frenan su replicacin eimpiden una correcta expresin de las protenasdel patgeno que constituyen la base de lainmunizacin frente al mismo. Un problemasimilar puede plantearse cuando se utilizancomo vectores virus con una alta incidencia deinfeccin como son los Adenovirus. Por todo elloninguna vacuna de este tipo se hacomercializado hasta el momento para uso enhumanos, aunque existen numerosas vacunasde vectores virales en desarrollo queactualmente se encuentran en distintas fasesclnicas (ver Anexo I), lo que hace suponer queesta situacin cambiar en un futuro.

Uno de los virus vacunales ms estudiados en la

actualidad es un virus propio de aves llamado

poxvirus canario. Este virus es incapaz de

multiplicarse completamente en las clulas de

28 Salleras, L. (2002). Tecnologas de produccin de vacunas (III). Vacunas gnicas. Vacunas; 3:145-9.

los mamferos, pero tiene capacidad de iniciaruna respuesta inmunitaria protectora frente alos antgenos inmunizantes expresados. Estevirus se ha utilizado con xito como vector devacunas experimentales frente al VIH-1, larabia, la encefalitis japonesa, el sarampin y elcitomegalovirus.

Otro de los vectores vricos empleados con msfrecuencia en vacunas gnicas es el virus de laviruela, al que se han insertado los genes quecodifican las protenas inmunizantes de los virusde la hepatitis B, gripe, encefalitis japonesa,

herpes simple, rabia, VIH y Mycobacteriumtuberculosis. Los adenovirus tambin se hanutilizado como vectores vivos de genes, en elcaso de enfermedades infecciosas respiratoriasen las que es esencial conseguir una buenarespuesta inmune en las mucosas, que son la vade acceso al organismo de la mayora de lospatgenos. Los alfavirus como vectores tambinhan sido utilizados en algunas vacunasexperimentales frente al sida y los herpes virus29.

Una alternativa al uso de virus atenuados oprocedentes de especies distintas a la humana,es la utilizacin de vacunas de partculassimilares a virus o VLPs30, tambin conocidascomo pseudoviriones. Estas vacunas se basanen la capacidad intrnseca de las protenas de lacpside o cubierta externa de los virus paraautoensamblarse. Los pseudoviriones seasemejan a virus reales desde el punto de vistade su estructura y de su morfologa, pero con laventaja de que no contienen ADN viral, por loque no son infecciosos31.

Las VLPs se emplean como vacunas ya quetienen la capacidad de inducir anticuerpos aunsin el uso de adyuvantes. Otra de las ventajasde este tipo de vacunas consiste en laactivacin de la respuesta T celular. Lasdesventajas de este tipo de vacuna incluyen larestriccin por especie, por lo que en ciertoscasos no es posible realizar ensayos de vacunashumanas mediante la experimentacin conmodelos animales. Las desventajas de este tipode vacuna incluyen su alto coste de producciny el desconocimiento actual acerca de su poderinmunognico a largo plazo.

Este tipo de vacunas se est estudiando en laactualidad como terapia preventiva enenfermedades provocadas por calcivirus,rotavirus, y cncer cervical por virus delpapiloma humano (ver anexo I).

Vacunas de vectores bacterianos

Uno de los principales atractivos de los vectoresbacterianos es su potencial para seradministrados oralmente, adems de permitir lainduccin de respuesta inmune mucosa,esencial en aquellas enfermedades producidaspor patgenos cuya va de entrada al organismoson las mucosas. Sin embargo, la posiblereversin hacia la patogenicidad, junto con lainmunidad preexistente, son unos de losprincipales escollos.

Entre los vectores bacterianos cabe mencionarel Bacilo Calmette-Gurin (BCG), el cual se haempleado con xito como vector en vacunascontra el VIH y Listeria monocytogenes32.Vectores basados en la bacteria Salmonella seemplean en vacunas que actualmente seencuentran en distintas etapas de ensayosclnicos, en concreto como vacunas contratuberculosis, sarampin y ttanos entre otras(ver Anexo I). Por otro lado, algunas bacteriasintestinales atenuadas como S. typhi, V.cholerae, S. flexneri, se han utilizado tambincomo vectores de genes de las protenasinmunizantes de patgenos intestinales, entreellos E. coli enteropatgeno. La principallimitacin del uso de vectores bacterianos comovectores radica en que resulta difcil mantenerla estabilidad del fragmento de ADN insertado.

