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Dirección General de Epidemiología
Instituto de Diagnóstico y referencia Epidemiológicos“Dr. Manuel Martínez Báez”
lineamientos para la vigilancia epidemiológicade leptospirosis mediante aglutinación
microscópica
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LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA
DE LEPTOSPIROSIS MEDIANTE AGLUTINACIÓN
MICROSCÓPICA
DGE-InDRE–RNLSP
2015
FOTOGRAFÍA DE LA PORTADA PROPIEDAD DE HKS ARQUITECTOS
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PRIMERA EDICIÓN, 2015 LEPTOSPIROSIS–RNLSP ESTE DOCUMENTO FUE AVALADO POR LOS REPRESENTANTES DE LAS INSTITUCIONES QUE
CONFORMAN EL GRUPO TÉCNICO INTERINSTITUCIONAL DEL COMITÉ NACIONAL DE
VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA (CONAVE). TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS CONFORME A LA LEY, © INDRE-SECRETARÍA DE SALUD SE PERMITE LA REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL SI SE CITA LA FUENTE: “LINEAMIENTOS
PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE LEPTOSPIROSIS MEDIANTE AGLUTINACIÓN
MICROSCÓPICA” VERSIÓN NO. 01. INDRE, 2015. COLECCIÓN PUBLICACIONES TÉCNICAS DEL INDRE: ISBN: EN PROCESO INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS DR. MANUEL MARTÍNEZ
BÁEZ. FRANCISCO P MIRANDA 177, COL. LOMAS DE PLATEROS DEL. ÁLVARO OBREGÓN, C. P. 01480, MÉXICO, D. F. WWW.INDRE.SALUD.GOB.MX, TEL. (55)53-42-75-50 LA EDICIÓN ESTUVO A CARGO DE: DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑÓNEZ EL DISEÑO ESTUVO A CARGO DE: LIC. BRENDA ESCOBEDO LÓPEZ IMPRESO EN MÉXICO. PRINTED IN MEXICO
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SECRETARÍA DE SALUD
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SUBSECRETARIO DE INTEGRACIÓN Y DESARROLLO DEL SECTOR SALUD
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LIC. MARCELA GUILLERMINA VELASCO GONZÁLEZ
SUBSECRETARIA DE ADMINISTRACIÓN Y FINANZAS
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TITULAR DE LA COMISIÓN COORDINADORA DE INSTITUTOS NACIONALES DE SALUD Y
HOSPITALES DE ALTA ESPECIALIDAD
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DIRECTOR GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE PROGRAMAS PREVENTIVOS Y CONTROL
DE ENFERMEDADES
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DR. CUITLÁHUAC RUIZ MATUS
DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGÍA
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DIRECTOR GENERAL ADJUNTO
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JEFE DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA
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JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA
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JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS
DR. JOSÉ ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y VALIDACIÓN DE TÉCNICAS
M. EN C. CARINA BERENICE BRITO LORÁN
JEFA DEL LABORATORIO DE LEPTOSPIROSIS
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GRUPO DE TRABAJO
M. EN C. CARINA BERENICE BRITO LORÁN
JEFA DEL LABORATORIO DE LEPTOSPIROSIS
BIOL. IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ
DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA
DR. HUGO MARTÍNEZ ROJANO
ASESOR TÉCNICO DE LA DIRECCIÓN GENERAL ADJUNTA DEL INDRE
COORDINADOR DE MEDICINA LABORAL
DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ
DIRECTOR GENERAL ADJUNTO
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LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA
EPIDEMIOLÓGICA DE LEPTOSPIROSIS
MEDIANTE AGLUTINACIÓN
MICROSCÓPICA
DGE-InDRE–RNLSP
2015
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ÍNDICE
Contenido
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 9
ANTECEDENTES ...................................................................................................... 10
Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública....................................................... 10
MARCO LEGAL ......................................................................................................... 12
DEFINICIONES OPERATIVAS ................................................................................ 13
OBJETIVO GENERAL .............................................................................................. 13
Objetivo Específico .................................................................................................... 13
Red Nacional de Laboratorios para la Vigilancia de Leptospirosis .......................... 14
ORGANIZACIÓN DE LA RED .................................................................................. 16
FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED ................................................ 16
Funciones del laboratorio de nivel central ............................................................ 16
Funciones de los laboratorios estatales (LESP) .................................................... 16
DIAGNÓSTICO DE LEPTOSPIROSIS POR LABORATORIO .................................. 17
ESTÁNDAR DE CALIDAD ........................................................................................ 19
Criterios de aceptación .......................................................................................... 19
Criterios de rechazo ............................................................................................... 19
Estándar de servicio ............................................................................................... 20
CAPTURA DE DATOS Y RESULTADOS .................................................................. 20
PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO (PEED) .............. 26
Evaluación del panel .............................................................................................. 28
Ponderación: .......................................................................................................... 28
Criterios para la liberación del diagnóstico .............................................................. 29
Banco de material biológico ...................................................................................... 29
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ........................................................................ 30
BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................... 31
TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS .................................................................................... 34
CARACTERÍSTICAS EQUIPOS COMERCIALES..................................................... 39
PREPARACIÓN DE REACTIVOS ............................................................................. 39
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INTRODUCCIÓN
La leptospirosis es una enfermedad infecciosa causada por bacterias patógenas
llamadas Leptospiras que son transmitidas, directa o indirectamente, desde los
animales a los seres humanos siendo, por tanto, una zoonosis, los humanos son
huéspedes ocasionales y los reservorios animales incluyen roedores en su mayoría,
estos excretan Leptospiras en orina y por lo tanto contaminan el medio ambiente
transmitiendo la enfermedad a otros animales o a humanos, es la zoonosis con
mayor distribución a nivel mundial. La transmisión entre humanos ocurre muy
raramente.
La leptospirosis se conoce también por otros nombres tales como: enfermedad de
Weil (L. icterohaemorrhagiae); Fiebre de los arrozales (L. bataviae); enfermedad
de los heneficadores; enfermedad de los porqueros (L. pomona); enfermedad de
los manipuladores de pescados, ictericia enzóotica; enfermedad de Stuttgard (L.
canicola en Europa); ictericia hemorrágica; ictericia infecciosa; agua roja; fiebre de
los 7 días (L. hebdomadis en Japón); fiebre otoñal japonesa (L. autumnalis); Fiebre
Canicola, Fiebre del barro, enfermedad de Swineherd.
Es una enfermedad que ocurre en todo el mundo, pero es más común en las áreas
tropicales y subtropicales con altos índices de precipitación, de las cuales podemos
encontrar en México. La enfermedad se encuentra en cualquier lugar en donde los
humanos entran en contacto con la orina de animales infectados o un ambiente
contaminado con orina.
