Validación de métodos analíticos

Análisis Espectrofotométrico

ELABORADO POR:

Domínguez Pérez Julio CésarMiranda Arreola Pedro de Jesús

Miranda Rivera Jorge IzhakMoran Torres AdrianaMuñiz Morales Edith

Pérez García Gabriela Ivonne

3 DE ABRIL DEL 2014

Catedrático: Alejandra Tovar Corona

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ÍNDICE

Objetivo ----------------------------------------------------------------------------------- 2

Introducción ------------------------------------------------------------------------------ 2

¿Por qué es necesaria la validación de un método?-------------------------- 3

Terminología ---------------------------------------------------------------------------- 4

Normatividad de la validación ------------------------------------------------------- 6

Parámetros de validación de métodos analíticos ------------------------------ 8

Selectividad ------------------------------------------------------------------------------ 8

Exactitud ---------------------------------------------------------------------------------- 8

Precisión --------------------------------------------------------------------------------- 9

Sensibilidad ----------------------------------------------------------------------------- 9

Linealidad y margen de error (rango) -------------------------------------------- 10

Límite de detección-------------------------------------------------------------------- 10

Límite de detección LOD------------------------------------------------------------- 11

Límite de detección LOQ------------------------------------------------------------- 11

Robustez ----------------------------------------------------------------------------------11

Curva de calibración--------------------------------------------------------------------12

¿Qué hay acerca del costo?----------------------------------------------------------13

Manejo de datos y errores experimentales--------------------------------------- 14

Conclusión --------------------------------------------------------------------------------15

Bibliografía --------------------------------------------------------------------------------15

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OBJETIVOS

Dar a conocer la función de la validación en la garantía de calidad y las buenas

prácticas de laboratorio.

Definir la validación de un método y su importancia.

¿Cómo se lleva a cabo la validación?

Manejo de datos.

INTRODUCCIÓN

La validación de método es el proceso de documentar o probar que un

método analítico proporciona datos analíticos experimentales aceptables para su

uso determinado. Estas son pruebas normalizadas que darán acreditación y

confiabilidad al laboratorio que las lleve a cabo.

Las buenas prácticas de laboratorio han sido establecidas por los

organismos mundiales como la Organización para la Cooperación y Desarrollo

Económico (OCDE) y la Organización Internacional de Estandarización (ISO).

En el mundo científico se toman como base las GLPs que se puede definir

como un conjunto de normas, procedimientos operativos y prácticas establecidas

por una organización determinada que se considera obligatoria con el fin de

garantizar la calidad y la exactitud de los resultados producido por un laboratorio.

Todos ellos contienen dos elementos comunes: los procedimientos normalizados

de trabajo (SOP) y una unidad de control de calidad (QAU). Estos procedimientos

operativos estándar proporcionan descripciones detalladas de actividades llevadas

a cabo por el laboratorio.

Aunque todas estas normas son lo más cercano a la validación, en este

documento se verá que esta unidad de garantía de calidad es en general

independiente del laboratorio y responde al gerente de la organización de éste

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¿POR QUÉ ES NECESARIA LA VALIDACIÓN DE UN MÉTODO?

1.- Por la importancia de las mediciones analíticas

En algún momento, la sociedad está apoyada por mediciones analíticas

como una forma de evaluar la salud, verificar la calidad de agua para

consumos humano etc.

El costo de realizar estas mediciones es levado y surgen costos adicionales

tomadas en base a los resultados. Por ejemplo, las pruebas que muestran

que algún alimento no es adecuado para su consumo pueden resultar en

demandas de compensación, ocasionar multas o encarcelamiento.

Claramente es importante determinar el resultado correcto y ser capaz de

demostrar lo que es.

2.- Por el deber profesional del químico analítico.

