VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS

Pablo Richter

Introducción

Una vez validada una metodología analítica, el laboratoriode ensayo deberá fijar los intervalos de aceptabilidad parael control de calidad de cada una de las propiedadesanalíticas del método. Una metodología, aún cuando tengael carácter de método estándar u oficial, debería servalidada antes de ser utilizada en forma rutinaria.

La validación de un método analítico tiene como objetivoestablecer por medio de estudios científicos, que unmétodo tiene las características de desempeño que sonadecuadas para cumplir los requerimientos de lasaplicaciones analíticas pretendidas.

Introducción

Las propiedades analíticas que necesariamente deberán ser

documentadas en un proceso de validación, son la

siguientes:

Precisión al nivel de replicabilidad y repetibilidad

Exactitud

Incertidumbre

Intervalo de linealidad

Límite de detección del método

Límite de cuantificación del método

Campo de Aplicación

El presente documento corresponde a una guía técnica quedefine los términos y los procedimientos relativos a lavalidación de un método de análisis.

En todas las actividades de laboratorio es esencialuniformar las definiciones y los métodos de cálculo para losdiferentes términos. En este documento se establecen lasdefiniciones relativas a propiedades de métodos analíticosque se utilizarán en los laboratorios de rutina del país.

Definiciones CURVA DE CALIBRACIÓN: Representación gráfica

bidimensional, que muestra la variación de la señal

analítica con la concentración del analito. Esta última se

obtiene al graficar el valor obtenido de la señal analítica

(valor absoluto, altura, área, etc.) versus las

concentraciones de los estándares respectivos.

SENSIBILIDAD: Propiedad analítica que se define como la

capacidad de un método para discriminar entre

concentraciones (cantidades) semejantes de analito. La

sensibilidad de un método analítico corresponde a la

pendiente de la curva de calibración. Algunas veces se

expresa informando la razón entre el valor de señal

obtenida a una concentración dada de estándar.

Definiciones

a) Límite de Detección IUPAC: Concentración deanalito que origina una señal que puedediferenciarse estadísticamente de un blancoanalítico.

LIMITE DE DETECCIÓN: Existen distintasformas de definir los límites de detección de unmétodo de acuerdo a criterios estadísticos,basados en el cuociente entre la magnitud de laseñal de la medida y el ruido de fondo producidopor el instrumento o por el blanco analítico.

Límites de detección y cuantificación

n = ruido

S= SeñalRazón señal ruido S/n

LD => S/n = 3

LC => S/n = 10

¿Cuál es la menor concentración que podemos detectar o cuantificar con este método

de análisis?

b) Límite de Detección Instrumental (LDI):

Corresponde a la concentración mínima de un compuesto

analizado que, sin la presencia de la matriz, un

instrumento puede detectar con una fiabilidad definida y

que es estadísticamente diferente de la respuesta

correspondiente al ruido de fondo obtenido por el

instrumento.

c) Límite de Detección del Método (LDM): Corresponde

a la concentración mínima de un compuesto que puede

ser detectada en una matriz real, la cual es tratada

siguiendo todas las etapas del método completo,

incluyendo separaciones y pretratamientos. Esta mínima

concentración produce una señal detectable con una

fiabilidad definida, estadísticamente diferente a la señal

producto del blanco obtenido en las mismas condiciones.

Definiciones

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN DEL MÉTODO (LCM):

Corresponde a la concentración mínima de un analito que

puede ser cuantificada en una matriz real, la cual es

tratada siguiendo todas las etapas del método empleado,

incluyendo separaciones y pretratamientos. Esta mínima

concentración produce una señal cuantificable con una

nivel de confianza definido.

INTERVALO DE LINEALIDAD O DE DETERMINACIÓN:

Corresponde al intervalo de concentración más fiable de

medida para la determinación analítica del analito. Este

intervalo esta comprendido entre la concentración

correspondiente al del LCM y la concentración máxima que

entrega el límite de linealidad.