El número de casos humanos que ocurren mundialmente no es conocido con
precisión. De acuerdo con los informes disponibles, la incidencia anual varía dentro
de un rango desde, aproximadamente 0.1-1 por 100,000 habitantes en climas
templados hasta 10-100 por 100,000 en climas húmedos tropicales. Cuando se
producen brotes, y en los grupos con alto riesgo de exposición, la incidencia de la
enfermedad puede alcanzar más de 100 por 100,000 habitantes, sin embargo se
considera que estas son cifras subestimadas ya que la enfermedad puede
confundirse fácilmente con una variedad de padecimientos debido a que puede
presentarse con una diversidad de manifestaciones clínicas que pueden variar
desde una enfermedad pseudo gripal leve hasta una enfermedad seria que puede
llegar a ser fatal. La leptospirosis también puede mimetizar otras enfermedades,
como por ejemplo el dengue y otras enfermedades hemorrágicas virales.
La ictericia, es un síntoma relativamente común en leptospirosis pero que también
puede ser encontrado en otras enfermedades que involucran el hígado como las
diversas formas de hepatitis. Otros síntomas son menos comunes y no son
reconocidos como posibles indicadores de una infección por leptospiras. El
diagnóstico es confirmado con pruebas de laboratorio, pero estas no están siempre
disponibles, especialmente en países en desarrollo.
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Existen diferentes clasificaciones de las leptospiras, una de ellas es basada en el
concepto de serovar, se han descrito alrededor de 200 serovares patógenos, los que
han sido agrupados en 25 serogrupos en base a sus similitudes antigénicas. Cepas
distintas, con pequeñas diferencias antigénicas, pueden algunas veces encontrarse
dentro de ciertos serovares. Tiene importancia epidemiológica pues un
determinado serovar puede desarrollar una relación comensal o de leve
patogenicidad con determinada especie animal. Por ejemplo, el ganado vacuno es a
menudo asociado con el serovar hardjo, los perros con canicola y las ratas con
icterohemorrágica y copenhageni.
En México las acciones de vigilancia se apoyan en la Red Nacional de Laboratorios
Estatales de Salud Pública (RNLSP) de la cual el InDRE es el laboratorio de
referencia.
El presente documento establece los lineamientos de operación que debe seguir la
RNLSP para realizar el diagnóstico de leptospirosis por Aglutinación Microscópica
(MAT), las bases y la evaluación de dicho diagnóstico.
ANTECEDENTES
El Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos tuvo su origen en el
Instituto de Salubridad y Enfermedades Tropicales (ISET). A pesar de que se
señala a 1939 como año de inicio de los trabajos del ISET, desde 1935 se había
designado una comisión para elaborar un proyecto de creación y organización del
Instituto para constituir un centro de investigación y docencia para el estudio de las
enfermedades importantes en salud pública prevalentes en México,
fundamentalmente las infecciosas. El ISET se inauguró oficialmente el 18 de marzo
de 1939 por el Lic. Rubén Leñero en representación del entonces Presidente de la
República General Lázaro Cárdenas.
ANTECEDENTES DE LA RED NACIONAL
Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública
La Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP) es el conjunto de
laboratorios de vigilancia epidemiológica con objetivos específicos que le han
permitido unificar métodos de diagnóstico, criterios de interpretación de
resultados, transferencia tecnológica, generación de conocimiento y formación de
recursos humanos. Es el soporte técnico-científico útil para la vigilancia
epidemiológica y que genera información de calidad para la toma oportuna de
decisiones a través de la confirmación de diagnósticos mediante estudios de
laboratorio en muestras biológicas.
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La RNLSP depende de la Secretaría de Salud y es el Instituto de Diagnóstico y
Referencia Epidemiológicos Dr. Manuel Martínez Báez (InDRE) su órgano rector
en el área de vigilancia epidemiológica. Tiene fundamento legal en la Norma Oficial
Mexicana NOM-017-SSA2-2012, Para la vigilancia epidemiológica y está
conformada por 31 Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP) de las 32
entidades federativas del país (el Distrito Federal envía sus muestras al InDRE).
El Marco Analítico Básico de la RNLSP consta de 27 diagnósticos, distribuidos en
16 redes de vigilancia específica.
Antecedentes de la Red de Leptospirosis
El diagnóstico de leptospirosis, se comenzó a realizar en el año 1993, donde el
“Departamento de Bacteriología y Micología” estaba integrado por el Laboratorio
de Cólera y Bacterias Entéricas, Laboratorio de Infecciones Respiratorias Agudas,
Laboratorio de Brucela, y el Laboratorio de Enfermedades de Transmisión Sexual.
A lo largo de la historia la organización interna del InDRE ha variado en repetidas
ocasiones, algunas de ellas para apegarse a la legislación pero siempre con la
finalidad de buscar mejoras, así actualmente el InDRE cuenta con seis
departamentos que son; Bacteriología, Biología Molecular, Enfermedades
Emergentes y Urgencias, Parasitología, Virología y Control de muestras y servicios.
El Laboratorio de Leptospirosis pertenece al Departamento de Bacteriología, el
cual desde 2008, con la finalidad de hacer eficientes algunos procesos, modifica su
organización y queda integrado de la siguiente manera: Laboratorio de Cólera y
Enterobacterias, Laboratorio de Producción de Sueros, Laboratorio de Infecciones
Respiratorias Agudas Bacterianas, Laboratorio de Brucelosis, Laboratorio de
Bacteriología Molecular, Laboratorio de Leptospirosis, Laboratorio de Medios de
Cultivo, Laboratorio de Micología y Laboratorio de Micobacterias.
La pandemia de influenza AH1N1 ocurrida en el año 2009, vino a reforzar la
importancia de que el país cuente con un instituto como el InDRE y de que este se
encuentre coordinando y al frente de la Red Nacional de Laboratorios de Salud
Pública. Así mismo el InDRE estrechó relaciones con los Centros de Control de
Enfermedades de EU (CDC) que son una referencia en pruebas interlaboratorios y
en el desarrollo de nuevas metodologías de diagnóstico, y de pruebas que se han
modernizado con el objetivo de mejorarlas y simplificarlas.
El InDRE es la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública y cuenta con los 31
laboratorios estatales, siendo la institución rectora, así a lo largo de los años ha
crecido en cuanto a personal, capacidades y necesidades.
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MARCO LEGAL
Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos. Artículo 4. DOF
05/02/1917, Última Reforma D.O.F. 15/02/2012.
