produção de proteínas recombinantes. o que são proteínas recombinantes? são proteínas...
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Produção de Proteínas
Recombinantes
O que são proteínas recombinantes?São proteínas produzidas artificialmente a partir de genes
clonados. Isto é, advêm da técnica de DNA recombinante.
Para que servem? A produção de proteínas recombinantes permite obter benefícios
em várias áreas: - saúde; - biologia; - bioquímica; - microbiologia; - genética; - biotecnologia; - agricultura; - etc.
Terapia gênicaPossibilidade de introdução de um gene num organismo e
consequente correção de doenças genéticas.
Melhoramento animal e vegetalPlantas resistentes a pragas e a
diferentes meios nutritivos.Animais de maiores dimensões,
mais férteis e carne com maior qualidade.
Criação de modelos animaisIdeais para o estudo da estrutura, função e regulação de um gene,
além de facilitar a compreensão da fisiopatologia da doença.
Algumas aplicações
www.dqb.fc.ul.pt
Técnica de produção de proteínas recombinantes
• Isolar e preparar o DNA;• Escolher o vetor apropriado;• O fragmento de DNA a clonar é introduzido em vectores de clonagem, formando-se o DNA recombinante.• O DNA recombinante é inserido na célula hospedeira – transformação, que possui mecanismos enzimáticos para a replicação do DNA e para a síntese protéica;• Selecção e identificação de células que incorporam o DNA recombinante;• Verificar se a proteína foi expressa;• Remoção e purificação das proteínas.
The Cell- A Molecular Approach;Cooper, Geoffrey M..
Algumas enzimas envolvidas no processo
Enzimas Função
Tipo II (endonuclease de restrição) Cortam os DNAs em sequências de bases específicas.
DNA ligase Juntam duas moléculas de DNA ou fragmentos.
Taq DNA polimerase Adiciona os nucleotídeos na extremidade 3´ da cadeia de DNA.
Transcriptase reversa Produz uma molécula de DNA através de uma molécula de RNA.
● Enzimas de restrição- EndonucleasesEnzimas de restrição- Endonucleases Os fragmentos de DNA usados para criar moléculas Os fragmentos de DNA usados para criar moléculas recombinantes são normalmente gerados por digestão através de recombinantes são normalmente gerados por digestão através de endonucleases de restrição ou PCRendonucleases de restrição ou PCR
. Conhecem pequenas sequências específicas com 4 a 6 . Conhecem pequenas sequências específicas com 4 a 6 pares de bases.pares de bases.
. São designadas por três letras: EcoRI, HindIII.. São designadas por três letras: EcoRI, HindIII.
Vetores de clonagem Capaz de transportar uma seqüência de DNA estranha dando
origem a um DNA híbrido ou recombinante. Capacidade de se auto-replicar. Conter pelo menos um gene que confira resistência a antibióticos. Possuir locais de restrição únicos, polylinker. Fácil de purificar.
Tipos de vectores de clonagem• Plasmídeos (pBR322)• Fasmídeos ou fagemídeos • Cosmídeos• Bacteriófagos λ• YACs, BACs e PACs
www.biologianaweb.com/ Livro2/C11/pbr322.html
Vetores de expressão
Promotor Códon de iniciação seguido de polylinker Local de ligação ao ribossoma
www.icampus.ucl.ac.be/. ../expression.html
Promotor
Local de ligação ao ribossoma
Sítio de clonagem e sequência codificante de 6 histidinas
www.icampus.ucl.ac.be/. ../expression.html
Vetores para clonagem gênica
O que precisa um vetor para servir de molécula carreadora?
A escolha de um vetor depende do design do experimento e de como o gene/proteína clonados serão pesquisados posteriormente
Alguns vetores contêm uma origem procariótica de replicação o qual permite sua manutenção em bactérias.
Alguns vetores contêm uma origem eucariótica de replicação permitindo replicação autônoma e epissomal em células eucarióticas.
Sítios de clonagem múltiplos são geralmente incluídos para versatilidade e construção de bibliotecas genômicas.
Genes de resistência a antibióticos e/ou marcadores selecionados permitem a identificação de células que adquiriram o vetor.
Alguns vetores possuem promotores induíveis ou tecido-específicos que permitem a expressão controlada dos genes introduzidos em células transfectadas ou animais transgênicos.
Vetores mais modernos possuem elementos multi-funcionais que permitem uma combinação de clonagem, seqüenciamento de DNA transcrição e replicação epissomal.
Muitos tipos de vetores
Plasmídeos, bacteriófagos, cosmídeos, cromossomo artificial bacteriano (BAC), cromossomo artificial de fungos (YAC), retrovírus, vetor de baculovírus...
