evaluacion del laboratorio en desordenes de celulas fagociticas
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Resumen acerca de las pruebas que se emplean para avaluar las inmunodeficiencias primarias en especial los trastornos de células fagocíticas.TRANSCRIPT
“EVALUACION DEL LABORATORIO EN DESORDENES DE
CELULAS FAGOCITICAS”
Evaluación del laboratorio en los trastornos de células fagocíticas Página 2
Universidad Autónoma de Chiriquí
Vicerectoría de Investigación y Postgrado
Maestría en Laboratorio Clínico
Inmunología Clínica
Presentado por:
Lic. Lisseth Samudio
CIP: 4-736-115
Facilitador: Dr. Moisés Alvarez
Médico especialista
David-Chiriquí
Fecha: 15 de Agosto del 2012
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INTRODUCCIÓN
Las inmunodeficiencias primarias son un grupo heterogéneo de desordenes generalmente
hereditarios que afectan la inmunidad celular (Linfocitos T) y humoral (Linfocitos B)
especifica o los mecanismos de defensa no específicos del huésped (Células fagocíticas,
citocinas, proteínas del complemento, entre otros).
La importancia de la evaluación del laboratorio en estos trastornos radica en que en su
mayoría aparecen durante los primeros estadíos de vida, no obstante algunas de estas
condiciones se desarrollan durante la etapa adulta. Durante los últimos años ha aumentado
su incidencia y afecta a personas de ambos sexos.
Este trabajo tiene como objetivo, presentar cuales son las pruebas de uso diagnóstico en
estos trastornos, dividiéndolas en pruebas cuantitativas y cualitativas.
Iniciamos con la descripción general de las inmunodeficiencias primarias las cuales
engloban a los trastornos inespecíficos como los de las células fagocitarias. Luego
describimos los tipos de células que participan en la función fagocitaria.
Por último, evaluamos y describimos las pruebas del laboratorio para evaluar los trastornos
de células fagocitarias.
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Generalidades
Cuando existe una deficiencia de alguno de los componentes del sistema inmune,
aparecen las enfermedades que llamamos inmunodeficiencias primarias. En ellas, el
defecto se circunscribe en general a un sólo aspecto de la respuesta, por lo que se pueden
catalogar en inmunodeficiencias específicas (si se afecta la parte específica de la respuesta
inmunitaria, es decir, los linfocitos B o T) o inespecíficas, si afectan a la porción
inespecífica de la respuesta (células fagocíticas y complemento).
La alteración en las inmunodeficiencias primarias existe desde el nacimiento aunque su
expresión puede ser posterior. La mayoría se transmiten de padres a hijos a través de los
genes, por lo tanto son hereditarias. Según el componente del sistema inmune afectado, se
pueden considerar cuatro grandes grupos de inmunodeficiencias primarias:
1. Deficiencias de células T. ej. Sindrome de Digeorge
2. Deficiencias de células B. ej. Agamaglobulinemia, Síndrome de hiper IgM,
Deficiencia selectiva de IgA.
3. Deficiencias de los fagocitos. ej. Enfermedad Granulomatosa crónica, Chediak
Higashi
4. Deficiencias del complemento
El 18% de las deficiencias primarias corresponden a las células fagocíticas. (S.
Manrique). Los fagocitos son células especializadas del sistema inmune cuya principal
función es la de ingerir y destruir microorganismos. Estas células, como algunas otras en el
sistema inmune, se desarrollan a partir de células madre en la médula ósea. Habiendo
madurado, emigran a todos los tejidos del cuerpo, pero son especialmente prominentes en
el torrente sanguíneo, bazo, hígado, ganglios linfáticos y pulmones.
www.primaryimmune.org/pubs/book_pats/esp_resources.pdf
Hay diversos tipos de fagocitos. Leucocitos polimorfonucleares (neutrófilos o
granulocitos) que son encontrados en el torrente sanguíneo y pueden emigrar a sitios de
infección en cuestión de minutos. Son estas células fagocíticas las que aumentan en número
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en el torrente sanguíneo durante una infección y son en gran parte responsables por un
recuento elevado de glóbulos blancos en la sangre cuando existe una infección. Son
también los fagocitos los que dejan el torrente sanguíneo y se acumulan en los tejidos
durante las primeras horas de la infección, y son responsables por la formación de “pus”.