Ley General de Salud. Artículo 3, XV; 59; 64, III; 133; 134, I; 136, 138, 139 y
141. DOF 7/02/1984, Última Reforma DOF 07/06/2012.
Secretaría de Salud. Programa Sectorial de Salud 2013-2018. Diario Oficial
de la Federación DOF: 12/12/2013.
Plan Nacional de Desarrollo 2013-2018. Diario Oficial de la Federación,
DOF: 20/05/2013, www.dof.gob.mx
Secretaría de Salud. Programa de Acción Específico 2013-2018. Sistema
Nacional de Vigilancia Epidemiológica, primera edición 2014.
Leptospirosis humana: guía para el diagnóstico, vigilancia y
control/Organización Mundial de la Salud; traducción del Centro
Panamericano de Fiebre Aftosa.- Río de Janeiro: Centro Panamericano de
Fiebre Aftosa-VP/OPS/OMS, 2008.
Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012. Para la vigilancia
epidemiológica. (DOF: 19/02/2013)
Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-029-SSA2-1999. Para la vigilancia
epidemiológica, prevención y control de la leptospirosis. (DOF:
30/06/2000)
Norma Oficial Mexicana NOM-032-SSA2-2010. Para la vigilancia
epidemiológica, prevención y control de enfermedades transmitidas por
vector. (DOF: 01/06//2011)
Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. Protección
Ambiental-Salud ambiental-Residuos peligrosos-biológico-infecciosos-
Clasificación y especificaciones de manejo. (DOF: 17/02/2003)
Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005. Que establece las
características, el procedimiento de identificación, clasificación y los listados
de los residuos peligrosos. (DOF: 23/06/2006).
Norma Oficial Mexicana NOM-007-SSA3-2011. Para la organización y
funcionamiento de los laboratorios clínicos. (DOF: 27/03/2012).
Lineamientos para programas de evaluación externa del desempeño de la
Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública, InDRE- Secretaría de Salud,
2014.
Criterios de Operación para la Red Nacional de Laboratorios de Salud
Pública, InDRE-Secretaría de Salud, 2014.
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DEFINICIONES OPERATIVAS
Caso confirmado positivo de Leptospirosis: Persona que presenta
sintomatología sugestiva de la enfermedad (una enfermedad leve de tipo pseudo
gripal fiebre, dolor de cabeza, dolores musculares, escalofríos, diaforesis, disnea de
esfuerzo, astenia, adinamia, nauseas, vómito, diarrea, uveítis, derrame y
hemorragia conjuntival, dolor abdominal, con poca frecuencia erupción en la piel,
exantemas maculopapulares, petequiales o purpúricos, ictericia, falla renal,
hemorragia y miocarditis con arritmias, meningitis/meningo-encefalitis
hemorragia pulmonar con falla respiratoria, se confunde con dengue u otras fiebres
hemorrágicas) con confirmación en una segunda muestra en donde el título debe
aumentar cuatro veces más que el valor inicial. Persona que en su primera muestra
presenta títulos de anticuerpos mayores o iguales a 1:1280.
Caso confirmado negativo de Leptospirosis: Persona cuyo título en una
segunda muestra no aumenta cuatro veces respecto a la primera.
Caso indeterminado de Leptospirosis: Persona que solo le fue tomada una primera muestra y presentó títulos menores a 1:1280 y no se cuenta con la segunda muestra para confirmar el resultado.
OBJETIVO GENERAL Establecer los procedimientos para la aplicación del algoritmo de diagnóstico de
Leptospirosis y el manejo adecuado de la información generada por el laboratorio,
a través de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP), en apoyo a
la Vigilancia Epidemiológica de esta enfermedad.
Objetivo Específico
Definir los lineamientos para realizar un diagnóstico homogéneo, oportuno y
confiable de la Leptospirosis, mantener la vigilancia continua de la circulación de
los diferentes serovares de Leptospira y generar datos útiles para estudios
epidemiológicos.
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Red Nacional de Laboratorios para la Vigilancia de Leptospirosis La red de diagnóstico de Leptospirosis del InDRE cuenta con una red de 17
laboratorios estatales; Aguascalientes, Baja California Sur, Chiapas, Chihuahua,
Guerrero, Hidalgo, Michoacán, Morelos, Oaxaca, Puebla, Quinta Roo, San Luis
Potosí, Sonora, Tabasco, Tamaulipas, Veracruz y Yucatán (ver figura 1),
actualmente el estado de Sinaloa se encuentra en proceso de incorporarse. En el
InDRE se realiza el diagnóstico del resto de los estados que no pertenecen a dicha
red, así mismo recibe muestras para realizar el control de calidad de la RNLSP
(10% indeterminadas, 100% de positivas y 100% de negativas) y referencia.
En el InDRE se realiza el diagnóstico con un panel de 19 serovares de Leptospiras,
mismo que fue donado por el Instituto Oswaldo Cruz de Brasil en el año 2009, sin
embargo los laboratorios estatales solo trabajan aquellos serovares con mayor
prevalencia en su región, y es su responsabilidad determinar cuáles son los
mismos. Cada año se renueva dicho panel para toda la red, pudiendo variar los
serovares solicitados, así también durante el transcurso del año se pueden realizar
otros envíos a algún estado si por sus necesidades lo llega a solicitar, en el año 2013
cada estado tiene la distribución mostrada en el cuadro 1.
Figura. 1. Red Nacional de Leptospirosis
17 laboratorios
Aguascalientes Baja California Sur Chiapas Chihuahua Guerrero Hidalgo Michoacán Morelos Oaxaca Puebla Quinta Roo San Luis Potosí Sonora Tabasco Tamaulipas Veracruz Yucatán
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Cuadro 1. Serovares RNLSP 2014
Ags BCS Chis Chih Gro Hgo Mich Mor Oax Pue Qro SLP Son Tab Tamps Ver Yuc Estado/ Serovariedad
x x x x x x x x x Autumnalis
Akiyami A
x x x Australis Ballico
x Bataviae Swart
x x x x x x x x x x x x x x x x x Canicola Hond
Utretch IV
Castellonis
Castellón 3
Copenhageni M20
x x x x x Cynopteri 3522C
x x x x x x Grippotyphosa
Moskva V
x x x x x x x x x x x x x x x x x Hardjo
Hardoprajitno
x Hebdomadis
Hebdomadis
x x x x x x x x x x x x x x x x x Icterohaemorragiae
RGA
Javanica Veldrat
Batavia 46
x x Panamá CZ 214 K
Patoc Patoc 1
x x x x x x x x x x x x x x Pomona Pomona
x x x x x x x x x x x x x x Pyrogenes Salinem
x x
Sejroe M84
x x x x x x x x x Tarassovi
Perepelitsin
x x x x Wolffi 3705
7 6 8 7 8 6 8 6 10 5 5 6 7 7 9 8 8 Total de serovares
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ORGANIZACIÓN DE LA RED
La Red Nacional de Laboratorios de diagnóstico de Leptospirosis la encabeza el
Laboratorio de Leptospirosis adscrito al departamento de Bacteriología del InDRE
y está integrada por los 17 Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP) que
realizan el diagnóstico con la técnica de Aglutinación Microscópica (MAT) y a los
cuales el InDRE evalúa a través del control de calidad y paneles de evaluación de
desempeño, también se incluyen aquellos laboratorios locales y/o jurisdicciones
que se encuentren ligados a los LESP.
