Antígenos Recombinantes e suas aplicações em Imunologia

Bióloga Mariana Monezi Borzi

Doutoranda em Microbiologia Agropecuária

Prof. Helio José Montassier

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESPFACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS – FCAV

CAMPUS DE JABOTICABAL

Novo Dogma Central

da Biologia Molecular

• Cópia das sequencias de nucleotídeos de umamolécula de DNAfd parental em duasmoléculas filhas de DNAfd

• Semi-conservativa

Replicação

Fita molde

Fita nova

É o processo pelo qual uma molécula de RNA é sintetizada a partir da informação contida na sequência de nucleotídeos de uma molécula

de DNA de fita dupla (gene)

Transcrição

Núcleo

Informação genética

Citoplasma

DNA mRNA

Consiste na transformação da mensagem contida no mRNA, via tRNA, na sequência de aminoácidos que

constituem a proteína

Tradução

Expressão gênica

Polímero de aminoácidos de massa molecular acima de 10 KDa, com cada aminoácido unido ao

seu vizinho por um tipo específico de ligação covalente.

Proteína

Sequencia linear dos

resíduos de aminoácidos

(Ligações peptídicas)

Padrões estruturais:

conformação helicoidal ou

lado a lado

(Pontes de hidrogênio)

Arranjo 3D

(Pontes de hidrogênio,

Forças de Van der Wall,

Interações iônicas)

Arranjo entre

cadeias/subunidades

(Ligações dissulfeto)

• Antígenos: substâncias (moléculas) estranhas aoSI que são reconhecidas por receptoresespecíficos em linfócitos B e T e também poranticorpos.

• Antígenos recombinantes: proteínas específicasdo agente infeccioso, produzidas artificialmentea partir da clonagem gênica

- Proteínas recombinantes

- Proteínas heterólogas

Produção em larga escala de proteínas recombinantes a partir da expressão de uma

molécula de DNA recombinante em um sistema de expressão adequado.

DNA recombinante: sequencia de DNA artificial que resulta da combinação

de diferentes sequencias de DNAs

Tecnologia do DNA recombinante

Estudos bioquímicosAnálises estruturais

Dificuldades de obtenção Produção de Anticorpos

Imunodiagnóstico

Clonagem gênica: isolamento,

amplificação e purificação de um ou

mais genes a partir do material genético

de um dado organismo.

Células hospedeiras: Leveduras, Células de

insetos, Células de mamíferos, Células bacterianas

Taxa de crescimento

celular;

Complexidade do meio de

cultura;

Custo do meio de cultura;

Nível de expressão;

Capacidade de expressão

extracelular.

Capacidade de produzir as

modificações pós-

traducionais:

- enrolamento correto;

- formação das pontes

dissulfeto;

- glicosilação;

- fosforilação;

- acetilação.

• Crescimento rápido

• Pouco espaço físico

• Genética bem compreendida

• Aceita material genético estranho

Escherichia coli

Vetor: molécula de DNA usada como um veículopara carregar sequências de DNA estrangeirasdentro de uma célula hospedeira.

Plasmídeos:

• Mais simples

• Circulares

• Independentes do cromossomo bacteriano

Vetores de expressão

Gene resistência a

antibiótico

Expressão de proteína recombinante em E. coli: 3 etapas

- Clonagem Gênica

- Indução da Expressão

- Análise da Expressão

Vetor de expressão

Preparo do inserto- gene

Reação de ligação

Plasmídeo recombinante

Transformação de E. coli

competente

Plaqueamento e seleção

dos clones recombinantes

Extração do

DNAp e

Sequenciamento

ETAPA

1

amp

Tampão

de lise

Sonicação Purificação

ETAPA 2

Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS PAGE)

• Quanto menor for o peso molecular daproteína mais facilmente ela migrarápelos poros do gel de poliacrilamida emrelação às outras

• Após a corrida as proteínas poderão servisualizadas com a aplicação do coranteCoomassie Blue

ETAPA

3

Preparo da amostra: dodecil-sulfato de sódio e β-mercapto-etanol

Confere carga negativa Separa as cadeias

260 kDa

72 kDa

52 kDa

42 kDa

10 kDa

Caracterização por SDS-PAGE da Nucleoprotéina recombinante do

Vírus da Influenza Aviária expressa em E. coli.

Western blotting

• Técnica bioquímica utilizada paradeterminar a quantidade relativa e o pesomolecular de uma proteína dentro de umamistura de proteínas ou outras moléculas.

• Uso de anticorpos específicos

• Detecção de antígenos proteicos

ETAPA

3

Caracterização por Western Blotting da Proteína NP recombinante do VIA expressa

em E. coli após purificação em resina de níquel-agarose.

1 2 3

260 kDa

72 kDa

52 kDa

42 kDa

Análise (mapeamento)dos epítopos

Epítopo linear ou contínuo

Epítopo conformacional ou

descontínuo

Imunodiagnóstico

• Sorologia - detecção de Acs contra antígenos viraise bacterianos específicos

• Clonagem e expressão da NP do VIA

• Testes de ELISA

• 121 soros testados

• Positivos – Acs presentes no soro reagiam com aNP recombinante

• Negativos – não ocorria reação

ELISA indireto

• Apresentam sequencias do material genéticodo agente infeccioso que codificam antígenos

Vacinas de DNA

Clonagem do gene em vetor de expressão (propagação)

Administração ao indivíduo (transfecção)

Células produzem a própria proteína (antígeno)

Resposta imunológica com memória

• Indução da imunidade protetora emcamundongos contra o câncer e algumasdoenças auto imunes.

• Em humanos:

Vacinas de DNA

Pesquisas direcionadas contra a AIDS, malária, tuberculose,

dengue, hepatite, raiva, leptospirose, teníase etc.

• Seleção do gene alvo

• Construção do vetor de expressão

• Frequência e via de administração

• Idade, saúde e espécie

Vai depender...

• Produção em larga escala – menos custo

• Mais fácil o controle de qualidade

• Estáveis a Tº ambiente

• Podem ser liofilizadas

• Sem necessidade de refrigeração – fácil comercialização, transporte, distribuição em regiões de difícil acesso

Vantagens

OBRIGADA!

mmborzi@gmail.com