Uma mutação no SCARB2 é um modificador na doença de Gaucher

Universidade Federal do Maranhão – UFMA

Laboratório de Genética e Biologia Molecular – LabGeM

Liga Acadêmica de Genética Médica – LAGeM

Poena Pereira da Silva/ Ciências Biológicas – Bacharelado

Doença de Gaucher

- O que é Doença de Gaucher?

Doença de Gaucher

- Erro inato do metabolismo, autossômica recessiva;

- Deficiência da enzima glicocerebrosidase ->

glicocerebrosídeo;

- Acúmulo progressivo de gordura nos lisossomos;

- Células de Gaucher;

- Baço, fígado e medula óssea.

- O que é Doença de Gaucher? - Células de Gaucher

- O que é Doença de Gaucher? - Via metabólica

- O que é Doença de Gaucher? - Via metabólica

- O que é Doença de Gaucher? - Base Genética

Gene GBA;

Cromossomo 1;

Mais de 240 mutações;

L444P, N370S.

- O que é Doença de Gaucher? - Base genética - Sinais e sintomas

Equimose e sangramentos fáceis;

Fadiga excessiva;

Anemia;

Fraturas óssea constantes;

Dores no ossos e articulações;

Aumento do abdômen e baço.

- O que é Doença de Gaucher? - Base genética - Sinais e sintomas - Tipos da Doença de Gaucher

Tipo I - Aumento do baço, fígado;

- Deformidades ósseas.

Tipo II - Aparecimento precoce, 3 meses de vida;

- Múltiplas convulsões, hipertonia, apnéia e progressivo retardo mental;

- Mais grave, compromete o pulmão.

Tipo III - Compromete os ossos;

- Quadro neurológico menos grave;

- Aparecimento tardio dos sintomas.

Não neuropática

Neuropática

- O que é Doença de Gaucher? - Base genética - Sinais e sintomas - Tipos da Doença de Gaucher

- O que é Doença de Gaucher? - Base genética - Sinais e sintomas - Tipos da Doença de Gaucher

- Diagnóstico

Exame de sangue - Atividade da enzima glicocerebrosidase.

Amostra de tecido da pele

- O que é Doença de Gaucher? - Base genética - Sinais e sintomas - Tipos da Doença de Gaucher - Diagnóstico - Tratamento

Introdução

Grande parte da ênfase na era da genética molecular tem sido

identificar genes e mutações;

Irmãos com fenótipos diferentes mostram que outros fatores

além do genético podem influenciar;

A DG é uma deficiência hereditária recessiva que causa a um

erro ou falta de produção da glicocerebrosidase, Gcase;

Dividida em 3 grupos;

Gcase é levada ao lisossomo através do LIMP-2;

Mutação do SCARB2 (que codifica a LIMP-2) pode levar ao

quadro clínico de DG;

Introdução

Irmãos possuírem o mesmo genótipo com as seguinte alterações

no GBA c.535G>C (p.Asp140His) e c.10936G>A (p.Glu326Lys),

herdadas da mãe, e c.586A>C (p.Lys157Gln) herdada do pai;

Possuíam as mesmas alterações, porém o probando (P1)

apresentava um quadro mais grave e o seu irmão (P2) não

apresentava sinais clínicos da doença.

- Objetivo

Relacionar a mutação do SCARB2 com a doença de Gaucher e epilepsia mioclônica;

Mostrar os mecanismos envolvidos na enzima Gcase nesses pacientes.

Metodologia

Relato de Caso

Probando (P1): O paciente teve uma infância normal, com bom desempenho escolar. Aos 13 anos, iniciou um quadro de convulsões acompanhado de febre e sintomas semelhantes a gripe. Devido a alterações na EEG, iniciou-se tratamento com Hidantoína e Fenobarbital. Devido à sonolência excessiva, associou-se Primidona, melhorando o estado do paciente. Ficou bem até os 14 anos, quando sofreu um acidente que rompeu o seu baço, tendo que ser submetido a esplenectomia de urgência.