Figura No1.
Figura No1. Fagocitosis. http://stephanie-da-silva-gomes.blogspot.com
Los monocitos, otro tipo de células fagocíticas, se encuentran también circulando en
el torrente sanguíneo. Estos también forran las paredes de los vasos sanguíneos en órganos
como el hígado y bazo. Aquí capturan microorganismos mientras pasan por la sangre.
Cuando los monocitos dejan el torrente sanguíneo y entran a los tejidos, estos cambian en
forma y tamaño y se convierten en macrófagos.
www.primaryimmune.org/pubs/book_pats/esp_resources.pdf
Las células fagocíticas cumplen un número de funciones críticas en la defensa del
cuerpo contra infecciones. Tienen la habilidad de dejar el torrente sanguíneo y moverse
dentro de los tejidos hacia el lugar de la infección. Una vez que se encuentran en el lugar de
la infección, ingieren al microorganismo invasor. La ingestión del microorganismo por las
células facocíticas se vuelve más fácil cuando los microorganismos se encuentran cubiertos
ya sea por el anticuerpo, por el complemento o por ambos. Habiendo ingerido al
microorganismo, el fagocito inicia una serie de reacciones químicas dentro de la célula, lo
cual resulta en la muerte del microorganismo.
www.primaryimmune.org/pubs/book_pats/esp_resources.pdf
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Las anomalías en la función de las células fagocitarias afectan a la inmunidad innata,
haciendo que los pacientes sean susceptibles a enfermedades bacterianas de repetición.
Clasificación
Las alteraciones de células fagocíticas pueden ser cuantitativas (siendo las más
frecuentes las neutropenias) o cualitativas. Estas últimas pueden presentarse a varios
niveles de la actividad funcional de los fagocitos: en la adhesión, la fagocitosis, la
producción de peróxido de hidrógeno, etc. La mayoría de estas alteraciones son secundarias
a fármacos o a enfermedades concomitantes. Las congénitas son raras pero, en general, son
mucho más graves, salvo excepciones como el déficit de mieloperoxidasa, que es la más
frecuente y es asintomática. Sin embargo, otras como el déficit de adherencia leucocitaria,
el síndrome de Job, el síndrome de Chediak-Higashi o la enfermedad Granulomatosa
Crónica, cursan con infecciones graves, que pueden producir la muerte a edades tempranas.
Diagnóstico
La valoración de la inmunocompetencia en un individuo con sospecha de
inmunodeficiencia primaria requiere de un análisis cuantitativo, cualitativo o estructural y
de estudios funcionales que permitan detectar alteraciones en sus mecanismos de defensa.
El diagnóstico comenzará descartando formas secundarias, y a continuación se estudiarán
las congénitas, empezando por las más frecuentes, basándose en datos clínicos claves o de
laboratorio sencillos de obtener (ej. anemia hemolítica, déficit de mieloperoxidasa,
anomalías en la granulación, dosificación de inmunoglobulinas e IgE) hasta llegar a
estudios más complejos, por citometría de flujo o secuenciación génica.
Los signos clínicos que deben despertar una alerta inmediata dirigida a descartar una
deficiencia en las células fagocíticas son: linfadenopatía crónica y/o supurativa; retardo o
mala cicatrización de las heridas; úlceras necróticas no supurativas; caída tardía del cordón
umbilical (mayor de 20 días); discromías (albinismo oculocutáneo parcial) y fotofobia;
gingivoestomatitis severa y perio-dontitis; paroniquia recurrente; eczema crónico; abscesos
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"fríos"; enfermedad inflamatoria intestinal; obstrucción granulomatosa del intestino o
aparato urinario; infecciones severas como absceso piógeno hepático o pulmonar,
osteomielitis multifocal y/o de huesos cortos; sepsis; neumonías supurativas y
neumatoceles perennes.
