LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI FARMASI

Tanggal Praktikum: 10 Maret 2015

Polymerase Chain Reaction (PCR), Purifikasi Hasil PCR, dan SDS-PAGE

Disusun Oleh:

Kelompok 6 (Kelas A)

Baginda Sati Pituanan 1206260204

Dina Salamah 1206244301

Mega Watty 1206260091

Michael Prajanto 1206257733

Zahra Adiyati 1206257670

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS INDONESIA

DEPOK

2015

ii

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas rahmat-Nya,

sehingga penulis dapat menyelesaikan laporan praktikum Bioteknologi Farmasi yang berjudul

Teknik Ekstraksi DNA dan Elektroforesis .

Penulis mengucapkan terima kasih atas bimbingan Ibu Dr. Amarila Malik Apt., M.Si,

selaku dosen mata kuliah Bioteknologi Farmasi yang telah mengusahakan berlangsungnya

praktikum di tengah padatnya kegiatan perkuliahan, serta kepada kakak-kakak asisten

Laboratorium Bioteknologi Fakultas Farmasi UI yang telah melakukan demo dan menjelaskan

teknik-teknik molekuler dasar. Penulis juga berterima kasih atas bantuan semua pihak yang

secara langsung maupun tidak langsung telah memberikan dukungan moral maupun material

kepada penulis sehingga penulis dapat membuat makalah ini dengan baik dan benar.

Penulis berharap informasi-informasi yang terdapat dalam laporan ini dapat berguna

bagi pembaca. Penulis menyadari bahwa laporan ini masih terdapat banyak kekurangan, maka

penulis mohon maaf apabila terdapat kesalahan kata maupun informasi yang kurang berkenan

di hati pembaca. Untuk itu, penulis mohon saran dan kritik yang membangun dari para

pembaca. Terima kasih.

Depok, Maret 2015

Penulis

iii

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ............................................................................................................... ii

DAFTAR ISI ............................................................................................................................ iii

BAB I PENDAHULUAN ......................................................................................................... 1

1.1. Latar Belakang ................................................................................................................ 1

1.2. Rumusan Masalah ........................................................................................................... 2

1.3. Tujuan Penulisan ............................................................................................................. 2

1.4. Metode Penulisan ............................................................................................................ 2

1.6. Sistematika Penulisan ...................................................................................................... 2

BAB II ISI .................................................................................................................................. 4

2.1. POLYMERASE CHAIN REACTION ........................................................................... 4

2.2. PURIFIKASI HASIL PCR ............................................................................................. 6

2.3. SDS-PAGE ...................................................................................................................... 8

2.4. PEMBAHASAN ........................................................................................................... 13

BAB III KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................................. 20

3.1. Kesimpulan.................................................................................................................... 20

3.2. Saran .............................................................................................................................. 20

DAFTAR PUSTAKA .............................................................................................................. 21

1 | P a g e

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA

secara in vitro untuk menghasilkan sekuens DNA spesifik dalam jumlah yang besar dimana

teknik ini digunakan sebagai pijakan oleh DNA sequencing. PCR merupakan suatu alat yang

alat yang relatif sederhana dan murah yang dapat digunakan untuk fokus pada suatu segmen

DNA dan menyalinnya miliaran kali. Dengan ditemukannya kedua teknik, di samping juga

teknik-teknik lain, telah merevolusi bidang sains dan teknologi khususnya di bidang diagnosa

penyakit genetik, kedokteran forensik dan evolusi molekular. Tahap awal dalam PCR adalah

isolasi dan ekstraksi DNA yang akan diperbanyak dari makhluk hidup asal.

Komponen esensial pada PCR adalah (1) dua primer oligonukleotida spesifik (masing-

masing mengandung ~20 nukleotida) yang merupakan komplemen strand berlawanan yang

memiliki sekuens DNA target; (2) sekuens template pada sampel DNA yang terbentang pada

lokasi ikatan primer dengan panjang 100-35000 bp; (3) DNA polimerase yang bersifat

termostabil, dapat bertahan pada suhu mencapai lebih dari 95oC, dan dapat mengkopikan

template DNA dengan ketelitian yang tinggi; dan (4) empat jenis DNA.