El cliente espera poder confiar en los resultados informados ya que el

laboratorio tiene un nivel de conocimiento experto. Puede cuestionar

cuando aparece alguna controversia (aquí el analista tiene la

responsabilidad de demostrar que la información que ha proporcionado es

correcta por la parte analítica del problema). La validación del método

permite demostrar que el método es “adecuado para su propósito”. Esto

lleva implícito que las pruebas realizadas son apropiadas por la parte

analítica del problema que el cliente desea resolver y que el informe final

presente los datos analíticos de tal manera que el cliente pueda entenderlos

fácilmente.

El resultado analítico debe ser lo suficientemente confiable para que cualquier

decisión basada en este pueda tomarse con confianza. Así el desempeño del

método debe validarse y debe estimarse la incertidumbre del resultado aun nivel

de confianza dado.

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TERMINOLOGÍA

Adecuación al propósito: Es la adaptación de un método para un fin previsto.

Analito: Sustancia buscada o determinada en una muestra, que debe ser

recuperada, detectada o cuantificada por el método.

Aplicabilidad: Los analitos, matrices y concentraciones para los cuales puede

utilizarse satisfactoriamente un método.

Blanco matriz: Matriz que no contiene el analito de interés u objetivo para el

método seleccionado.

Componente de la Incertidumbre: Cada una de las contribuciones a la

incertidumbre.

Criterios de aceptabilidad: Exigencias de una característica de funcionamiento o

comportamiento en función de las cuales se puede determinar que un método

analítico es adecuado para la finalidad perseguida y ofrece resultados confiables.

Ensayo: Operación técnica realizada de acuerdo a un procedimiento específico,

que consiste en la determinación cualitativa y/o cuantificación de una o más

características en un determinado producto, proceso o servicio.

Error aleatorio: Es aquel error inevitable que se produce por eventos únicos

imposibles de controlar durante el proceso de medición. Se contrapone al

concepto de error sistemático.

Error Sistemático: Es aquel que se produce de igual modo en todas las

mediciones que se realizan de una magnitud. El error sistemático está

condicionado por algún factor distinto al azar.

Idoneidad para el fin previsto: La medida en que los datos obtenidos en un

proceso de medición permiten al usuario adoptar decisiones correctas, tanto

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desde el punto de vista técnico como administrativo, para alcanzar un fin

establecido.

Incertidumbre: Parámetro asociado al resultado de una medición que caracteriza

la dispersión de los valores que podrían razonablemente ser atribuidos al

mensurando.

Intervalo de trabajo: Es el intervalo entre el nivel más bajo y más alto de

concentración que ha sido demostrado que puede ser determinado con la

precisión y exactitud requeridas para una determinada matriz.

Límite máximo permitido LMP: Nivel máximo o tolerancia establecida para un

analito en una reglamentación.

Matriz: Es el tipo de sustancia compuesta que puede o no contener al analito de

interés

Método de ensayo validado: Método de ensayo aceptado para el que se han

llevado a cabo estudios de validación con el fin de determinar su precisión y

fiabilidad para un propósito específico.

Requerimiento del método: Corresponde a aquellas características del método

que son esenciales para poder aplicarlo para el fin previsto. Cuando no están

establecidas por el cliente o usuario, debe definirlas el responsable del ensayo de

manera confiable y científica.

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NORMATIVIDAD DE LA VALIDACIÓN

Las normas de validación se regirán dependiendo del tipo de método del que

se hable, para lo cual se dividirán en dos clasificaciones:

Métodos no establecidos

Estos métodos serán aquellos que desarrollados por el laboratorio o método

nuevos (ejemplo: publicado en revista científica), o bien, a métodos que

tradicionalmente se han utilizado en el laboratorio pero que no están

normalizados.

Método normalizado

Estos métodos que ya están estandarizados tienen alguna modificación

significativa hecha por él laboratorio.

Debe tomarse en cuenta que dentro de los métodos no establecidos se

encuentran aquellos que ha marcado el laboratorio como viables pero que no han

sido acreditados.