Edad de inicio: En la mayoría de los casos severos, las infecciones se inician durante el
primer año de vida. En las formas autosómicas recesivas de la enfermedad granulomatosa
crónica, se pueden presentar casos de inicio tardío y menor severidad clínica.
De acuerdo con el mecanismo de defensa que se quiere evaluar existen diferentes estudios
que se pueden organizar por niveles de complejidad.
I Primera etapa: Estudios básicos de laboratorio
Hemograma completo con eritrosedimentación, extendido de sangre periférica y
recuento plaquetario. Se debe prestar atención ante la presencia de los siguientes hallazgos,
que sugieren el diagnóstico de una deficiencia en las células fagocíticas: granulocitopenia,
neutropenia, leucocitosis aún en ausencia de infección, eosinofilia, gránulos anormales en
las células de las diferentes series (pero en especial en los granulocitos), anemia moderada
a severa, especialmente con características de cronicidad.
Estudio de la etiología de las infecciones y su sensibilidad. El déficit en la función
de las células fagocíticas se asocia con infecciones producidas por: Staphylococcus aureus,
Pseudomonas spp, Serratia marsescens, Klebsiella spp, E. coli, Burkholderia cepacia,
Proteus spp, Aspergillus spp, Candida albicans, Nocardia spp.
En las alteraciones combinadas de la inmunidad celular y los fagocitos, se
encuentran infecciones por: Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Streptococcus
pneumoniae, Candida albicans, Aspergillus spp y bacilos gram negativos.
Electroforesis de proteínas séricas. Con la determinación de las proteínas totales, su
distribución y la relación albúmina/globulinas se establece un importante parámetro del
estado nutricional del paciente, para descartar deficiencias de origen carencial. Es común
encontrar una hipergamaglobulinemia reactiva ante los procesos infecciosos. Ofrece una
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visión general de la composición y distribución de las proteínas circulantes del paciente.
Con la determinación de las proteínas totales se deben considerar los siguientes aspectos:
• Aproximadamente el 90% de la fracción α-1 antitripsina, cuya deficiencia es una causa de
infecciones recurrentes especialmente del aparato respiratorio. Esta fracción se encuentra
elevada en la ataxia telangiectasia por un aumento en la producción de a fetoproteína.
• Los factores del complemento más importantes se encuentran representados en la fracción
β.
• En la fracción γ migran las diferentes inmunoglobulinas séricas y el mayor porcentaje
corresponde a la IgG, por lo tanto con este examen se puede detectar fácilmente una
disminución de inmunoglobulinas. Se considera hipogamaglobulinemia la presencia de
menos de 500 mg/dl en esta fracción y agamaglobulinemia cuando los niveles son menos
de 200 mg/dl. En individuos inmunocompetentes o en deficiencias de células fagocíticas o
del complemento es común encontrar una hipergamaglobulinemia reactiva ante los
procesos infecciosos.
Estudios imagenológicos cuando sean necesarios (Rx de tórax, TAC, etc.). Se
pueden revelar hallazgos como la presencia de neumonías supurativas con desarrollo de
neumatoceles y empiemas, abscesos hepáticos.
Si se confirma un diagnóstico de inmunodeficiencia primaria, se debe realizar el
árbol genealógico familiar con el mayor número de generaciones posibles.
II. Estudios de la segunda etapa
1. En todo paciente con sospecha de inmunodeficiencia celular se debe descartar
una infección por el VIH.
2. Reducción en placa del Nitroazul de Tetrazolio (NBT) por los neutrófilos de
sangre periférica (en reposo y activados con PMA). Evalúa la activación del
complejo enzimático NADPH-oxidasa de los fagocitos.
