metodos de analisis microbiologicos

7/22/2019 Metodos de Analisis Microbiologicos

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MTODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICO. NORMAS ISO, UNE...

Sara Cano Ruera. Consultora Analiza Calidad.

Mircoles 5 de abril 2006.

NDICE:

1. INTRODUCCIN

2. CULTIVO DE BACTERIAS

a. Medios de cultivo

b. Toma del inculo

c. Transferencia

d. Aislamiento

3. PRINCIPALES MTODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICO DE ALIMEN-

TOSa. Microorganismos aerobios mesfilos

b. Mohos y levaduras

c. Enterobacterias

d. Coliformes totales

e. Escherichia coli

f. Staphylococcus aureus

g. Salmonella

MTODOS DE ANLISIS MICROBIOLGI-

CO. NORMAS ISO, UNE...


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ANALIZA CALIDAD Departamento de Formacin 1

Ante la diversidad de mtodos y procedimientos analticos que dificulta la comparacin yarmonizacin de los resultados obtenidos se hace necesario establecer unas normas quepermitan dicha comparacin entre los resultados que se obtienen en los distintos labora-torios.

La implantacin de las Buenas Prcticas de Laboratorio (BPL) y el Aseguramiento de laCalidad obliga a normalizar todas las operaciones que se realizan en el laboratorio. Porello se han redactado una serie de procedimientos e instrucciones de trabajo con el fin dedar uniformidad y consistencia a los anlisis de alimentos que se realizan en los laborato-rios de microbiologa y reducir los riesgos de error por parte de las personas que realizanel ensayo.

Dado que la finalidad de trabajar con BPL es la obtencin de resultados analticos de ca-lidad y conseguir la aceptacin mutua de estos resultados entre los diferentes pases, hayque seguirlas escrupulosamente. La elaboracin de estos documentos viene dada por lanecesidad de tener un sistema unificado de funcionamiento y gestin de los laboratorios,ya que hace falta asegurar la calidad e integridad de los resultados y datos obtenidos enlos anlisis, y establecer esquemas de funcionamiento equivalentes entre laboratorios.

As, se ha realizado una homogenizacin de los mtodos de anlisis de alimentos, unifi-cando sus caractersticas en base a las normas internacionales correspondientes (ISO:Internacional Standard Organisation; EN: European Norme; NF: Norme Franaise; AF-NOR: Association Franaise de Normalisation). Junto con ellos se han redactado los pro-cedimientos de preparacin de medios cultivo y reactivos necesarios para realizar losensayos, de manera que hay una explicacin de cada uno de los aspectos de los proce-dimientos de anlisis.

Los mtodos ISO (2 placas por dilucin, confirmacin de 5 colonias) suelen utilizarse co-mo mtodos de referencia; y los mtodos NF (1 placa por dilucin, confirmacin de 3 co-lonias) se suelen emplear como mtodos de rutina, siendo los dos mtodos normaliza-dos.

Con el objetivo de uniformizar todos los procedimientos del laboratorio, se han redactadounos Procedimientos Normalizados de Trabajo (PNT) que dan las instrucciones para larealizacin de todos estos documentos, tanto de mtodos de anlisis de alimentos comolos de preparacin y control de calidad de los medios de cultivo y reactivos necesariospara ellos. Los Procedimientos Normalizados de Trabajo (PNT) son un conjunto de ins-trucciones escritas de obligado y riguroso cumplimiento que describen cmo deben reali-zarse determinados mtodos de ensayo, como deben manejarse los equipos de anlisiso cmo se debe proceder ante cualquier otra actividad del laboratorio.

Las normas ISO, EN, NF, AENOR (Asociacin Espaola de Normalizacin) se van elabo-rando y revisando de forma continua. Como este proceso suele ser bastante largo, esaconsejable consultar las siguiente pginas web:

ISO: www.iso.ch

EN: www.cenorm.be AFNOR: www.afnor.fr

1. INTRODUCCIN


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AENOR: www.aenor.es

Los esquemas que se presentan son un reflejo de los medios de cultivo y de todas lasreacciones bioqumicas que en ellos se producen, al reflejar las caractersticas del medioy de las colonias que crecen en l. As, se puede saber rpidamente si el medio que seha de utilizar se necesita en frascos, en tubos (con o sin campana) o en placas, conocersu color original y observar los cambios que sufre en el proceso.


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A) MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros compo-nentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos.

a) Constituyentes habituales de un medio de cultivo:

- AGAR utilizado como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo.- EXTRACTOS son concentrados en polvo, deshidratado, de parte de rganos o

tejidos animales o vegetales para confeccionar el medio adecuado.- PEPTONAS se obtienen por digestin enzimtica o qumica de protenas animales

o vegetales. Son muy ricas en pptidos y aminocidos.- FLUIDOS CORPORALES (sangre o plasma) Se aaden a los medios de cultivo

porque contienen factores de crecimiento que facilitan el crecimiento de algunos mi-croorganismos exigentes.- SISTEMAS AMORTIGUADORES (fosfatos bisdicos y bipotsicos) se utilizan para

mantener el pH del medio en un determinado valor.- INDICADORES DE pH son indicadores cido-base con el objeto de detectar varia-

ciones de pH.- AGENTES REDUCTORES se aaden para crear condiciones que permitan el de-

sarrollo de los grmenes microaerfilos o anaerfilos.- AGENTES SELECTIVOS son sustancias que se adicionan para convertir al medio

de cultivo en selectivo.

b) Tipos de medios de cultivo:

1. Medios generales permiten el desarrollo de una gran variedad de microorga-nismos.

2. Medios de enriquecimiento favorecen el crecimiento de un determinado tipo demicroorganismo, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto.

3. Medios selectivos permiten el crecimiento de un tipo de microorganismo de-terminado, inhibiendo el desarrollo del resto.

4. Medios diferenciales ponen de relieve propiedades (normalmente bioqumicas)que un determinado microorganismos posee y de esa forma se puede distinguirese microorganismo de otros que tambin pueden crecer en ese medio.

5. Medios de transporte y mantenimiento se utilizan en la recogida, transporte yconservacin de muestras microbiolgicas. Son medios no nutrientes (los mi-

croorganismos se mantienen pero no se multiplican), semislidos, que inhiben lasreacciones enzimticas autodestructivas dentro de las clulas y evitan los efectoslaterales de la oxidacin.

c) Preparacin de medios de cultivo:

En la actualidad, la mayora de los medios de cultivo se encuentran comercializados,normalmente como productos liofilizados que es necesario hidratar. En general la prepa-racin de un medio de cultivo consiste en pesar la cantidad necesaria del polvo liofilizado,disolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo las instruccio-nes del fabricante y esterilizar la disolucin, previa comprobacin y correccin del pH sies necesario.Antes de ser esterilizados en autoclave, los medios lquidos se distribuyen en los reci-pientes adecuados (tubos o matraces) y se tapan; en ningn caso la altura del lquido en

2. CULTIVO DE BACTERIAS


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el recipiente debe exceder un tercio del volumen total de ste. Si se trata de un medioque contenga agar (slido o semislido) suele ser preciso calentarlo (al bao Mara o almicroondas) para fundir el agar antes de esterilizarlo en el autoclave. Una vez fundido sereparte, en caliente, en matraces o tubos (nunca en placas de Petri), se tapa y se esterili-za.