Las Normas de Calidad

Las Normas de calidad son aquellas que dan la pauta a seguir para que el

laboratorio en cuestión se mantenga en óptimas condiciones de calidad. Se debe

tomar en cuenta que al momento de poner en marcha un laboratorio de análisis

clínicos se debe contar por default con la Norma Oficial Mexicana NOM-007-

SSA3-2011, para la organización y funcionamiento de los laboratorios clínicos,

publicada en el Diario Oficial de la Federación el 27 de febrero de 2012 (la cual

dejó sin efectos la Norma Oficial Mexicana NOM-166-SSA1-1997 para el mismo

fin), esta norma rige los lineamientos mínimos para los laboratorios de análisis

clínicos.

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Cuando un laboratorio busca demostrar la calidad de su sistema debe ser

acreditado (en México) por la Entidad Mexicana de Acreditación (EMA) la cual se

rige por la Norma NMX-EC-15189-IMNC-2008 / ISO 15189:2007, ésta norma tiene

las especificaciones que debe cumplir el laboratorio que busca la acreditación. En

el apartado “5.3 Equipo de laboratorio” será evaluado el equipo mediante la

calidad de la maquinaria utilizada para fines clínicos, así como en el apartado “5.5

Procedimientos de examen” se verificará que los métodos utilizados para cada

examen llevado a cabo en ese laboratorio estén perfectamente validados.

Los laboratorios que pasen esta evaluación aceptablemente, tendrán el

certificado ISO 15189:2007 proporcionado por la EMA.

8PARÁMETROS DE VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS

Proceso de validación La necesidad de validar un método y el procedimiento a seguir son cuestiones de

criterio profesional, el gobierno y los organismos internacionales han emitido

directrices para la validación de métodos apropiados, en particular para los

métodos de presentación de registro (resultados).

Generalmente, incluyen estudios sobre:

Selectividad Linealidad Exactitud

Precisión Sensibilidad Rango

Límite de detección Límite de cuantificación Robustez

Selectividad

Describe la habilidad de un procedimiento analítico para diferenciar entre

varias sustancias en la muestra y es aplicable a métodos en los que dos o más

componentes son separados y cuantificados en una matriz compleja.

Linealidad

Un estudio de linealidad verifica que los resultados son linealmente

proporcionales a la concentración del analito en el rango de concentración de las

soluciones de muestras. El estudio se debe realizar usando soluciones estándar a

cinco niveles de concentración, en el intervalo de 50 a 150% de los niveles de

concentración del analito diana.

Exactitud (Veracidad)

Expresa la cercanía entre el valor que es aceptado, sea como un valor

convencional verdadero (material de referencia interno de la firma), sea como un

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valor de referencia aceptado (material de referencia certificado o estándar de una

farmacopea) y el valor encontrado (valor promedio) obtenido al aplicar el

procedimiento de análisis un cierto número de veces.

Precisión

Expresa la cercanía de coincidencia (grado de dispersión) entre una serie de

mediciones obtenidas de múltiples muestreos de una misma muestra homogénea

bajo condiciones establecidas. Puede considerarse a tres niveles: repetibilidad,

precisión intermedia y reproducibilidad. Debe determinarse utilizando muestras

originales y homogéneas. Sin embargo, si no es posible obtener una muestra

homogénea puede ser determinada usando muestras preparadas o una

disolución de la muestra.

Repetibilidad

Precisión obtenida bajo las mismas condiciones de operación en un intervalo corto

de tiempo (mismo día), por un mismo analista, en la misma muestra homogénea y

en el mismo equipo.

Precisión intermedia

Precisión obtenida dentro del laboratorio por diferentes analistas, diferentes

equipos, días distintos con la misma muestra homogénea.

Reproducibilidad

Expresa la precisión entre laboratorios como resultado de estudios

interlaboratoriales diseñados para estandarizar la metodología.

Sensibilidad

La sensibilidad es la capacidad de distinguir dos concentraciones diferentes

y se determina por la pendiente de la curva de calibración. Usted puede medir las

muestras de pendiente o medida de concentración muy relacionada a

concentraciones altas, intermedias y bajas. La sensibilidad y la precisión regirán

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cuántas cifras significativas deben declararse en una medición. No informan

11,25% cuando el método es la suerte de distinguir 0,1% Diferencias (1%

Diferencias relativas).

