3. Utilizacin industrial de microorganismos recombinantes

Cultivos a gran escala de microorganismos de inters industrial.

y La fuente de todas las

cepas industriales es el ambiente naturaly Las cepas industriales se

depositan en colecciones de cultivos que sirven como almacn

Microorganismos industrialesy No todos los microorganismos

tienen un uso industrial

y Microorganismos industriales

producen uno o ms productos especficos

y Microorganismos industriales

y El microorganismo es

son capaces de producir especficamente y con un alto rendimiento, metabolitos particulares.

modificado antes de ingresar a la industria: se altera genticamente por mutacin o por recombinacin

EMPLEO DE MICROORGANISMOS EN PROCESOS INDUSTRIALES: VENTAJASy y y y y y

Rpido crecimiento debido a la favorable relacin rea/ volumen Diversidad metablica Estabilidad gentica Crecimiento en gran escala y separacin fcil de productos y sustratos Adaptabilidad a distintos ambientes y condiciones de crecimiento Facilidad de manipulacin gentica Incrementar la productividad Modificar los productos finales

y y

Habilidad para sintetizar enantimeros especficos Tecnologas limpias

Requisitos de un microorganismo industrial:y Producir la sustancia de inters y Crecer rpidamente en un medio de cultivo barato y Fabricar el producto en un perodo corto y Desarrollarse en cultivo puro y en gran escala y Ser estable genticamente pero susceptible de y y y y

manipulacin gentica Cultivos que se mantengan durante perodos largos en laboratorio y en planta industrial Facilidad para inocular en grandes fermentadores No debe ser peligroso para el hombre o las plantas y animales de inters econmico Posibilidad de retirar fcilmente las clulas del cultivo

Empleo industrial de microorganismosy Productores de metabolitos primarios y secundarios y Productores de biomasa y sus constituyentes

y Protenas y aminocidos, y Vitaminas, y cidos Nucleicos y Polmeros de H de C y Esteres y Huspedes para la expresin de genes homlogos y heterlogos y Unidades de Biotransformacin

Clases de productos industrialesMetabolitos microbianos y Alcohol y cido actico y cido lctico y Aminocidos y Vitaminas y Antibiticos y Esteroides y Alcaloides Enzimas Digestin de almidones, lpidos y protenas Sntesis de antibiticos semisintticos Clulas microbianas y Protena unicelular: levaduras, algas, bacterias y hongos y Clulas para la inoculacin: bacterias fijadoras de nitrgeno, micorrizas, inculos para la fermentacin de lcteos y embutidos

Productos de la microbiologa IndustrialBiotransformacin ClulasSustrato

Levadura

Producto

Productos de las Clulas

Enzimas (Glucosa Isomerasa) Antibiticos (Penicilina) Aditivos Alimenticios (aminocidos)

Alcohol

Productos Qumicos (cido ctrico)

Bioqumica y Microbiologa Industrial 2 de Bioqumica Universidad de Zaragoza

Metabolitosprimariosy Producidos durante el

secundariosy Sintetizados al final de la fase de

crecimiento activo o fase de crecimiento

crecimiento y en la fase estacionaria

Typical Grow h Curve for a Bacterial Population100 Log No of Viable cells 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Time in (hrs) Biomass (g/L)

Metabolitosprimariosy Producidos en paralelo del crecimiento primario

secundariosy Especficos de un grupo de organismos y No esenciales para el crecimiento y Dependientes de las condiciones de crecimiento y Grupos de estructuras estrechamente ligadasy Una cepa de Streptomyces produce 32 antibiticos distintos del tipo antraciclina

y Pueden ser sobre-producidos y Aislados del medio de crecimiento

Metabolitos Primarios y SecundariosSustrato de crecimiento Sustrato de crecimiento Sustrato de crecimiento

Clulas

Metabolito Primario

Clulas

Metabolito Primario

Clulas

Metabolito Primario

Las clulas y el metabolito se producen ms o menos simultneamente

Metabolito Secundario Despus de producidas las clulas y el metabolito primario, las clulas convierten el metabolito primario en uno secundario