Finalizada la esterilizacin en el autoclave:- los medios lquidos se dejan enfriar a temperatura ambiente.- los medios slidos contenidos en tubo deben inclinarse para que al solidifarse, adop-

ten la forma de agar inclinado (slant), si tal es su finalidad.- la preparacin de los medios slidos en placa de Petri se realiza rellenando las placas

con el medio estril fundido y atemperado a unos 50C en ambiente estril. El am-biente estril se consigue en la proximidad de un mechero Bunsen o en una campanade siembra adecuada.

B) DILUCIONES DECIMALES

Primero se prepara el MACERADO INICIAL. El procedimiento ms frecuentemente em-pleado para este fin consiste en la utilizacin de un homogenizador de paletas tipo "sto-macher" en el cual se homogenizan diluyente y muestra y, de esta forma se prepara unasuspensin ms o menos homognea de alimento y microorganismos que permite la pre-paracin posterior de las oportunas diluciones que posteriormente sern utilizadas en losdiversos mtodos de recuento. Para ello se pesan aspticamente 10 g del alimento. Lapesada suele realizarse en bolsa de plstico para stomacher. Se aaden a la bolsa 90 mLde diluyente estril y se homogeniza el alimento con el diluyente en Stomacher durante 2minutos. As conseguimos el macerado inicial que es la dilucin 1:10. Si es posible esmejor pesar 25 g de alimento. Aadir 225 mL de diluyente estril y proceder como en elcaso anterior homogenizando en Stomacher durante 2 minutos.

Para preparar las DILUCIONES DECIMALES, aadir 1 mL de macerado inicial (tambinllamado dilucin madre o dilucin 1:10) a un tubo con 9 mL de diluyente, homogenizarusando un agitador excntrico de tubos de ensayo durante 20 segundos o agitando ma-nualmente. De esta forma hemos preparado la dilucin 1:100 10 2. Repetir la opera-cin anterior transfiriendo 9 mL de la dilucin 1:100 a un tubo con 9 mL de diluyente parapreparar la dilucin 1:1000 10 3. Repetir la operacin anterior tantas veces como seanecesario hasta conseguir el nmero de diluciones deseado. El nmero de diluciones quese necesita depende de lo contaminado que este el alimento. De un alimento del que sesospecha un nmero alto de microorganismos/g hay que hacer ms diluciones que deuno poco contaminado.

Para los mtodos de ausencia / presencia no es necesario preparar las diluciones deci-

males, stas se utilizan para los mtodos de contaje.

C) MTODOS DE SIEMBRA

Siembra en masa

Se caracteriza porque durante la incubacin las colonias crecen en el interior de la masadel agar.

1. Se deposita 1 mL de la muestra (si es lquida) o de cada dilucin en placas estri-les, vacas.

2. Se agrega a cada placa 15 a 20 mL del medio de cultivo a emplear, previamente

fundido y mantenido a unos 47C.


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3. Se agita moviendo la placa tapada sobre la superficie de la mesa con movimien-tos circulares y de vaivn (siempre sin levantar la placa de la mesa). Con esto seconsigue mezclar el inculo con el agar.

4. Se deja solidificar el agar a temperatura ambiente (esperar al menos media hora)y se llevan las placas a incubar (la temperatura y el tiempo de incubacin elegidosvara segn el tipo de microorganismos).

5. Pasado el tiempo de incubacin las colonias habrn crecido dentro del agar (en lamasa del agar). Elegir de entre todas las placas las dos correspondientes a aque-lla dilucin que presenten un nmero de entre 30 y 300 colonias /placa (esto pro-

porciona una precisin estadstica suficiente y no es engorroso de hacer).Para realizar el contaje, se utiliza un cuenta-colonias; se pone la placa de Petri

con la base hacia arriba y, si es preciso, se divide en sectores marcando medianteun lpiz graso a lo largo de los dimetros. El nmero de unidades formadoras de

colonia o UFC/g (o mL en muestras lquidas) de la muestra original ser:

Nmero de UFC/g = Nmero de colonias x factor de dilucin6.

Siembra en superficie

Se caracteriza porque durante la incubacin las colonias crecen en la superficie del agar.1. Se utilizan placas previamente preparadas que contienen el medio de cultivo soli-

dificado (unos 15 mL/placa).2. Se deposita en la superficie del agar 0,1 mL de la muestra o de cada dilucin.3. Luego de realizada la descarga de la muestra, se procede a extenderla sobre toda

la superficie de las placas, usando un asa de Drigalski estril.4. Esperar 2 3 minutos a que se seque el inculo.5. Se llevan las placas a incubar y se procede de la misma manera que en el caso

anterior.

D) TOMA DEL INCULO

Una vez que las colonias han crecido, puede ser necesario su confirmacin.

Si la muestra proviene de un medio lquido, el inculo se toma agitando el suavemente elasa dentro del mismo, quedando la muestra adherida por tensin superficial en el extre-mo del filamento del asa de siembra.

Si el medio es slido y se encuentra en superficie la muestra a sembrar (placa Petri), to-me una pequea porcin de cultivo mediante un ligero roce con el asa de siembra.

Si la muestra se encuentra en la profundidad del agar (tubo con agar en pico de flauta),hunda el filamento dentro del medio hasta tomar una pequea porcin de la misma. Fla-mee la boca del tubo antes de taparlo y colquelo en el soporte necesario.


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E) TRANSFERENCIA

La tcnica que se aplica depende de la consistencia de los medios de cultivo y del tipo derecipiente que los contiene.Se pueden presentar los siguientes casos:

- Siembra de medio lquido a medio lquido: El procedimiento se puede reali-zar con asa en anillo, aguja o pipeta y en tubos de ensayo, matraces o frascos.

- Siembra de medio slido a medio lquido: El procedimiento se puede reali-zar con asa en anillo o aguja y en tubo de ensayo, matraces o frascos.

- Siembra de medio slido a medio slido: El procedimiento se puede reali-zar con asa o aguja y en tubo de ensayo, ya sea en superficie o en profundi-dad o en placa Petri, en superficie.

- Siembra de medio lquido a medio slido: El procedimiento se puede reali-zar con asa en anillo, aguja o pipeta y en tubo de ensayo, ya sea en superficieo en profundidad o en placa Petri, ya sea en superficie o por homogeinizacin.

1. Tcnica de transferencia en tubos de ensayo.

Tcnica para medio lquido

Los dos tubos, el que contiene el medio de cultivo sin sembrar y el que contiene los mi-croorganismos a transferir, se toman con una mano, con las bocas colocadas a la mismaaltura.

Se sostienen con los dedos ndice, medio y anular apoyndolos en el dedo meique, y selos sujeta con el dedo pulgar muy cerca de la base para permitir la visualizacin de todala superficie del cultivo.

Con los dedos pulgar e ndice (como un lpiz) de la otra mano, se toma la pipeta estril oel mango de Koll con su aguja o asa en anillo y se esteriliza.

Se destapan los tubos con los dedos libres de la mano que sujeta el asa, de la siguientemanera: el tapn del tubo ms alejado del operador (que es el que contiene la muestra)entre el dedo meique y la palma de la mano; el tapn del tubo ms cercano al operador(que contiene el medio de cultivo estril) entre el meique y el anular.

