proteínas recombinantes histórico e vantagens. origem • 1944 - oswald avery: transmissão de...

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  • Protenas Recombinantes Histrico e vantagens
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  • Origem 1944 - Oswald Avery: transmisso de informaes pelo DNA. 1961- Franois Jacob e Jacques Monod: sntese proteica apartir do DNA. 1972- Paul Berg: Ligao de cadeias genticas de animais organismos diferentes. 1978- Werner Arber, Daniel Nathans e Hamilton Smith: Enzimas de restrio (Nobel)
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  • Sistemas de Expresso
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  • Desvantagem: Produz muitas proteases!!
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  • Sistemas de Expresso
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  • Impacto das P.Rs no desenvolvimento de vacinas 17 vacinas em 137 anos. 31 vacinas em 40 anos
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  • Objetivo: Estabelecer uma abordagem eficiente frente a protenas de difcil expresso utilizando E.coli. Para estabelecer uma estratgia 71 protenas foram escolhidas e cada uma expressa em 15 formas diferentes: (cepa x temperatura x plasmdeos x estresse)
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  • Cepas de E.coli BL21-Gold: deficiente em EndA1 nuclease BL21-Codon plus: obtida da BL21 Gold, apresenta mais copias de genes que codificam tRNAs. BL21-V2R1: Derivadas de cepas BL21 deficientes em lon (deficiente em proteases dependentes de ATP) de e omT (deficiente em proteases de membrana). BL21-V2R1 pRARE2: introduo do plasmdeo pRARE2 que fornece tRNAs. BL21-Rosetta: cdons raros, deficiente em protease e resistente a cloranfenicol. ArcticExpress: contm chaperonas que auxiliam no folding e possibilitam o funcionamento metablico de 4 a 12C. JM109: mutaes em EndA1 e RecA1, indicado para clonagem de plasmdeos. W3110: mutao no gene gatA que responsvel pela metabolizao do C.
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  • Plasmdeos 6 His-tags introduzidas em C-terminal ou N-terminal.
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  • Purificao Os lisados e sobrenadantes so incubados com beads NI-NTA. A avaliao da expresso feita por SDS-PAGE.
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