El LESP Sinaloa se encuentra en proceso de implementación y próxima liberación
del diagnóstico
FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED
Funciones del laboratorio de nivel central
El laboratorio de Leptospirosis del InDRE, es el laboratorio nacional de referencia y
el órgano normativo para el diagnóstico, las funciones que le competen son:
Realizar el diagnóstico de Leptospirosis con la técnica aglutinación
microscópica.
Realizar el control de calidad y ser referencia de los LESP.
Capacitar en servicio a los LESP en el diagnóstico de Leptospirosis.
Asesorar y dar soporte a la RNLSP respecto al diagnóstico de Leptospirosis
por MAT.
Resguardar los serovares de Leptospiras, propagarlos y proveer a la red.
Realizar dos veces al año el “Programa de Evaluación Externa del
Desempeño” (PEED) para la RNLESP.
Capacitar anualmente al personal de la Red.
Dar soporte a todos aquellos LESP que deseen unirse a la red nacional de
diagnóstico de Leptospirosis y además que cumplan con los requerimientos
necesarios para realizar la técnica de aglutinación microscópica.
Funciones de los laboratorios estatales (LESP)
Emitir en tiempo y forma los resultados de los exámenes de laboratorio.
Referir muestras al InDRE para control de calidad y referencia (los
porcentajes de las mismas dependerán de los resultados obtenidos en
las evaluaciones de cada laboratorio).
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Solicitar al InDRE el panel de serovares como mínimo cada inicio de
año.
Participar en el Programa de Evaluación Externa de Desempeño
(PEED).
Realizar el diagnóstico de manera homogénea con la RNLESP
siguiendo las directrices acordadas durante los talleres anuales de
capacitación realizados en el InDRE.
Elegir su panel de serovares de acuerdo a la prevalencia que tengan los
mismos en el estado correspondiente.
Capacitar al personal de nuevo ingreso.
Asistir a capacitación en servicio en el InDRE cuando su evaluación del
PEED sea inferior a 80% o cuando se integre algún nuevo integrante al
diagnóstico y no haya podido ser capacitado por alguien previamente
capacitado en el InDRE.
DIAGNÓSTICO DE LEPTOSPIROSIS POR LABORATORIO
Toma manejo y envío de muestras
La toma de la muestra deberá realizarse los pacientes deberán estar en ayunas, en
un lugar perfectamente iluminado y el paciente cómodamente sentado y en ayuno.
Deberá localizar una vena adecuada en la cara anterior del codo y colocar el
torniquete en la parte media del brazo. Desinfectar el área con un algodón
humedecido con alcohol al 70% e introducir la aguja con el bisel hacia arriba. Si la
sangre no fluye espontáneamente presionar el tubo de ensaye hacia arriba. Al
empezar a fluir la sangre retirar el torniquete y una vez que se haya obtenido la
cantidad de sangre requerida; 5-7 mL, retirar la aguja y colocar una torunda con
alcohol sobre el sitio de punción ejerciendo presión para detener el sangrado. Para
la obtención de suero usar tubo sin anticoagulante (tubo Vacutainer de tapón rojo).
Para hacer la separación de suero, una vez tomada la muestra dejar el tubo a
temperatura ambiente durante 15 minutos para permitir la retracción del coágulo,
separar el coágulo formado con un aplicador de madera estéril y dentro de un
gabinete de bioseguridad tipo II, centrifugar a 2,500-3,000 rpm durante 10 min.
Colocar el suero en tubos estériles, de plástico de 1.5 mL con tapón de rosca y si
muestra indicios de contaminación debe desecharse de inmediato (realizar este
paso dentro de un gabinete de bioseguridad tipo II), rotular y sellar correctamente
con papel parafinado, si no cuenta con la infraestructura para realizar la separación
del suero puede enviar el tubo con el que se realizó la toma, almacenar a 4 °C.
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Enviar las muestras en una hielera, colocadas verticalmente en una gradilla a 4 °C
debidamente rotuladas y selladas [1].
ALGORITMO DIAGNÓSTICO
Figura. 2. Algoritmo de laboratorio para el diagnóstico de leptospirosis
1 El sistema básico de triple embalaje consiste en la utilización de un recipiente primario, en el cual está
contenida la muestra biológica (exudado faríngeo, exudado nasofaríngeo, lavado bronquio alveolar, biopsia,
suero, etc.), el recipiente primario (p. ej. criotubos, tubos o frascos con tapa de rosca) debe ser hermético para
evitar que la muestra se derrame y tiene que estar perfectamente etiquetado con el nombre o número de
muestra del paciente. El recipiente primario deberá rodearse de material absorbente como gasa o papel
absorbente y colocarse en un recipiente secundario hermético a prueba de derrames y golpes. Si se colocan
varios recipientes primarios dentro de un recipiente secundario se deberá usar una gradilla y material
absorbente para evitar algún derrame. Es importante mencionar que dentro del recipiente secundario (hielera)
tiene que haber suficientes refrigerantes para mantener una temperatura de 4 a 8 °C. Los recipientes
secundarios deberán llevar las etiquetas de riesgo biológico y señal de orientación del recipiente, a su vez el
recipiente secundario deberá ir contenido en un paquete externo de envío (caja de cartón o hielera) que proteja
el contenido de elementos externos del ambiente y debe estar etiquetado con los datos del remitente,
destinatario y señal de orientación. La documentación que se integre al triple embalaje deberá colocarse en la
parte interior del paquete.
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ESTÁNDAR DE CALIDAD Criterios de aceptación
El paciente debe cumplir con la definición de caso, con el tipo de muestra de
acuerdo al diagnóstico (suero o sangre), que sea la cantidad suficiente (mínimo 500
µL de suero o 5 mL de sangre) y se haya mantenido a una temperatura de
conservación de 4-8 °C, el embalaje debe ser adecuado durante el transporte y la
muestra debe estar debidamente rotulada y sellada.