Escolha do vetor
Depende da natureza e do protocolo de experimento
Tipo de célula que vai receber o vetor Procariótica Eucariótica
Vetor de Plasmídeo Fechado, circular, DNA dupla fita, ocorre naturalmente em
bactérias e replica extracromossomalmente Muitos conferem resistência a drogas para cepas bacterianas Origem de replicação presente (ORI)
Examplos pBR322
Um dos primeiros plasmídeos utilizados Dois marcadores (resistência a Amp and Tet) Vários sítios de restrição espalhados através do plasmídeo ColE1 ORI
pUC18 Derivado do pBR322 Vantagens sobre pBR322:
Pode acomodar fragmentos de DNA maiores durante a clonagem (5-10kbp)
MAior número de cópias por célula (500 per cell = 5-10x mais que pBR322)
Múltiplos sítios de clonagem = “polylinker”
Esquema geral de clonagem O vetor e o gene a ser clonado são purificados
separadamente e depois ligados entre si
Produtos ligados são introduzidos em células competentes por técnicas de transformação. As colônias são analizadas individualmente.
Os vetores que vêm de bactérias que sobreviveram à seleção por antibióticos são amplificados em outras bactérias
O plasmídeo contendo DNA é purificado em larga escala
F. Vetores cosmídeos Moléculas híbridas contendo DNA de plasmídeos e
de bacteriófagos lambaLambda components: COS sequences (required for in vitro packaging into phage coats) Componentes do plasmídeo: ORI + Gene de resistência
aos antibióticos Os sítios de clonagem vêm do lambda
F. Vetores cosmídeos
Após a transformação da bactéria, o rDNA replica como plasmídeo.
Insertos bem grandes podem ser acomodados por cosmídeos (mais de 35-45 kbp)
Bacterial artificial chromosomes (BACs)
Pode acomodar mais de 1 Mb de DNA (= 1000kbp) Vários componentes de replicação e de controle de
número de cópias estão presentes Marcadores e sítios de clonagem em diferentes
lugares Outras características:
Prmotores SP6 and T7 Síntese de RNA mais eficiente Sondas de RNA para hibridização
Bacterial artificial chromosomes (BACs)
I. Yeast artificial chromosomes (YACs) Molécula híbrida contendo componentes de fungos, protozoários
e bactérias (plasmídeos)
ORI = ARS (autonomously replicating sequence) MArcadores (TRP1 and URA3) Centrômero de fungos
Protozoa= Tetrahymena Sequências de telômeros
Plasmídeos bacterianos Polylinker
Pode acomodar >1Mb (1000kbp = 106 bp)
I. Yeast artificial chromosomes (YACs)
I. Yeast artificial chromosomes (YACs)
Human artificial chromosomes
Devenvolvidos em 1997 – sintéticos, auto-replicantes
1/10 do tamanho de um cromossomo normal Microcromossomo que passa para as células
durante a mitose Contém:
ORI Centrômero Telômero Cap protetor de DNA repetitivo no fim do cromossomo Histonas dadas pela célula hospedeira
J. Human artificial chromosomes
Transformação
Ocorre quando uma célula incorpora e exprime um fragmento de material genético.
Para a introdução do DNA recombinante podem ser utilizados vários métodos:
• Células competentes;• Eletroporação;• Bombardeamento de DNA
revestido de Tungsténio;• Microinjeção;• Transfecção.
Modern Genetic Analysis.
Extracção e purificação de proteínas• Extração lise celular
• Purificação
Cromatografia de afinidade
Lehningher Principles of Biochemistry
Tags moleculares de fusão
Fusion Tag Immobilized Ligand
Binding Conditions Elution Conditions Available Formats
Glutathione (S-transferase(GST)
Reduced glutathione
Neutral (physiologic) pH, and non-denaturing; glutathione must be reduced and GST must be active
Free reduced glutathione at neutral pH (competitor)
Prepacked column kits, spin cup column kits, SwellGel Discs, coated microplates
Histidine-tagged Chelated Nickel or Cobalt
Neutral (physiologic) pH without reducing or oxidizing agents; small tag must be accessible in fusion protein structure; high ionic strength and denaturants (chaotropes such as 8 M urea) compatible.