Vacunas de ADN desnudo

Los plsmidos que forman parte de lasvacunas de ADN consisten en molculas de ADNcircular que se encuentran en muchas bacteriasy levaduras, y que se caracterizan porquepueden replicarse independientemente delgenoma de la clula. Contienen genes deresistencia a antibiticos, lo que permitedistinguir las clulas que han incorporado elplsmido, y que por consiguiente son capacesde crecer en un medio con el antibitico.

26

29 Kay, M. A.; Glorioso, J. C.; Naldini, L. (2001). Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents intovehicles of therapeutics. Nature Medicine;7:33-40.

30 VLPs: Virus-Like-Particles o Partculas semejantes a virus.31 Sanclemente, G. (2003). Lo que los clnicos deben saber acerca de las vacunas contra el virus del papiloma humano. Gac

Md Mx Vol. 139 No. 2, 173-183.32 Medina, E.; Guzmn, A. (2001). Use of live bacterial vaccine vectors for antigen delivery: potential and limitations.

Vaccine;19:1573-80.

Los plsmidos que forman parte de las vacunas de ADN contienen un gen codificante para una protena, unpromotor33 generalmente viral, un terminador que permite la expresin del gen en clulas de mamferos, yun gen de resistencia a antibitico que permite la seleccin del plsmido durante su produccin enbacterias. Se suelen aadir genes adicionales que aumentan la potencia de las vacunas de ADN, como songenes codificantes de citoquinas34 o molculas co-estimulatorias, o genes codificantes de replicasas virales,y otras variaciones del plsmido.

27


33 Promotor y teminador: fragmentos de ADN que flanquean a una secuencia codificante, y que sealan el comienzo y el finrespectivamente.

34 Citoquinas: protenas que no son anticuerpos, liberadas por una poblacin celular, y que participan en la respuestainmune.

35 Kwissa. M., et al. (2000). Efficient vaccination by intradermal or intramuscular inoculation of plasmid DNA expressinghepatitis B surface antigen under desmin promotor/enhancer control. Vaccine 18:2337-2344.

Genesde resistenciaa antibiticos

Promotor

Genes antignicos

Genes de citoquinasy molculas co-estimulatorias

Terminador

Figura 6. Representacin esquemtica de una vacuna de ADN (Fuente: elaboracin propia, adaptado de: Review:Gregersen, Jens-Peter (2001). DNA vaccines. Naturwissenschaften. 88:504-513).

Elementos bsicos que forman parte de los plsmidos de vacunas de ADN

Origen de replicacin bacteriano.

Promotor/potenciador de clulas de mamferos: la mayora provienen del gen del citomegalovirushumano o de otros virus. Otro promotor empleado puede ser el promotor de desmina especfico demiocitos35, que permite dirigir la expresin del antgeno hacia los miocitos cardiacos.

Sitio de insercin multiclnico para la insercin de antgenos extraos.

Seal de terminacin de mamferos (poliadenilacin): generalmente procedente de la hormona delcrecimiento bovina o de ciertos virus.

Gen de resistencia a antibiticos para la seleccin del cultivo bacteriano: ampicilina, neomicina okanamicina se emplean generalmente en la seleccin de plsmidos.

Nucletidos GPC: nucletidos no metilados especficos de bacterias, que no estn presentes enclulas eucariotas. Son potentes estimuladores de clulas B y activan las clulas killer y clulasT. Actan como adyuvantes.

Por otra parte, es posible la utilizacin de plsmidos bicistrnicos, es decir, aquellos que contienen dosgenes bajo la regulacin de un nico promotor, e incluso vectores de expresin mltiple, que contienenmltiples genes con promotores y seales de terminacin individuales para cada uno de ellos.

En la actualidad se estn realizando ensayosclnicos de vacunas gnicas con humanos paraenfermedades como el VIH, Virus de la influenza,Tuberculosis, Herpes Simplex Virus tipo 2 ,Malaria, Leishmaniosis, Dengue, Hepatitis A, B, Cy E, Virus del papiloma humano, Melanoma,Enfermedad de Lyme, Leucemia linfoctica crnica,Citomegalovirus, Hantavirus, Tuberculosis,Paracoccidioidomicosis, Rotavirus, y Enfermedadneumoccica (ver Anexo I). Estos ensayosemplean como estrategia para introducir el ADNtanto vectores vivos como vectores plasmdicos.

Pese a que los ensayos previos con animalesdemostraron que las vacunas gnicas eran capacesde inducir respuestas humorales y sobre todocelulares, en los humanos la inmunogenicidad deestas vacunas es bastante menor. Para mejorar lainmunogenicidad se estn perfeccionando una seriede tecnologas tales como el uso de adyuvantes

clsicos o genticos, la combinacin con otrasvacunas, o la modificacin del plsmido en el casode vacunas de ADN desnudo.