Definiciones

PRECISIÓN: Grado de concordancia de ungrupo de resultados entre sí. Dispersión de estosresultados alrededor de su media. Existen tresformas de plantear un estudio de precisión:

Replicabilidad (Repeatability, “within run precision”)

Repetibilidad (Intermediate precision, “within lab reproducibility”)

Reproducibilidad (Reproducibility conditions, “between lab precision”)

Niveles de Precisión

Replicabilidad: Forma de plantear el estudio de precisión. Se define

como la dispersión de resultados originados por aplicaciones del mismo

método a alícuotas de la misma muestra, para determinar el mismo

analito, en el mismo laboratorio, por el mismo operador y con las mismas

herramientas analíticas, en un corto intervalo de tiempo.

Repetibilidad: Forma de plantear el estudio de precisión. Se define

como la dispersión de resultados originados por aplicaciones del mismo

método a alícuotas de la misma muestra, para determinar el mismo

analito, en el mismo laboratorio, y al menos una de las siguientes

condiciones es diferente: analista, instrumento, día.

Reproducibilidad : Forma de plantear el estudio de precisión. Se define

como la dispersión de resultados originados por aplicaciones del mismo

método a alícuotas de la misma muestra, para determinar el mismo

analito, en diferentes laboratorios, y en las siguientes condiciones:

diferente analista, diferente instrumento, igual o diferente día.

Esta propiedad analítica no se determina de forma rutinaria en un procedimiento devalidación. Sólo es aplicable a ejercicios de intercomparación.

Definiciones

EXACTITUD: Expresa la cercanía entre el valor que es aceptado,

como un valor de referencia (material de referencia certificado) y

el valor encontrado (valor promedio) obtenido al aplicar el

procedimiento de análisis un cierto número de veces. La exactitud

se expresa en términos de error, generalmente como error

relativo (Ver más adelante SESGO).

RECUPERACIÓN: Corresponde a la diferencia (en porcentaje)

entre la concentración medida de un analito en una muestra

fortificada (a la que se le ha agregado una cantidad conocida de

estándar) y la concentración medida en la misma muestra sin

fortificar, dividido por la concentración de sustancia agregada.

Definiciones

INCERTIDUMBRE: Se puede distinguir entre los siguientes

conceptos:

a) Incertidumbre genérica: Duda acerca de la composición

química de un objeto o una muestra. Es lo contrario a

información.

b) Incertidumbre específica: Intervalo de valores en que puede

encontrarse un resultado, una media de los mismos y el valor

considerado verdadero.

SELECTIVIDAD: Capacidad de un método analítico para

originar resultados que dependan de forma exclusiva del

analito, para su identificación y/o cuantificación.

Error vs Incertidumbre

Resultado de un análisis: 2,5 ± 0,8 mg / Kg

Valor certificado: 2,9 ± 0,2 mg / Kg

Error: 2,9 – 2,5 = 0,4 mg / Kg

Incertidumbre: 0,8 mg / Kg

PROCEDIMIENTOS

I. Calibración del método

1) Procedimiento para construir una Curva de calibración

Preparar una batería de estándares de concentración conocida en el

solvente apropiado, dentro del intervalo de concentraciones en que

se estima que estarán las muestras a analizar. Posteriormente

determinar la señal analítica que origina cada una de las soluciones,

y

Realizar una inspección preliminar, graficando los puntos

experimentales disponibles y verificando visualmente si existe

alguna desviación de la linealidad y aproximadamente a partir de

qué valor ésta se manifiesta.

A partir de la curva de calibración estimar la parte lineal, obtener

la recta de calibración: Y = S C + Yb, donde C es la masa o la

concentración de la sustancia a ser cuantificada y S e Yb la

pendiente y ordenada en el origen de la recta, respectivamente.

Calcular los coeficientes S, Yb y r (coeficiente de correlación)

para la curva de calibración, descartando los puntos

preliminarmente eliminados en la etapa anterior. Calcular también

los límites inferior (LI) y superior (LS) a partir de los cuales los

cuocientes (señal / masa) o (señal / concentración) indiquen que

un punto está fuera del intervalo lineal LI = 0,95s y LS= 1,05s,

respectivamente.

Verificar si existe algún punto preliminarmente incluido

en la curva de calibración que, por comparación con los

límites de corte calculados en b) debería de ser excluido

(o sea, si el correspondiente cuociente (señal / masa) o

(señal / concentración) es menor que LI o mayor que LS)

o si algún punto inicialmente excluido debería de ser

considerado para el cálculo de la curva de calibración.

