Validacin de Mtodos Microbiolgicos

Validar mtodos microbiolgicos requiere:

Comparar con un METODO DE REFERENCIAUsar cepas de referencia certificadas ATCC La evaluacin sistemtica de los factores que afectan la medicinEnsayos interlaboratoriosEstimacin de la IncertidumbreQUITO JULIO 2014

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Que son cepas ATCCCepas Certificadas: es un material biolgico de referencia certificado.La coleccin certifica que se suministra una determinada cepa, que es un cultivo puro, y que se han observado las convenientes pruebas morfolgicas, bioqumicas y moleculares correspondient

ATCC: American Type Culture Collectiones.QUITO JULIO 2014

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PRINCIPIO DEL SISTEMA DE LIOFILIZACINGelatina: medio transporte Leche descremada,acido ascrbico, dextrosa y carbn activado: Agentes Crioprotectores (preservan pared celular, evitan deshidratacin por congelacin). Carbn Vegetal: Neutraliza sustancias toxicas generadas por la liofilizacinQUITO JULIO 2014

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CLASIFICACION CEPAS ATCCQUITO JULIO 2014

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Definiciones:QUITO JULIO 2014

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FILTRACIN POR MEMBRANAIntroduccinLa tcnica de filtracin, en comparacin a la de Nmero Ms Probable (NMP), tiene la ventaja de requerir menor cantidad de medios de cultivo y optimizar el espacio en las estufas de incubacin. La utilizacin de las placas Petrifilm agrega a estas, las ventajas de no requerir la preparacin de medios, de reducir los tiempos de incubacin y el espacio en estufas. Adems no es necesaria la confirmacin de colonias y permite la posibilidad de informar un recuento de Escherichia coli.

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FILTRACIN POR MEMBRANA

Es adaptable para muestras de agua natural, agua residual y agua de consumo con rango

Macfarland 0,5 equivalente a 1x108 col/mlQUITO JULIO 2014

Nmero de la turbidez estndarCloruro de Bario di-hidratado (1.175%)Acido sulfrico (1%)Densidad Bacteriana aproximada correspondiente0,50,5 ml99,5 ml1 x 10810,1 ml9,9 ml3 x 10820,2 ml9,8 ml6 x 10830,3 ml9,7 ml9 x 10840,4 ml9,6 ml12 x 10850,5 ml9,5 ml15 x 10860,6 ml9,4 ml18 x 10870,7 ml9,3 ml21 x 10880,8 ml9,2 ml24 x 10890,9 ml9,1 ml27 x 108101,0 ml9,0 ml30 x 108

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Inoculacin de MuestrasSe prepararon repiques de las cepas utilizadas en caldo BHI (infusin cerebro corazn), que fueron incubados a 35 0,5C durante 18 2 horas.

Se preparan diluciones decimales en agua peptonada al 0,1 % ( recomendable agua peptona bufferada) y de acuerdo al inculo que se deseaba utilizar se elige la dilucin y el volumen a sembrar. Para evaluar el efecto matriz se utiliza agua de red inactivada con tiosulfato de sodio (0,1 mL de una solucin 3% por cada 120 mL). Para conocer el inculo terico se siembra un volumen inoculado en una placa y se incuba

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Mtodo APHA 9222 BSe filtraron 100 mL de cada muestra a travs de una membrana de 0,45 m de poro utilizando un equipo Microfil de Millipore. La membrana fue colocada sobre una placa con agar LES Endo. Las placas fueron incubadas invertidas a 35 0,5C durante 22-24 horas.Se contaron las colonias tpicas y atpicas y se sembraron al menos 5 colonias tpicas y 5atpicas en caldo Brila para confirmar la presencia de coliformes. Los tubos de caldo Brilafueron incubados a 35 0,5C durante 48 3 horas. Para la deteccin de E. coli los tubos de caldo Brila con produccin de gas fueron sembrados en caldo EC y estos fueronincubados a 44,5 0,2C durante 24 2 horas. Los tubos de caldo EC con produccinde gas fueron sembrados en agar EMB, las placas fueron incubadas a 35 0,5C durante24 2 horas. Al menos una colonia tpica fue sembrada en agar nutritivo y este fue incubado a 35 0,5C durante 24 2 horas. Se sembraron las pruebas del IMViC en caldo triptona, caldo MR-VP y agar citrato de Simmons.Los resultados fueron expresados en ufc en 100 mL de muestra.Coliformes: Si no se detectan coliformes se informa: < 1 ufc en 100 mL de muestra. Si no se confirma el total de colonias sospechosas de coliformes se aplica la ecuacin correspondiente para calcular el total de colonias de coliformes.Escherichia coli: Si no se detecta E. coli se informa No se detecta en 100 mL de muestra.Si se confirma al menos una colonia sospechosa como E. coli se informa: Se detectaen 100 mL de muestra.