>200 mM Imidazole, low pH, or strong chelators
Prepacked column kits, spin cup column kits, SwellGel Discs, Swell- Gel Discs in 96-well filter plates, coated microplates
Maltose Binding Protein (MBP)
Dextrin Neutral (physiologic) pH and non-denaturing; NaCl added to reduce nonspecific binding
Maltose at neutral pH (competitor)
Gel slurry, coated microplates
Green Fluorescent Protein (GFP)
Anti-GFP antibody Neutral (physiologic) pH and non-denaturing
Usual antibody/antigen elution buffers (e.g., low pH or chaotropic salts)
Coated microplates
Exemplos de Proteínas Recombinantes
Hormônio de crescimento humano – a administração deste hormônio durante a infância permite a correção dos casos de nanismo.
Anticoagulantes – ativadores de plasminogênio tecidual que por sua vez ativam a plasmina, enzima que dissolve os trombos (evita ataques cardíacos).
Dismatase do superóxido – previne danificação de tecidos quando este é exposto à falta de oxigênio.
Anticorpos monoclonais – são usados em testes diagnósticos; transporte direccionado (drogas, toxinas, componentes radioactivos utilizados na terapia cancerígena), assim como outras aplicações.
ioh.medstudents.com.br/ humoral.htm
Referência cronológica
1922 - Frederick Grant Banting descobre a insulina.
1978 - É produzida insulina humana recombinante.
1982 - Esta insulina é disponibilizada no mercado.
Insulina
Insulina- Duas cadeias peptídicas- cadeia A e cadeia B.
- Duas pontes dissulfeto entre as cadeias A e B e outra na própria cadeia A.
Insulina recombinante
http:\\bio.chm.nu.edu\resources\webproject\rasHol\tutorial\isulina4.htm
http:\\bio.chm.nu.edu\resources\webproject\rasHol\tutorial\isulina4.htm
Monômeros- Insulina é ativa na forma de monômeros.
Dímeros – pontes de hidrogênio entre as extremidades C da cadeia B.
Zn 2+
Produção de insulina Insulina proveniente de suínos e bovinos
Insulina humana biossintética
Introduction to Genetic Analysis.
Β-gal
Β-gal peptide
Purify β-gal- insulin fusion proteins
SAG Seqüência Referência
SAG1 Forward: CGGAATTCATGTCGGTTTCGCTGCACCACReverse: CCCAAGCTTCACTCACGCGACACAAGCTG
Burg et al, 1988
SAG2 Forward: GCGGATCCATGAGTTTCTCAAAGACCACGReverse: GGGAATTCTTACACAAACGTGATCAACAA
Parmley et al, 1992
SAG3 Forward: GAGGATCCATGCAGCTGTGGCGGCGCAGReverse: GGGAATTCTTAGGCAGCCACATGCACAA
Cebron-Delauw, 1994
100pb
200pb
300pb
400pb
500pb
900pb
1500pb
Padrão SAG2 SAG1 SAG3
100pb
200pb
300pb
400pb
500pb
900pb
1500pb
Padrão SAG2 SAG1 SAG3