Inclusión o exclusión de nuevos valores en la curva: Si el

examen hecho en c) indica que todos los puntos de la

curva preliminarmente incluidos (o excluidos) lo han sido

correctamente, el procedimiento está terminado. En caso

contrario, repetir las etapas de b) a d), incluyendo o

excluyendo los puntos necesarios, hasta que ningún valor

sea rechazado o considerado para el cálculo de la curva

de calibración.

EJEMPLO – Curva calibrado

Los siguientes datos son las áreasmáximas relativas encromatogramas de disolucionespatrón de metil vinil cetona(MVK):

Determine la recta por el métodode los mínimos cuadrados

Una muestra dio una señal paraMVK con un área relativa de 10,3.Calcule la concentración de MVKen la muestra.

Dos evaluaciones adicionales dela muestra dieron como resultadolas siguientes áreas; 10,8 y 10,1.Calcule la precisión de estadeterminación.

Conc. MVK, mM Área relativa

0,5 3,02

1,5 9,00

2,5 15,03

3,5 21,42

4,5 27,03

5,5 32,97

6,5 39,00

7,5 44,20

8,5 47,00

9,5 50,20

2) Adición de estándares

a) Con muestra sintética: Utilizar una mezcla preparada en ellaboratorio de todos los componentes de la matriz de la muestrasin el principio activo a determinar, luego enriquecer con estándara diferentes niveles de concentración. Para preparar las soluciones,en este caso se mantiene constante la cantidad de muestrasintética y se agregan cantidades variables del estándar.

(curva en presencia de matriz)

I. Calibración del método

Cuando en el proceso de calibración del método, se determine que hayinterferencia de la matriz, utilizar el método de la adición estándar deacuerdo a los siguientes procedimientos alternativos.

Ácido oxolínico

Curva de Calibración de Estándar

de ácido Oxolínico

Curva Oxolínico

y = 42084x - 9036,7

R2 = 0,9997

0

5000000

10000000

15000000

0,00 100,00 200,00 300,00 400,00

Conc: (ng/ml)

Áre

a

Curva de Calibración de ácido

Oxolínico en matriz

Curva Calibración Ác. Oxolínico en Matriz

y = 19162x + 4564,4

R2 = 0,9982

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

0,00 50,00 100,00 150,00 200,00

Conc. (ng/g)

Área

2) Adición de estándares

b) Con muestra: Cuando no es posible contar con una muestrasintética (o matriz blanco), trabajar directamente con una muestrareal. Determinar por duplicado la señal promedio del analito en lamuestra, con el método a validar; una vez conocida la señalpromedio, proceder a enriquecer las muestras con estándar adiferentes niveles de concentración. Para preparar las soluciones,en este caso se mantiene constante la cantidad de muestra tomaday se agregan cantidades variables del estándar.

La ICH (International Conference Harmonization), recomienda prepararmuestras independientes por triplicado a cada nivel de concentración.

I. Calibración del método

EJEMPLO – Adición estándar

En una muestra de agua de mar se determina cobre por voltamperometría de

redisolución anódica (ASV). Una alícuota de 5 ml de muestra es diluida en un

matraz de 10 ml con agua destilada. Enseguida en tres matraces de aforo de

10 ml se agrega una alícuta de 5 ml de muestra y respectivamente se agrega

un volumen de 1, 2 y 3 ml de solución estándar del analito de 10 µg/l. Las

señales respectivamente obtenidas son: 4,11 µA; 6,15 µA; 7,99 µA y 10,05

µA. Determinar la concentración de cobre en la muestra.

Cu, µg/l Señal, µA

0 4,1

1 6,15

2 7,99

3 10,05

ejemplo adicion estándar.xls

Siempre que sea posible, particularmente en cromatografía, debe emplearse un

estándar interno (explicar diferencia con estándar subrrogate), puesto que

esto minimiza los errores debidos a la adsorción en superficies, a la pérdida

durante la extracción, a las pérdidas durante la evaporación del solvente, o

durante los procedimientos de derivatización, y la irreproducibilidad debida a las

técnicas de transferencia y de inyección.

Los estándares internos deben ser, idealmente, un homólogo del analito. Si esto

no es posible, se elegirá un compuesto que posea propiedades físico-

químicas similares a las del analito. Las propiedades cromatográficas del

estándar interno deben ser tales que eluya muy cerca del analito pero aún así,

completamente resuelto de cualquier otra sustancia presente.