Por otro lado, la ruta de aplicacin, dosis, y la posiblereinmunizacin, son factores que influyen en lapotencia y naturaleza de la respuesta inmuneresultante de la administracin de la vacuna gnica.Aunque la mayora de las vacunas de ADN que seencuentran actualmente en ensayos clnicos seadministran mediante inyeccin intramuscular ointradrmica, la tendencia actual apunta haciamtodos de administracin de vacunas alternativos,como el gene-gun o bombardeo de partculas deoro cubiertas de ADN, que permite la incorporacindel ADN en un mayor nmero de clulas de distintotipo. Sin embargo, debido a la capacidad deadsorcin limitada de estas partculas, la cantidad deplsmido que se introduce en las clulas es muylimitada.

28

36 SIE-ODN, tambin conocidas como ISS-ODN (Immunostimulatory OligoDeoxynucleotides).37 Vogel, F. R.; Alving, C. R. (2002). Progress in immunologic adjuvant development: 1998-2002. The Jordan Report. 39-42.

Estrategias seguidas en la mejora de vacunas gnicas

Mejora de la inmunogenicidad del antgeno

Modificacin del ADN plasmdico en vacunas de ADN aumentando sus secuenciasinmunoestimuladoras: al ser de origen bacteriano, el ADN plasmdico contiene motivos CpG,secuencias SIE inmunoestimuladoras de OligoDeoxinucletidos36, los cuales son reconocidos por elsistema inmune humano como extraos, incrementando la respuesta inmune. La adicin de unnmero mayor de estos motivos aumenta por tanto la inmunogenicidad de la vacuna de ADN.

Uso de adyuvantes o potenciadores de la respuesta inmune: en la actualidad se estudian nuevosadyuvantes que proceden de compuestos bacterianos, emulsiones oleicas, surfactantes, polmerosbioadhesivos, partculas biodegradables, citoquinas, liposomas, e incluso la adicin de genescodificantes de citoquinas y otras molculas co-estimulatorias, o bien la coadministracin de estasprotenas37.

Combinacin de ambos tipos de vacunas gnicas: la inmunogenicidad se incrementa en ciertoscasos si a la respuesta primaria de la vacuna de ADN (priming) se aade la respuesta de refuerzo(booster) de vacunas de vectores vivos de genes.

Mejora de la administracin y captura del ADN

Administracin por vas mucosas.

Administracin del plsmido de ADN va electroporacin, por medio de un dispositivo generador decorriente elctrica que crea agujeros temporales en la membrana celular, resultando en unadifusin del ADN ms efectiva.

Administracin epidrmica de partculas de oro cubiertas de ADN: gen gun.

Formulacin de la vacuna en micropartculas de ADN encapsulado, que protegen al ADN de ladegradacin y pueden aumentar la captura por parte de clulas presentadoras de antgeno.

Aunque las principales aplicaciones de las vacunas

gnicas son la prevencin y tratamiento de

enfermedades infecciosas y crnicas, stas poseen

un gran potencial como herramientas de

investigacin. Una de sus aplicaciones reside en el

empleo de libreras de vacunas de ADN para

determinar qu genes codifican posibles antgenos

protectores, sin la necesidad de conocer la

secuencia del gen o la funcin de la

correspondiente protena. Estas libreras de

expresin estn formadas por varios miles de

plsmidos diferentes y representan el genoma

entero del microorganismo, que puede usarse en

estudios de inmunizacin. La vacunacin por

medio de ADN es una herramienta que permite el

cribado de numerosos antgenos y la deteccin de

antgenos inductores de respuesta inmune.

La secuenciacin del genoma de organismos

patgenos supone por tanto una de las claves en

la identificacin de nuevos antgenos y sus

secuencias codificantes. En la actualidad existen

numerosas iniciativas que se centran en la

secuenciacin de virus y bacterias

principalmente38.