La segunda muestra debe tomarse después de 15 días y antes de tres meses
respecto a la fecha de toma de la primera muestra, en caso de tomarse.
Se debe hacer llegar el Formato Único de Envío de Muestras del InDRE
especificando fecha de inicio de síntomas y fecha de toma de muestra, además de
toda la demás información general y de sintomatología, indicar si es primera o
segunda muestra y si el paciente ha recibido tratamiento (incluir nombre del
medicamento, dosis y fechas de inicio y término).
Si se cuenta con la historia clínica, es recomendable su envío porque esta
información es de utilidad.
Criterios de rechazo
Las muestras se rechazan cuando:
Este en envase roto
Sean un volumen menor a 3 mL en caso de sangre
Sean un volumen menor a 500 µL en caso de sueros
Este contaminada
Este contenida en envase de vidrio
Este derramada
Este hemolizada
Este lipémica
No sean conservadas en cadena fría.
En caso de ser segunda muestra no haya sido tomada después de 15 días
respecto a la primera.
No coincidan los datos con los de su correspondiente documentación.
No cumplan con la definición de caso.
Sean diferentes de suero o sangre.
No tengan anotada la fecha de inicio de síntomas.
No tengan etiqueta o rótulo de identificación.
No tengan anotada la fecha de toma de muestra.
No traiga el Formato Único de Envío de Muestras del InDRE o historia
clínica.
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Estándar de servicio
El estándar de servicio es de 7 días para muestras de diagnóstico y 15 para muestras
de control de calidad y 20 para referencia.
CAPTURA DE DATOS Y RESULTADOS
La captura de los resultados se realiza en el programa INFO-LAB Ver 3.0 dentro de
la base de datos “LESP”.
1. Se selecciona la opción “Laboratorio” y después “Ver muestras recibidas”.
2. Se abrirá la ventana Recepción de muestras, donde se debe elegir en
Laboratorio la opción “LEP” (Leptospirosis), en Año el año en curso, en
Tipo de búsqueda la opción “Número” y finalmente seleccionar “Aceptar”.
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3. Enseguida se desplegaran todas las muestras que se han recibido en el año
seleccionado para el diagnóstico de Leptospirosis. Las que se encuentran en
Status “Asignado” corresponden a las que no se les ha registrado un
resultado. Deberá colocar el cursor sobre alguna de ellas y oprimir la tecla
“Enter”, se abrirá entonces una ventana con toda la información
correspondiente a dicha muestra, la cual debe ser correcta, de lo contrario se
debe corregir mediante una solicitud al área de recepción de muestras.
4. Cuando se ha comprobado que los datos de las muestras son correctos se
cierran esas ventanas oprimiendo la tecla “Escape” hasta regresar a la
ventana inicial (así se cierran todas las ventanas siempre que se desee) y ahí
se selecciona la opción Laboratorio y después “Proceso”.
5. Se abrirá la ventana Selector y deberá seleccionar en Laboratorio la opción
“LEP”, en Año el año en curso, en Status la opción “Recepción” y finalmente
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“Aceptar”, se desplegará la información de todas las muestras que han sido
capturadas para el Diagnóstico de Leptospirosis y que están pendientes de
resultado, se coloca el cursor en alguna o varias de ellas y luego se oprime la
tecla “Enter”, estás muestras pasarán así a otra ventana, la de
“Actualización”, donde se pueden capturar los resultados correspondientes.
6. Se cierra la ventana Selector y se abre nuevamente otra original, y deben
seleccionar en Laboratorio la opción “LEP”, en Año el año en curso, y en
Status seleccionará la opción “Actualización” y finalmente “Aceptar”.
7. Se coloca el cursor sobre la muestra que se vaya a capturar y se oprime la
tecla “Enter”, aparecerá la ventana Proceso por lotes como la que se
muestra a continuación (si el resultado es el mismo para varias muestras
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consecutivas se puede capturar por bloque, de lo contrario por única
muestra y eso se elige en la opción” Desde y “Hasta”) y se oprime la opción
“Aceptar”.
8. Para el caso de muestras de diagnóstico se abrirá la ventana Resultado de
muestras donde se debe elegir en Diagnóstico inicial la opción “LP,
Leptospirosis”, en Origen de la muestra la opción “H” (humana). En la parte
de “Resultado” se selecciona la técnica de análisis realizada, en este caso
“Microaglutinación”, luego se elige el resultado correspondiente (“Positivo”,
“Negativo” o “Indeterminado”), en caso de resultados positivos se llena la
casilla de “Serovar” y “Valor” (título del serovar). En “Observaciones” se
selecciona la casilla que corresponda al resultado emitido.
Finalmente en la ventana “Diagnóstico de lab” se vuelve a capturar solo el resultado
final (positivo, negativo o indeterminado), se oprime la tecla “Enter” y aparecerá
una ventana con la pregunta “Desea salvar los cambios realizados”, en caso de ser
correctos se selecciona la opción “Si”, de lo contrario la opción “No” y se vuelve a
capturar.
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9. Para las muestras de control de calidad se deben seguir los pasos del 1-7
posteriormente se abrirá la ventana Resultados de Control de Calidad
de Referencia donde se debe elegir en Diagnóstico inicial la opción de
Leptospirosis, en Origen de la muestra se coloca la letra H (humana),
enseguida la pantalla se divide en dos, en la sección izquierda “Resultados
del Estado” se captura el resultado emitido por el LESP que envió la
muestra, y en la sección derecha “Resultado del InDRE” se captura el
resultado emitido por el InDRE, en ambos campos se debe capturar el
“Resultado” (Positivo cuando se encuentre la presencia de algún serovar y de
lo contrario negativo, no aplica el resultado Indeterminado en Control de
Calidad) y cuando aplique, el “Serovar” y el “Valor” (título) obtenido para el
mismo.
Finalmente en la ventana “Diagnóstico de lab” se vuelve a capturar solo el resultado
final (positivo o negativo) y se oprime la tecla “Enter”, aparecerá una ventana con
la pregunta “Desea salvar los cambios realizados”, en caso de ser correctos se
selecciona la opción “Si”, de lo contrario la opción “No” y se vuelve a capturar.
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10. Una vez que se ha capturado de manera correcta toda la información se
procede a realizar la impresión de los resultados, en la ventana principal se
elige la opción de Laboratorio y posteriormente la de “Impresiones”, se
abrirá la ventana Impresión de muestras en donde deberá elegir en la
barra de herramientas en Laboratorio la opción “LEP”, en la opción del Año,
el año que corresponda y finalmente en Status el status que corresponda a la
muestra que se desea imprimir (usualmente se elige la opción de “No
impreso”), después se desplegará una nueva pantalla con las muestras
disponibles para impresión, se debe colocar el cursor en alguna de ellas y
posteriormente oprimir la tecla “Enter”, se abrirá la ventana Procesos por
lotes donde se deben introducir los números de las muestras que se desean
imprimir y finalmente se elige la opción de “Aceptar” después los resultados
se firman y se envían.