I. Calibración del método

3) Uso de estándar interno

EJEMPLO – Estándar Interno

Conc. BP, ppm Area BP Area estándar interno

Area

relativa

0,1 1100 8600 0,13

0,5 5200 8000 0,65

1,0 18000 12800 1,41

5,0 59000 9100 6,48

10,0 95000 7300 13,01

Los siguientes datos de calibración han sido obtenidos en unadeterminación de benzopireno (BP) por GC-MS. Como estándar internose utilizó pireno (C13). Construya la curva de calibrado correspondiente.

Una vez establecida la curva de calibración de acuerdo al

procedimiento anterior, determinar la pendiente de la curva (S),

lo cual define la sensibilidad del método.

II. Procedimiento para determinar lasensibilidad

Curva Oxolínico

y = 42084x - 9036,7

R2 = 0,9997

0

5000000

10000000

15000000

0,00 100,00 200,00 300,00 400,00

Conc: (ng/ml)

Áre

a

Curva Calibración Ác. Oxolínico en Matriz

y = 19162x + 4564,4

R2 = 0,9982

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

0,00 50,00 100,00 150,00 200,00

Conc. (ng/g)

Área

Medir la respuesta de al menos 10 blancos analíticos independientes, de

los que se deduce la media YB y la desviación estándar σB. De acuerdo

a la IUPAC, el límite de detección es:

YLD = YB + 3 σB

A una señal YLD le corresponde una concentración CLD, lo que se

consigue por extrapolación gráfica en la curva de calibrado.

YLD CLD

III. Procedimiento para determinar ellímite de detección IUPAC

Curva de Calibrado

El límite de detección debe expresarse en unidades de concentración

EJEMPLO – LD Para estudiar la sensibilidad de un método de determinación de quínina

en agua tónica se han realizado dos series de experimentos. En laprimera, se realizan 11 medidas repetidas del blanco (agua tónica enausencia de quinina suministrada por el fabricante) y se obtiene lossiguientes datos de intensidad de fluorescencia: 0,70; 0,74; 0,72; 0,71;0,73; 0,71; 0,73; 0,74; 0,70; 0,69 y 0,75. En otra serie de experimentos,al agua tónica sin quinina, se le añaden cantidades crecientes de quininapara preparar 7 muestras artificiales, obteniéndose los siguientesresultados:

Quinina, ug/L 1,0 2,0 3,0 4,0 6,0 8,0 10,0

Intensidad de Fluorescencia 2,51 4,60 6,52 8,60 12,71 16,68 20,81

Determinar la sensibilidad y límite de detección del método

ejemplo Limite deteccion quinina.xls

Agregar una alícuota de solución estándar de analito en “agua pura” o

en el solvente adecuado, de manera de obtener una concentración

correspondiente a 2-10 veces el LDI estimado (obtener el límite

estimado alternativamente de valores reportados en literatura, catálogo

del equipo, razón señal / ruido, etc.). Someter esta solución a medición

(n replicas independientes de la solución) en el sistema instrumental.

Se determina la señal analítica Yb y su desviación estándar (σB) de

acuerdo a la siguiente expresión:

σB = ( (Xi- promedio)2/n-1)1/2

La expresión para calcular el límite de detección instrumental es la

siguiente:

YLD= 3 σB n ≥10

Después utilizando la curva de calibrado se obtiene la concentración en

el límite de detección.

IV. Procedimiento para la determinación delLímite de Detección Instrumental (LDI)

V. Procedimiento para la determinación delLímite de Detección del Método (LDM)

Determinar el límite de detección del método en una muestrareal, según el siguiente procedimiento

1) Si la concentración del compuesto analizado se sitúa entre 2 y 10

veces la concentración del límite de detección estimado, pasar a

la etapa siguiente. Si por el contrario la concentración es

demasiado elevada, cambiar de muestra. Si la concentración es

demasiado baja, ajustar mediante la adición de un estándar la

concentración del compuesto de interés, para situarla entre 2 y

10 veces el límite de detección estimado.

2) Separar a lo menos 10 alícuotas de la muestra utilizada para

evaluar el LDM y realizar todas las etapas implicadas en el

método analítico.