29


38 Instituto Pasteur http://www.pasteur.com L. monocytogenes, L. innocua, L.a ivanovii, L. pneumophila, S. agalactiae, P.luminescens, S. flexneri, Y.a pestis, N. meningitidis.NIAID, NIH http://www.niaid.nih.gov S. pyogenes, N. gonorreae.The Institute Genome Research (TIGR) http://www.tigr.org S. pneumoniae, B. burgdorferi, C. pneumoniae, H.influenzae, T. pallidum, V. cholerae, H. pylori, C. diphteriae, B. anthracis, M. tuberculosis, N. meningitidis.Lilly http://www.lilly.com S. pneumoniae.Nara http://ecoli.aist-nara.ac.jp Osaka University http://genome.gen-info.osaka-u.ac.jp/bacteria/o157 Univ. Wisconsin http://www.genome.wisc.edu Colibri http://genolist.pasteur.fr/Colibri The genome center at the University of Wisconsin http://www.genetics.wisc.edu Japanese Consortium; Genome Information Research Center,Osaka Univ. http://www.gen-info.osaka-u.ac.jp/welcome_en.html, Astra Resource Center Boston and GenomesTherapeutics http://scriabin.astrazeneca-boston.com/hpylori E. coli.ZMBH, Heidelberg http://www.zmbh.uni-heidelberg.de M. pneumoniae.PhatoGenesis Corp. http://www.pseudomonas.com/whos_involved.html P. aeruginosa.NITE http://www.bio.nite.go.jp/ngac/e-home/index-e.html C. eficiens.Sanger Institute http://www.sanger.ac.uk Salmonella tiphy, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae,Bordetella pertusis, Yersinia pestis, Campylobacter jejuni, Neisseria meningitidis.University of Uppsala http://www.uu.se Rickettsia prowazekii.CHGC Shangai http://www.chgc.org.cn/gn Leptospira interrogans.Genome Sequencin Center http://www.genome.wustl.edu/gsc Klebsiella pneumoniae.Goettingen http://www.g2l.bio.uni-goettingen.de Clostridium tetani.University of Glasgow http://www.gla.ac.uk Virus Herpes Simplex (HSV-1, HSV-2).Univ. Canada y U.S. Centers for Disease Control and Prevention http://www.cdc.gov Sndrome respiratorio agudo severo (SARS).

30

39 Walmsley, A. M.; Arntzen, C. J. (2003). Plant cell factories and mucosal vaccines. Curr Opin Biotechnol. Apr; 14(2):145-50.40 Mason, S. H., et al. (2002). Edible plant vaccines: applications for prophylactic and therapeutic molecular medicine.

Trends Mol Med 8:324-329.

4.6. Vacunas comestibles

Las vacunas comestibles consisten en plantas a las cuales se les ha introducido, por medio de tcnicas deingeniera gentica, un gen que conlleva la informacin necesaria para producir en su interior una protenaantignica. Estas plantas transgnicas se pueden por tanto cultivar de manera natural y ms adelante usarel tejido vegetal como vacunas comestibles en seres humanos o en animales. Las principales ventajas de lasvacunas comestibles radican en que al ser administradas de forma oral, desencadenan una respuestainmunitaria mucosa.

2. Aislamiento del fragmentode ADN que codifica la protena.

1. Identificacin de la protena de inters inmunolgico.

3. Insercin del fragmento de ADN en un plsmidoque hace de vector de transferencia.

5. Cultivo de vectores de expresin y clulasvegetales.

4. Introduccin del plsmidoen un vector de expresin(ej. bacteria).

6. Cultivo de la plantamodificadagenticamente.

Figura 7. Produccin de vacunas comestibles en plantas transgnicas (Fuente: elaboracin propia).

El principal problema tcnico que poseen estas

vacunas orales es la degradacin que sufren los

antgenos en el estmago e intestino antes de que

puedan inducir una respuesta inmune. Este es el

principal motivo por el cual las vacunas comestibles

tan slo podran emplearse en alimentos que puedan

ser consumidos en su forma fresca, como la patata,

el tabaco, tomate, lechuga o maz. Por otra parte,

estos alimentos deben contener gran cantidad del

antgeno en su forma soluble para que la vacunacin

sea efectiva, y no sea necesario consumir grandescantidades de alimento. En la actualidad, se estnrealizando estudios relativos al uso de cultivos defrutas como el pltano y los cereales39.

Las estrategias de mejora de las vacunascomestibles se centran en la tecnologa deexpresin de antgenos en la planta, as como enla proteccin de antgenos frente a la degradacingastrointestinal40.

Las vacunas comestibles no se limitan tan slo a las plantas transgnicas, sino que es posible su desarrolloen animales modificados genticamente para que expresen el antgeno de inters. El primer pez vacunadesarrollado hasta el momento produce en sus tejidos musculares una protena inmunizante contra lahepatitis B y ha de ser comido crudo para evitar la destruccin de las protenas41.