Se flamean las bocas de los tubos, se toma el inculo; se siembra; se flamean nueva-mente las bocas de los mismos y se tapan respetando las procedencias de los tapones yse quema el asa.

Como el inculo procede de un medio lquido, antes de realizar la transferencia se debeagitar el tubo para poner en suspensin a los microorganismos que pudieran estar depo-sitados. Si la siembra se realiza en medio lquido, se agita el tubo sembrado para distri-buir homogneamente el inculo.

Para realizar la agitacin se toma el tubo cerca del extremo superior con los dedos ndicey pulgar y se golpea suavemente la base del mismo sobre el dedo ndice de la otra manocon una amplitud de 5 cm. Otra forma consiste en hacer rotar los tubos entre las palmasde las manos.


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Tcnicas para medio slido.

Cuando el medio de cultivo a sembrar es slido, se puede sembrar en superficie, en pro-fundidad o en profundidad y superficie.

1) En superficie:

a) Por estra: Introducir el asa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado hasta elfondo diluyendo el inculo en el agua de condensacin que se acumula en esaparte, luego mover el asa suavemente sobre la superficie del agar con un movi-miento en zig-zag ascendiendo desde el fondo hasta la parte superior del medio.

b) Por trazo: Introducir el asa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado y trazaruna lnea de siembra desde la base del pico de flauta hasta el extremo superior,sin ejercer presin para que no se rompa el medio.

2) En profundidad:

a) Por puncin: El medio de cultivo que se emplea est solidificado en tubo en for-ma vertical y la siembra se realiza con aguja, la que se introduce con el inculorpidamente en el seno del medio y se retira de la misma forma. La puncin serealiza en el centro del medio o excntricamente.

3) En profundidad y superficie:

Por puncin y estra: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinado perocon mucho fondo. Se introduce la aguja en el tubo de agar inclinado, se punza el fondo,se retira y se realiza un trazo o estra en el pico de flauta.

Tcnica de transferencia en placa Petri.

La siembra en placa Petri, puede hacerse:

1) En superficie:

a. Por estra central: Se levanta la tapa lo suficiente como para permitir la introduc-cin del asa con la carga de microorganismos, inicindose la estra en el borde delmedio ms alejado del operador y se la extiende hasta llegar al centro de la placa,luego se gira sta 180 y se contina realizando otra estra de la misma manera.

Esta divisin evita el obstculo del borde de la placa

b. Por estra en cuadrantes: Se divide la placa en cuatro sectores y se siembra enestra cada uno de ellos, partiendo del borde de la placa hacia el centro. El cua-

drante a sembrar debe ser el ms alejado del operador y el inculo en cada caso


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puede ser el mismo (la misma especie) o distinto (diferente especie) para cadacuadrante.

c. Por diseminacin con esptula de Drigalsky: Se deposita sobre el medio slidocontenido en la placa, una asada o una gota con pipeta del material a sembrar,que luego se extender por toda la superficie del medio con una esptula de DRI-GALSKY.

*La esptula se introduce inmediatamente despus de su uso en un recipientepara su esterilizacin en autoclave o en formaldehdo al 5 %.

d. Por diseminacin con hisopo: Se sumerge en el caldo de cultivo, se escurre elexceso de lquido sobre la pared interior del tubo y se estran ambas mitades de laplaca de Petri, partiendo de los bordes hacia el centro, luego se gira 90 y se es-tran nuevamente ambas mitades, finalmente se gira 45 y se estran ambas mita-des.

2) Por homogeneizacin:

a. Tcnica de la siembra en tubo para volcar en placa: El inculo se introduce

con el asa o pipeta en un tubo con el medio de cultivo fundido y enfriado a 45 Cen cantidad suficiente para cubrir la placa de Petri. Se homogeneiza por rotacin yse vuelca en la placa previo flameado de la boca del tubo.

b. Tcnica del agar volcado: Se deposita el inculo con pipeta en el centro de laplaca Petri y luego se vuelca sobre el mismo el medio de cultivo fundido y enfriadoa 45C. Se homogeneiza por rotacin para lo cual se le imprime a la placa movi-mientos circulares, en sentido horario y en sentido antihorario y movimientos recti-lneos, horizontales y verticales.

Se debe tener en cuenta que de las placas Petri preparadas con medio de cultivo parasembrar, debe eliminarse el agua de sinresis (condensacin) antes de efectuar dicha

operacin. Para tal fin es aconsejable preparar las placas con 24 hs. De anticipacin ydejarlas invertidas a temperatura ambiente.


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F) AISLAMIENTO

El objeto es obtener cultivos en estado puro, operacin imprescin-dible y previa al estudio e identificacin de una especie bacte-

riana. Se pueden realizar aislamientos por mtodos generales y pormtodos especiales.

1) Mtodos generales de aislamiento.

Estos mtodos utilizan medios de cultivos slidos en placa Petri:

a.Por diluciones sucesivas:

En general, para preparar diluciones seriadas, se parte deuna solucin concentrada y se preparan series de dilucionesal dcimo (1:10) o al medio (1:2). De esta manera se obtieneuna serie de soluciones relacionadas por ejemplo por un fac-tor de dilucin 10 es decir 1/10; 1/100; 1/1000 y as sucesi-

vamente. O la otra serie es 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32 etc.

Por ejemplo: si partimos de una solucin de 50mg/ml de unasustancia (Solucin A):

- Dilucin 1/10: 1ml de la solucin A + 9 ml deagua= una solucin de 5 mg/ml (dilucin 1:10).

- Dilucin 1/2: 5 ml de la solucin A + 5 ml deagua= una solucin de 25 mg /ml (dilucin 1:2).

Se homogeneiza la muestra y se carga el asa por nica vez.Luego se pasa el asa de un tubo a otro. Estos tubos contienenagar a 45 C. De esta manera el primer tubo contendr mayorconcentracin de microorganismos que el ltimo. Luego se pasael contenido de los tubos a las placas Petri y de all a lostubos con agar en pico de flauta (slant o tubo inclinado).

b.Por agotamiento en superficie en una placa:

Es el mtodo ms utilizado. Se prepara una placa Petri con elmedio de cultivo a la que se le elimina el exceso de humedadsegn se indic anteriormente.

Primero, se marca la parte exterior de la contratapa deacuerdo al esquema. Se carga el asa con la muestra, se depo-sita en un punto de la superficie del sector (I) cercano alborde, y se extiende en el mismo con estras prximas y para-lelas. A continuacin se quema el asa y se deja enfriar.

Se gira la placa 90 , se pasa el asa una vez sobre la ltimaestra de la regin ya inoculada y se arrastra al sector (II)


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efectuando sobre l la siembra sin superponer las estras conlas realizadas antes.

Se quema nuevamente el asa y de la misma manera se estra elsector (III).

Luego de quemar el asa, en el sector (IV) se realizan estrascon el material que se arrastra de (III), ms amplias y queterminan en el centro de la placa.

Cualquiera sea el mtodo empleado, si se realiza correctamen-te, podrn obtenerse colonias aislada. Estas pueden pertene-cer a distintas especies bacterianas, las que generalmente sediferencian macroscpicamente.

