Polymerase Chain Reaction Trabalho realizado por: Alexandre Sarmento Ana Catarina Gomes Ana Filipa Côrte Ana Filipa Lima Ana Sofia Sampaio Rita Cardona.

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  • Polymerase Chain Reaction Trabalho realizado por: Alexandre Sarmento Ana Catarina Gomes Ana Filipa Crte Ana Filipa Lima Ana Sofia Sampaio Rita Cardona Biologia Celular e Molecular 2005/2006
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  • PCR Como tudo comeou Dezembro de 1983 A sua ideia: desenvolver um processo com o qual o DNA poderia ser multiplicado artificialmente atravs de ciclos repetidos de duplicao catalisada pela DNA polimerase Kary Mullis
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  • Thomas D. Brock no lago do Yellowstone National Park de onde foi isolado o Thermus aqquaticus
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  • 10 anos mais tarde Ganhou o prmio Nobel da Qumica!
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  • Qual o objectivo? Produzir uma quantidade aprecivel de um segmento especfico de DNA a partir de uma quantidade mnima Quais os componentes? Mg 2+ DNA Polimerase dNTP Primers
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  • Quais os instrumentos? TermomixerTermociclador Eppendorfs
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  • Influncia dos componentes na reaco de PCR DNA molde: deve estar livre de impurezas uma vez que estas podem inibir a reaco de PCR Soluo tampo Tris: mantm o pH da soluo Ies monovalentes: K +, Na + e NH4 + optimizam as condies da reaco Soro de albumina de bovino: actua como protena estabilizadora Io Magnsio: - Baixa concentrao: pouco ou nenhum produto - Elevada concentrao: baixa especificidade. Primers Baixa concentrao: induz m polimerizao Elevada concentrao: induz o aparecimento de produtos inespecficos e formao de dmeros de primers
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  • Nucletideos (dNTPs) Baixa concentrao: maior especificidade, com pouco produto final. Elevada concentrao: h aumento da quantidade de produto com perda de especificidade. DNA polimerase DNA polimerase de Thermus aqquaticus (Taq polimerase) - Termoestvel e sem actividade exonucleotdea 3- 5, ou seja, no tem actividade correctiva DNA polimerase de Pyrococcus furiosus (Pfu) - Termorresistente e com actividade exonucleotdea 3-5, ou seja, tem actividade correctiva
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  • In vitro e a cores
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  • Vantagens Rapidez e facilidade na utilizao: devido ao uso do thermal cycler e sntese dos primers simplificada pelo uso do software dos computadores; Sensibilidade: o PCR capaz de amplificar uma sequncia de DNA correspondente a uma nica clula; Robustez: o PCR permite a amplificao de sequncias especficas de material cujo DNA est degradado ou embutido num meio do qual o isolamento do DNA difcil.
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  • Limites necessria informao prvia da regio de interesse O rendimento da tcnica de PCR fica muito aqum do seu potencial mximo: Qualidade do DNA molde : contaminantes includos na amostra podem inibir a reaco Indisponibilidade de DNA devido a falhas/rupturas DNA ao dissociar-se de outras macromolculas durante a purificao Diminuio da actividade da Taq polimerase ou a sua saturao Competio entre o produto obtido por PCR e os primers na ligao ao fragmento DNA a amplificar
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  • Limites Taq polimerase no possui actividade de exonuclease no sentido 3 5 e por isso ocorrem erros (1 em cada 10000 pb); A utilizao de primers degenerados diminui a sua especificidade podendo a sequncia amplificada no corresponder a sequncia de interesse;
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  • RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) A amostra fornece o RNAm, que convertido em cDNA Composta por 2 etapas: transcrio reversa - sntese de uma cadeia de DNA, utilizando-se como molde uma cadeia de RNAm, numa reaco catalisada por uma transcriptase reversa. So utilizados primers de oligonucleotdeos compostos por vrias timinas consecutivas (6 a 35), complementares s regies Poly-A do RNAm amplificao A avaliao do RNAm permite detectar quais as protenas que esto a ser efectivamente expressas
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  • Mais de um segmento genmico amplificado numa nica reaco, cada um com o seu par de primers especfico Permite simplificar algumas experincias, como a investigao de paternidade, onde vrios marcadores genmicos devem ser analisados, reduzindo o tempo, trabalho e custo da genotipagem Aplicada em anlises de deleco, mutaes e polimorfismos Multiplex PCR