31


41 Nacional University of Singapore, Fish Biology and Aquaculture http://www.dbs.nus.edu.sg/research/Fish%20bio/index.html

AGENTE PATGENO FRENTEAL QUE PROTEGE LA VACUNA

PROTENA INMUNIZANTEEXPRESADA EN LA PLANTA

SISTEMA DE EXPRESIN

E. coli enterotoxignico Subunidad B de la toxinatermolbil (LTB)Intimina

Tabaco

Patata

Maz

Alfalfa

Patata

Tabaco

Patata

Lechuga

TomateGenoprotena

Glicoprotena B


Virus de la rabia

Citomegalovirus

Virus Norwalk

Tabaco

Tabaco

Patata

Subunidad B de la toxina colrica

Protena de superficie de lacubierta del virus

Vibrio cholerae

Virus de la hepatitis B

VACUNAS HUMANAS FORMADAS POR PROTENAS INMUNIZANTESEXPRESADAS EN PLANTAS TRANSGNICAS

Tabla 4. Vacunas formadas por protenas inmunizantes expresadas en plantas transgnicas de aplicacin en humanos(Fuente: adaptado de Salleras, L. Tecnologas de produccin de vacunas II: vacunas intactivadas. Vacunas 3, 78-84; Gmez Lim, M.A. (2001) Produccin de vacunas y compuestos farmacuticos en plantas transgnicas. Avance yperspectiva. Vol 20, 365-375).

32

VENTAJAS DESVENTAJAS

VACUNAS VIVASATENUADAS

VA

CU

NA

S C

LS

ICA

SV

AC

UN

AS

NU

EV

AS

DE A

DN

VACUNASINACTIVADAS

VACUNAS DESUBUNIDADES

VACUNASATENUADASMEDIANTE

MODIFICACINGENTICA

VACUNASSINTTICAS

VACUNASANTI-IDIOTIPO

Alta efectividad.Inmunidad intensa y duradera.Respuesta humoral y celular.No necesitan dosis de recuerdo niadyuvantes.No requieren administracin de grancantidad de patgeno.Bajo coste de produccin.

Estabilidad.Seguridad.Bajo coste de produccin.

Menos efectos secundarios que lasvacunas con microorganismos enteros.Bajo coste de produccin.

Respuesta humoral y celular.No requieren adyuvantes.No requieren administracin de grancantidad de patgeno.

Seguridad.Estabilidad trmica.

No requieren adyuvantes.No requieren administracin depatgeno.

Posible reversin a la virulencia delpatgeno.Variaciones genticas en el caso de losvirus.Baja estabilidad.Difcil produccin.

Inmunidad menos intensa y duradera.Escasa respuesta celular.Requieren dosis de recuerdo.Requieren adyuvantes.Altas dosis para conseguir efectividad.Efectos secundarios

Toxoides: posible reversin a latoxicidad.Polisacridos: sin respuesta humoral.

Riesgos de seguridad.Variaciones genticas en el caso de losvirus.

Caracterizacin del antgenonecesaria.Sin respuesta celular.No tiene formas nativas.

Sin respuesta celular.Respuesta menos duradera.

VACUNASDE PPTIDOS

RECOMBINANTES

Potente respuesta humoral.Efectivas.No hay riesgos de seguridad.

No adquiere configuracin nativa.Escasa respuesta celular.Requieren dosis de recuerdo.Baja estabilidad.Requieren adyuvantes.

VACUNASCOMESTIBLES

INSERCIN OCLONAJE DE GENES

DE INTERS ENVECTORES VIVOS

VACUNAS DE ADN

Seguridad.Fuerte inmunidad en mucosas.Fcil administracin.

Respuesta humoral y celular.

Respuesta humoral y celular.Estabilidad relativa.No hay riesgos de seguridad.Vacunacin neonatal posible.Mltiples antgenos en la mismavacuna.Antgenos de protenas transmembrana.Fcil produccin.

Requiere de altos niveles de expresindel antgeno en el tejido vegetal.

Posible reversin a la virulencia delvector.Resistencia/anticuerpos preexistentes.Requieren dosis de recuerdo.Coste de produccin muy elevado.

Respuesta celular insuficiente.Posibles dosis de recuerdo.Baja eficiencia en la transfeccin in vivo.Respuestas inmunitarias frente alADN, inmunotolerancia yautoinmunidad.Expresin de antgenosinapropiadamente.Respuesta inmune mucosa pobre.Alto coste de produccin.

COMPARACIN DE VACUNAS CLSICAS Y DE UNA NUEVA GENERACIN

Tabla 5. Comparacin de vacunas clsicas y de nueva generacin (Fuente: Elaboracin propia, tomado de: Review:Gregersen. J-P (2001) DNA vaccines. Naturwissenschaften (2001) 88:504-513; Salleras, L. Tecnologas de Produccin deVacunas II: Vacunas inactivadas. Vacunas, 3:78-84).