En general cada colonia se considera formada a partir de unaclula bacteriana, aunque esto no es del todo cierto puespuede darse el caso de que dos o ms clulas den origen a unacolonia. Si todas pertenecen a una misma especie, la coloniaresultante ser pura. Caso contrario, la finalidad del traba-jo no se habr cumplido, no logrndose el aislamiento.

Para comprobar la pureza de la colonia aislada se puede rea-lizar una coloracin de Gram. Para ello se pica la colonia y

se la identifica con una marca en el fondo de la placa conun nmero identificatorio. Se hace el extendido con una por-cin de la colonia y si todas las clulas observadas coinci-den morfolgicamente, se repica el resto de la colonia en untubo con agar en estra para obtener un cultivo puro.

A veces la igualdad morfolgica en la coloracin de Gram re-sulta engaosa por existir bacterias de diferentes especies(pero iguales morfolgicamente) presentes dentro de la colo-nia seleccionada pero en muy bajo nmero debido a su imposi-bilidad de desarrollar. Por consiguiente es necesario reali-zar siempre aislamiento para observar la uniformidad de lascolonias.


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2) Mtodos especiales de aislamiento.

Mtodos derivados de las propiedades de las bacterias:

Consisten en hacer desarrollar la mezcla bacteriana, en un mediode cultivo especial, donde una especie puede dar lugar a coloniasde un color que la identifiquen (ya sea por cambios de pH o porprecipitacin de elementos del medio). Un ejemplo, es el aisla-miento en el llamado agar- lactosa- verde-brillante- bilis, dondelas bacterias coliformes dan colonias color rojo intenso en elcentro con un halo rosado que destacan del fondo azul del medio.

a.Mtodos biofsicos: Se basan en el empleo de condiciones f-sicas determinadas que afectan a ciertos microorganismos yno a otros.

Empleo de temperaturas disgensicas: La mayora de lasbacterias desarrollan bien a 37C. Sin embargo hay es-pecies que lo hacen hasta 40C -42C y an ms, otraspor debajo de 35 C. Estas caractersticas se puedenusar para la separacin de especies.

Termorresistencia de las bacterias esporuladas: Losesporos de las bacterias son formas de resistencia quetoleran temperaturas que resultan letales para lasformas vegetativas. Este comportamiento se aprovechapara la separacin de las especies que tienen la capa-cidad de esporular.

Movilidad del microorganismo: Las bacterias mvilesdesarrollan en gran parte de la superficie del medio,mientras que las inmviles lo hacen solo en el puntode siembra.

b.Mtodos biolgicos: Estos mtodos utilizan la propiedad quetienenciertos animales de laboratorio de ser receptivos a algunosmicroorganismos.


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A. MICROORGANISMOS AEROBIOS MESFILOS

El anlisis de los alimentos y piensos para determinar la existencia, tipo y nmero de mi-croorganismos es bsico para la microbiologa de alimentos. Sin embargo ninguno de losmtodos utilizados habitualmente permite determinar el nmero exacto de microorganis-mos que existe en un determinado alimento.

Son cuatro los mtodos bsicos utilizados para investigar el nmero total de microorga-nismos:

1.- Recuento en placa (SPC) para la determinacin del nmero de clulas viables2.- Mtodo del nmero ms probable (NMP) de grmenes como clculo estadstico delnmero de clulas viables3.- Tcnicas de reduccin de colorantes para el clculo del nmero de clulas viables concapacidad reductora4.- Recuento microscpico directo (DMC) tanto para clulas viables como para las noviables

El recuento en placa es el mtodo ms utilizado para la determinacin del nmero de

clulas viables o unidades formadoras de colonias (u.f.c.) en un alimento.Los recuentos totales deben hacerse en funcin de uno de los siguientes factores:- mtodo de muestreo utilizado- distribucin de los microorganismos en la muestra- naturaleza de la microflora del alimento- naturaleza del alimento- antecedentes del alimento- adecuacin nutricional del medio de cultivo- temperatura y medio de incubacin- pH, aw, potencial de oxidacin reduccin del medio- tipo de diluyente utilizado

- nmero relativo de microorganismos en la muestra

Los recuentos de microorganismos viables se basan en el nmero de colonias que sedesarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento eincubadas en unas condiciones ambientales determinadas. Estos recuentos no puedenconsiderarse como recuentos totales ya que solo son susceptibles del contaje aquellosmicroorganismos capaces de crecer en las condiciones establecidas. Se puede conseguiruna amplia gama de condiciones variando la temperatura, la atmsfera, la composicindel medio y el tiempo de incubacin.

El intervalo de temperaturas en el que crecen los microorganismos es muy amplio: de 34 C a > 90 C. En funcin de esto se encuadra a los microorganismos en tres grupos:

a) los que crecen bien a 7 C o por debajo de esta temperatura cuya tem-peratura: psicrtofos

3. PRINCIPALES MTODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICO DEALIMENTOS


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b) los que crecen entre 20 30 C, con una temperatura ptima de creci-miento est entre 30 40 C: mesfilos

c) los que crecen por encima de los 45 C: termfilos

Recuento de aerobios mesfilos

En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarro-llarse a 30 C en las condiciones establecidas.

En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos.

Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulacin, las condi-ciones higinicas de la materia prima.

Un recuento bajo de aerobios mesfilos no implica o no asegura la ausencia de patge-nos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia deflora patgena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentacin, no son reco-

mendables recuentos elevados.

Un recuento elevado puede significar:- Excesiva contaminacin de la materia prima- Deficiente manipulacin durante el proceso de elaboracin- La posibilidad de que existan patgenos, pues estos son mesfilos- La inmediata alteracin del producto

El recuento de mesfilos nos indica las condiciones de salubridad de algunos alimen-tos.

Mtodos normalizados

ISO 4833 Directiva general para el recuento de microorganismos. Mtodo por re-cuento de colonias a 30 C

Este mtodo se basa en la siembra en profundidad en un medio de cultivo definido, verti-do en dos placas de Petri, con una cantidad determinada de muestra si el producto aexaminar es lquido, o con una cantidad determinada de suspensin madre en el caso deotros productos.

En las mismas condiciones, siembra de las diluciones decimales obtenidas de la muestrao de la suspensin madre. Incubacin a 30 C, en aerobiosis durante 72 horas. A partirdel nmero de colonias obtenidas en las placas de Petri, calcular el nmero de microor-

ganismos por mililitro o por gramo de muestra.

AF V 08-01 Mtodo de rutina para el recuento de microorganismos. Mtodo de recuen-to de las colonias a 30 C

Este mtodo se basa en la siembra en profundidad en un medio de cultivo definido, verti-do en una placa de Petri, con una cantidad determinada de muestra si el producto a exa-minar es lquido, o con una cantidad determinada de suspensin madre en el caso deotros productos. En las mismas condiciones, siembra de las diluciones decimales obteni-das de la muestra o de la suspensin madre. El recuento podr ser realizado utilizandoun sembrador espiral (NF V08-100) Incubacin a 30 C, en aerobiosis durante 72 horas.A partir del nmero de colonias obtenidas en las placas de Petri escogidas, calcular elnmero de microorganismos por mililitro o por gramo de muestra.