3. Si se sospecha una neutropenia cíclica, realizar al menos dos leucogramas por
semana, durante 6 semanas. Con el fin de observar la típica caída de las cifras
de neutrófilos circulantes durante la crisis de la enfermedad y el ascenso unos
pocos días después con la recuperación clínica.
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4. La confirmación de una deficiencia de adhesión leucocitaria tipo I se hace
mediante la evaluación de las β2 integrinas leucocitarias (CD11a, b, c/CD18) en
la superficie de los glóbulos blancos por citometría de flujo.
5. Anticuerpos antineutrófilos (anti NA1, NA2, NB1) por inmunofluorescencia
indirecta o aglutinación; importantes para descartar una neutropenia
autoinmune. La detección de anticuerpos antineutrófilos ha sido particularmente
complicada por las características propias del granulocito, agregabilidad,
modulación de membrana y escasez de células.
6. Estudio de la explosión respiratoria por medio de citometría de flujo midiendo la
oxidación de la rodamina 123. Esta técnica permite confirmar los defectos en la
explosión respiratoria de las células fagocíticas y al mismo tiempo cuantificar la
severidad de la deficiencia, así como detectar las madres portadoras de un
defecto molecular en la forma de enfermedad granulomatosa crónica ligada al
cromosoma X.
7. Biopsia de médula ósea: útil en el diagnóstico de la Disgenesia Reticular y la
Enfermedad de Kostmann.
8. Cuantificación de subpoblaciones de linfocitos en sangre periférica por
citometría de flujo: porcentaje y valor absoluto de los linfocitos CD3+, CD4+,
CD8+ y CD16+/CD56+. Los resultados se deben analizar teniendo en cuenta los
valores establecidos para la edad.
9. Análisis de otras moléculas de superficie de los linfocitos, utilizando la
citometría de flujo: expresión de moléculas del complejo mayor de
histocompatibilidad (para diagnóstico del síndrome del linfocito desnudo), CD7,
cadena gamma común del receptor de IL-2, CD154.
10. Dosificación de inmunoglobulinas séricas (IgG, IgA, IgM, IgE: se realizan
cuando se sospeche una IDSC; si las cifras de IgG son anormales se deben
avaluar también los linfocitos CD19+ en sangre periférica. Se deben tener en
cuenta los niveles establecidos para la edad para definir una deficiencia
cuantitativa (media geométrica +/- 2SD). Cifras elevadas de IgE sérica se
encuentan característicamente en algunas formas de IDSC y en los síndromes de
Omenn, Nezelof y Wiskott-Aldrich.
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11. Cuando no se encuentren deficiencias cuantitativas en la imunidad humoral,
pero existan infecciones bacterianas recurrentes, se recomienda evaluar
funcionalmente la producción de anticuerpos específicos en respuesta a los
antígenos suministrados en la vacunación: para determinar la respuesta ante
antígenos proteicos se determinan anticuerpos contra hepatitis B, rubéola o
sarampión; para analizar la respuesta a poisacáridos se analizan los anticuerpos
contra diferentes serotipos de neumococo.
12. Cuando se sospecha un Síndrome de Hiper-IgE: se debe realizar dosificación de
IgE sérica; en los mayores de 1 año están indicadas las pruebas de
hipersensibilidad retardada, por ejemplo 0,1 ml de Candida intradérmicos; se
considera positiva una induración mayor de 5 mm leída a las 48 horas. Debido a
que en esta inmunodeficiencia se ha reportado una deficiencia cualitativa en la
producción de anticuerpos, se sugiere evaluar también funcionalmente la
producción de anticuerpos específicos en respuesta a los antígenos
suministrados en la vacunación: para determinar la respuesta ante antígenos
proteicos se determinan anti-cuerpos contra hepatitis B, rubéola o sarampión;
para analizar la respuesta a polisacáridos se analizan los anti-cuerpos contra
diferentes serotipos del neumococo.