Metabolito Secundario Despus de producidas las clulas el sustrato se convierte en un metabolito secundario durante un posterior crecimiento

Cintica de metabolitos primarios

Cintica de metabolitos secundarios

Va metablica primaria para la sntesis de aminocidos aromticos y metabolitos secundarios con anillos aromticosGlucosa Eritrosa Fosfoenol-piruvato Metabolito primario Metabolito secundario

D-arabinoheptulosonato

3-Desoli-7-fosfo

Ansamicina Rifamicina

cido shikmico Piocianina

Candicidina Nistatina Cloranfenicol Nocardicina Polimixina Fenilalanina

cido corsmico

cido antranlico

Triptfano Actinomicina

cido prefnico Tirosina Novobiocina

Clasificacin de los productos industriales segn su uso:y Productos farmacuticos de y y y y

origen microbiano Biotecnologa microbiana en agricultura Sustancias qumicas y aditivos alimentarios Productos qumicos comerciales y produccin de energa Biorremediacin

Productos farmacuticos de origen microbianoy Antibiticos y Hormonas esteroides y Insulina y Hormona del crecimiento y Linfocinas y Pptidos neuroactivos y Factores de coagulacin sangunea y Activador del plasmingeno tisular y Vacunas y Anticuerpos monoclonales para diagnstico y terapia

Biotecnologa microbiana en agriculturay Productos farmacuticos

veterinarios de origen microbiano y Inculos radiculares y Ingeniera gentica de plantas mediada por microorganismos como portadores genticos

Sustancias qumicas y aditivos alimentarios Sustancias especiales y aditivos alimentarios: y Aminocidos:y Glutamato: potenciar el sabor y Aspartato+alanina: modular el sabor de jugos de frutas y glicina: mejorar el sabor de alimentos dulces y Aspartame: endulzar y Lisina y metionina: aditivos nutrivos y Cistena antioxidante de jugos de frurtas y Triptofano + histidina: evita la rancidez de los alimentos

y Vitaminas: rivoflavina, vitamina B12, vitamina C

Productos qumicos comerciales y produccin de energaProductos qumicos comerciales de estructura sencilla y bajo valor monetariosy Etanol (combustible para

motores) y cido actico y cido lctico y Glicerol

Fermentaciones

y Para procesos industriales, se usan

fermentadores de hasta de 400.000 litros de capacidad y Los fermentadores son construidos de acero inoxidable y tienen una camisa externa la cual puede ser esterilizada inicialmente y enfriadada durante la fermentacin.

y Spargers e impellers en el tanque

son usados para la aireacin y revolver el contenido. y The vessel may contain various devices for monitoring the environmental conditions within the culture, so that these factors can be controlled to obtain high product yields.

Ejemplos: productos derivados de mo en la industria

EtanolProducido por : 1- Levaduras * Saccharomyces (a partir de hexosas) * Kluyveromyces fragilis (a partir de lactosa) * Cndida o Pichia (a partir de pentosas) 2- Bacterias* Clostridium (a partir de celulosa) (termfilos, anaerobios) * Zymomonas 3- RecombinantesE.coli recombinante: Introduccin de los genes Alcohol deshidrogenasa y piruvato decarboxilasa de Zymomonas.

AminocidosPrincipales productores: Bacterias de los gneros Corynebacterium y Brevibacterium * Mutantes auxotrofas y regulatorias * Mutantes alteradas en la secrecion * Cepas recombinantes

Principales productos: Acido glutmico 600,000U$S 915 milliones Lisina U$S 500 milliones Fenilalanina U$S 200 millones Aspartato U$S 43 milliones