Meses após o acidente, convulsões generalizadas tornaram-se mais graves e frequentes, acompanhadas de escotomas visuais e ataques mioclônicos. Dosagem de cobre e CT de crânio normais. Aos 18 anos, sua função intelectual estava bem abaixo de acordo com a idade cronológica, com fraca memorização e conhecimento. Estava disártrico, com movimentos lentos, mioclonia e escotomas visuais. Aos 19 anos, exames revelaram uma queda da GCase e presença de células de Gaucher na medula óssea e no fígado. Função renal e auditiva normais. Paciente submetido a plasmaférese para diminuir o acúmulo de glicocerebrosídeo no cérebro, o que diminuiu a frequência das convulsões, mas continuaram as mioclonias e os escotomas visuais. Aos 20 anos, paciente apresentava fraco conhecimento, com dificuldade de nomear objetos comuns. Reflexos tendíneos profundos ausentes nos tornozelos, preservados nos outros locais.

Aos 21 anos, começou a depender de cadeira de rodas. Iniciou tratamento com apomorfina, o que diminuiu bastante a mioclonia e as fotoconvulsões. Tratamentos com bromocriptina e lítio foram iniciados, porém, foram suspensos por ineficácia ou efeitos colaterais. Com 26 anos, as mioclonias eram capazes de interromper a fala do paciente, e era totalmente desatento durante as crises. Tônus muscular bastante aumentado, níveis de vitamina B12 normais. Contraiu ITU, sendo tratada, sem presença de proteína nas EAS de controle.

Com 27 anos, o paciente se recusava a comer e perdeu peso, sendo submetido a Gastrostomia. Aos 28 anos, o paciente contraiu endocardite infecciosa, que evoluiu para óbito. À autopsia, foram encontrados: hepatomegalia, tecido esplênico acessório, osteoporose e células de Gaucher na medula óssea e linfonodos. À neuropatologia, fibrose meníngea e degeneração das colunas laterais da medula espinhal, mas sem presença de células de Gaucher. Sem alterações renais.

Metodologia

Relato de caso

Após o diagnóstico, os níveis de GCase foram medidos em seus pais e três irmãos;

Seu irmão (P2) também foi deficiente na atividade da GCase e carrega o genótipo GBA idêntico. Um exame completo aos 26 anos era normal, e um exame no baço e fígado mostrou o baço muito maior que seu limite normal. Ele manteve-se saudável sem hepatosplenomegalia palpável, dor óssea, episódios de hemorragia, convulsões ou comprometimento cognitivo. Agora 60 anos de idade, ele tem seu próprio negócio e tem trabalhado em profissões fisicamente exigentes. Ele não recebeu terapia de reposição enzimática;

A mãe do probando, uma portadora em seus 80 anos, também não tem nenhum comprometimento cognitivo ou neurológica. Sua genótipo GBA foi c.535G> C (p.Asp140His) + c.10936G> A (p.Glu326Lys) / WT.

Metodologia

Amostra dos pacientes - Linfócitos, linfoblastos ou fibroblastos;

- Irmãos e mãe do probando;

- 13 pacientes com DG epilepsia mioclônica;

- 40 controles;

- Protocolos aprovados pelo Institute NIH Review Board.

Sequenciamento de DNA/cDNA - DNA isolado dos fibroblastos dos irmãos, pacientes com

DG e controles;

- RNA -> cDNA.

exon 1-1F: 5’- GTCTTCGACGCCTCTGCGGC-3’ exon 12-1R: 5’-CAACTCATGGGTATTGCC-3’ exon 12-8F: 5’-GGTAGCTTCATCCAATATATC-3’ exon 12-2R 5’- GTGAACCAACTGTATAAGCTAC-3’

Metodologia

Os plasmídeos e a transfecção

- Vetor de expressão neo-pCMV6;

- Tipo selvagem LIMP-2 e a mutação c.1412A>G;

- Os fibroblastos do irmão do probando (P2) foram transfectadas

com SCARB2 selvagem e mutado.

Análise quantitativa de qPCR

Ensaio de atividade da Gcase

- Atividade de Gcase ensaiada em fibroblastos;

- Irmãos, mãe e controles;

- Substrato 4-metilumbeliferil-β-D-glucopiranósido;

- 3 réplicas de cada amostra.