Debido a las implicaciones que tiene una inmunodeficiencia primaria, todo diagnóstico de
inmunodeficiencia por alteración en las células fagocíticas debe estar respaldado por una
segunda prueba de laboratorio confirmatoria.
III. Estudios de la tercera etapa
En los pacientes con sospecha de Síndrome de Hiper-IgE: evaluación funcional por
cultivos de células mononucleares de sangre periférica estimuladas con mitógenos y
antígenos, para determinar la producción de citoquinas y la proliferación. También se puede
realizar cultivo mixto de linfocitos.
Evaluación de la quimiotaxis in vitro (en gel de agarosa) de los neutrófilos de
sangre periférica.
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Estudio de la explosión respiratoria de los neutrófilos: cuantificación de la
producción de anión superóxido por espectrofotometría o quimioluminiscencia;
determinación de la producción de peróxido de hidrógeno por citometría de flujo
(Dihidrorodamina 123).
Determinaciones enzimáticas: G6PDH, mieloperoxidasa.
Estudio por citometría de flujo de la expresión de: moléculas de adhesión como las
Beta-2 integrinas leucocitarias (CD11/CD18) y la L-selectina, FcR gamma II (CD32),
receptores para fragmentos del complemento (CD35, CD11b/CD18). Estos estudios son
útiles para descartar entidades como las deficiencias de adhesión leucocitaria.
Western blot: para evaluar las proteínas del sistema NADPH-oxidasa: gp91-phox,
p22-phox, p47-phox, p67-phox. Esta técnica analítica es usada para detectar proteínas
específicas en una muestra determinada (una mezcla compleja de proteínas, como un
extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al
criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas
posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una membrana
adsorbente (típicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la proteína de
interés con anticuerpos específicos contra ella. Finalmente, se detecta la unión antígeno-
anticuerpo por actividad enzimática, fluorescencia entre otros métodos. De esta forma se
puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto y analizar su cantidad relativa
respecto a otras proteínas.
Estudios genético-moleculares para la caracterización de mutaciones en las
diferentes inmunodeficiencias.
Cuando estén indicados: caracterización del HLA en los afectados y familiares, y el
cariotipo.
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Pruebas para medir la función de las células fagocíticas:
Los defectos en la función de los neutrófilos se pueden clasificar como cuantitativos
o cualitativos. En los trastornos cuantitativos el número total de neutrófilos de función
normal se encuentra bastante disminuido. En los trastornos cualitativos el número total de
neutrófilos se encuentra normal pero no pueden ejercer sus funciones microbicidas
normales (Stites, 1999).
Para poder evaluar el tipo de defecto que presentan estas células existen varias
clases de pruebas de laboratorio como la reducción de NBT, la medición de radicales libre
de oxigeno y la expresión de beta-2 integrinas, entre otras.
Reducción de NBT
La muerte de un microorganismo después de su fagocitosis se debe a la producción
de iones superoxido, que ayudan a la muerte del microorganismo. En algunas enfermedades
la fagocitosis no tiene ningún problema pero la producción de sustancias toxicas para el
microorganismo no ocurre eficientemente, por lo que la destrucción no se lleva a cabo
correctamente.
El azul de tetrazolio nitrado (NBT) es un compuesto claro, amarillo y soluble en
agua que al reducirse forma el formazan, tinción de color azul oscuro. Los neutrófilos
pueden reducir el colorante después de la ingestión de látex u otras partículas, subsecuente
a la descarga metabólica abrupta generada por la vía derivada del monofosfato de hexosa.
Figura No 2. Prueba de NBT. http://www-sante.ujf-grenoble.fr/CGD/diagnosis.html
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La reducción del NBT es una prueba útil para analizar la integridad metabólica de
los neutrófilos ya que la falla en la reducción del colorante se asocia con enfermedad
granulomatosa crónica por lo tanto los neutrófilos de estos pacientes no pueden dar muerte
a ciertos microorganismos intracelulares ni generar radicales superoxido.