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11. El envío de resultados cuando se trata de muestras enviadas por los LESP se
realiza por correo electrónico diariamente a las 13:00 horas, posteriormente
se envían por mensajería, el día puede variar, sin embargo el envío a cada
LESP se realiza por lo menos una vez a la semana. Los resultados de
muestras que llegan de manera particular se pueden enviar por fax o correo
electrónico, también si dejan los datos correspondientes o por mensajería si
se deja alguna guía pagada, de lo contrario se deben recoger directamente en
el InDRE.
PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO (PEED)
Los laboratorios de ensayo y los organismos de acreditación deben contar con
programas de evaluación que permitan evidenciar la confiabilidad de la emisión de
resultados. Un servicio adecuado y la satisfacción del usuario debe ser la meta
claramente identificada por los hospitales y laboratorios de salud. Las redes de
laboratorios ocupan un espacio de primera línea como apoyo a los programas
vinculados con la salud pública, por lo tanto es fundamental contar con servicio y
prestaciones de calidad que mejoren la eficacia de la respuesta.
La participación de cada uno de los laboratorios en el Programa de Evaluación
Externa del Desempeño de diagnóstico de Leptospirosis (PEED) por aglutinación
microscópica (MAT) manifiesta el interés por mejorar dicho diagnóstico mediante
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la unificación de criterios de interpretación para participar eficientemente en la
detección, control y prevención de la Leptospirosis.
Los laboratorios que participan en el presente programa son Aguascalientes, Baja
California Sur, Chiapas, Chihuahua, Guerrero, Hidalgo, Michoacán, Morelos,
Oaxaca, Puebla, Quinta Roo, San Luis Potosí, Sonora, Tabasco, Tamaulipas,
Veracruz y Yucatán.
El alcance del presente programa de desempeño es:
Determinar el desempeño de los laboratorios en el diagnóstico de
Leptospirosis mediante aglutinación microscópica (MAT).
Determinar necesidades de capacitación y/o áreas de oportunidad.
La presente evaluación externa del desempeño (PEED) se realiza a través del envío
de 5 sueros que conforman un panel (4 sueros positivos y uno negativo) y que
tienen un comportamiento conocido por el laboratorio evaluador, son
seleccionados y previamente probados mediante la metodología de MAT. Las
muestras positivas presentan títulos diversos a una o más serovariedades de
Leptospiras.
El volumen de suero enviado para cada muestra es de 250 µL, los sueros se
etiquetan con una clave, se empacan con gel refrigerante en Triple Embalaje y se
distribuyen a los 17 laboratorios que integran la red que realiza el diagnóstico de
Leptospirosis, también se hace un resguardo de los mismos por el laboratorio
evaluador.
Una vez que cada laboratorio recibe los sueros debe informar de manera inmediata
las condiciones en que estos llegaron, utilizando el formato que el InDRE les
proporciona.
Los resultados obtenidos en el análisis de las muestras deben ser enviadas en el
intervalo de tiempo estipulado por el laboratorio evaluador (InDRE).
Los sueros deben tener anexado de forma impresa el oficio de envío del panel y por
vía electrónica (al correo del director estatal y del personal de laboratorio
responsable de analizar el panel) se debe enviar el formato de recepción de paneles
y el de informe de resultados junto con un cuestionario de evaluación de
conocimientos, mismo que se incluye en la calificación final del PEED.
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Evaluación del panel
Los paneles son procesados de manera rutinaria en los laboratorios estatales y los
resultados deben ser enviados vía correo electrónico al InDRE en el formato
proporcionado, anexando clave confidencial y nombre de identificación del
laboratorio, a la jefatura del laboratorio de Leptospirosis y del departamento de
Bacteriología; y vía impresa a través de un oficio.
Ponderación:
En este panel se evalúan 4 aspectos:
1. Oportunidad en la emisión de resultados, dándose un máximo de 13 días
hábiles para su recepción en el InDRE.
2. Conocimiento teórico de MAT y de emisión de resultados, lo cual se evalúa
a través de un cuestionario.
3. Identificación de serovariedades en la muestra.
4. Concordancia de títulos de anticuerpos en la muestra.
La evaluación se lleva a cabo de manera independiente para cada aspecto
expresando la ponderación alcanzada en porcentaje de la siguiente manera:
1) La emisión oportuna de resultados representa 10% de la calificación total,
considerando emisión oportuna a la recepción de resultados dentro de los
primeros 13 días hábiles.
2) El cuestionario de evaluación de conocimientos tiene un valor total del 20%.
3) Identificación de las serovariedades en la muestra (comparación entre las
esperadas y las detectadas por el laboratorio participante), el cual representa
el 40% de la calificación total.
4) Concordancia en títulos, se considera como concordante todo valor obtenido
dentro de un intervalo de ± 2 títulos respecto al asignado por el InDRE, este
punto tiene un valor de 30%.
La calificación final de cada participante se obtiene de la suma de los cuatro
aspectos evaluados y se considera como mínimo aceptable 80%, en caso de ser
menor el personal del laboratorio está obligado a cursar una capacitación en
servicio en el InDRE.
Se envían dos informes a cada LESP que participó en la evaluación, uno general en
donde se indica el desempeño de todos los integrantes de la red en el último PEED
enviado y la comparación de dicho desempeño a lo largo de las evaluaciones
pasadas, cada LESP es identificado con una clave confidencial, así también se envía
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el informe individual del LESP correspondiente, el cual contiene su evaluación
obtenida y los resultados encontrados por el InDRE.
Criterios para la liberación del diagnóstico
Para que un LESP se integre a la red de diagnóstico de Leptospirosis y sea liberado
dicho diagnóstico debe contar con la infraestructura, equipos, reactivos e insumos
necesarios, además el personal que es designado para realizar dicho diagnóstico
deberá haber asistido a una capacitación en servicio en el InDRE.
Una vez cumplidos los puntos anteriores el laboratorio puede comenzar a realizar
el diagnóstico y se evaluará su desempeño al igual que para el resto de los
laboratorios mediante el control de calidad y paneles de evaluación externa.