Secara umum, proses ini terdiri dari tiga bagian, yaitu (1) Denaturasi DNA dengan

peningkatan suhu mencapai 95oC; (2) Renaturasi dengan menurunkan suhu hingga mencapai

~55oC, pada tahap ini basa primer berpasangan dengan sekuens komplemennya pada sampel

DNA; dan (3) Sintesis, suhu dinaikkan kembali menjadi ~75oC yang merupakan suhu optimum

Taq polymerase yang akan mengkatalis sintesis DNA. Sintesis DNA diinisiasi pada ujung

primer 3-hidroksil dan menggunakan sumber DNA sebagai template.

Setelah dilakukan PCR, langkah berikutnya yang perlu dilakukan adalah purifikasi

hasil PCR. Secara umum, purifikasi hasil PCR dapat dilakukan secara kualitatif ataupun

kuantitatif. Pemeriksaan purifikasi bisa dengan elektroforesis agaros gel mini atau dengan

spektrofotometer nanodrop. Purifikasi ini penting terkait masalah reproduksibilitas karena

dalam pemeriksaan atau diagnosis DNA atau RNA yang digunakan harus dimurnikan terlebih

dahulu. Setelah dilakukan PCR, purifikasi amplikon DNA dapat dilakukan dengan metode atau

kit berikut yaitu Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit atau menggunakan protokol QIA

quick Purification Kits (QIAGEN). Kedua metode tersebut memiliki prinsip yang sama yang

berbeda hanya pada bagian bahan dan alat yang digunakan selama proses. Purifikasi ini

2 | P a g e

dimaksudkan guna memperoleh DNA yang murni dengan sisa primer, primer dimer, nukleotida

(sisa dNTPs), enzim polymerase, dan garam-garam dengan menggunakan membran dan

sentrifugasi.

Elektroforesis gel poliakrilamid dapat digunakan untuk pemisahan, identifikasi, dan

pemurnian protein. Teknik ini merupakan teknik sederhana, cepat, dan dapat memisahkan

molekul yang diinginkan dari matriksnya yang tidak dapat dilakukan oleh prosedur lainnya,

seperti sentrifugasi gradien.

1.2. Rumusan Masalah

Masalah umum yang diangkat dalam makalah ini adalah mengenai gambaran umum,

metode, serta alat dan bahan yang digunakan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR),

Purifikasi Hasil PCR, dan SDS-PAGE.

1.3. Tujuan Penulisan

Tujuan penulisan makalah ini adalah untuk menemukan jawaban kualitatif terhadap

rincian masalah yang tersimpul dalam ruang lingkup masalah di atas.

Kegunaan pembahasan makalah ini adalah untuk menjelaskan mengenai permasalahan

dalam bidang bioteknologi terkait dengan Polymerase Chain Reaction (PCR), Purifikasi Hasil

PCR, dan SDS-PAGE.. Penulis berharap melalui makalah ini, pembaca dapat memperluas

pemahaman bioteknologi farmasi terutama dibidang yang dibahas pada makalah ini.

1.4. Metode Penulisan

Metode penulisan yang digunakan dalam penyusunan makalah adalah metode pustaka.

Metode pustaka mencakup pencarian data dari berbagai sumber. Sumber yang penulis gunakan

berupa literatur, buku, situs dan jurnal ilmiah di internet.

1.6. Sistematika Penulisan

Untuk memperoleh gambaran yang utuh dan terpadu, maka penulis telah menyusun

sistematika penulisan sebagai berikut:

Bab 1: Pendahuluan

Menguraikan mengenai penulisan makalah ini dan terdiri atas latar belakang masalah,

perumusan dan ruang lingkup, tujuan, kegunaan penulisan, metode yang digunakan, serta

sistematika penulisan.

Bab 2: Isi

3 | P a g e

Terdiri atas permasalahan utama yang dibahas dalam makalah ini yaitu mengenai

gambaran umum Polymerase Chain Reaction (PCR), Purifikasi Hasil PCR, dan SDS-

PAGE.

Bab 3: Penutup

Terdiri atas kesimpulan dan saran.