Medición de radicales libres de oxigeno
El desbalance en la producción de especies reactivas de oxígeno y la defensa
antioxidante provoca un daño oxidativo conocido como estrés oxidativo, que lleva a una
gran cantidad de cambios fisiológicos y bioquímicos, los cuales provocan el deterioro y
muerte celular. Figura 3.
Figura 3. Producción de radicales libres a nivel mitocondrial.
http://alucinamedicina.com/tag/teorias-del-envejecimiento/
Se puede medir este tipo de daño mediante métodos directos e indirectos. Entre los
métodos directos está la medición de la concentración de agentes oxidantes, que es muy
difícil debido a su corta vida media. El uso de la espectrometría de la resonancia de
rotación (espín) de electrones, es la única técnica analítica que mide directamente las
especies oxígeno reactivas, pero debido a su costo y complejidad su aplicación en el ser
humano es difícil. Los métodos indirectos se realizan mediante la determinación de los
productos finales de la acción oxidante sobre algunas moléculas biológicas tales como los
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lípidos, ácidos nucleicos y proteínas. Los métodos para medir peróxidos lipídicos son el
patrón de oro, cuando se trata de probar el papel de los oxidantes en algún tipo de daño
celular. Es posible medir los dienos conjugados derivados del ácido araquidónico mediante
espectrofotometría UV, los hidroperóxidos lipídicos mediante cromatografía líquida de alta
presión.
Quimiotaxis
La locomoción direccional de los neutrófilos hacia diversos estímulos
quimiotacticos se cuantifican mediante el uso de la cámara de boyden. Las células por
analizar se colocan en la parte superior y se separan de la cámara inferior que contiene la
sustancia quimiotatica mediante una membrana de filtro de poro pequeño. Los neutrófilos
pueden atravesar el filtro, pero se atrapan en el tránsito hacia la membrana y luego de un
periodo de incubación, el filtro se tiñe y se observa al microscopio. Figura No 4
Fig.3 Quimiotaxis. http://es.wikipedia.org/wiki/Ensayos_de_quimiotaxis
Fagocitosis y actividad bactericida de los neutrófilos
La ingestión de microorganismos por neutrófilos es un proceso que requiere la
producción de energía por parte de la célula fagocítica. La internación de microorganismos
recubiertos de anticuerpos y complemento se presenta muy rápido después del contacto con
neutrófilos ya que los procesos intracelulares subsecuentes dependen del éxito de la
fagocitosis. Las pruebas para fagocitosis proporcionan un método rápido y relativamente
simple para evaluar el proceso fagocítico en general.
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Adherencia
En el proceso de fagocitosis es importante el mecanismo de adhesión de las células
fagocíticas al endotelio vascular, ya que se sabe que el neutrófilo se encuentra en un estado
de “patrullaje” permanente y que el mecanismo de adherencia esta mediado por una serie
de citocinas y factores químicos que lo inducen a llevar a cabo el proceso de fagocitosis.
Figura 6.
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BIBLIOGRAFÍA
1. Morado Arias, M; Hernández Navarro, F Publicado en Medicine. 2
http://alucinamedicina.com/tag/teorias-del-envejecimiento/004;09:1303-13. - vol.09
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2. R. Buznego Sánchez*, J.E. Viñuela Roldán**, M.L. Couce Pico*, M.J. Saavedra
Pereira**, J.R. Fernández, Lorenzo*, J.M. Fraga Bermúdez* An Esp Pediatr
1996;44:176-178. Neutropenia neonatal aloinmune por anticuerpos anti-NA1.
3. http://es.wikipedia.org/wiki/Ensayos_de_quimiotaxis
4. http://alucinamedicina.com/tag/teorias-del-envejecimiento
5. http://www-sante.ujf-grenoble.fr/CGD/diagnosis.html
6. www.primaryimmune.org/pubs/book_pats/esp_resources.pdf