A- SAG1 – CEPA RH 5`ATGTCGGTTTCGCTGCACCACTTCATTATTTCTTCTGGTTTTTTGACGAGTATGTTTCCGAAGGCAGTGAGACGCGCCGTCACGGCAGGGGTGTTTGCCGCGCCCACACTGATGTCGTTCTTGCGATGTGGCGTTATGGCATCGGATCCCCCTCTTGTTGCCAATCAAGTTGTCACCTGCCCAGATAAAAAATCGACAGCCGCGGTCATTCTCACACCGACGGAGAACCACTTCACTCTCAAGTGCCCTAAAACAGCGCTCACAGAGCCTCCCACTCTTGCGTACTCACCCAACAGGCAAATCTGCCCAGCGGGTACTACAAGTAGCTGTACATCAACGGCTGTAACATTGAGCTCCTTGATTCCTGAAGCAGAAGATAGCTGGTGGACGGGGGATTCTGCTAGTCTCGACACGGCAGGCATCAAACTCACAGTTCCAATCGAGAAGTTCCCCGTGACAACGCAGACGTTTGTGGTCGGTTGCATCAAGGGAGACGACGCACAGAGTTGTATGGTCACGGTGACAGTACAAGCCAGAGCCTCATCGGTCGTCAATAATGTCGCAAGGTGCTCCTACGGTGCAGACAGCACTCTTGGTCCTGTCAAGTTGTCTGCGGAAGGACCCACTACAATGACCCTCGTGTGCGGGAAAGATGGAGTCAAAGTTCCTCAAGACAACAATCAGTACTGTTCCGGGACGACGCTGACTGGTTGCAACGAGAAATCGTTCAAAGATATTTTGCCAAAATTAACTGAGAACCCGTGGCAGGGTAACGCTTCGAGTGATAAGGGTGCCACGCTAATGATCAAGAAGGAAGCATTTCCAGCCGAGTCAAAAAGCGTCATTATTGGATGCACAGGGGGATCGCCTGAGAAGCATCACTGTACCGTGAAACTGGAGTTTGCCGGGGCTGCAGGGTCAGCAAAATCGGCTGCGGGAACAGCCAGTCACGTTTCCATTTTTGC
CATGGTGATCGGACTTATTGGCTCTATCGCAGCTTGTGTCGCGTGA 3`B- SAG2 – CEPA RH
5´ATGAGTTTCTCAAAGACCACGAGCCTAGCGTCGCTAGCGCTCACGGGCTTGTTTGTTGTGTTCAAGTTCGCTCTTGCGTCCACCACCGAGACGCCAGCACCCATTGAGTGCACTGCCGGCGCAACGAAGACTGTTGATGCACCCTCCAGTGGTTCCGTTGTCTTCCGATGTGGGGATAAACTAACCATCAGTCCCAGTGGCGAAGGTGATGTCTTTTATGGCAAGGAATGCACAGACTCGAGGAAGTTGACGACTGTCCTTCCAGGTGCGGTCTTGGCAGCTAAGGTCGAGCAGCCCCCGAAAGGTCCTGCTACCTACACACTGTCTTACGACGGTACTCCCGAGAAACCTCAGGTTCTCTGTTACAAGTGCGTTGCCGAAGCAGGTGCTCCCGCTGGTCGAAATAATGATGGTGGTTCTAGCGCTCCGACGCCTAAAGACTGCAAACTCATTGTTCGCGTTCCGGGTGCCGATGGCCGTGTCACATCTGGGTTTGACCCTGTGTCTCTCACGGGCAAGGTTCTTG
CTCCCGGTCTCGCAGGTTTGTTGATCACGTTTGTGTAA 3`C- SAG3 – cepa rh
5´ATGCAGCTGTGGCGGCGCAGAGCAGCAGGTCCCGCGAGCCTGGGGAGGCAGTCTTTGCCGCTCGGGTGTTTTTTCGCGGCTTTTGGTTTGTGCGTGTTGTCTGCGATCTTGGGAACCGGAGAGCACGGACTGTTCGTCGCCGCAGGGAAATCGAGAAGTAAGATAACCTATTTTGGCACGCTCCTCAAGAAGGCTCCGAACTGGTACCGCTGCTCTTCAACGAGGGCGAATGAAGAGGTCGTAGGACATGTGACGCTGAACAAAGAGCACCCTGATATGACAATTGAATGCGTCGACGACGGCTTGGGCGGAGAGTTTTTGCCGCTCGAAGGCGGCACGTCGTCGTACCCGCGAGTATGTCACATTGATGCCAAGGACAAGGGCGACTGCGAGCGCAACAAGGGCTTTCTGACCGACTACATACCGGGCGCGAACAGGTACTGGTACAAGATAGAAAAGGTGGAGAACAACGGCGAGCAATCCGTTCTGTACAAATTCACAGTTCCTTGGATATTCCTTCCGCCCGCCAAGCAGCGATACAAGGTTGGATGCCGATACCCGAACCACGAGTATTGCTTTGTTGAGGTCACCGTCGAACCCACGCCGCCAATGGTCGAAGGCAAGAGAGTGACCTGCGGGTATCCCGAGTCCGGCCCCGTGAATCTCGAGGTGGACTTGTCAAAGGACGCGAACTTTATCGAGATTCGGTGCGGCGAACAGCACCACCCGCAGCCGTCGACCTACACGCTGCAGTACTGCTCAGGTGACTCGGTGGACCCGCAGA
AGTGTTCGCCGCAGTCCCTGACGAACATTTTTTATGACTACAGCTCTTCGTGGTGGAAGGGGAAACTGAACGGGCCTGACGGGGCAACTCTCACCATTCCACCCGGCGGGTTCCCCGAAGAAGACAAATCTTTTCTTGTCGGGTGTTCACTCACTGTGGACGGGCCGCCCTTCTGCAACGTCAAAGTGAGAGTTGCCGGGAACCCCAGAAAGTGGGGGAGAGGCGGAGGCGGCCATCCAGGAAGCGGAGGATTGCAGCCGGGAACTGAAGGGGAAAGTCAAGCTGGAACAGAAAGTTCAGCCGGCGCGAGTTCGCGAATGGCTTCCGTTGCCCTGGCGTTCCTTCTCG
GTCTCCTTGTGCATGTGGCTGCCTAA 3´
A - SAG1M S V S L H H F I I S S G F L T S M F P K A V R R A V T A G V F A A P T L M S F L R C G V M A S D P P L V A N Q V V T C P D K K S T A A V I L T P T E N H F T L K C P K T A L T E P P T L A Y S P N R Q I C P A G T T S S C T S K A V T L S S L I P E A E D S W W T G D S A S L D T A G I K L T V P I E K F P V T T Q T F V V G C I K G D D A Q S C M V T V T V Q A R A S S V V N N V A R C S Y G A D S T L G P V K L S A E G P T T M T L V C G K D G V K V P Q D N N Q Y C S G T T L T G C N E K