4 | P a g e

BAB II

ISI

2.1. POLYMERASE CHAIN REACTION

A. Tujuan

Polymerase Chain Reaction adalah teknik molekuler yang dilakukan bertujuan untuk

mengamplifikasi fragmen DNA dengan menggunakan suatu pasangan primer yang

dirancang dengan khas

B. Alat dan Bahan

Alat:

- Mesin Thermal Cycler

- Sentrifuge mikro

- Mixer (vortex)

Bahan:

- DNA template (DNA Genomik dalam 25L TE)

- Pasangan primer oligonukleotida (primer 16s rDNA)

- Enzim DNA Taq polymerase

- Nukleotida bebas (dNTPs = dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

C. Cara Kerja

1. Membuat PCR master mix dengan volume akhir 25 mL dengan komposisi sebagai

berikut:

a. Dapar 2.5L

b. Enzim DNA Taq polymerase 1 L

c. dNTP 0.5 L

d. Primer forward

e. Primer reverse

f. ddH2O 18L

Jika contoh yang akan diamplifikasi lebih dari satu, maka masing-masing

jumlah komponen tersebut dikalikan dengan jumlah contoh ditambah satu (n+1),

kemudian campur di dalam satu tabung mikro 1.5 mL (pembuatan master mix).

5 | P a g e

Jika volume akhir 50L, maka jumlah masing-masing komponen harus

disesuaikan.

2. Mencampurkan 1L hasil ekstraksi DNA ke dalam master mix yang telah dialiquot

dalam tabung PCR 0.2 atau 0.5L, kemudian dicampur dengan mixer (vortex)

3. Mensentrifugasi singkat (Spindown) campuran dengan sentrifuge mikro, kemudian

ditempatkan pada mesin PCR

4. Mengatur mesin PCR sesuai kondisi yang sudah dirancang sebelumnya sebagai berikut:

a. Pre-denaturasi : 94oC; 5 menit

b. Denaturasi : 94oC; 30 detik

c. Annealing : 55oC; 30 detik

d. Extension : 72oC; 1 menit

e. Jumlah siklus : n= 25-30 (b-c-d)

f. Post-extension : 72oC; 20 menit

g. Hold : 16oC

5. Memvisualisasi hasil PCR dan purifikasi dengan elektroforesis agarose gel mini atau

secara kunatitatif dengan spektrofotometer nanodrop.

6 | P a g e

2.2 PURIFIKASI HASIL PCR

A. Tujuan

Purifikasi hasil PCR adalah teknik yang bertujuan untuk memperoleh DNA hasil PCR

(DNA amplikon) yang murni

B. Alat dan Bahan

Alat:

- Sentrifuge mikro

- Tabung mikro 1.5mL baru dan steril

- Tabung penampung 2mL, tersedia di dalam kit

- Pisau silet atau cutter yang baru dan steril

Bahan:

- Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit yang terdiri dari:

Dapar DF

Wash buffer + Etanol 95%

Kolom DF

ddH2O

C. Cara Kerja

1. Melakukan elektroforesis 20 L DNA hasil amplifikasi PCR dan 5 L loading

buffer pada gel agarose 1%

2. Memotong pita yang diinginkan dengan menggunakan pisau silet atau cutter yang

baru dan steril lalu memindahkan irisan gel ke dalam tabung mikro 1.5 mL baru dan

steril.

3. Menambahkan 300 L dapar DF, vortex dan inkubasi pada 55-60oC selama 10-15

menit hingga irisan gel terlarut sempurna. Selama inkubasi tabung mikro dibolak-

balik setiap 2-3 menit. Kemudian campuran tersebut didamkan dingin pada suhu

kamar

4. Memipet campuran tersebut dan memasukkan ke dalam kolom DF yang terpasang

pada tabung penampung kemudian mensentrifugasi pada kecepatan maksimum

(13.000 rpm) selama 30 detik. Cairan yang tertampung dibuang dan kolom DF

ditempatkan kembali pada tabung penampung.

7 | P a g e

5. Menambahkan 600 L dapar pencuci (wash buffer) yang telah ditambah etanol dan

sentrifugasi kembali pada kecepatan maksimum selama 30 detik. Cairan yang

terkumpul dibuang kembali dan kolom DF ditempatkan kembali dalam tabung

penampung, sentrifugasi pada kecepatan maksimum selama 3 menit sampai

membrane kolom mongering.