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DISEO EXPERIMENTAL DE VALIDACIN

Este busca establecer la sistematica para la toma de datos con el mtodo escogido por el laboratorio con la finalidad de obtener el mayor rango posible y la mayor cantidad de matrices posibles.PROCESO DE VALIDACINQUITO JULIO 2014

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Los parmetros de validacin pueden ser pero no estar limitados a:

Lmite de deteccin (en los mtodos microbiolgicos cuantitativos).Lmite de cuantificacin ( en los mtodos microbiolgicos cuantitativos).RepetibilidadReproducibilidadRecuperabilidad (Cuando se desea determinar exactitud de un mtodo pero por falta de materiales de referencia se recurre a la adicin de un estndar de valor conocido a la muestra).Criterio de duplicado para control de calidadPara los anlisis microbiolgicos adems se podr determinar presencia o ausencia con cepas.Intervalo de trabajo (definido por LC y McF 0,5)QUITO JULIO 2014

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Para evaluar el Lmite de Deteccin y Lmite de Cuantificacin se debe:

Para ensayos microbiolgicos: Tomar 10 datos para la mayor dilucin posible y calcular la desviacin estndar.

LD= 3S LC=10 S (Poco aplicable, muy grande la dispersin)

NIVEL MAS BAJO aceptadoUso de algoritmo matemtico

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Para evaluar la repetibilidad se debe:Para mtodos microbiolgicos tomar 10 datos en cada nivel de dilucin (muestras), en condiciones de repetibilidad

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Para evaluar la reproducibilidad se debe:

Tomar 10 datos en cada nivel (muestra), en condiciones de reproducibilidad (diferentes condiciones diferentes analistas

(MUESTRAS NO ESTABLE LA REPRODUCIBILIDAD SOLO CAMBIA TECNICO ANALISTA)QUITO JULIO 2014

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Para evaluar la exactitud se debe:

Realizar el ensayo mnimo diez veces en cada muestra inoculada con cepa, en condiciones de repetibilidad, y evaluar los resultados precisin y recuperacinRECOMENDADOLa exactitud se puede tambin evaluar por la participacin en un PT, intercomparacinQUITO JULIO 2014

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Para evaluar recuperabilidad se debe:

Preparar muestras de concentracin conocida para probar la recuperabilidad.

Tomar mnimo 10 datos

Inocular en una muestra real para evaluar efecto matriz

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Realizar un anlisis de espina de pescado, o causa efecto, para determinar cules son las contribuciones de la incertidumbre.

Una vez determinadas todas las contribuciones igualar los valores a una misma unidad para que sea comparable.

La mejor opcin es demostrar que la reproducibilidad es el principal aporte de la incertidumbre (recomendado) y que las dems aportaciones estn dentro de control

Para evaluar IncertidumbreQUITO JULIO 2014

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CRITERIOS DE ACEPTACION Y RECHAZO:Los criterios de aceptacin pueden ser pero no estar limitados a:

Lmite de deteccin y cuantificacinCoeficiente de variacin %SDR (30%)F calculadaT-student% recuperabilidad (70% al 130%)

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Lmite de deteccin y cuantificacin:

Se aceptar el valor de los lmites si se cumple con las necesidades del ensayo o de la legislacin establecida.

Ejemplo: T5 RAOHE1215, INEN 1108QUITO JULIO 2014

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Para la repetibilidad y reproducibilidad:

Se determina el %SDR como mtodo para evaluar la dispersin de la serie de datos de una muestra, se aceptar si el valor es menor al 30% para ensayos microbiolgicos,

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PRUEBA t

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Se realiza una prueba de ADEVA en donde se analiza el criterio F, la F calculada debe ser menor que la F tabulada, lo que permite evaluar si existe o no diferencia significativa entre los datos obtenidos.

Si el valor de F que se obtiene es menor al F tabulado, indica que no existe diferencia significativa entre los datos y hay un solo rango de trabajo.