S F K D I L P K L T E N P W Q G N A S S D K G A T L T I K K E A F P A E S K S V I I G C T G G S P E K H H C T V K L E F A G A A G S A K S A A G T A S H V S I F A
M V I G L I G S I A A C V AB - SAG2
M S F S K T T S L A S L A L T G L F V V F K F A L A S T T E T P A P I E C T A G A T K T V D A P S S G S V V F R C G D K L T I S P S G E G D V F Y G K E C T D S R K L T T V L P G A V L A A K V E Q P P K G P A T Y T L S Y D G T P E K P Q V L C Y K C V A E A G A P A G R N N D G G S S A P T P K D C K L I V R V P G A D G R
V T S G F D P V S L T G K V L A P G L A G L L I T F VC - SAG3
M Q L W R R R A A G P A S L G R Q S L P L G C F F A A F G L C V L S A I L G T G E H G L F V A A G K S R S K I T Y F G T L L K K A P N W Y R C S S T R A N E E V V G H V T L N K E H P D M T I E C V D D G L G G E F L P L E G G T S S Y P R V C H I D A K D K G D C E R N K G F L T D Y I P G A N R Y W Y K I E K V E N N G E Q S V L Y K F T V P W I F L P P A K Q R Y K V G C R Y P N H E Y C F V E V T V E P T P P M V E G K R V T C G Y P E S G P V N L E V D L S K D A N F I E I R C G E Q
H H P Q P S T Y T L Q Y C S G D S V D P Q K C S P Q S L T N I F Y D Y S S S W W K G K L N G P D G A T L T I P P G G F P E E D K S F L V G C S L T V D G P P F C N V K V R V A G N P R K W G R G G G G H P G S G G L Q P G T E G E S Q A G T
E S S A G A S S R M A S V A L A F L L G L L V H V A A
SAG3 SAG1 SAG2Plasm Padrão
24Kda
45 Kda
35 Kda
SAG3 SAG1 SAG2Plasm Padrão
24Kda
45 Kda
35 Kda
SAG3
SAG1
Positivo Negativo
SAG2
SAG3
SAG1
Positivo Negativo
SAG2
IgGTotal IgG1 IgG3
0
5000
10000
15000
20000
25000
14%
76%
24% 60%
40%86%
RLUSAG1
PosNeg PosNeg PosNeg
0
5000
10000
15000
20000
25000
32%
68%62%
38% 72%
28%
SAG2
RLU
SAG3
0
5000
10000
15000
20000
25000
29%
62%
38%63%
27%71%
RLU
0
5000
10000
15000
20000
25000
24%
68%
32% 68%
32%76%
RLU
GIPLs
IgGTotal IgG1 IgG3
0
5000
10000
15000
20000
25000
14%
76%
24% 60%
40%86%
RLUSAG1
PosNeg PosNeg PosNeg
0
5000
10000
15000
20000
25000
32%
68%62%
38% 72%
28%
SAG2
RLU
SAG3
0
5000
10000
15000
20000
25000
29%
62%
38%63%
27%71%
RLU
0
5000
10000
15000
20000
25000
24%
68%
32% 68%
32%76%
RLU
IgGTotal IgG1 IgG3
0
5000
10000
15000
20000
25000
14%
76%
24% 60%
40%86%
RLUSAG1
PosNeg PosNeg PosNeg
IgGTotal IgG1 IgG3
0
5000
10000
15000
20000
25000
14%
76%
24% 60%
40%86%
RLUSAG1
PosNeg PosNeg PosNeg
0
5000
10000
15000
20000
25000
32%
68%62%
38% 72%
28%
SAG2
RLU
0
5000
10000
15000
20000
25000
32%
68%62%
38% 72%
28%
SAG2
RLU
SAG3
0
5000
10000
15000
20000
25000
29%
62%
38%63%
27%71%
RLUSAG3
0
5000
10000
15000
20000
25000
29%
62%
38%63%
27%71%
RLU
0
5000
10000
15000
20000
25000
24%
68%
32% 68%
32%76%
RLU
0
5000
10000
15000
20000
25000
24%
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32% 68%
32%76%
RLU
GIPLs