6. Memindahkan kolom DF yang telah kering ke dalam tabung mikro 1.5 mL yang

baru dan steril. Kemudian tambahkan 25 L akuades steril (ddH2O) ke dalam

bagian tengah dari membran kolom DF agar pengendapan pada dinding kolom

dapat dihindari. Biarkan akuabides terserap selama 2 menit kemudian sentrifugasi

pada kecepatan maksimum selama 1 menit untuk mendapatkan DNA murni.

7. Menyimpan DNA pada suhu -20oC.

8. Untuk mengamati DNA hasil purifikasi secara visual, DNA dianalisis kembali

dengan elektroforesis agarose gel mini. Jika informasi sequence DNA amplikon

diperlukan, maka dapat dilakukan sequencing DNA.

8 | P a g e

2.3. SDS-PAGE

A. Tujuan

Memisahkan protein berdasarkan ukurannya dengan cara elektroforesis

B. Alat dan Bahan

Alat:

- Elektroforesis

- Sisir elektroforesis

- Mikro pipet

- Thermoblock

Bahan:

- 10% SDS (Sodium Dodecyl

Sulphate)

- Stacking gel

- Resolving gel

- 30% Acrylamide solution

- 1,5 M Tris-HCl buffer (4x)

pH 8,8

- 0,5 M Tris-HCl buffer (4x)

pH 6,8

- (4x) Tris-Glycine Reservoir

Buffer

- (5x) Sample Buffer

- 10% APS

- Running Buffer

- Staining/ Destaining

Solution

- Larutan fiksasi

- aquades

C. Cara Kerja

Pembuatan Buffer dan Larutan Pereaksi

Stacking gel

Komposisi Volume

ddH2O 3,05 ml

4x0,5 M Tris HCl

pH 6,8

1,25 ml

Akrilamid 30% 0,67 ml

APS 10% 25 l

TEMED 5 l

9 | P a g e

*Volume yang digunakan bisa berbeda-beda, namun bahan penyusun gel tetap sama

Resolving gel

Resolving

gel

4% 6% 8% 10% 12%

ddH2O 6,15 ml 5,45 ml 4,75 ml 4,15 ml 3,45 ml

4x0,5 M

Tris HCl

pH 8,8

2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml

Akrilamid

30 %

1,3 ml 2 ml 2,7 ml 3,3 ml 4 ml

APS 10% 50 l 50 l 50 l 50 l 50 l

TEMED 5 l 5 l 5 l 5 l 5 l

*Volume yang digunakan bisa berbeda-beda, namun bahan penyusun gel tetap sama

30% Acrylamide solution

30gr acrylamide : bis-acrylamide (29:1)

Dilarutkan dalam 100 ml aquabidest

Simpan di botol cokelat/tempat gelap pada suhu 40C

1,5 M Tris-HCl buffer (4x) pH 8,8

18,17 gr Tris base

4,0 ml 10% SDS, atur pH hingga 8,8 dengan HCl

Larutkan dalam 100 ml aquabidest

Simpan pada suhu 40C

0,5 M Tris-HCl buffer (4x) pH 6,8

6,06 gr Tris base

4,0 ml 10% SDS, atur pH hingga 6,8 dengan HCl

Larutkan dalam 100 ml aquabidest

Simpan pada suhu 40C

10 | P a g e

(4x) Tris-Glycine Reservoir Buffer

12 gr Tris-base

57,6 Glycine

Dilarutkan dalam 1000 ml aquabidest

Simpan pada suhu 40C

(5x) Sample buffer

3,9 ml aquabidest

1,0 ml 0,5 M Tris

0,8 ml gliserol

1,6 ml 10% SDS

0,4 ml 2-mercaptoethanol

0,4 ml 1% bromophenolblue

Disimpan dalam freezer

10% SDS

50 gr SDS dengan aquabidest hingga 500 ml, aduk hingga homogeny

Simpan pada suhu ruangan

10% APS

Larutkan 0,1 ml APS dalam 1 ml aquabidest, dibuat fresh setiap pemakaian

Running Buffer

370 ml aquabidest

125 ml (4x) reservoir buffer

5 ml 10% SDS

Campurkan semua bahan ke dalam beaker glass, aduk hingga homogen. Simpan

pada suhu 40C.