Linealidad y margen de error (rango)

Tradicionalmente se considera que un método es lineal cuando existe una

relación directa- mente proporcional entre la respuesta obtenida cuando se aplica

el método y la concentración del analito en la matriz dentro del rango de

concentraciones del analito buscado (rango de trabajo). El rango de trabajo viene

definido por la finalidad del método y puede representar sólo una parte de la

totalidad de la línea recta. Habitualmente los criterios de aceptación implican una

prueba de la “bondad de ajuste”. Frecuentemente se utiliza como criterio de la

linealidad un coeficiente de correlación (r) elevado, del 0,99. Sin embargo, este

criterio no basta para demostrar que existe una relación lineal, por lo que cabe

considerar que se puede utilizar un método que no permita establecer un

coeficiente de correlación tan alto como el 0,99 pero permita cumplir los fines

previstos. Estos parámetros no son aplicables a los métodos cualitativos salvo si

se establece un umbral de concentración para reflejar resultados.

Límite de detección

Se trata de la concentración mínima de analito que puede ser detectada e

identificada con un determinado grado de certidumbre. El límite de detección se

define también como la concentración mínima que puede distinguirse del ruido de

fondo con un determinado grado de confianza. Para estimar el límite de detección

pueden utilizarse varios métodos, todos los cuales dependen del análisis de

especímenes en blanco y el examen de la relación entre la señal y el ruido. Por lo

general se acepta un requisito mínimo de relación señal/ruido de 3/1. El límite de

detección no es un parámetro robusto y puede resultar afectado por cambios

menores del sistema analítico (por ejemplo, temperatura, pureza de los reactivos,

efectos de matriz, condiciones instrumentales). Por tanto, es importante que este

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parámetro sea siempre verificado por laboratorios que hayan adoptado métodos

previamente validados.

Límite de detección LOD

Es la concentración más baja del analito que se puede detectar pero no

necesariamente cuantificar. En general, es el punto al que la señal del analito es

igual a tres veces el ruido de la medida.Para algunos espectrofotómetros se puede

establecer que el LOD es, aproximadamente, tres veces la desviación estándar.

Límite de detección LOQ

El LOQ es la concentración más baja del analito que se puede determinar

con una precisión y exactitud aceptables. Para calcular el LOQ se deben de definir

por tanto los límites aceptables de precisión y exactitud. Se puede aproximar a la

relación entre la precisión de la medida analítica y la sensibilidad del método.

Robustez

La robustez es una medida de la capacidad de un procedimiento analítico

de no ser afectado por variaciones pequeñas pero deliberadas de los parámetros

del método; proporciona una indicación de la fiabilidad del procedimiento en un

uso normal. En este sentido el objetivo de la prueba de robustez es optimizar el

método analítico desarrollado o implementado por el laboratorio, y describir bajo

qué condiciones analíticas (incluidas sus tolerancias), se pueden obtener a través

de estos resultados confiables.

Un método de ensayo es más robusto entre menos se vean afectados sus

resultados frente a una modificación de las condiciones analíticas.

Entre las condiciones analíticas que podrían afectar a un método se encuentran:

• Analistas

• Equipos

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• Reactivos

• pH

• Temperatura.

• Tiempo de reacción.

• Estabilidad de la muestra.

CURVA DE CALIBRACIÓN

Una curva de calibración es la representación gráfica de una señal que se

mide en función de la concentración de un analito. La calibración incluye la

selección de un modelo para estimar

los parámetros que permitan

determinar la linealidad de esa curva y,

en consecuencia, la capacidad de un

método analítico para obtener

resultados que sean directamente

proporcionales a la concentración de

un compuesto en una muestra, dentro

de un determinado intervalo de

trabajos

Las curvas de calibración están

regidas por el método de mínimos

cuadrados ya que la mayoría de las veces se trabaja en una región en la que la

curva de calibrado es recta. Éste método nos permitirá presentar la mejor línea

recta que se ajusta a los datos experimentales.