3) A partir de los resultados obtenidos, calcular la media y ladesviación estándar (σB) de las replicas:

La expresión para calcular el límite de detección del método esla misma anterior.

V. Procedimiento para la determinación delLímite de Detección del Método (LDM)

VI. Procedimiento para la determinación del límitede detección de un método analítico, a travésde la construcción de una curva de calibración

a) Ordenada en el origen de la línea de regresión: YB

b) Desviación estándar de la regresión (se obtiene con cualquier programaestadístico): σy/x

Donde:

yi: Valor observado del punto en la ordenada

ŷi: Valor teórico del punto obtenido por la predicción del modelo de regresión

n: Número de puntos de la curva de calibración (n ≥ 4)

c) Pendiente de la curva de calibración: S

2n

)y(yσ

2ii

y/xˆ

1) Construir curva de calibración, sobre matriz de muestra, en unintervalo de concentraciones cercano al cero (lo más bajo que puedaser detectado) (n ≥ 4) .

2) A partir de la curva, determinar:

3) Calcular Límite de detección:

Señal del Límite de detección:

yLD = yB + 3 sy/x

Concentración del Límite de detección se calcula haciendo usode la ecuación de la curva de calibración.

VI. Procedimiento para la determinación del límitede detección de un método analítico, a travésde la construcción de una curva de calibración

VII. Procedimiento para la determinación delLímite de Cuantificación del Método (LCM)

El límite de cuantificación del método se determinasiguiendo el mismo procedimiento que el usado para elLDM pero finalmente en la expresiones respectivas elfactor 3 se sustituye por 10.

VIII. Ej: Procedimiento para la determinación del límite decuantificación de un método analítico, a través de laconstrucción de una curva de calibración

El límite de cuantificación del método, a través de una

curva de calibración, se determina siguiendo el mismo

procedimiento que el usado para el LDM, pero finalmente

la expresión que debe considerarse es:

Señal del Límite de cuantificación:

yLCM = yB + 10 sy/x

Concentración del límite de cuantificación a través de la

curva de calibración

IX. Procedimiento para calcular lareplicabilidad (Precisión)

Dentro del intervalo de 2 a 10 veces el límite de cuantificación

del método, separar 10 alícuotas de una muestra y aplicarles

el método completo, respetando las siguientes condiciones:

mismo analista, mismo instrumento y mismo día. Para realizar

los cálculos que requiere el método e informar los resultados,

utilizar las unidades apropiadas y el número de cifras

significativas necesarias.

La replicabilidad se expresa como la desviación estándar

relativa o coeficiente de variación (CV).

X. Procedimiento para calcular larepetibilidad (Precisión)

Dentro del intervalo de 2 a 10 veces el límite de cuantificación

del método, separar 10 alícuotas de una muestra y aplicarles

el método completo, cambiando al menos una de las

siguientes condiciones: el analista, el instrumento o el día.

Para realizar los cálculos que requiere el método e informar

los resultados, utilizar las unidades apropiadas y el número de

cifras significativas necesarias.

Los resultados se expresan como desviación estándar relativa

o coeficiente de variación (CV).

XI. Procedimiento para determinar laexactitud

Dentro del intervalo de determinación, aplicar el métodoanalítico completo “n” veces (n = 3-10 replicas) a una muestraen la cual el parámetro a medir esté certificado por unorganismo reconocido (material de referencia certificado).

Vc = Valor certificado;

Vo = media de los valores obtenidos aplicado el método.

Además, puede ser necesario hacer el cálculo estadístico parala equivalencia con el material de referencia, utilizando el testde varianzas homogéneas

100V

)V(VE(%)

c

co

Para determinar el error relativo del método (E, %), aplique lasiguiente ecuación:

XI. Procedimiento para determinar laexactitud

1) Comparación del método en la misma muestra, con un métodoabsoluto

2) Comparar el método con un método independiente, ya sea éste dereferencia o validado previamente.

3) Recuperación en una matriz real con 2 niveles de concentracióndistintos. Los niveles de concentración deben estar, en un caso entre 2y 10 veces el LCM y en el otro, entre 20 y 30 veces el LCM.

4) Intercomparación entre a lo menos 2 laboratorios que utilicenmetodologías validadas.