Staining/Destaining Solution

400 ml methanol

100 ml asam asetat glasial

500 ml aquabidest

11 | P a g e

1 gr Coomassie Brilliant Blue (untuk staining solution)

Tahapan Elektroforesis

Persiapan gel

Gel yang telah memadat siap digunakan untuk elektroforesis. Pasang gel pada alat,

dan keluarkan sisir dari gel.

Gel yang telah siap tetapi tidak segera digunakan untuk elektroforesis dapat

disimpan direndam dalam buffer (running buffer) atau aquadest.

Gel tidak boleh disimpan terlalu lama

Persiapan sampel

Sampel protein didenaturasi dengan menambahkan sampel buffer, lalu dipanaskan

dengan menggunakan thermoblock, pada suhu 850C selama 5 menit.

Elektroforesis

Setelah protein marker (5-8 l) dan sampel (10-15 l) dimasukkan ke dalam

sumuran (well), alat elektroforesis di set. (Semakin kecil arus, pemisahan akan

semakin baik, namun waktu akan semakin lama). Untuk running 1 gel biasanya

diperlukan waktu 120 menit dan 180 menit untuk 2 gel.

Elektroforesis dihentikan ketika semua sampel dan protein marker mencapai dasar

resolving gel.

Staining gel

Gel hasil elektroforesis digunakan untuk mengetahui ukuran protein serta

menganalisa bentuk pita proteinnya.

Gel yang telah selesai dielektroforesis difiksasi dengan merendam gel hasil

elektroforesis di dalam larutan fiksasi (10% asam asetat; 25% isopropanol; 65%

aquadest) selama 15 menit. Larutan fiksasi kemudian dibuang lalu potongan gel ini

direndam di dalam larutan staining Coomasie Brilliant Blue.

Setelah gel direndam, wadah yang berisi gel kemudian digoyangkan perlahan dan

dibiarkan selama satu malam dalam temperatur kamar.

12 | P a g e

Destaining gel

Gel kemudian dibilas beberapa kali dengan menggunakan aquadest steril atau

direndam dalam wadah plastic berisi aquadest. Gel kemudian disimpan di dalam

wadah plastic dalam keadaan terendam oleh air. Hasil staining tersebut kemudian

dibandingkan dengan penanda protein untuk mengetahui perkiraan ukuran protein

yang berhasil diperoleh.

13 | P a g e

2.4. PEMBAHASAN

Polymerase Chain Reaction

Dalam melakukan PCR, langkah yang pertama dilakukan adalah membuat master mix

yang mengandung: dapar (untuk menyesuaikan dan mempertahankan pH), enzim DNA

Taq polymerase (untuk memanjangkan primer menjadi strand DNA dari sekuens

komplementer template DNA single strand), dNTP (terdiri dari dATP, dGTP,dCTP, dan

dTTP untuk DNA sequencing sebagai prekursor nukleosida yang dibutuhkan dalam sintesis

atau pemanjangan strand DNA), primer forward dan reverse (sebagai komponen yang akan

menempel pada single straind DNA pada saat proses annealing, dimana primer forward

akan menginisiasi sintesis untai DNA dari ujung 5---3 dan primer reverse akan

menginisiasi sintesis untai DNA dari ujung 3---5), serta ddH2O (sebagai pelarut DNA).

Kemudian DNA hasil ekstraksi dimasukkan ke dalam master mix tersebut dan di vortex

dan disentrifugasi untuk selanjutnya ditempatkan pada mesin PCR. Mesin PCR diatur

sedemikian rupa agar tercipta kondisi optimal untuk berlangsungnya proses polymerase

chain reaction.

Pada tahap pertama, dilakukan predenaturasi terlebih dahulu sebagai tahap untuk

mempersiapkan tahapan denaturasi pada suhu 94oC selama 5 menit. Setelah proses

predenaturasi selesai dilaksanakan, dilakukan lah proses denaturasi. Suhu diatur menjadi

94oC agar terjadi denaturasi DNA sehingga double strand terpisah menjadi single straind.

Proses ini berlangsung selama kurang lebih 30 detik. Langkah berikutnya, suhu diturunkan

menjadi 55oC selama 30 detik sehingga basa primer berpasangan dengan sekuens

komplemennya pada sampel DNA. Proses tersebut dinamakan proses annealing.

