SINTESIS DE FLOURESCEÍNA:ABSORCION Y EMISION DE LUZ

OBJETIVOS Realizar la síntesis de la fluoresceína

mediante una reacción de sustitución electrofilia aromática.

Estudiar el mecanismo de la reacción y las condiciones necesarias para sintetizar la fluoresceína.

Analizar la capacidad fluorescente de la fluoresceina y sus variaciones según el pH.

Determinar características de los compuestos fluorescentes.

Diferenciar las técnicas espectroscópicas.

RESULTADOS

Tabla 1. Registro de datos para la determinación del rendimiento de la reacción de síntesis de fluoresceína

REACTIVO/PRODUCTO MASA (g)

Resorcinol 2,2067

Anhídrido ftálico 1,5073

Fluoresceína

Masa papel filtro vacío

0.870

Masa de papel filtro más fluoresceína

2.507

Masa del producto

1,637

Determinación del reactivo límite:

Resorcinol (R):

2,2067 g R x1mol R

110,1g Rx

1mol F2mol R

x333 g

1 molF=3,337 g

Anhídrido Ftálico (AF):

1,5073 g AF x1 AF

148,1 gAFx

1mol F1 mol AF

x333 g

1mol F=3,389 g

*F= Fluoresceína

El resorcinol es el reactivo que se consume primero, por este motivo, se determina el porcentaje de rendimiento con la cantidad de producto formado a partir del resorcinol.

Porcentaje de rendimiento:

% rendimiento= peso obtenidopesoreal

x 100

%rendimiento= 1,6373,337 g

x100=49 %

Tabla 2. Aspecto de la fluoresceína en el visible y en el ultravioleta

DisolucionAspecto/

Color Visible

Aspecto/ Color en el

UV

Absorbancia (546nm)

Fluoresceina en HCl

Amarillo

Verde fluorescente intensidad media

0.141

Fluoresceina en NaOH

VerdosoVerde fluorescente muy intenso

0.069

Fluoresceina en agua

Amarillo

Verde fluorescente de poca intensidad

ANALISIS DE RESULTADOS

La fluoresceína es una compuesto de la familia de las xantinas, producto de una reacción de sustitución electrofílica aromática es una sal de sodio de resorcinol ftaleína. Tiene propiedades colorantes y fluorescentes. Es hidrosoluble y colorea el agua de color amarillo. Cuando se encuentra en soluciones de pH mayor a cinco, su color se torna verde y altamente fluorescente. La razón por la cual la fluoresceína emite fotones en el UV-vis, se debe a grupos funcionales con enlaces π responsables de este tipo de transiciones, conocidos como cromóforos. Entre mayor cantidad de grupos funcionales que permitan realizar transiciones π→π* (baja energía), se van a presentar transiciones en el UV-vis a mayor de 250nm. Las longitudes de onda de mayor energía afectan los enlaces σ→ σ* (mayor energía), produciendo la desactivación de los estados excitados y el rompimiento los enlaces.

Esta molécula es muy utilizada como un indicador de pH. Presenta transiciones electrónicas diferentes, al poseer 3 grupos ionizables, en medio ácido, estos grupos se van a protonar, en medio básico se van a desprotonar. Al generar cambios en la forma y el tamaño de la nube electrónica dependiendo del pH del medio, se van a presentar diferencias en el color del UV y el UV-vis además en la absorbancia. En una disolución básica se tiene un λmax de 490 nm, neutra 470nm y ácida a 437nm.

La radiación electromagnética es un espectro de emisión, ocurre cuando hay una relajación de las partículas excitadas a niveles de menor energía. Las formas más comunes para la excitación de partículas son: bombardeo de electrones, exposición a chispas de corriente, calor de una llama, horno, radiación ultravioleta, visible o infrarroja, radiación electromagnética.

Un espectro de emisión en la representación gráfica de la potencia de la radiación emitida de una sustancia vs la longitud de onda o frecuencia. Hay varios tipos de espectros de emisión, siendo el espectro de líneas la representación de la excitación de átomos individuales, las líneas más intensas en este tipo de espectros se conocen como líneas de resonancia y son características únicas para cada metal. El espectro de bandas consiste en varias longitudes de ondas definidas y muy cercanas, provenientes de todos las posibles transiciones de los niveles vibracionales que tiene las moléculas o radicales.