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ESQUEMA:

AEROBIOS MESFILOS

ISO4833 AF V 08-051

10 g muestra +

90 ml agua peptona

Diluciones decimales

10-2 10-3 10-4

Agar PCAIncubacin30C / 72 h

Recuento de colonias

10-1

1ml

1ml 1ml 1ml

AEROBIOS MESFILOS

ISO4833 AF V 08-051

10 g muestra +

90 ml agua peptona


10-2 10-3 10-4

Agar PCAIncubacin30C / 72 h

Recuento de colonias

10-1

1ml

1ml 1ml 1ml


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B. MOHOS Y LEVADURAS

Los hongos son organismos eucariticos, cuya pared celular contiene quitina y -glucanos. Son unicelulares o filamentosos, de reproduccin sexual o asexual, saprfitosmutualistas o parsitos.

En funcin de la temperatura de crecimiento se dividen en:- termfilos: 20 50 C (40 50 C)- termolatentes: mximo 50 C, mnimo por debajo de 20 C- mesfilos: 10 40 C (20 35 C)- psicrfilos: por debajo de 10 C (por debajo de 20 C)

Los hongos engloban los mohos y las levaduras. Los mohos son multicelulares filamento-sos cuyo crecimiento en un alimento se reconoce por su aspecto aterciopelado. Las leva-duras crecen en agregados de clulas independientes, cuando crecen en los alimentosforman colonias caractersticas.

- Mohos habitualmente transmitidos por los alimentos:

Divisin: ZygomycetaClase: ZygomycetesOrden: MucoralesFamilia: MucoraceaeGnero: Mucor, Rhizopus, ThamnidiumDivisin: AscomycetaClase: PleitomycetesOrden: EurotialesFamilia: TrichocomaceaeGnero: Byssochlamys, Eupnicillium, Emericella, Eurotium

Divisin: DeuteromycetaClase: CoelomycetesFamilia: CoelomycetaceaeGnero: Colletotrichum

Clase:HypomycetesOrden: HypomycetalesFamilia: MoniliaceaeGnero:Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Fusarium, Penicillium,.....

- Levaduras habitualmente transmitidos por los alimentos:

Divisin: AscomycotinaFamilia: SaccharomycetaceaeSubFamilia: NadsonioideaeGnero: Hanseniaspora

SubFamilia: SaccharomycotoideaeGnero: Debaryomyces, Issatchenkia, Kluyveromyces, Saccharomyces, ................


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SubFamilia: SchizosaccharomycotoideaeGnero: Schizosaccharomyces

Divisin: DeuteromycotinaFamilia: CrypteococcaceaeGnero: Brettanomyces, Candida, Crytococcus...............

El significado de la contaminacin fngica de los alimentos viene determinado por su ca-pacidad para deteriorar los alimentos, produciendo defectos en el aspecto modificacionesqumicas, alterando el valor nutricional, variando sus caractersticas organolpticas y difi-cultando su conservacin. Algunos mohos pueden producir infecciones en el hombre eincluso reacciones alrgicas. Adems, muchos mohos producen gran nmero de toxinasa las que el hombre es susceptible.

Las micotoxinas son un grupo de metabolitos txicos, producidos por ciertas cepas demohos cuando crecen en unas condiciones determinadas, en una amplia variedad de

alimentos.

El estudio de los mohos productores de micotoxinas ha sido bastante completo debido a:- la ubicuidad de sus esporas- que pueden estar presentes en alimentos organolepticamente aceptables- que los alimentos constituyen un sustrato orgnico adecuado para su crecimiento.

Estos mohos producen micotoxinas que al ser ingeridas por los animales originan me-tabolitos txicos secundarios, que pasan a la leche, carne o huevos y son absorbidosindirectamente por el hombre

- al riesgo cancergeno, sobre todo de las aflatoxinas

Toxicolgicamente nos interesan ms las micotoxinas y los factores que puedan afectar

la capacidad de su produccin, que los mohos productores.

En la mayora de los casos las intoxicaciones son producto de la accin combinada devarias micotoxinas. Rara vez un alimento es contaminado por una sola especie y cadaespecie suele producir varias micotoxinas.

Los alimentos que ms fcilmente son contaminados por micotoxinas y las micotoxinasms frecuentes son:

1.- Semillas oleaginosas y alimentos derivados2.- Aceites vegetales no refinados3.- Cereales y alimentos derivados4.- Frutos secos

5.- Zumos de frutas6.- Legumbres7.- Bebidas alcohlicas8.- Leche y productos lcteos9.- Carne y productos crnicos

Para la prevencin y control sanitario de las intoxicaciones por micotoxians es necesario:- conocer los factores que afectan al crecimientos de los mohos y a la produccin de

las micotoxinas- conocer el periodo entre la germinacin y la produccin de micotoxinas, para estimar

el potencial txico del alimento- evitar la contaminacin- evitar, durante la manipulacin, las posibles lesiones de los granos y las frutas


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- mantener unas condiciones de almacenamiento que eviten en lo posible el crecimien-to de los mohos

El recuento de mohos y levaduras es un ndice de las condiciones higinicas de una ma-teria prima y de las condiciones de manipulacin. Su significado es similar al de los aero-bios mesfilos.

Mtodos normalizados

ISO 7954 Directiva general para el recuento de levaduras y mohos. Tcnica de enu-meracin de las colonias a 25 C

Este mtodo se basa en la siembra en profundidad en un medio de cultivo selectivo de-terminado, en dos placas de Petri, con una cantidad determinada de muestra si el produc-to a examinar es lquido, o con una cantidad determinada de suspensin madre en elcaso de otros productos. En las mismas condiciones, siembra de las diluciones decimales

obtenidas de la muestra o de la suspensin madre. Incubacin de las placas en aerobio-sis a 25 C, durante 3, 4 5 das. Clculo del nmero de levaduras y mohos por mililitro opor gramo de muestra a partir del nmero de colonias obtenidas en las placas escogidasa los niveles de dilucin que dan un resultado significativo.

NF V 08-059 Mtodo de rutina para el recuento de levaduras y mohos. Tcnica de enu-meracin de las colonias a 25 C

Este mtodo se basa en la siembra en superficie en un medio de cultivo definido, reparti-do en placas de Petri, con una cantidad definida de muestra por ensayo si el producto aexaminar es lquido, o con una cantidad determinada de suspensin madre en el caso deotros productos. El recuento puede ser igualmente realizado en profundidad. Incubacin

de las placas en aerobiosis a 25 C, durante 3, 4 5 das. En el caso de recuento de es-pecies de mohos supuestos conocidos la temperatura de incubacin puede ser diferentede 25 C, buscando despus el acuerdo entre las dos partes (20 C 22 C) e indicndo-lo en el informe del ensayo. A partir del nmero de colonias obtenidas en las placas dePetri retenidas, calcular el nmero de levaduras y mohos por mililitro o por gramo demuestra.