Toneladas/ ao

VitaminasVitamina B12Microorganismos productores: Bacterias de los generos Propionibacterium shermani y Pseudomonas denitrificans. Produccin: 150 mg/ L. BiotinaMicroorganismo productor: cepas modificadas (mutantes) de Serratia marcescens.Produccin: 150-600 mg/ L. Vitamina B2 (Riboflavina)Microorganismos productores: -hongos (Eremothecium ashby y Ashbya gossypii) Candida sp Bacillus subtilis recombinante Produccin: 20 -30 g/ L

PRODUCCION DE METABOLITOS SECUNDARIOS

y Los metabolitos secundarios funcionan en los organismos que

los producen como: Reguladores del crecimiento Ionoforos Defensa frente a otros microorganismos (antibiticos, toxinas,

pesticidas) Agentes de simbiosis Efectores de diferenciacin Respuesta a Stress

ANTIBIOTICOSDesde 1940 se han introducido una gran variedad de molculas con actividad antibitico para su uso en medicina y agricultura.yEn el mercado hay 160 antibiticos en uso por un

valor de 23,000 millones de U$S.

ySe han descrito 6,000 antibiticos de los cuales

4,000 se han aislado de Actinomycetes, y se describen alrededor de 500 antibiticos nuevos por ao. Una sola cepa de Streptomyces hygroscopicus produce aproximadamente 200 antibiticos. yMuchos nuevos antibiticos se obtienen por semisntesis, es decir, por modificacin de antibiticos existentes

INHIBIDORES ENZIMATICOS yEj. Estatinas y acido zaragozico yInhibidores competitivos de la HMGCo A reductasa y escualeno ciclasa, por lo cual se emplean como anticolesterolemicos. y Microorganismo productor: Aspergillus terreus (hongos)yEj. Acido clavulanico (inhibe

penicilasas) yEj. Acarbosa: Inhibidor de la glucosidasa intestinal. Disminuye la hiperglucemia y tambin la sntesis de triglicrido en los tejidos adiposos, el hgado y las paredes intestinales de individuos obesos, diabticos o con trastornos de la lipemia. yMicroorganismo productor: Actinoplanes (actinomycetes)

BIOPESTICIDAS Se aislaron en un principio como agentes antibiticos y luego, en las sucesivas investigaciones, surgieron nuevos usos o usos mas especficos. jFungicidas: kasugamycin, polyoxins, anfotericina jInsecticidas: toxina de Bacillus thuringiensis jHerbicidas: bialaphos j antihelminticos: avermectinas jReguladores del crecimiento de plantas: giberellinas jInmunosupresores: ciclosporinas jAgentes antitumorales: mitomycin, bleomycin j Antivirales: inhibidores de la transcriptasa reversa y de la proteasa de HIV (ritonavir, nevirapine, etc)

EMPLEO DE LOS MICROORGANISMOS COMO VECTORES DE GENES HETEROLOGOS

Los principales huespedes que se emplean para la produccion de proteinas recombinantes son E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polimorpha y Aspergillus niger.y

y y y y

Quimosina recombinante (Clonado del gen de la quimosina bovina en una levadura). Se emplea para la coagulacion de la caseina, en la obtencion de quesos. Insulina humana (en E.coli) Hormona de crecimiento humana (en E.coli y levaduras) Vacuna Hepatitis (en levaduras ) Farmacos (interferon 2 alfa)

EMPLEO DE PLANTAS TRANSGENICAS CON GENES BACTERIANOS CLONADOS (bt)

MAIZ Y ALGODON BT

Uso de Microorganismos en biotransformaciones

Reacciones Quimicas realizadas por microorganismos: Oxidaciones* Hidroxilacion : introduccion de grupos HO con regio y estereo especificidad. Ej obtencion de esteroides Produccion de 11OH derivados y eliminacion de cadena lateral (cortisol, prednisolona, testosterona, etc) * Epoxidaciones * Desaturaciones * Rupturas oxidativa de anillos

Reducciones Reacciones hidroliticas Condensaciones

Ingenieria metabolica: ruta artificial para la obtencion de hidrocortisona en levadurasArtificial pathway for the biosynthesis of the hydrocortisone as rebuilt in yeasty