Figura 1. Transiciones de los espectros de emisión de líneas y de bandas

Cuando la radiación atraviesa una capa de sólido, líquido o un gas, se absorbe energía a diferentes longitudes de onda, dependiendo de la sustancia. La absorción provoca que las partículas pasen de un estado basal a un estado excitado de energía superior. Los iones y moléculas tienen un número limitado de niveles de energía discretos y para que se produzca la radiación tiene que coincidir la energía de los fotones excitadores con la diferencia de energía entre el estado fundamental y uno de los estados excitados

El estudio de las diferentes frecuencias de radiación permite caracterizar los componentes de una muestra, para esto se realiza un espectro de absorción que representa la absorbancia en función de la longitud de onda o frecuencia.

La radiación ultravioleta y visible tiene la energía suficiente para producir transiciones únicamente de los electrones más externos o electrones enlazantes. Las frecuencias de rayos X al ser mucho más energéticas interaccionan con los electrones más próximos al núcleo.

Figura 2. Espectros de absorción a diferente pH de la fluoresceína

Los espectros de absorción molecular son más complejos que los espectros atómicos, debido a la gran cantidad de estados de energía que tienen las moléculas en comparación a los átomos aislados. Esto se debe a que las moléculas están constituidas por energía electrónicas, energía vibracionales y energía rotacionales, las cuales al absorber energía.

Una de las diferencias que presentan los espectros de absorción y emisión, radica en que un compuesto absorbe a longitudes de ondas específicas para pasar de un estado basal a uno excitado, pero en un espectro de emisión no siempre se emite a la misma longitud de onda de absorción, un gran ejemplo de estos es la fluoresceína que emite a longitudes de onda mayores, es decir, a menor energía.1

Figura 3. Estados de transición de la fluorescencia

La fluorescencia está caracterizada por tener estados singuletes excitados, este estado tiene la misma dirección del spin

del electrón del estado fundamental. En el estado fundamental o basal, se mantiene un estado singulete, caracterizado por tener dos electrones en el orbital, con espines en diferente dirección (principio de exclusión de Pauli).

Entre los niveles de energía, van a aparecer niveles vibracionales. Cuando se excita la molécula va a presentarse una serie de relajaciones vibracionales hasta llegar al nivel de energía más bajo, así se genera emisiones de menor energía, es decir a mayores longitudes de onda. La energía disipada permite que aumente la temperatura por las colisiones entre las moléculas excitadas y el disolvente. Se va a generar una transferencia de energía y un incremento en la temperatura del disolvente.

Las emisiones de la fluorescencia se ven favorecidas entre menos tiempo dure la excitación, es decir, entre más rápido se llegue al estado fundamental para poder tener un menor tiempo de vida media del estado excitado. En la fluorescencia se van a presentar desactivaciones radiantes y no radiantes, siendo estas últimas las pertenecientes a las relajaciones vibracionales, las desactivaciones radiantes son las que permite la emisión de los fotones. Al desactivar la fluorescencia (procesos radiantes) mucho más rápido que los procesos no radiantes, se favorece la emisión de la molécula. En cambio, si la desactivación no radiante es mucho más rápida, la fluorescencia desaparece o es menos intensa.

La fluorescencia es afectada por: 2

Estructura: a mayor cantidad de dobles enlaces, el aumento del número de anillos y del grado de condensación va a aumentar la eficacia (relación entre el número de moléculas que emiten, respecto al número total de moléculas excitadas). Los heterocíclicos sencillos no presentan fluorescencia, pero aquellas estructuras condensadas con piridina, furano y tiofeno etc., si la presentan (quinolina, indol). Los halógenos disminuyen la fluorescencia porque quitan carga a los compuestos.

Efectos de la temperatura: al aumentar la temperatura va a aumentar la frecuencia de las colisiones, conllevando a la desactivación del estado electrónico excitado por la transferencia de energía que ocurren entre las moléculas excitadas y el disolvente.

Efectos del pH: la influencia del pH se ha utilizado para la determinación de puntos de equivalencia en titulaciones de ácido/base. Esto se debe a la gran cantidad de formas resonantes que se pueden presentar.

Efectos de la concentración: al aumentar la concentración, se van a presentar una mayor cantidad de colisiones que va a generar que se absorba mucho más rápido los fotones emitidos, es por esta razón que durante la determinación de los diferentes comportamientos de la fluoresceína según el pH, se necesitó diluirla lo suficiente, para poder apreciar la fluorescencia.

Figura 4. Estructuras resonantes de la fluoresceína

La forma lactona de la fluoresceína carece de grupo cromóforo y no presenta coloración, en cambio su forma quinoidea al presentar el cromóforo va a permitir que absorba en medio alcalino.

Figura 5. Formación del electrófilo del anhídrido ftálico

Esta reacción de sustitución electrofilíca aromática se cataliza en un medio ácido con el fin que se protone el oxígeno y se pueda formar un carbocatión (figura 5) que va a ser atacado por el resorcinol.