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ESQUEMA:

MOHOS Y LEVADURAS

ISO7954 AF V 08-059

10 g muestra +90 ml agua peptona


10-2 10-3 10-4

AgarSaboureaudIncubacin

25C / 5 das

Recuento de mohos y levaduras

10-1

1ml

1ml 1ml 1ml

MOHOS Y LEVADURAS

ISO7954 AF V 08-059



10-2 10-3 10-4

AgarSaboureaudIncubacin

25C / 5 das

Recuento de mohos y levaduras

10-1

1ml

1ml 1ml 1ml


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C. ENTEROBACTERIAS

Cada vez es ms frecuente recurrir a la determinacin de microorganismos indicadorespara determinar la inocuidad de un alimento. Estos indicadores deben cumplir una seriede requisitos:- fcil y rpido de detectar- fcilmente diferenciable de otros representantes de la flora de un alimento- tener antecedentes de asociacin con el patgeno del que es indicador- ser un microorganismos con cifras, que en teora coincidan con las del patgeno a

indicar- tener condiciones y velocidad de crecimiento semejantes a las del patgeno- tener una tasa de muerte paralela a del patgeno y que persista algn tiempo ms

que este

- no existir en alimentos exentos del patgeno, salvo en cantidades mnimas

Actualmente se reconocen 29 gneros de enterobacterias, que incluyen ms de 100 es-pecies diferentes. El 99% de los aislamientos clnicos pertenecen nicamente a 23 espe-cies.

Atendiendo a su poder patgeno se dividen en dos grupos:- Enterobacterias patgenas: EScherichia colienteropatgeno, Shigella, Salmone-

lla, Yersinia- Enterobacterias oportunistas: E. coli, Citrobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus,

Hafnia, Edwardsiella, Providencia, Morganella

El recuento total de enterobacterias se utiliza como indicador de contaminacin fecal, ycomo uno de los indicadores de Buenas Prcticas de Fabricacin. Se utiliza como indica-dor de la calidad microbiolgica de alimentos procesados, y recuentos elevados sealanuna elaboracin inadecuada o una contaminacin posterior, o ambas cosas a la vez;siempre implica un riesgo higinico-sanitario.

Mtodos normalizados

ISO 7402 Directiva general para el recuento, sin revivificacin, de las Enterobacteria-ceae. Tcnica del NMP y mtodo por recuento de colonias

Esta directiva expone dos mtodos para el recuento de enterobacterias. El primero deellos se recomienda utilizar en muestras que se sospecha que presentan contaminacinbaja (1 100 por mililitro o gramo de muestra). Para ello se siembran en tres tubos demedio de doble concentracin, una cantidad determinada de la muestra problema si lamuestra es lquida o una cantidad determinada de la suspensin madre en el caso de losotros productos. Despus y en las mismas condiciones, se siembran tres tubos con me-dio de concentracin simple con la primera dilucin decimal obtenida a partir de la mues-tra problema o de la suspensin madre. Los tubos se incuban a 35 C 37 C (segnacuerdo) durante 24 horas. A partir del nmero de tubos positivos confirmados se calculael nmero ms probable de Enterobacteriaceae por mililitro o por gramo de muestra deensayo mediante la tabla NMP.

El segundo mtodo se basa en la siembra en profundidad con el medio agar biliado cristalvioleta glucosa, en placas de Petri, con una cantidad determinada de la muestra a exami-


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nar, si el producto es lquido o una cantidad determinada de la suspensin madre en elcaso de los otros productos. En las mismas condiciones siembra de diluciones decimalesobtenidas a partir de la muestra problema o de la suspensin madre. Incubacin de lasplacas a 35 C 37 C durante 24 horas +/- 2 horas. Clculo del nmero de Enterobac-teiaceae por mililitro o por gramo de muestra, a partir del nmero de colonias caractersti-cas confirmadas obtenidas en las placas de Petri

NF V 08-054 Mtodo de rutina para la enumeracin de Enterobacteriaceae mediante elrecuento de colonias

Este mtodo se basa en la siembra en profundidad con el medio agar biliado cristal viole-ta glucosa, en una placa de Petri, con una cantidad determinada de la muestra a exami-nar, si el producto es lquido o una cantidad determinada de la suspensin madre en elcaso de los otros productos. Se recubre la placa con una segunda capa del mismo medio.En las mismas condiciones siembra de diluciones decimales obtenidas a partir de lamuestra problema o de la suspensin madre. Incubacin de las placas a 30 C durante24 horas +/- 2 horas. Clculo del nmero de Enterobacteiaceae por mililitro o por gramo

de muestra, a partir del nmero de colonias caractersticas confirmadas obtenidas en lasplacas de Petri.


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ESQUEMA:

enterobacterias

ISO7402 AF V 08-054



10-2 10-3 10-4

Agar VRBG +

2 capaIncubacin30C / 24 horas

10-1

1ml

1ml 1ml 1ml

Recuento. Colonias Rosas

enterobacterias

ISO7402 AF V 08-054



10-2 10-3 10-4

Agar VRBG +

2 capaIncubacin30C / 24 horas

10-1

1ml

1ml 1ml 1ml

Recuento. Colonias Rosas


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D. COLIFORMES TOTALES

En conjunto los coliformes estn representados por cuatro gneros de la familia Entero-bacteriaceae: Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, y Klebsiella. Todos ellos son fer-mentadores de la lactosa en 48 horas.

Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, y tambin en el suelo, lasplantas, etc. No son muy buenos como indicadores, pero se utilizan como indicadores decontaminacin fecal y son buenos indicadores de un proceso o de un estado sanitariopoco satisfactorio.

En un recuento de coliformes es conveniente determinar la incidencia de E. colidado quees la especie ms indicativa de una contaminacin fecal.

Hay que destacar que el recuento de coliformes tiene sus limitaciones como indicador enciertos alimentos:- Productos lcteos: reflejan el estado higinico del establo y de la planta industrial, no

es indicador de contaminacin fecal- Hortalizas congeladas blanqueadas: la presencia de E. colipuede ser indicativo de

que en el proceso existe algn problema. Los coliformes estn habitualmente asocia-dos con la vegetacin

- Derivados de aves de corral: los coliformes no son indicadores higinicos apropiados,las aves pueden tener salmonella antes del sacrificio

A pesar de todo lo anterior, los coliformes tienen un valor acreditado como indicadorres

de inocuidad. Su principal aplicacin como integrantes de un programa para la determi-nacin de la inocuidad de los alimentos la tienen dentro del sistema APPCC.

Pueden crecer en presencia de sales biliares, que inhiben el crecimiento de las bacteriasGram negativas. Son capaces de fermentar la lactosa con produccin de gas, siendo estacaracterstica suficiente para hacer determinaciones presuntivas. Su facilidad de cultivo yde diferenciacin los hace casi ideales como indicadores.

Mtodos normalizadosISO 4831 Directiva general para el recuento de coliformes

Esta directiva se basa en la siembra de tres tubos de medio de enriquecimiento selectivode doble concentracin con una cantidad determinada de la muestra si es lquida, o unacantidad determinada de la suspensin madre en el caso de otros productos. A continua-cin, se siembran tres tubos de medio de enriquecimiento selectivo de concentracinsimple con una cantidad determinada de la muestra si es lquida, o una cantidad determi-nada de la suspensin madre en el caso de otros productos. Despus y en las mismascondiciones, se siembran tres tubos con medio de enriquecimiento selectivo de concen-tracin simple con una cantidad determinada de la primera dilucin decimal obtenida apartir de la muestra problema o de la suspensin madre. Los tubos se incuban a 30, 35 37 C durante 24 horas para los de doble concentracin, y 24 48 horas los de concen-tracin simple. A partir de cada tubo incubado que presenta desprendimiento de gas en lacampana se inocula con asa un tubo con medio de confirmacin (BGBL). La reaccin espositiva cuando se produce desprendimiento de gas recogido en la campana de Duirham,


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como consecuencia de la fermentacin de la lactosa en presencia de sales biliares. Serealizan las lecturas a las 24 48 horas.A partir del nmero de tubos positivos confirmados se calcula el nmero ms probablede coliformes por mililitro o por gramo de muestra de ensayo.