The enzymes in red come from human, bovine and plant organisms and their genes were engineered before introduction in yeast cells. Those in blue are original yeast enzymes whose genes were modified to change their expression levels. The green pathway is the main pathway for hydrocortisone production, the red one corresponds to controlled side reactions and the yellow one to secondary biosynthesis pathway coexisting with the major green one.

y

y

PRINCIPALES ETAPAS DE UN PROCESO DE PRODUCCIONy Bsqueda y seleccin de microorganismos (Screening) y Organismos mesfilos y Organismos extremfilos SI BIEN LOS MO SON BUENOS PRODUCTORES DE UNA GRAN VARIEDAD DE COMPUESTOS, LOS PRODUCEN EN BAJA CANTIDAD, POR LO QUE SE REQUIERE : y Aumentar los rendimientos mediante: y Obtencin de mutantes (tcnicas de mutagnesis, recombinacin gentica, fusin de protoplastos) y Empleo de tecnologa de DNA recombinante (para aumento gentico de enzimas claves, utilizacin de nuevos sustratos, etc.) y Diseo y seleccin de medios de cultivo que maximicen la produccin, disminuyan los costos o faciliten la recuperacin de productos. y Diseo y seleccin de las condiciones y sistemas de cultivo mas convenientes

PRINCIPALES PRODUCTOSPRODUCTO Solventes Etanol Acetona/butanol Biomasa Starters para alimentos Proteina unicelular Acidos organicos Acido citrico Acido gluconico Acido lactico Aminoacidos Acido glutamico Lisina Fenilalanina arginina ORGANISMO PRODUCCION (Ton/ao) 20 millones 2000 500,000 50,000

Saccharomyces cerevisiae Clostridium acetobutylicum Levaduras y bacterias lacticas Candida utilis

Aspergillus niger Aspergillus niger Lactobacillus delbrueckii

250,000 50,000 50,000

Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum

300,000 30,000 2000 1000

PRODUCTO Enzimas Proteasas Alfa-Amilasas Glucoa-amilasa Glucosa isomerasa Pectinasa Renina otras Vitaminas B12 Riboflavina Vacunas Difteria Tetanos Pertussis Polio Rubola Hepatitis B

ORGANISMO

PRODUCCION (Ton/ao) 600 500 500 500 100 50 50

Bacillus spp Bacillus amyloliquefasciens Aspergillus niger Bacillus coagulans Aspergillus niger Mucor o levaduras recombinantes

Propionibacterium shermanii Eremothecium ashbyii

10

Corynebacterium diphteriae Clostridium tetani Bordetella pertussis Virus atenuado crecido en rion de mono o celulas diploides humanas Idem anterior Antigenos de superficie expresados en levadura

< 0.1

Alcaloides del ergot

Claviceps paspali

5

PRODUCTO Pigmentos Shikoninas Beta-carotenos Proteinas de uso teraputico Insulina Hormona de crecimiento Eritropoyetina FactorVIII-C Activador del plasminogeno Interferon alfa2

ORGANISMO

PRODUCCION (Ton/ao) < 0.1

Lithospermum (plantas) Levaduras E. coli recombinante E. coli recombinante o celulas de mamfero recombinante celulas de mamfero recombinante celulas de mamfero recombinante E. coli recombinante

< 0.1

Antibioticos Penicilinas Cefalosporinas Tetraciclinas Macrolidos (eritromicina) Polipeptidicos (gramicidina) Aminoglicosidos (estreptomicina) Aromticos (griseofulvina) Insecticidas Esporas bacterianas Anticuerpos monoclonales

Penicillum chrysogenum Cephalosporium acremonium Streptomyces aureofaciens Streptomyces erythreus Bacillus brevis Streptomyces griseus Penicillum griseofulvum

80,000 15,000 15,000 10,000 2,000 1,000

Bacillus thuringiensis Celulas de hibridoma

< 0.1 < 0..01