Metodologia

SDS-PAGE and Western blotting;

Imunofluorescência e microscopia confocal;

Análise de secreção extra-celular.

Resultados

Diferentes níveis de atividade GCase nos irmãos refletiu diferenças na expressão GCase

- P1 e P2 tem genótipos iguais para GBA;

- Diminuição nos níveis de Gcase em ambos os irmãos;

Resultados

Diferentes níveis de atividade GCase nos irmãos refletiu diferenças na expressão da GCase

Resultados

A nova mutação SCARB2 interferiu na redução dos níveis LIMP-2

- Os fenótipos discrepantes e diminuição na quantidade

de LIMP-2 em P1 solicitou sequenciamento do SCARB2

através do cDNA;

- Uma mutação heterozigótica, c.1412A>G; resultando na

alteração de um aminoácido , p.Glu47Gly.

- Também foi identificada na mãe e foi encontrada

apenas em um dos alelos;

- Não foi detectada no outro irmão (P2), nem nos

controles.

Resultados

As células com a mutação p.Glu471Gly SCARB2 mostraram excreção extracelular de Gcase

Resultados

SCARB2 em outros pacientes com doença de Gaucher e epilepsia mioclônica

- Avaliação das mutações de SCARB2 tinham associação com

GD e epilepsia mioclônica;

- Sequenciaram as regiões intrônicas de SCARB2 de 13

indivíduos que tinham GD e epilepsia mioclônica, mais 40

controles;

- Não detectaram diferenças que não fossem sinônimas;

- Identificaram 3 SNPs diferentes em SCARB2;

- Nenhum SNPs foi mais frequente entre os pacientes com

epilepsia mioclônica.

Discussão

A elucidação do mecanismo molecular pelo qual a Gcase é submetido

dentro do lisossomo fornece uma boa noção para triagem de

modificadores genéticos candidatos para DG;

Produção adequada de LIMP-2 pode ser um pré-requisito para o bom

funcionamento da Gcase principalmente em pacientes que possuem

deficiência nessa enzima;

O SCARB2 pode levar o paciente a desenvolver o tipo 3 de GD;

Isto é particularmente interessante à luz dos recentes relatórios que

identificam mutações SCARB2 homozigotos e heterozigotos em

pacientes com epilepsia mioclônica (Balreira et al. and Berkovic et al.,

2008, Dardis et al., 2009);

Discussão

Epilepsia mioclônica é uma característica de outras doenças que

também são erros inatos do metabolismo relacionadas ao depósito

lisossômico;

Por tanto é muito importante trabalhos que mostrem os

mecanismos e trajetos das proteínas lisossômicas afim de encontrar

tratamento mais completo para essas doenças;

Curiosamente, Glu471, o aminoácido mutado no LIMP-2, já foi

discutido na literatura e dois resíduos de aminoácidos Asp470 e

Glu471 regulam a distribuição intracelular de LIMP-2;

Com base no fenótipo clínico normal da mãe, a mutação

p.Glu471Gly sozinha não causa epilepsia mioclônica;

Discussão

O probando (P1) apresenta tanto o problema na produção de GCAse

como apresenta problemas na LIMP-2, o seu transportador;

Mutações SCARB2 não foram observadas em pacientes que não tinham

o tipo 3 da DG manifestando epilepsia mioclõnica;

Vários modificadores podem fazer com pacientes do tipo 3 (neuropática)

de DG tivessem epilepsia mioclônica;

A identificação de SCARB2 apenas no irmão com epilepsia mioclônica

segure que LIMP-2 é um modificador da DG;

Enquanto neste caso LIMP-2 parece estar associado com a epilepsia

mioclônica, outras proteínas relacionadas no transporte ou

processamento de Gcase ou LIMP-2 poderia igualmente ter afetado no

genótipo do paciente.

Uma mutação no SCARB2 é um modificador na doença de Gaucher

OBRIGADA!

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Liga Acadêmica de Genética Médica – LAGeM

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Doença de Gaucher