Si el valor de F es mayor al tabulado, indica que si existe diferencia significativa entre los datos y se deber tomar las acciones correctivas que se estimen necesarias o establecer rangos QUITO JULIO 2014

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Para la Exactitud:

Se realiza una prueba de Z-score, los valores considerados como satisfactorios sern los comprendidos entre -2 y 2. De no ser satisfactorios se debe realizar una accin correctiva para determinar las causas del desvo.

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Para la Recuperabilidad:

En mtodos microbiolgicos: Se acepta el resultado si su valor se encuentra entre en 70 y 130%

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Incertidumbre (de Medida):Es el parmetro asociado con el resultado de una medida, que caracteriza la dispersin de los valores que se pueden atribuir razonablemente al mensurando.

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Incertidumbre tipo A

Esta se determina por mtodos estadsticos y es la incertidumbre de una magnitud de entrada Xi obtenida a partir de observaciones repetidas bajo condiciones de repetibilidad, se estima con base en la dispersin de los resultados individuales. Se denomina tambin incertidumbre estndar.

Incertidumbre tipo BEsta se determina por clculos de ingeniera. Las fuentes de incertidumbre tipo B son cuantificadas usando informacin externa u obtenida por experiencia. Estas fuentes de informacin pueden ser:Certificados de calibracin.Manuales del instrumento de medicin, especificaciones del instrumento.Normas o literatura.

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IncertidumbrePara el clculo de la incertidumbre del ensayo deben identificarse todos los componentes de la incertidumbre, entre ellas pueden encontrarse:Preparacin de muestras (diluciones)Condiciones ambientalesDesviaciones personales en la lectura de instrumentos analgicos Lmites en la discriminacin o resolucin del instrumento (lecturas de placas) recuentos en placaValores inexactos de los patrones y materiales de referencia utilizadosIncertidumbres de Balanza, material volumtrico

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Para la Incertidumbre Expandida:

Se acepta el resultado si el valor obtenido, es menor al 30% del valor ms bajo del rango de trabajo evaluado.

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CRITERIOS ACEPTACION DE LA VALIDACIONQUITO JULIO 2014

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TALLER

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IDENTIFICACION FUENTES DE INCERTIDUMBREQUITO AGOSTO 2014

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PRINCIPAL APORTE DE UQUITO JULIO 2014

APORTES PIPETEO, DILUCIN Y PREPARACIN DE AGUA PEPTONADAEQUIPO MATERIALincertidumbres EXPAND INCERT EN %Incert balanza (Calibracion)0,000330,000170,085%Resolucion balanza0,000010,000000,001%Deriva de Balanza0,000010,000010,003%Pipeta 1 ml(tolerancia) de clase0,010,004622,375%Pipeta 10 ml(tolerancia) de clase0,020,001150,594%probeta 100 ml(tolerancia) de clase1,000,005772,969%INCERTIDUMBRE DE REPRODUCIBILIDADSR0,1827293,972%total0,19445100%

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DECLARACIN DE LA VALIDACIN:

El mtodo se aceptar como validado si se ha cumplido con todos los criterios de aceptacin de la validacin.

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DECLARACIN DE LA VALIDACIN:QUITO JULIO 2014

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ASEGURAMIENTO DE RESULTADOSDescribe las actividades a cumplirse en un perodo de tiempo para verificar el desempeo adecuado de un mtodo declarado como validado.

VERIFICACION DE MEDIOS, MATERIALES Y RVOS ANTES DE SU USOQUITO JULIO 2014

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CONTROL DE CALIDADGRACIASQUITO AGOSTO 2014TALLER

REPETICDUPLICADOS123342123335465.123111.6578

Estimacin del Criterio de Presicin Coliformes Fecaleslog Alog BRango de logaritmos11,361,530,169821,081,520,439331,731,810,080542,092,050,044651,811,890,0792Sumatoria de Rango de log0,8134n5,0000Rango medio0,1627Criterio de Aceptacion = 3,27*Rango(med)0,5319

PARA VERIFICAR DUPLICADOSUFC/100 MLUFC/100 MLLogALogBRango de logaritmos

1002232,00002,34830,3483CUMPLE33431,51851,63350,1150CUMPLE120552,07921,74040,3388CUMPLE42991,62321,99560,3724CUMPLE34981,53151,99120,4597CUMPLE

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