Estas evaluaciones se analizarán periódicamente, en caso de obtener resultados
deficientes el personal del LESP deberá asistir de nuevo a una capacitación en
servicio, cuando las evaluaciones sean buenas se disminuirá el porcentaje de
muestras que deben enviar para control de calidad y a aquellos LESP con
evaluaciones sobresalientes se les liberará el diagnóstico, lo que implica que ya no
deberán enviar muestras para control de calidad, en este caso se les indicará de
manera oficial el porcentaje de muestras que deberán hacer llegar al InDRE, con
justificación de referencia, esto con el objetivo de vigilar la prevalencia de los
serovares con los que no cuente cada LESP.
Banco de material biológico
Se mantiene un banco de muestras positivas y de negativas, las muestras negativas
solo se conservan tres meses (cada mes se desechan las que hayan sido
almacenadas más de tres meses) debido a que las muestras son numerosas, y no se
cuenta con espacio suficiente para su almacenamiento, por otra parte la cantidad
de muestras positivas en este diagnóstico es menor, por lo tanto todas son
conservadas y se almacenan por tres años.
Aquellas muestras pareadas que hayan sido positivas con un título 1:80 en la
segunda muestra, se desechan pues el título es demasiado bajo y considerando el
tiempo de congelación se incrementa la posibilidad de que el título disminuya aún
más durante la descongelación para analizarlo y ya no será posible identificarlo).
El objetivo de mantener un banco de sueros es el tener un resguardo de controles
secundarios positivos y negativos que pueden ser utilizados para el diagnóstico o
evaluación, validación y verificación de pruebas diagnósticas.
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CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
Cuadro 2. Cronograma de actividades para el diagnóstico de
Leptospirosis
ACTIVIDAD ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DIC
Envío del PEED
(1) a los LESP de
la Red de
Leptospirosis
xx
Recepción de
resultados del
PEED (1) en el
InDRE
xx
Taller de
Leptospirosis xx
Envío de
resultados del
PEED (1) a la
RNLSP
xx
Envío del PEED
(2) a los LESP de
la Red de
Leptospirosis
xx
Recepción de
resultados del
PEED (2) en el
InDRE
xx
Envío de
resultados del
PEED (2) a la
RNLSP
xx
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BIBLIOGRAFÍA
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ANEXOS
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ANEXO I
TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS
REGISTRO DE LA MUESTRA
Se le da número de muestra y se anotan datos del paciente en bitácora.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Hacer una dilución 1:40 suero: PBS (a 3.9 mL de PBS, agregar 0.1 mL del
suero), en un tubo de ensaye limpio, previamente rotulado con el número de
registro de la muestra a analizar y la fecha de realización.
Agitar y calentar la dilución en baño María por 30 minutos a 56 °C.
Las diluciones de las muestras se conservan en refrigeración durante 5 días
después de los cuales se desechan; en el caso de no haber terminado el proceso se
vuelve a realizar la dilución.
PREPARACIÓN DE LAS SEROVARIEDADES DE LEPTOSPIRA
Los cultivos de las serovariedades de Leptospira que son utilizadas como antígeno
en la prueba de MAT deben estar vivos, libres de contaminación, con un
crecimiento mayor al 50% (al observar al microscopio de campo oscuro con el
objetivo de 40X, esto se hace colocando una gota del cultivo sobre un portaobjetos)
y con un desarrollo no mayor a 10 días.
Para su utilización en la MAT se hace una dilución de las 19 serovariedades (con
PBS) hasta ajustarlas de 100-150 bacterias por campo, se procura apegarse al valor
inferior, se agitan vigorosamente entre cada adición de PBS para homogenizar y
deshacer auto-aglutinaciones. El volumen de dilución que se prepara es de acuerdo
al número de reacciones que se van a realizar al día correspondiente, tomando en
cuenta que a cada reacción de micro-aglutinación se le adicionan 50 µL de dicha
dilución.
Antes de comenzar la dilución se sugiere observar el cultivo puro de Leptospiras
para verificar el crecimiento y con base a eso se pueda estimar aproximadamente el
volumen de PBS a adicionar, esto es muy útil sobretodo el primer día que se va a
trabajar con un cultivo, los subsecuentes días se sugiere hacer una regla de tres
relacionando los volúmenes de cultivo del serovar y PBS usados el día previo y el
volumen total de dilución que se requiere el día siguiente.
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Se hace una dilución 1:40 suero: PBS (a 3.9 mL de PBS, agregar 0.1 mL del suero),
en un tubo de ensaye limpio previamente rotulado con el número de registro de la
muestra a analizar y la fecha de realización.
Se agita y calienta la dilución en baño maría por 30 minutos a 56 °C.
Las diluciones de las muestras se conservan en refrigeración durante 5 días
después de los cuales se desechan; en el caso de no haber terminado el proceso se
vuelve a realizar la dilución.
PRUEBA TAMIZ
Procedimiento
Rotular con número consecutivo las placas que se utilizan un mismo día,
esto de acuerdo al número de muestras por analizar.
Anotar en bitácora las muestras que se incluyen en la prueba de tamiz y el
orden en el que se colocan en las placas.
Adicionar a las placas de poliestireno de 96 pozos lo siguiente:
Primera fila (A): 50 µL de solución PBS en cada pozo.
Segunda fila (B): 50 µL del suero testigo negativo en cada pozo.
Tercera fila (C): 50 µL del suero testigo positivo el cada pozo respectivo a
su serovar (placa 1 serovariedades 1 a 12, placa 2 serovariedades 13 a 19).
El resto de las filas (D-H): 50 µL de la muestra de suero a analizar (una alícuota
para cada uno de los 19 serovares a probar, por lo que se ocupan la placa 1 y 2).
Adicionar, finalmente, en cada pozo 50 µL de la serovariedad
correspondiente. Los serovares se colocan a lo largo de las columnas, la
columna 1 siempre será la que contendrá al serovar 1 y así
consecutivamente.
Si se analizan más muestras en un mismo día ya no es necesario incluir otra placa
con controles, simplemente se adicionan en las placas consecutivas las muestras y
el serovar.
Agitar los serovares diluidos antes de colocarlo en los pozos.
Usar una punta limpia para cada muestra y para cada serovariedad.
Descartar las puntas ya utilizadas en un contenedor con solución
desinfectante.
Apilar las placas, cubrirlas de la luz e incubar a 30 °C durante 90 min.
Una vez pasado el tiempo, se realizan las lecturas de micro-aglutinación, si la
cantidad de aglutinaciones es mayor o igual 2+ en algún serovar, entonces esa
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muestra se debe titular (únicamente se titula con el o los serovares que presentó la
aglutinación), de lo contrario el resultado de tamiz será negativo.