Los avances de la inmunologa y ms especialmente de la gentica estn abriendo puertas a las nuevastecnologas de desarrollo de vacunas. La tecnologa del ADN recombinante, la gentica reversa y latransgnesis son las principales tecnologas que han permitido estos avances. Los sectores de aplicacin deestas nuevas tecnologas no slo estn relacionados de forma directa con la prctica clnica, ya que lastecnologas empleadas en la producin de anticuerpos recombinantes y la identificacin de nuevos antgenosprotectores son determinantes para el desarrollo de nuevas vacunas.

33


5. Aplicaciones de las vacunas

Enfermedadesinfecciosas.Enfermedadesautoinmunes.Cncer.

Produccin de anticuerpos.Identificacin de antgenos.

CLNICAS TECNOLGICAS

TECNOLOGAS: ADN recombinante,gentica reversa,

transgnesis.

Figura 8. Aplicacin de las vacunas (Fuente: adaptado de: Srivastava IK, Liu MA (2003) Gene Vaccines. Ann Intern Med.;138:550-559).

5.1. Enfermedades infecciosas

Las enfermedades causadas por agentes patgenos se denominan genricamente enfermedades infecciosas.Los virus, las bacterias, parsitos y hongos, son los agentes patgenos causantes de las mismas.

Los virus son capaces de eludir la respuesta inmune gracias a cambios que se producen en las protenas desus cubiertas que les hacen irreconocibles por los anticuerpos. Sin embargo, las protenas internas seencuentran ms conservadas, y aunque los anticuerpos no son capaces de reconocerlas debido a sulocalizacin intracelular, estas protenas s son capaces de estimular la respuesta celular. ste es el motivopor el cual se ha realizado un gran esfuerzo en el desarrollo de vacunas capaces de generar respuestacelular contra eptopos derivados de protenas vricas intracelulares conservadas.

CLASIFICACIN DE VIRUS HUMANOS Y ENFERMEDADES MS FRECUENTES

34

Enfermedades

Herpesvirus

Infecciones entricas

Infecciones respiratorias

Enfermedades transmitidas porvectores animales y zoonosisvricas

Hepatitis vrica

Enfermedades de transmisinsexual

Retrovirus

Infecciones por protozoos yhelmintos

Micosis

Patgenos responsables.

Varicela, Citomegalovirus, Virus Epstein-Barr, Virus herpessimplex. Virus herpes zoster.

Virus: Poliomelitis, Clera, Enterovirus.Bacterias: Disentera bacilar, H. Pylori, fiebre tifoidea.

Virus: Gripe, Rubola, Sarampin, Parotiditis, Varicela,Virus respiratorio sincitial, Virus parainfluenza, Viruela.Bacterias: Strepcocco grupos A y B, C. pneumoniae,Difteria, H. influenzae tipo B, Enfermedad meningoccica,Enfermedad neumoccica, Ttanos, Tos ferina, Tuberculosis,M. neumoniae, P. aeruginosa, M. catarrhalis, Lepra.

Fiebre amarilla, Rabia, Encefalitis japonesa,Encefalitis centroeuropea, Enfermedad de Lyme,Leptospirosis, Peste, ntrax.

Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C.

Virus del papiloma humano, Herpes genital, Sfilis,Gonorrea, Clamidia.

Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH).

Malaria, Esquistomiasis, Leishmaniosis.

Blastomicosis, Candidiasis, Coccidiomicosis,Criptococosis, Histoplasmosis, Paracoccidiomicosis,Pitiosis.

35


5.1.1. Herpesvirus

Existen 8 herpesvirus humanos que estn implicados en una serie de patologas de importancia42, y cuyafrecuencia de incidencia es alta ya que la mayora de la poblacin ha estado en contacto alguna vez conalguno de los virus.

42 Virus herpes simplex tipos 1 y 2 (HSV-1, HSV-2); Virus Epstein-Barr (EBV); Citomegalovirus (HCMV); Virus varicella-zoster (VZV); Herpesvirus humano 6,7,y 8 (HHV-6,HHV-7, HHV-8).

43 Vacunas frente a la varicela disponibles comercialmente:Varilrix de GSK, Biken de Pasteur Mrieux Connaught.44 Vacuna anticlera CVD-103HgR (Berna Biotech, Ltd).45 Toxina B recombinante del clera B (Dukoral, SBL Vaccin AB/Chiron).

HERPESVIRUS ESTRATEGIAS FUTURAS EN VACUNAS *

Varicela.Citomegalovirus.Virus Epstein-Barr.Virus herpes simplex.