Berikutnya adalah proses sintesis atau extention. Suhu dinaikkan kembali menjadi 72oC

selama satu menit yang merupakan suhu optimum Taq polymerase yang akan mengkatalis

sintesis DNA. Sintesis DNA diinisiasi pada ujung primer 3-hidroksil dan menggunakan

sumber DNA sebagai template. Siklus diatas dapat diulang kembali sesuai dengan jumlah

kopi DNA yang diinginkan. Selanjutnya, hasil PCR dapat divisualisasi dan dipurifikasi

pada elektroforesis agarose gel mini.

14 | P a g e

Purifikasi Hasil PCR

Purifikasi hasil PCR adalah teknik yang bertujuan untuk memperoleh DNA hasil PCR

(DNA amplikon) yang murni. Setelah dilakukan PCR, purifikasi amplikon DNA dilakukan

dengan Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit. Purifikasi ini dimaksudkan guna

memperoleh DNA yang murni dari sisa primer, primer dimer, nukleotida (sisa dNTPs),

enzim polymerase, dan garam-garam dengan menggunakan membran dan sentrifugasi

Mula-mula DNA hasil amplifikasi PCR sebanyak 20 l diambil dan dicampur dengan 5 l

loading buffer untuk dilakukan elektroforesis di gel agaros 1%. Loading buffer digunakan

untuk membantu estimasi waktu migrasi dari DNA dan mengoptimasi run time dari gel

agarose. Loading buffer juga berguna untuk menambah densitas sehingga DNA akan selalu

berada di dasar well dan sebagai pewarna untuk memudahkan peletakkan sampel DNA ke

dasar well. Pita DNA yang diinginkan diiris pada gel tersebut dan dipindahkan ke dalam

tabung mikro 1,5 ml yang baru dan steril. Ke dalam irisan gel tersebut ditambahkan 300 l

dapar DF lalu divortex dan diinkubasi pada 55-60oC selama 10-15 menit hingga larut.

Campuran didiamkan pada suhu kamar. Kemudian campuran tersebut dipipet dan

dimasukkan ke dalam kolom DF yang terpasang pada tabung penampung. Lalu

disentrifugasi pada 13000 rpm selama 30 detik. Cairan yang tertampung dibuang dan kolom

DF ditempatkan kembali pada penampung.

Pada tabung tersebut ditambahkan 600 l wash buffer yang telah ditambah etanol dan

disentrifugasi kembali dengan kecepatan yang sama selama 30 detik. Wash buffer ini

berguna untuk mencuci DNA dari pengotor-pengotor. Cairan yang terkumpul dibuang

kembali dan kolom DF dikembalikan pada tabung penampung, sentrifugasi kembali hingga

membran kolom mengering. Kolom DF yang telah kering dipindahkan ke tabung baru dan

steril 1,5 ml dan ditambahkan dengan 25 l aquabidest pada bagian tengah kolom DF. Hal

ini untuk mencegah terjadinya pengendapan pada dinding kolom. Aquabidest dibiarkan

hingga terserap lalu disentrifugasi kembali selama 1 menit untuk memperoleh DNA murni.

DNA yang telah diperoleh disimpan pada suhu -20oC.

DNA yang murni yang diperoleh tersebut dapat diamati purifikasinya secara visual secara

kualitatif dengan dianalisis pada elektroforesis agaros gel mini atau secara kuantitatif

dengan spektrofotometer nanodrop. Dengan elektroforesis agaros gel mini dapat

dibandingkan antara hasil elektroforesis DNA amplikon murni dengan penanda ukuran

molekul. Apabila DNA tersebut murni akan diperoleh bercak tunggal (1 band) yang

menandakan tidak ada komponen atau genom lain.

15 | P a g e

SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

Elektroforesis merupakan teknik pemisahan suatu molekul dalam suatu campuran di

bawah pengaruh medan listrik. Molekul terlarut dalam medan listrik bergerak atau migrasi

dengan kecepatan yang ditentukan oleh rasio muatan dan masa. Sebagai contoh, jika dua

molekul mempunyai masa dan bentuk yang sama, molekul dengan muatan lebih besar akan

bergerak lebih cepat ke elektrode. Elektroforesis gel poliakrilamid dapat digunakan untuk

pemisahan, identifikasi, dan pemurnian protein. Teknik ini merupakan teknik sederhana,

cepat, dan dapat memisahkan molekul yang diinginkan dari matriksnya yang tidak dapat

dilakukan oleh prosedur lainnya, seperti sentrifugasi gradien.