Si no existe o no está disponible el material de referencia, la determinación dela exactitud puede llevarse a cabo de acuerdo a una de las siguientesposibilidades, y en siguiente orden de prioridad:

XII. Procedimiento para determinar larecuperación

Analizar una muestra real y en paralelo analizar la misma

muestra a la que se ha agregado una concentración dada de

estándar. La concentración final debe estar dentro del rango de

determinación del método. Calcular la recuperación de acuerdo

a la siguiente expresión:

100C

C)(C(%) ónRecuperaci

a

s

Cs = concentración de la muestra fortificada

C = concentración en la muestra no fortificada

Ca= concentración agregada.

XIII. Procedimiento para el cálculo dela incertidumbre

Cuantificación de los componentes de incertidumbre.

• Una forma común de presentar las diferentes contribuciones a laincertidumbre de la medición total es usar los diagramas de causa y efecto.Este enfoque puede resultar muy útil cuando se estudia o cuantificacomponentes de incertidumbres individuales.

• Se ha demostrado, sin embargo, que en algunos casos esta metodologíasubestima la incertidumbre de las mediciones, dado que es difícil poder incluirtodas las posibles contribuciones de incertidumbre en tal enfoque.

• En este contexto, el grupo de expertos en calidad y metrología de “Nordtest(2004)” ha propuesto el modelo para el cálculo de la incertidumbre en el quela repetibilidad (P. intermedia) de las mediciones se combina con la estimacióndel sesgo del método. Así, usando el control de calidad existente y los datosobtenidos en la validación del método analítico, la probabilidad de incluir todaslas contribuciones de incertidumbre se maximiza.

Sesgo: Diferencia entre el valor medio medido a partir de una serie de resultados de ensayo y un valor de referencia aceptado (un valor certificado o nominal).

XIII. Procedimiento para el cálculo dela incertidumbre

En este plano, un laboratorio puede combinar dichos componentes individualesen 2 tipos de incertidumbre: incertidumbre derivada de la repetibilidad(P. Intermedia) del método (urep) y la incertidumbre derivada delsesgo (usesgo).

La manera más común de estimar los componentes del sesgo son: eluso de material de referencia certificado, participación en rondasinterlaboratorios o ensayos de recuperación.

XIII. Procedimiento para el cálculo dela incertidumbre

Cálculo de Incertidumbre Expandida (U).

Para realizar el cálculo de U, se deben determinar previamente las dosincertidumbres estándares antes expuestas.

Cálculo de incertidumbre repetibilidad del método (urep):

Donde:

= Desviación estándar al nivel de repetibilidad.

t = Coeficiente de student para un 95% de nivel de confianza.n = número de datos.

n

nt )1,95.0(*urep =

XIII. Procedimiento para el cálculo dela incertidumbre

Cálculo de incertidumbre derivada del sesgo (usesgo):

Donde:

sesgo = el valor puede ser determinado alternativamente por medio delanálisis de un material de referencia certificado, participación en rondasinterlaboratorios o ensayos de recuperación .

u(CER) = Incertidumbre del material de referencia certificado o del patrón dereferencia (valor certificado) utilizado en el ensayo de recuperación

usesgo = 22 )()( uCERsesgo

XIII. Procedimiento para el cálculo dela incertidumbre

Finalmente la incertidumbre expandida (U) del proceso analítico, seexpresa combinando ambas incertidumbres antes mencionadas, considerandoun factor de recubrimiento igual a 2:

Incertidumbre Expandida (U): Cantidad que define un intervalo alrededor delresultado de una medición que se espera que abarque una gran parte de ladistribución de valores que se podrían atribuir razonablemente al mensurando,para un cierto nivel de confianza. Una Incertidumbre expandida (U) se calculade una incertidumbre estándar combinada (u) y un factor de cobertura kusando: U = k x u.

U = 22 )()(2 usesgourep

EJEMPLO – Calculo incertidumbre

Determinación de BTEXSe lleva a cabo una determinación de benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos(m+p, o) en una muestra de agua.

El estándar de calibración corresponde a una solución en metanol que certificaque las concentraciones de los compuestos son las nominales ± 0,5%.