Método de los mínimos cuadrados

Este método es explicado por la ecuación de la recta:

y=mx+b

Dónde:

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m es la pendiente y b es la ordenada al origen

A partir de la curva de calibración y a fin de asegurar que la recta

encontrada con los puntos experimentales se ajuste correctamente al modelo

matemático de la ecuación se calculan los valores de la ordenada al origen, la

pendiente y el coeficiente de determinación (r2).

La linealidad de la curva de calibración (habilidad para asegurar que los

resultados obtenidos directamente o por medio de una transformación matemática

definida) es un requerimiento fundamental en la práctica del análisis químico

cuando se realizan curvas de calibración.

Por medio de las curvas de calibración se puede detectar la sensibilidad de

métodos analíticos, ya que la mayor linealidad en los resultados generará una

mayor confiabilidad en los datos y la precisión del sistema o método analítico

utilizado.

La finalidad de crear una curva de calibrado es conocer la concentración de

una muestra problema, para ello se deberá hacer disoluciones con una muestra

estándar o conocida, la cual nos indicará por medio de nuestra regresión lineal

(método de mínimos cuadrados) la concentración de esa muestra problema.

Método de adición de patrón

Consiste en añadir una cantidad conocida de analito a la muestra desconocida

y así aumentar la concentración del analito en una sustancia desconocida.

Patrón interno

Es una cantidad conocida de un compuesto diferente del analito que se añade

al problema. La señal del analito se compara con la del patrón interno para hallar

el analito presente en el problema.

¿Qué hay acerca del costo?

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Con la calidad asegurada, esto no es garantía de obtener datos exactos, es

por eso que es necesario tener documentación razonable de que es la exactitud e

identificar áreas que contribuyan significativamente a que inexactitudes puedan

ocurrir y tomar acciones para minimizarlas. Esto por supuesto no ocurre sin un

costo. Implementar un programa que asegure la calidad involucra una inversión

inicial substanciosa, tanto en tiempo como en costo. Estudios han demostrado

que implementar un programa que garantice la calidad incrementa de 20 a 30%

los gastos del laboratorio. Es por eso que es importante que el protocolo

implementado sea tan eficiente como sea posible y debe ser tomado con seriedad

por el personal del laboratorio. Sin embargo estar acreditado por estas

validaciones aumentará las ganancias a largo plazo y serán constantes mientras la

calidad se mantenga.

MANEJO DE DATOS Y ERRORES EXPERIMENTALES

Al momento de hacer análisis experimentales los datos obtenidos llevan

ciertos errores, que pueden ser determinados e indeterminados. Los errores

determinados se pueden atribuir a 3 diferentes razones: errores instrumentales,

operativos y de metodología; mientras que los indeterminados no pueden ser

predichos o estimados puesto que representan la incertidumbre experimental de

cada medición.

Los errores determinados pueden ser reducidos calibrando el equipo, un

mejor manejo manual o una mejor metodología, por otro lado los errores

indeterminados no pueden ser evitados, sin embargo, estos errores siguen una

distribución Gaussiana. Se dice que los datos experimentales siguen este tipo de

distribución porque al replicar mediciones estos se agrupan en forma de campana

alrededor de la medición media, a la proximidad de estos datos a la media se le

denomina desviación estándar. Esta representación de errores indeterminados

tiene una relación directa con el control de calidad porque muestra la proximidad

de los datos obtenidos con el valor esperado.

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CONCLUSIÓN

Con el empleo de técnicas que nos permitan validar diversos métodos analíticos

nos es posible determinar si dichos métodos nos resultan efectivos en el trabajo

de laboratorio así como evaluar la calidad de resultados que son emitidos,

basándonos en los lineamientos de las normas establecidas nacionales e

internacionales que rigen a un laboratorio y al trabajo de un Químico en General.

BIBLIOGRAFIA

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16

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management systems – Requirements.

Se pueden visitar estos sitios web para más información

UNODC http://www.unodc.org/

SWGDRUG http://www.swgdrug.org/

ISO http://www.iso.org/iso/home.htm

EURACHEM http://www.eurachem.org/