Akrilamid merupakan suatu monomer, yang jika ada radikal bebas, biasanya diberikan oleh

ammonium persulfat dan distabilkan oleh TEMED, terjadi reaksi berantai sehingga

monomer terpolimerisasi menjadi rantai panjang. Jika dalam reaksi itu ada bisakrilamid,

reaksi menjadi bersambung melintang menjadi gel yang pori-porinya ditentukan oleh

panjang rantai dan jumlah sambungan silang. Panjang rantai ini ditentukan oleh konsentrasi

poliakrilamid dalam reaksi ini (3,5%-20%) dan satu molekul sambungan silang terjadi pada

setiap 29 monomer akrilamid.

16 | P a g e

Gambar 1. Pembentukan gel poliakrilamid. Jaringan tiga dimensi terbentuk oleh

kopolimerisasi monomer teraktivasi dengan penghubung dari bis akrilamid

Gel poliakrilamid dibuat dengan cara menuangkan antar dua lempeng kaca yang

dipisahkan dengan pembatas dengan ketebalan tertentu. Gel poliakrilamid dapat berukuran

dari 5 cm sampai 50 cm panjangnya tergantung pada keperluannya dan dilakukan

elektroforesis dengan cara vertikal. SIstem ini menunjukkann tiga keunggulan daripada gel

agarosa: (1) kekuatan pemisahannya sangat besar sehingga dapat memisahkan satu pasang

basa dalam 500 pasang basa. (2) sistem ini dapat menampung jumlah sampel lebih besar

daripada agarosa. (3) DNA yang diperoleh kembali dari gel poliakrilamid sangat murni

sehingga dapat digunakan untuk keperluan percobaan mikroinjeksi embrio tikus. Selain itu

poliakrilamid tidak bereaksi dengan sampel dan tidak membentuk matriks dengan sampel.

Tabel 1. Rentang Pemisahan DNA dalam gel poliakrilamid

17 | P a g e

Bis-akrilamid diberikan dalam konsentrasi 1/30 konsentrasi akrilamid. Angka yang tertera

merupakan ukuran pasang basa dari fragmen DNA untai ganda yang migrasi bersama

pewarna.

SDS atau disebut juga dengan Sodium Lauril Sulfat adalah suatu detergent anionic,

yang apabila dilarutkan molekulnya memiliki muatan negatif. Suatu rantai polipeptida

dapat berikatan dengan sejumlah tertentu SDS sesuai ukuran molekul. Muatan negatif SDS

menghancurkan sebagian besar struktur kompleks protein, dan secara kuat tertarik kea rah

anoda (positively-charged electrode) bila ditemaptkan pada suatu medan listrik.

Komposisi gel terdiri dari stacking gel dan resolving gel. Stacking gel merupakan

gel penahan yang berfungsi untuk mengumpulkan protein yang telah diload menjadi pita

atau band yang tajam sebelum gel terpisah pada resolving gel. Sementara itu, resolving gel

merupakan gel pemisah yang memisahkan protein berdasarkan ukuran molekul. Komposisi

resolving gel biasanya yang diubah saat dilakukan optimasi gel untuk pemisahan protein.

Protein dapat dipisahkan berdasarkan ukran massanya dengan elektroforesis gel

poliakrilamid dengan sistem tegak. Sebelumnya, campuran protein dipanasi dengan

natrium dedosil sulfat (SDS), suatu detergen anionic untuk menyelubungi melekul protein.

Penyelubungan ini menyebabkan interaksi non-kovalen terganggu sehingga molekul

protein dalam struktur primer. Anion SDS berikatan dengan rantai utama dengan rasio satu

molekul SDS untuk dua residu asam amino.

18 | P a g e

Gambar 2. Alat elektroforesis gel poliakrilamid. Beberapa sampel dapat dimasukkan

dalam gel poliakrilamid. Pipet microliter digunakan untuk memasukkan larutan ke dalam

sumuran. Sampel yang bermuatan negative akan bergerak ke anoda, pada bagian bawah

gel.

Merkaptoetanol atau ditiotreitol juga ditambahkan untuk mereduksi ikatan disulfida.