Figura 6. Mecanismo de la síntesis de la fluoresceína

El anhídrido ftálico es el electrófilo, el cual es atacado por el anillo del resorcinol. Al unirse a la molécula, el OH del anhídrido se protona y presenta una pérdida de agua formando de nuevo un carbocatión. Viene otra molécula de resorcinol y ataca de nuevo al carbocatión. Se presenta un ataque del OH del resorcinol sobre el carbono contiguo, eliminándose agua y dándose la formación de un ciclo. En este instante se forma un equilibrio entre la forma lactona y la forma quinoidea, diferenciándose esta última por la formación de COOH debido al rompimiento del enlace éster.

En la determinación del rendimiento de la reacción se obtuvo un 49%, este valor debió haber sido más alto ya que la reacción se hizo en reflujo. La temperatura acelera la velocidad de la reacción aumentando las colisiones entre

las moléculas de resorcinol y anhídrido ftálico. Pero la temperatura aplicada no puede ser muy grande porque puede descomponerse alguno de los componentes ya que no poseen puntos de ebullición muy grandes.

Además de la síntesis de la fluoresceína, se analizó su comportamiento en soluciones de diferente pH, observándose que tanto en medio acido como en neutra el compuesto colorea la solución de amarillo, pero en medio básico la solución presentaba una coloración verdosa. Además, en al observarse las soluciones en una cámara de UV, la solución neutra y la acido dieron un color verde pero de poca intensidad, a diferencia de la solución alcalina, que dio un verde fluorescente muy intenso. Este comportamiento debe a que en pH neutros o acidos, se favorece la forma lactona y en pH básico se favorece la forma quinoidea, que posee un grupo cromóforo que le permite absorbe y emitir en este medio.

Figura 7. Espectro de masas de la fluoresceína.

La espectrometría de masas es una técnica muy sensible que puede identificar compuestos a partir de la masa. En la cámara de ionización se pueden introducir muestras solidas o liquidas, o con acoples con otros instrumentos como cromatógrafos. Se bombardea con una corriente de electrones que al chocar con las moléculas producen iones cargados positivamente. Estos iones formados denominados iones moleculares, pasan a través de un campo eléctrico a una cámara de selección que separa cada uno de los iones moleculares según la relación masa/carga, la mayoría de los iones tiene una carga de +1.

A partir del espectro de masas de la fluoresceína, se aprecia que el correspondiente ion molecular aparece a 332, este ion determina entonces la masa del compuesto que concuerda con la literatura. La abundancia de la señal es muy pequeña, debido a que el compuesto presenta un gran peso molecular y porque tiene una estructura no lineal.

Se presenta un pico a 287 muy intenso (pico base) por la pérdida de COOH de m/z 45. Aparece también un pico a 303, producto de la pérdida de CHO del fenol.

Figura 8. Pérdida de COOH de la fluoresceína.

Figura 9. Perdida de COH de la fluoresceína

Figura 10. Espectro IR de la fluoresceína

En el espectro de absorción infrarroja para la fluoresceína se observó aproximadamente en 3300cm-1, una banda ancha pero de mediana intensidad, característica de los grupos hidroxilo tanto del fenilo como del ácido carboxilo que forman parte de la estructura del compuesto. Generalmente se esperaría que dicha banda apareciera por encima de los 3500cm-1 y con una intensidad mayor de la observada. La disminución de la intensidad de la banda, es ocasionada por el uso de un solvente líquido para realizar la lectura en el IR, el cual hace que las moléculas del compuesto interaccionen entre ellas mediante enlaces de hidrogeno. Además, la presencia de los dobles enlaces en la

molécula, permiten que haya resonancia especialmente los de los anillos aromáticos, haciendo que la señal se desplace hacia menores frecuencias.

Entre 3000 y 2800cm-1 hay una banda intensa característica de la vibración de tensión de los enlaces C-H de hibridación sp2, también se encuentra desplazada hacia la derecha por el efecto de resonancia producida por múltiples enlaces dobles de la molécula, ya que, generalmente en un hidrocarburo aromático la banda se observa entre los 3100-3000cm-1.