NF V 08-050 Mtodo de rutina para la enumeracin de coliformes mediante el recuentode colonias a 30 C.

Se basa en la siembra en profundidad con el medio agar biliado cristal violeta lactosa, enuna placa de Petri, con una cantidad determinada de la muestra si es lquida, o una can-tidad determinada de la suspensin madre en el caso de otros productos. Se recubre laplaca con una segunda capa del mismo medio. En las mismas condiciones, siembra dediluciones decimales obtenidas a partir de la muestra o de la suspensin madre. Incuba-cin de las placas a 30 C 24 horas. Clculo del nmero de coliformes por mililitro o porgramo de muestra, a partir del nmero de colonias caractersticas obtenidas en las placasde Petri.


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ESQUEMA:

Coliformes totales ISO4831


Caldo lactosado (con campana Durham)

37C / 48 horas

Gas = +

10 ml

10 ml

1 ml

10-1

10-2

Confirmacin

Coliformes totales ISO4831


Caldo lactosado (con campana Durham)

37C / 48 horas

Gas = +

10 ml

10 ml

1 ml

10-1

10-2

Confirmacin


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Coliformes tota les ISO4831

Confirmacin

Tubos positivos

Tubos con Caldo Verde brillantecon campana Durham

Asa de siembra

45C / 24 horas

Gas = +

Coliformes tota les ISO4831

Confirmacin

Tubos positivos

Tubos con Caldo Verde brillantecon campana Durham

Asa de siembra

45C / 24 horas

Gas = +

COLIFORMES TOTA LES

10 g muestra +

90 ml agua peptona


10-2 10-3 10-4

Agar VRBA

Incubacin30C / 24 horas

10-1

1ml

1ml 1ml 1ml

NF V 08-050COLIFORMES TOTA LES

10 g muestra +

90 ml agua peptona


10-2 10-3 10-4

Agar VRBA

Incubacin30C / 24 horas

10-1

1ml

1ml 1ml 1ml

NF V 08-050


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E. ESCHERICHIA COLI

Escherichia colies un coliforme fecal. Los coliformes fecales son un grupo de microorga-nismos seleccionados por incubacin de los inculos procedentes de un caldo de enri-quecimiento de coliformes a temperaturas superiores a las normales (44 +/-0,5 C) y sonmuy indicativos de una posible contaminacin de origen fecal del alimento. Se definen porla produccin de cido y de gas en caldo EC a 44 46 C (44,5 45,5 C). Las cepasenterohemorrgicas de E. coli no crecen a 44,5 C en la formulacin convencional de EC,pero lo hacen cuando el porcentaje de sales biliares se reduce del 0,15 al 0,112%.

Slo unas pocas cepas son patgenos verdaderos, enteropatgenos; o patgenos opor-tunistas.

Es muy resistente en suelo y agua. Muere a 60 C en 15 minutos, y con 0,5 p.p.m. decloro.

Vive en el tracto intestinal del hombre y animales, por eso su presencia en un alimento

indica contaminacin directa o indirecta de origen fecal. Es indicador de posibles patge-nos entricos en el agua, moluscos, productos lcteos,.....

Mtodos normalizados

ISO 7251 Directiva general para el recuento de Escherichia coli presuntivos. Tcnicadel NMP

Esta directiva se basa en la siembra de tres tubos de enriquecimiento selectivo de dobleconcentracin con una cantidad determinada de la muestra problema si es lquida o unacantidad determinada de la suspensin madre para otros productos. A continuacin se

siembran tres tubos de enriquecimiento selectivo de concentracin simple con una canti-dad determinada de la muestra problema si es lquida o una cantidad determinada de lasuspensin madre para otros productos. Despus y en las mismas condiciones se siem-bran tres tubos de enriquecimiento selectivo de concentracin simple con la primera dilu-cin decimal obtenida de la muestra problema o de la suspensin madre. Los tubos seincuban a 35 37 C segn acuerdo durante 24 48 horas, y se realiza el examen enbusca de tubos con gas. A partir de cada tubo que muestra desprendimiento de gas seinocula un tubo con medio selectivo lquido EC. La reaccin es positiva cuando se produ-ce desprendimiento de gas recogido en la campana de Durham, como consecuencia dela fermentacin de la lactosa en presencia de sales biliares a 45 C. Se hacen las lecturasa las 24 y 48 horas. A partir del nmero de tubos positivos en medio selectivo EC sesiembra una nueva serie de tubos con agua de triptona. Incubacin a 45 C, 24 48

horas y se examina la produccin de indol. A partir de los tubos positivos a la produccinde gas en medio selectivo y a la produccin de indol en agua de triptona, se calcula elnmero ms probable de E. colipor mililitro o gramo de muestra de ensayo.

NF V 08-053 Mtodo de rutina para el recuento de Escherichia coli-glucuronidasa posi-tivos

Este mtodo se basa en la siembra en profundidad con el medio agar PTX o PTG, en unaplaca de Petri con una cantidad determinada de la muestra problema si es lquida o unacantidad determinada de la suspensin madre para otros productos. En las mismas con-diciones, siembra de diluciones decimales obtenidas de la muestra o de la suspensin

madre. Incubacin de las placas a 44 C durante 18 24 horas. Clculo del nmero deEscherichia coli por mililitro o por gramo de muestra a partir del nmero de colonias ca-ractersticas obtenidas en las placas de Petri.


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ESQUEMAS:


Lauril triptosa (con campana Durham)

37C / 48 horas

Gas = +

10 ml

10 ml

1 ml

10-1

10-2

Confirmacin

Escherichia coli ISO7251


Lauril triptosa (con campana Durham)

37C / 48 horas

Gas = +

10 ml

10 ml

1 ml

10-1

10-2

Confirmacin



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Confirmacin

Tubos positivos

Tubos con Caldo EC con campana

Asa de siembra

45C / 24 horas

Gas = +

Tubos positivos

Agua de triptona

Asa de siembra

37C / 24 horas

Prueba del indol

0,5 ml reactivo

Kovacs

Amarillo -

Rojo +


Confirmacin

Tubos positivos

Tubos con Caldo EC con campana

Asa de siembra

45C / 24 horas

Gas = +

Tubos positivos

Agua de triptona

Asa de siembra

37C / 24 horas

Prueba del indol

0,5 ml reactivo

Kovacs

Amarillo -

Rojo +


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Escherichia coli



10-2 10-3 10-4

AgarCROMOGNICOIncubacin

44C / 24 horas

Colonias Violceas

10-1

1ml

1ml 1ml 1ml

NF V 08-053Escherichia coli



10-2 10-3 10-4

AgarCROMOGNICOIncubacin

44C / 24 horas

Colonias Violceas

10-1

1ml

1ml 1ml 1ml

NF V 08-053


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F. STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Staphylococcus aureus es un microorganismo de distribucin en el medio ambiente muyamplia, se encuentra de forma natural en el hombre, los animales de granja, el polvo ydiversos alimentos y otros productos en los que la contaminacin se debe principalmentea los manipuladores.