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  • Nested PCR Composta por duas etapas: 1 etapa amplificao do DNA alvo. A complementaridade dos primers a locais alternativos, para alem do pretendido, implica obteno de produtos no desejados 2 etapa o produto da 1 etapa submete-se a uma segunda reaco, com novos primers. muito improvvel que alguns dos produtos no desejados contenham os locais pretendidos para ambos os primers novos, assegurando a pouca contaminao do produto da segunda etapa Aumentar a sensibilidade e especificidade do mtodo
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  • Alm do DNA molde, adicionado reaco um outro segmento de DNA, de sequncia, tamanho e concentrao conhecidos (controlo), cujas extremidades so tambm complementares dos primers que iro amplificar a sequncia-alvo A amplificao do segmento controlo, tendo em conta a quantidade inicial e dados sobre a eficcia da reaco, serve de padro para a quantificao do DNA alvo Esta tcnica utilizada principalmente em kits diagnsticos (ex: carga viral de HIV) PCR Competitiva
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  • Enzima de restrio corta dois fragmentos de DNA: o do gene SDF-1 (alvo) e o do gene da -actina Os fragmentos das bordas de SDF-1 so unidos com o interior do fragmento da -actina hbrido de tamanho maior, amplificvel pelos primers especficos de SDF-1. Este hbrido adicionado na reaco em quantidades pr-determinadas, Construo de um fragmento controlo
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  • Real Time PCR Utiliza primers e dNTP`s marcados por compostos fluorescentes Termocicladores utilizados alm de realizar os ciclos de temperatura, possuem leitores de fluorescncia que fornecem dados sobre a quantidade de DNA formada durante a reao. Permite a deteco da fluorescncia emitida durante a reaco como indicador do produto amplificado em cada ciclo da PCR (em tempo real) Aumento da fluorescncia Ciclos de PCR
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  • Qual a sua utilidade? Genetic fingerprinting Testes de paternidade Relaes genticas podem ser determinadas atravs de dois ou mais DNA fingerprints, que por sua vez podem ser usadas nos testes de paternidade Electroforese de fragmentos de DNA amplificados por PCR (1) Pai. (2) Criana (3) Me Tcnica forense, na qual pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime so amplificadas para serem analisadas
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  • Mutaes Doenas virais Anlise de DNA antigo DNA de um fssil pode ser amplificado por PCR. Investigaes tm tido sucesso em amplificar material gentico de insectos fossilizados em amber que esto extintos h mais de 20 milhes de anos H situaes nas quais se est interessado em fazer cpias de DNA mutado, por exemplo, ao tentar avaliar a funo de um determinado gene ou na evoluo in-vitro de uma proteina Podem ser detectadas usando PCR, atravs da amplificao do DNA viral. Esta anlise possvel depois de uma infeco, que pode ocorrer muitos dias ou at muitos meses antes dos sintomas ocorrer. Um diagnstico precoce oferece aos mdicos um avano significativo no tratamento
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  • Deteco de doenas hereditrias Clonagem de genes Assentam no isolamento de um gene de um organismo e a sua insero noutro organismo. Clonagem de um gene usando um plasmdeo. (1) DNA cromossomal do organismo A. (2) PCR. (3) Multiplas cpias de um nico gene do organismo A. (4)Insero do gene no plasmdeo. (5) Plasmdeo com o gene do organismo A. (6) Insero do plasmdeo no organismo B. (7)Multiplicao ou expresso do gene, originalmente do organismo A, ocorrendo agora no organismo B. Um determinado gene pode ser amplificado com PCR usando os primers apropriados e ento ser arranjado em sequncia para detectar mutaes.
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  • Antes, procurar o segmento pretendido na amostra era igual a encontrar uma agulha no palheiro Actualmente, com a tcnica de PCR procurar o segmento pretendido na amostra igual a encontrar vrias agulhas num s palheiro
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  • Agradecimentos Professora Doutora Delminda Neves
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  • Referncias www.bio.davidson.edu/Courses/immunology/Flash/RT_PCR.html www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html www.pt.wikipedia.org Molina, A. L., Tobo P. R., Uso das tcnicas de biologia molecular para diagnstico, Einstein, 139-142 http://pt.wikipedia.org www.etall.hpg.com.br: Vieira D. P., Tcnicas de PCR: Aplicaes e Padronizao de Reaes Maurizio Provenzano, MD, et tal, 2001, Scientific communication, 88-91

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