Administracin intradrmica.Atenuacin por modificacingentica.Vacunas de subunidadesrecombinantes.Vacunas de vectores vricos.Vacunas de ADN.

La nica vacuna comercializada frente a unherpesvirus contiene cepas atenuadas del virus dela varicela junto con trazas de antibitico, y seadministra por va intradrmica43.

La mayora de los herpesvirus infectan alorganismo por medio de las vas mucosas, por loque es esencial el desarrollo de vacunas quedesencadenen respuestas humorales y celulares,como son las vacunas atenuadas, vacunas devectores vricos y de ADN desnudo.

5.1.2. Infecciones entricas

Las infecciones entricas afectan al intestino ysistema digestivo, y pueden estar causadas tanto porvirus como por bacterias. El clera, la poliomelitis, ylas patologas provocadas por enterovirus sondebidas a infecciones virales, mientras que lashigelosis, el tifus, la gastroenteritis por E. coli, y lalcera por H. pylori, corresponden a infeccionesbacterianas. La gran mayora de estas enfermedadesse encuentran controladas en pases desarrollados,aunque son una causa de mortalidad elevada enpases en desarrollo.

La poliomelitis se considera erradicada enEspaa desde los aos 80. Las dos vacunasantipolio que se emplean actualmente son lavacuna oral VOP con virus vivos atenuados, y lavacuna VIP consistente en poliovirus inactivados

que se administra va intramuscular. Con

frecuencia se administra conjuntamente con otras

vacunas en forma de vacunas combinadas, como

es el caso de la vacuna triple vrica.

El virus Vibrio cholerae es el patgeno

responsable de las infecciones entricas por

clera. La enterotoxina producida por este

virus es una protena que posee dos

subunidades, A y B, siendo la subunidad A la

responsable de la actividad txica. La vacuna

anticlera actualmente utilizada en Espaa y

otros pases europeos consiste en una vacuna

oral compuesta de virus a los que se ha

eliminado el gen que codifica la subunidad A de

la enterotoxina colrica, manteniendo la

subunidad B con capacidad de producir una

respuesta inmunitaria44. En otros pases entre

los que se encuentran Noruega, Suecia y pases

centroamericanos, se comercializa una vacuna

oral compuesta por la toxina B recombinante45.

Los enterovirus son la causa ms comn de

diarrea severa en nios, por lo que despiertan

gran inters a la hora de desarrollar vacunas.

Los principales enterovirus son los rotavirus y

calcivirus, para los que no existe an una

vacuna disponible comercialmente. Para los

primeros, Estados Unidos desarroll hace unos

aos una vacuna de virus reasortados que sin

embargo no produjo los resultados esperados

debido a problemas de seguridad.

* Vase Anexo I

36

INFECCIONES ENTRICAS VIRALES ESTRATEGIAS FUTURAS EN VACUNAS*

CleraAtenuacin por modificacin gentica.Vacunas de subunidades recombinantes.

PoliomelitisEstudio de mecanismos de atenuaciny reversin a la virulencia.

Enterovirus

Virus reasortados.Atenuacin natural.Vacunas de VLPs.Administracin parenteral y oral.Vacunas de ADN.Expresin en plantas transgnicas.

* Vase Anexo I

46 Institute of Child Health and Human Development (NICHD)-NIH, EEUU http://www.nichd.nih.gov47 NIAID-NIH, ProdiGene, Inc.

La bacteria Shigella provoca la disenterabacilar, una enfermedad de distribucinmundial, que actualmente no dispone de vacunacomercial en el mercado. El principal problemacon el que se enfrentan los investigadores es ladificultad de conseguir una atenuacinsuficiente, manteniendo la inmunogenicidad sinque haya el peligro de provocar una infeccin.

Algunas cepas de la bacteria Escherichia colison causantes de graves trastornos delaparato digestivo, en concreto las cepas de E. coli enterotoxignica (ETEC),enterohemorrgica (STEC), y enteropatgena(EPEC). Aunque la incidencia de esta patologano es elevada en pases desarrollados, noocurre lo mismo en pases en vas dedesarrollo, donde estas cepas son endmicas.Las estrategias seguidas para las dos ltimasse basan en la utilizacin de la intimina comoantgeno, una protena implicada en la uninde la bacteria a la pared intestinal46. Esteantgeno es una de las protenasrecombinantes expresadas en plantascomestibles que se encuentran enexperimentacin actualmente, aunque por elmomento su uso est siendo evaluado tanslo para animales de granja. En cuanto a lascepas enterotoxignicas, existen ensayos

clnicos en vacunas comestibles en maz yotras plantas47.