Kompleks SDS dengan protein terdenaturasi mempunyai jumlah muatan negatif yang

sebanding dengan ukuran protein. Muatan negatif yang terdapat pada ikatan SDS ini jauh

lebih besar daripada muatan pada protein asli. Kompleks protein-SDS kemudian

dielektroforesis, sehingga semua molekul protein bergerak menuju kutub positif. Ketika

elektroforesis selesai, protein dalam gel dapat ditampakkan oleh pewarnaan dengan perak

atau zat warna seperti Coomassive biru, yang akan menampakkan beberapa pita.

Coomasive biru berikatan dengan protein berdasarkan interaksi ionic antara gugus sulfit

pada Coomasive biru dengan asam amino basa, dan interaksi hidrofobik cincin Coomasive

biru. Pewarna mampu menghasilkan pita pada jumlah protein 10-100ng.

19 | P a g e

Gambar 3. Elektroforesis gel poliakrilamid-SDS. Subunit A dan B terikat dengan ikatan

disulfide yang direduksi menjadi SH sehingga menjadi dua polipeptida. Protein

terselubungi SDS menjadi bermuatan negatif. Mobilitas protein dalam gel poliakrilamid-

SDS berbanding terbalik dengan log ukuran molekulnya.

Protein kecil akan bergerak cepat melewati gel, sedangkan protein besar bergerak lebih

lambat. Mobilitas kebanyakan polipeptida di bawah kondisi seperti ini berbanding lurus

terhadap log ukurannya. Beberapa protein yang banyak mengandung karbohidroksida dan

protein membrane tidak mengikuti aturan ini. Akan tetapi metode SDS-PAGE

(elektroforesis gel poliakrilamid-SDS) ini sangat cepat, peka dan dapat menghasilkan

pemisahan yang baik. Sebanyak sekitar 0,1 mg (2pmol) protein menghasilkan pita yang

jelas dengan pewarna Coomasive biru. Pada jumlah yang kecil (0,02 mg) dapat dideteksi

dengan pewarna perak. Protein dengan perbedaan ukuran sekitar 2% (misalnya 40 dan 41

kD, yang berbeda 10 residu) biasanya dapat ditunjukkan.

20 | P a g e

BAB III

KESIMPULAN DAN SARAN

3.1. Kesimpulan

PCR merupakan tahap mengamplifikasi fragmen DNA yang telah diperoleh.untuk

selanjutnya dipurifikasi agar memperoleh DNA hasil PCR (DNA amplikon) yang murni.

Sementara itu elektroforesis gel poliakrilamid (SDS-PAGE) dapat digunakan untuk

pemisahan, identifikasi, dan pemurnian protein. Teknik ini merupakan teknik sederhana,

cepat, dan dapat memisahkan molekul yang diinginkan dari matriksnya yang tidak dapat

dilakukan oleh prosedur lainnya, seperti sentrifugasi gradien.

3.2. Saran

Produk Bioteknologi PCR sangat bermanfaat untuk meningkatkan efektivitas untuk

diagnosa penyakit. Penting untuk terus mengembangkan produk-produk bioteknologi

untuk meningkatkan kualitas kesehatan Indonesia. Selain itu, perkembangan bioteknologi

yang semakin pesat ini membutuhkan penelitian lebih lanjut untuk menghasilkan produk-

produk bioteknologi yang lebih bermanfaat dan ekonomis bagi kehidupan makhluk hidup.

21 | P a g e

DAFTAR PUSTAKA

Glick, B.R., Pasternak, J.J., Patten, C.L. (2010). Molecular Biotechnology:

Principles and Applications of Recombinant DNA 4th Edition. Washington

DC: ASM Press

Malik, Amarila. (2015). Protokol Kerja (1) Ekstraksi DNA dan PCR Dasar.

Depok: Fakultas Farmasi Universitas Indonesia

Sudjadi. (2007). Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Penerbit Kanisius.

Suharsono dan Wisyastuti, U. (2006). Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik

Pengklonan Gen. Bogor: Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan

Bioteknoloi Institut Pertanian Bogor.

Walsh, Gary. (2007). Pharmaceutical Biotechnology: Concepts and Applications.

West Sussex, England: John Wiley & Sons, Ltd.