Teniendo en cuenta la estructura del compuesto, se esperaría encontrar una banda intensa en 1720cm-1 debido a la presencia de un grupo carboxilo en la fluoresceína, pero en el espectro de referencia, la banda no aparece y la más cercana a ese valor se encuentra en 1600cm-1 banda característica de la vibración de tensión del doble enlace carbono-carbono de los anillos aromáticos. Pero para este caso, normalmente se esperaría ver 4 bandas de intensidad variable unas cerca de los 1600cm-1 y las otras cerca de los 1500 cm-

1, realmente en el espectro no se ve tal comportamiento solo se observan dos bandas un poco intensas cercanas a las regiones ya mencionadas, lo que sugiere un solapamiento de las señales de los enlaces C=C y C=O, además siendo la fluoresceína una sal, su grupo carboxilo estaría en su forma anicónica como anión carboxilato, donde los dos enlaces carbono-oxigeno están fuertemente

acoplados con fuerza de enlace intermedia entre el C=O y C-O.3

Figura 11. Espectro RMN1H de la fluoresceína

El espectro de RMN1H, tomado con la forma estructural lactona de la fluoresceína, aparentemente muestra que la molecula posee cinco tipos de hidrógenos, que se encuentra en medios electromagnéticos diferentes.

Figura 12. Estructura de la fluoresceína para RMN!H.

Pero al observar la imagen estructural que acompaña al espectro se observan siete tipos de hidrógenos diferenciados con las letras del alfabeto.En primero lugar se encuentra el protón A que está 10.1ppm, a simple vista la señal no es muy notoria debido a su poco intensidad, esta señal corresponde a los hidrógenos que están unidos a los oxígenos. Siendo el oxígeno un átomo más electronegativo que el hidrogeno y el carbono, ocasiona una desprotección en el

hidrogeno desplazando la señal hacia frecuencias más altas y la baja intensidad ocurre porque el hidrogeno en esta posición no posee hidrógenos vecinos que puedan desdoblar su señal.El protón tipo B, aparece cerca de los 8.1ppm, es el hidrogeno que se encuentra cerca del grupo carboxilo, el cual está induciendo el desplazamiento de la señal. Los protones C, D y E corresponden a los protones que están más lejos del grupo carboxilo pero ubicados en el mismo añillo, son responsables de la señal que aparece entre 7.2 y 7.8 ppm, que tiene apariencia de multiplete pero no se alcanza a distinguir por la resolución de del espectro. Estos tres protones son diferentes, pero la diferencia de sus ambientes electromagnéticos no es tan grande y por lo tanto, sus señales están muy juntas. Los hidrógenos tipo F, aparecen aproximadamente a 6.7 ppm, se encuentra desplazados por el efecto de los oxígenos presentes en la molécula y su señal corresponde a un singulete, debido a que no tiene hidrógenos vecinos. Muy cerca de esta señal, aproximadamente a unos 6.5 ppm aparece la señal de los hidrógenos tipo G, que se encuentras más lejos de los oxígenos, pero se encuentran desplazados a mayores frecuencias, debido a que el fenómeno de desprotección ocasionado por la electronegatividad del oxígeno es muy fuerte.

PREGUNTA

Rodamina B

Las rodaminas B son un tipo de colorantes rojos, de la familia de las xantinas, se deriva por la condensación de las interacciones del meta N,N dimetilamino fenol y el anhídrido ftálico. Estos colorantes orgánicos solubles son ampliamente empleados para la fabricación de barnices coloreados y tintas tipográficas.

Naranja de acridina

El naranja de acridina es un colorante catiónico selectivo para los ácidos nucléicos y útil para realizar determinaciones sobre el ciclo celular. Interacciona con el ADN y el ARN por intercalación dentro de la molécula o por atracción electrostática, respectivamente. El máximo de excitación es a a 502 nm y una emisión a 525 nm (en el verde). Cuando está asociado al ARN, la excitación máxima deriva a 460 nm (en el

azul) y la emisión máxima a 650 nm (en el rojo).

El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. El color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentración. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y rojo si está muerto.4

CONCLUSIONES

Los compuestos fluorescentes tiene la capacidad de emitir fotones a longitudes de ondas mayores que la irradiación utilizada para la excitación.

La fluoresceína tiene una mayor absorbancia y emisión de luz, cuando se encuentra en un pH alcalino, debido a que en este medio se favorece la forma quimoidea que posee un cromóforo.

En la espectrometría de masas, a diferencia de las demás técnicas como UV, IR, RMN., las moléculas al ser ionizadas a partir de un haz de electrones se rompen los enlaces de las moléculas, destruyéndose la muestra.

REFERENCIAS

1. SKOOG, PRINCIPIOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL, quinta edición, editorial Mc Graw Hill. Pág. 139- 141

2. SKOOG, PRINCIPIOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL, quinta edición, editorial Mc Graw Hill. Pág. 384-391

3. ZULUAGA, F; INSUASTY, B.; YATES, B.; ANALISIS ORGANICO CLASICO Y ESPECTRAL, Universidad del Valle, Facultad de ciencias, departamento de química, mayo 2006. Pág. 133-135

4. http://www.bio-nica.info/biblioteca/

TincionBacterias.pdf. Visitada 01/09/2011