La bacteria H. pylori es una de las principalescausantes de gastritis y lceras duodenales,contribuyendo adems al desarrollo de cnceresestomacales. El diseo de una vacuna preventivaes muy complicado debido a la heterogeneidad deeste patgeno, aunque se est consiguiendo ciertoxito en el desarrollo de vacunas decombinaciones de antgenos conjugados contoxinas modificadas del clera y E. coli, lo que lashace ms inmunognicas, as como laadministracin oral de antgenos recombinantesexpresados por vectores.

La fiebre tifoidea es una enfermedad deincidencia mundial endmica de pases endesarrollo. La enterobacteria Salmonella typhies la causante de esta enfermedad que secaracteriza por una septicemia generalizada. EnEspaa se emplean dos tipos de vacunas queposeen diferentes vas de administracin, lavacuna oral de cepas atenuadas de la bacteria,y la vacuna inyectable inactivada de antgenocapsular Vi. Fuera de Espaa se puedeencontrar otra vacuna formada por clulasenteras inactivadas, que aunque licenciadatiene problemas de tolerancia.

37


INFECCIONES ENTRICAS BACTERIANAS ESTRATEGIAS FUTURAS EN VACUNAS*

Disentera BacilarAtenuacin por modificacin gentica.Vacunas recombinantes conjugadas.

E. coliExpresin de intimina en plantas.Vacunas atenuadas.Vacunas conjugadas.

H. pilory

Fiebre Tifoidea

Vacunas conjugadas con otras toxinas.Vacunas de vectores vricos.Administracin oral y transcutnea.

Vacunas recombinantes.Atenuacin por modificacin gentica.

5.1.3. Infecciones respiratorias

Las infecciones respiratorias son las patologas

ms frecuentes, y por tanto aquellas que

concentran ms inters en la investigacin y

desarrollo de nuevas vacunas. Al igual que las

infecciones entricas, stas pueden estar

causadas por agentes vricos o bacterianos.

En el caso de los virus, dado que su ruta de

infeccin natural es el tracto respiratorio, la

administracin de vacunas atenuadas por medio

de aerosoles est siendo evaluada como posible

alternativa a la administracin por va

intramuscular o intradrmica. Otro de los objetivos

que se persiguen es el diseo de vacunas efectivas

en nios menores de 6 meses, quienes no

responden adecuadamente a las vacunas

convencionales debido a la presencia de

anticuerpos maternales en su organismo. Una de

las principales dificultades en el desarrollo de

estas vacunas radica en la falta de modelos

animales adecuados.

El virus de la gripe es un agente patgeno de

gran importancia debido a su alta incidencia,

llegando a afectar a un 10% de la poblacin

anualmente en pases desarrollados. Las

vacunas contra la gripe disponibles

comercialmente son de dos tipos, vacunas de

virus inactivados que se emplean a escala

mundial, y vacunas de virus atenuados. La

vacuna empleada con ms frecuencia consiste

en una vacuna trivalente inactivada que

contiene las cepas del virus ms probable,

administrada por va intramuscular. Las

necesidades principales a la hora de desarrollarnuevas vacunas frente a cepas del virus de lagripe consisten en mejorar el sistema deproduccin de vacunas y conseguir vacunas quesean efectivas frente a un amplio rango de virusinfluenza. Por otra parte, el principal problemaen el desarrollo de vacunas antigripales es laelevada tasa de mutacin del virus de la gripe,que modifica sus caractersticas de un ao aotro.

El virus de la parotiditis es un Paramyxoviruscausante de la enfermedad de las paperas,cuya incidencia es relativamente frecuente ennios en pases desarrollados como Espaa. Lasvacunas que se comercializan en nuestro pasestn compuestas por virus enteros atenuados,generalmente combinadas con otras vacunas deenfermedades tpicas de la poblacin infantil.

El sarampin, rubola, y parotiditis opaperas son las tres patologas que cubre lavacuna conocida como triple vrica,admnistrada en Espaa desde 1980 en formade vacuna de virus vivos atenuadosadministrada por va subcutnea. En el futurose prev que esta vacuna sea substituida por latetra vrica, que incluir el virus atenuado dela varicela.

El Virus Respiratorio Sincitial (VRS) es elprincipal agente causal de enfermedades devas respiratorias inferiores en menores de 2aos. En la actualidad no existe una vacunacomercial disponible, aunque se estnensayando varios tipos de vacunas que seencuentran en distintas fases clnicas.

* Vase Anexo I

Los Virus Parainfluenza Humanos

resubido vacunas recombinantes

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