El principal problema a nivel de la microbiologa de los alimentos es que S. aureus puedeproducir una enterotoxina termoestable, y otras toxinas.

Estas toxinas actan sobre receptores intestinales cuyo estmulos alcanzan el centro delvmito del cerebro, por lo que deberan considerarse como neurotoxinas.

El mayor inconveniente de estas toxinas es su elevada resistencia a los tratamientos tr-micos habituales, soportando tratamientos de pateurizacin a 72 C / 13 segundos, e in-cluso 100 C / 30 minutos. Se inactivan a temperaturas de esterilizacin de 115 C, resis-

ten la irradiacin y las enzimas proteolticas.

Para la produccin de toxinas en un alimento tienen que concurrir los siguientes requisi-tos:- contaminacin del alimento porStaphylococccus aureus: en origen, por los manipula-

dores o por falta de higiene en locales o utensilios- la multiplicacin de una cepa enterotoxignica del microorganismo en el alimento al-

canzando al menos 106 clulas por gramo.

Staphylococcus auerus se multiplica en alimentos proteicos, soporta concentracionesnormales de azcar e incluso elevadas de sal y el tratamiento con nitritos.

Mtodos normalizadosISO 6888 Directiva general para el recuento de Staphylococcus aureus. Mtodo me-

diante enumeracin de colonias

Este mtodo se basa en la siembra en superficie en un medio de cultivo slido, preparan-do dos series de placas,con una cantidad determinada de la muestra problema si es l-quida o una cantidad determinada de la suspensin madre para otros productos. En lasmismas condiciones, siembra de diluciones decimales obtenidas de la muestra o de lasuspensin madre. Incubacin de las placas a 35 C durante 24 48 horas. Clculo delnmero de Staphylococcus aureus por mililitro o por gramo de muestra a partir del nme-ro de colonias caractersticas obtenidas en las placas escogidas a los niveles de dilucin

que dan un resultado significativo, y confirmadas mediante la prueba de la coagulasa.

NF V 08-057-1 Mtodo de rutina para la enumeracin de estafilococos cuagulasa positi-vos mediante recuento de colonias a 37C. Tcnica de confirmacin de las colonias.

Este mtodo se basa en la siembra en superficie en un medio de cultivo slido selectivo,repartido en placas de Petri,con una cantidad determinada de la muestra problema si eslquida o una cantidad determinada de la suspensin madre para otros productos. Incu-bacin de las placas a 37 C durante 24 48 horas. Clculo del nmero de estefilococos-cogulasa positivos por mililitro o por gramo de muestra a partir del nmero de coloniascaractersticas y/o no caractersticas obtenidas en las placas escogidas a los rdenes dedilucin que dan un resultado significativo, y confirmadas mediante la prueba de la coagu-lasa.


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MTODOS:

Colonias Negras o Grises con zona parcialmente opaca

Staphylococcus aureus



10-2 10-3 10-4

Placas deBaird - ParkerIncubacin

37C / 48 horas

10-1

1ml

1ml 1ml 1ml

ISO6888 AF V 08-057 - 1

Asa de Dirglasky

Confirmacin


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Staphylococcus aureus

Confirmacin

Caldo Cerebro Corazn

Asa de siembra

37C / 24 horas

Coagulacin = +

0,5 ml caldo+ 0,5 ml plasma conejo

Caldo RM -VP

37C / 24 horas

Prueba de la coagulasa

1 ml caldo+ 0,3 ml A + 0,1 ml B

15 min

Rojo fresa = +

37C / 24 horas

Prueba de la acetona


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G. SALMONELLA

El gnero Salmonella pertenece a la familia de las enterobacterias y constituye un grupomuy complejo de microorganismos patgenos para el hombre, pudiendo afectar a diver-sos animales.

Comprende dos especies:- Salmonella enterica dividida en seis subespecies- Salmonella bongori

Todas ellas se pueden identificar por caractersticas fenotpicas fciles de ver.

Mtodos normalizados

ISO 6579 Directiva general concerniente a los mtodos de investigacin de Salmonella.

Este mtodo se basa en las investigacin de Salmonella en cuatro etapas sucesivas:

. Preenriquecimiento en medio no selectivo: Siembra de la muestra en agau depeptona tamponada e incubacin a 37 C (35 C) durante 16 20 horas

. Enriquecimiento en medios selectivos lquidos: Con el cultivo del preenriqueci-miento siembre en verde malaquita con cloruro de m,agnesio e incubacin a 42 C 24horas, y en caldo selenito cistina e incubacin a 37 C 24 horas y 24 horas suplementa-rias.

. Aislamiento e identificacin: A partir de los cultivos anteriores se siembran dosmedios slidos, agar rojo fenol verde brillante y otro medio selectivo a eleccin. Ambos se

incuban a 37 C 24 horas y si es necesario 48 horas.. Confirmacin: Resiembra de las presuntas colonias de Salmonella y confirma-

cin en los medios de ensayos bioqumicos y serolgicos apropiados.

V 08-052 Mtodo de rutina para la investigacin de Salmonella

Este mtodo se basa en las investigacin de Salmonella en cuatro etapas sucesivas:

. Preenriquecimiento en medio no selectivo: Siembra de la muestra en agua depeptona tamponada e incubacin a 37 C durante 16 20 horas

. Enriquecimiento en medios selectivos lquidos: Con el cultivo del preenriqueci-miento siembra en caldo verde malaquita con cloruro de magnesio e incubacin a 42 C

24 horas, y en caldo selenito cistina e incubacin a 37 C 18 24 horas.. Aislamiento e identificacin: A partir de los cultivos anteriores se siembra en un

medio slido selectivo a eleccin. Se incuba a 37 C 24 horas y si es necesario 48 horasy se examinan las caractersticas de las colonias.

. Confirmacin: Resiembra de las presuntas colonias de Salmonella y confirma-cin en los medios de ensayos bioqumicos y serolgicos apropiados.


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ESQUEMAS:

salmonella


ISO6579 AF V 08-052

0,1ml 2 ml

Caldo Selenito - CistinaCaldo Rappaport

42C / 24 horas 37C / 24 horas

XLD

Hektoen

XLD

Hektoen

Colonias Negras

37C / 20 horas

salmonella


ISO6579 AF V 08-052

0,1ml 2 ml

Caldo Selenito - CistinaCaldo Rappaport

42C / 24 horas 37C / 24 horas

XLD

Hektoen

XLD

Hektoen

Colonias Negras

37C / 20 horas


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salmonella

Colonias Negras

Confirmacin

Agar nutritivo

37C / 24 horas

Tira API

Asa de siembra:siembra en estra

por agotamiento

37C / 20 horas

salmonella

Colonias Negras

Confirmacin

Agar nutritivo

37C / 24 horas

Tira API

Asa de siembra:siembra en estra

por agotamiento

37C / 20 horas

metodos de analisis microbiologicos

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