El sesgo del método fue determinado a través de un ensayo de recuperación,con los siguientes datos (O: valor promedio obtenido; R: valor de referencia):

Bencenoµg/g

Tolueno µg/g

E-Bzµg/g

(m+p)-XIL µg/g

o-XILµg/g

O R O R O R O R O R

10,2 11,0 9,9 11,0 11,5 11,0 25,0 11,0 11,1 11,0

Determinación de BTEX

Nº µg/g BEN µg/g TOL µg/g ET-BEN µg/g (m+p)-XIL µg/g o-XIL

1 43,42 48,62 32,14 44,15 14,15

2 43,41 48,44 32,17 44,64 13,07

3 43,52 48,20 31,36 44,67 13,59

4 43,60 48,27 31,14 43,68 13,06

5 43,61 48,41 31,91 44,22 12,91

6 43,57 48,56 31,80 44,67 12,96

7 42,17 47,63 31,21 45,33 13,19

8 42,29 47,70 31,25 43,03 12,80

Ejemplo incertidumbre.xls

En la validación del método analizaron separadamente 8 alícuotas de una muestra real obteniéndose las siguientes concentraciones:

1. Para la determinación analítica de nitrofurantoína en formas farmacéuticas se añaden cantidades crecientes de la

droga de la droga en dimetilformamida (DMF). En seguida se mide la respuesta instrumental (señal analítica) de cada

solución y se obtienen los siguientes datos:

CONCENTRACIÓN Respuesta

mg/l Instrumental

0 0,01

0,5 0,058

1 0,11

2 0,225

4 0,445

6 0,67

8 0,89

10 1,08

12 1,1

15 1,12

20 1,11

(a)Determine la Sensibilidad del método.

Por otra parte, al no disponer de un material de referencia certificado, se prepara una muestra artificial de tableta que contiene 750

mg de excipientes comunes (estereato de magnesio, talco, almidon, colorante, gelatina etc.) y 250 mg de nitrofurantoina pura. Una

porción de 10 mg de muestra artificial se agrega en un matraz de aforo de 1 litro y se afora con DMF. A la solución resultante se le

determina su respuesta instrumental dando un valor de 0,272. (b) Determine la exactitud del método (error relativo) e indique si

hay interferencia por parte de los excipientes de la formulación.

10 muestras que contienen sólo la mezcla de excipientes (sin nitrofurantoína) son analizadas independientemente por el método. Las

respuestas instrumental obtenidas son: 0,015; 0,010; 0,012; 0,015; 0,010; 0,012; 0,009; 0,010; 0,015; 0,008. (c) Determine el límite

de detección del método.

10 porciones de una muestra real de tabletas de nitrofurantoína se analizan independientemente por el método analítico y se obtienen

los siguientes resultados (mg): 250,35; 250,44; 249,36; 248,99; 250,98; 250,00; 249,98; 251,05; 250,39; 248,98. (d) Determine la

precisión del método (desviación estándar relativa).

Rechazo de datos dudosos

Un dato dudoso difiere excesivamente de la media.

La prueba estadística Q se utiliza para decidir si un dato debe

retenerse o rechazarse.

Primero se calcula un valor de Qexp y se rechaza el dato

cuando el valor es mayor que el valor estadístico (Qcrit)

dudoso.valoralcercanomásvaloreles

dudoso.valoreles,minmax

exp

n

q

nq

x

xxx

xxQ

Valores de Qcrit

Número

de Datos

Qcrit a 90%

de probabilidad

Qcrit a 95%

de probabilidad

3 0.941 0.970

4 0.765 0.829

5 0.642 0.710

6 0.560 0.625

Ejemplo: Prueba Q

Para las mediciones replicadas queaparecen al lado, aplique laprueba Q para el valor 2.5. Useun Qcrit a 90% de confianza.

Valor (x) x2

3.5 12.25

3.1 9.61

3.1 9.61

3.3 10.89

2.5 6.25

(x)=15.5 (x2)=48.61

.,

60.05.25.3

1.35.2

ad.probabilidde90%ayvalores5para0.642

exp

exp

valorelretieneseQQ

Q

Q

crit

crit

EJEMPLO – Dato dudoso

En el mundial de fútbol de Alemania 2006, al final de cada partido,llevan a un par de jugadores para hacer la prueba del doping. En laorina se determinan si hay substancias prohibidas (en este casoefedrina).

Previamente el laboratorio que hizo el análisis validó su método conmuestras certificadas de efedrina en orina. Esta tenía un contenidocertificado de 2,05 ± 0,08 ng/ml. Al analizar esta muestra diez vecesde manera independiente se obtuvieron los siguientes valores enng/ml: 2,08; 2,14; 2,09; 2,21; 3,91; 2,01; 2,09; 1,99; 1,98; 2,05.

Indique: cuál es el objeto, el analito y la muestra para el análisis.

cuál es la exactitud y precisión del método que utiliza el laboratorio.

Qcrit (tabla (n=10) 0,464)

ejemplo prueba Q.xls

Cartas de Control

Una vez que ha sido validada una metodología y se comienza con su

aplicación en análisis de rutina, todos los controles de calidad

relacionados con las propiedades analíticas deben ser documentadas a

través de la construcción de Cartas de Control, de forma tal que el

comportamiento del método en el tiempo pueda ser trazable.

EJEMPLO carta control turbiedad.xls

GLOSARIO

Alícuota: porción bien definida (masa, volumen) de la muestra

Muestra: es la parte (alícuota) del objeto que contiene los analitos

Análisis: someter una muestra a un proceso analítico para conocer informaciónquímica sobre la misma

Blanco analítico: Muestra, generalmente artificial, que no contiene el analito.Teóricamente no debería originar señal, si lo hace ésta se denomina “señal blanco”.El blanco analítico es un elemento de control de calidad utilizado en la rutinaanalítica el que se procesa como una muestra más en un análisis

Interferente: Todo compuesto, todo elemento, toda partícula o todo factor queafecte el resultado generado por un método analítico

Determinación (cuantificación): proceso para conocer la cantidad/concentración de un analito (o familia) de una muestra que es analizada

Detectar: Acción de un instrumento para producir una señal y transducirla en unamagnitud física fácilmente medible. Proceso de medición con fines cualitativos.

Identificar: proceso analítico cualitativo que implica un reconocimiento del analito,a través de las características químicas o fisicoquímicas del mismo o de suproducto de reacción

Caracterizar: acción de establecer los aspectos diferenciales de un objeto osistema, a partir de los resultados analíticos

Técnica: principio científico que se utiliza para extraer información analítica.Implica el empleo de un instrumento

Método Analítico: corresponde a la Adaptación específica de una técnica analíticapara un propósito de medición seleccionado. Es un conjunto de operacionesespecificas para caracterizar cuali y/o cuantitativamente a un analito (o familia) enuna determinada muestra. Implica el empleo de un técnica (instrumento)

Método absoluto: es aquel método de cuantificación calculable que no se basa enel empleo de estándares analíticos

Procedimiento: descripción pormenorizada de una metodología analítica

Material de referencia: Material o sustancia, en el cual una o más de suspropiedades están suficientemente bien establecidas, homogéneas y estables, quese emplean para calibración, asignación de valores a materiales o evaluación demétodos analíticos

Material de referencia certificado: son materiales de referencia que tienencertificados uno o varios valores de sus propiedades (con sus incertidumbresespecíficas) obtenidos por procedimientos especiales (Ejemplo: ejercicio deintercomparación) bajo la responsabilidad de un organismo competente eindependiente

Ejercicio de intercomparación: conjunto de procesos de medida (método)llevados a acabo por diferentes laboratorios, bajo la coordinación de un entecompetente, para analizar alícuotas de la misma muestra para determinar losmismos analitos

Referencias

J.C. Miller and J.N.Miller, Statistic for Analytical Chemistry, Ellis Horwood Limitededition, Chichester, England, 3rd edition, pag. 115-118, 1993.

M. Valcarcel, Principios de Química Analítica, Springer-Verlag Ibérica, Barcelona,España, 1999.

Norma IRAM 301:2000-Norma ISO/IEC 17025: 1999.

The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to MethodValidation and Related Topics. EURACHEM Guide. Editor: H. Holcombe, LGC,Teddington: 1998.

Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. Guide EURACHEM- CITAC Guide:2000.

Nordtest Report 537. 2004. Handbook for Calculation of Measurement Uncertainty inEnvironmental Laboratories.

Norma ISO 9000: 2000.

IUPAC, Limit of Detection, Spectrochim. Acta 33 B, 242, 1978.

Centre d'expertise en analyse environnementale du Québec. Protocole pour lavalidation d'une méthode d'analyse en chimie DR-12-VMC. Edition 2000-03-01