Titulación
Procedimiento
Rotular las placas con número consecutivo del día, el número de placas
depende del número de muestras que se sometan a la prueba de MAT.
Si se realiza prueba tamiz ese mismo día, no es necesario que se incluyan más
testigos, de no ser así, entonces deberán incluirse los testigos negativo, blanco y
positivo y se deberá llenar también dicho formato.
Las muestras a analizar y sus respectivas diluciones se registran, solo se realiza
titulación a aquellas muestras que en el tamiz presentaron aglutinaciones iguales o
mayores a 2 +, dichas muestras de manera inicial se llevan a 4 diluciones (1:80,
1:160, 1:320, 1:640) y se colocan en pozos consecutivos de la placa de manera
vertical.
Colocar 100 µL de la muestra a analizar en el primer pozo, y así
consecutivamente el resto de las muestras en sentido horizontal.
Adicionar 50 µL de PBS en los siguientes tres pozos en sentido vertical de
donde se colocó la muestra, posteriormente se toman 50 µL de la muestra
colocada en el primer pozo y se vacían en el siguiente pozo que contiene
PBS, se agita aproximadamente 10 veces con una micropipeta, después se
toman 50 µL y se repite la operación en el siguiente pozo y de nuevo en el
último pozo con PBS, de ahí, después de agitar se toman 50 µL y se
desechan, en total por cada muestra se ocupan 4 pozos, el primero solo con
la muestra y los otros tres con muestra y PBS (que corresponden a las
diluciones).
Cada pozo queda con un volumen total de 50 µL, posteriormente a cada dilución se
le adiciona 50 µL del serovar al que haya sido positivo en el tamiz.
Usar una punta limpia para cada dilución y para cada serovariedad.
Apilar las placas, se cubren de la luz y se incuban a 30 °C durante 90min.
Una vez transcurrido el tiempo, se realizan las lecturas de micro-aglutinación, el
título de corte será la última dilución donde la cantidad de aglutinaciones sea igual
a 2+, si en la mayor dilución (1:640) se obtiene una lectura de 2+ aglutinaciones,
entonces se deben realizar diluciones mayores, pues no hay manera de asegurar
que a diluciones mayores ya no haya aglutinación, por lo tanto en estos casos se
procede a realizar una segunda serie de diluciones (1:1280, 1:2560, 1:5120,
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1:10240), el proceso es exactamente igual al anteriormente descrito, si en la última
dilución (1:10240) se obtiene una lectura de 2+ aglutinaciones, entonces se deben
realizar diluciones mayores, pues de igual manera no se puede asegurar que a
diluciones mayores ya no haya aglutinación, en este caso se procede a realizar una
tercera serie de diluciones (1:20480, 1:40960, 1:81920, 1:163840, 1:327680,
1:655360, 1:1310720 y 1:2621440).
Lectura de la reacción de micro-aglutinación
Agitar la reacción de cada pozo con una micropipeta.
Tomar una gota, y colocar en un portaobjetos.
Observar con el objetivo 10X, y realizar este procedimiento para cada pozo.
Registrar la lectura. Para agilizar la lectura se pueden colocar varias
reacciones a la vez en el mismo portaobjetos, esto de acuerdo a la habilidad
del analista.
La lectura de cada pozo se realiza con base en los siguientes criterios:
Lectura Criterio
++++ (4+) 75% a 100% de células aglutinadas o 25% a 0% de células libres.
+++ (3+) 50% a 75% de células aglutinadas o 50% a 25% de células libres.
++ (2+) 25% a 50% de células aglutinadas o 75% a 50% de células libres.
+ (1+) 1% a 25% de células aglutinadas o 99% a 75% de células libres.
_ Negativo, sin aglutinación o 100% de células libres
La interpretación de las lecturas es la siguiente:
Criterio Resultado
Menos de 2+ Negativo
Mayor o igual a 2+ Positivo (y se toma esa dilución como título de corte)
La interpretación del resultado obtenido de la prueba confirmatoria, para cada
serovariedad es:
Criterio Resultado
Menos de 2+ Negativo
El título corresponde a la última dilución del suero en que se observa
una lectura igual a 2+ registrados en el formato.
Positivo
(título)
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Las lecturas son registradas y posteriormente se emite el resultado.
Es requerimiento indispensable trabajar en las mismas condiciones una segunda
muestra, con un intervalo mayor o igual a 15 días y menor de 90 días después de la
toma de la primera muestra.
En la primera muestra no se informan títulos ni serovar cuando los títulos
encontrados son menores a 1:1280.
En la segunda muestra se puede informar título de 1:320 como valor mínimo y no
existe un valor máximo fijo, éste será el título de corte, depende de los anticuerpos
presentes en la muestra.
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Anexo II
CARACTERÍSTICAS EQUIPOS COMERCIALES
Microscopio binocular, con condensador de campo oscuro, objetivos 10X y 40X,
Anexo III
PREPARACIÓN DE REACTIVOS
Preparación de medio líquido EMJH
MATERIAL
vaso de precipitados de 1000 mL
probeta de 1000 mL
charola para pesar
espátula
agitador magnético
matraz de 2000 mL
gasa
algodón
papel Kraft
cinta testigo
EQUIPOS
1. balanza analítica o semianalítica
2. potenciómetro
3. parrilla de agitación
REACTIVOS
Medio basal EMJH para Leptospiras
Marca: Difco
Referencia: 279410
Presentación: Frasco de 500 g
pH: 7.5 ± 0.2
Medio de Enriquecimiento EMJH para Leptospira
Marca: Becton Dickinson.
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Referencia: 279510
Presentación: Caja con 6 frascos con 100 mL de EMJH enriquecimiento
Procedimiento de preparación
1.- Pesar 2.3 g del medio basal EMJH y disolver en 500 mL de agua destilada,
colocar en una parrilla con agitación constante hasta su completa disolución.
2.-Ajustar pH a 7.5 ± 0.2 con hidróxido de sodio al 20% y/o ácido clorhídrico al
20%.
3.-Aforar a 900 mL con agua destilada, tapar y rotular con nombre del medio,
fecha de preparación, laboratorio y responsable. Colocar cinta testigo.
4.-Esterilizar en autoclave a 121 °C, durante 15 minutos.
5.-Agregar asépticamente en el gabinete de bioseguridad 100 mL de
enriquecimiento EMJH para Leptospiras al medio ya estéril, a temperatura
ambiente.
6.-Mezclar bien y dosificar 5 mL en tubos estériles de 13 x 100 mm de tapón de
rosca.
Evaluación: control de calidad del medio EMJH líquido
1.- Incubar a 37 ± 2.0 °C durante 120 horas o 5 días.
2.- Primeramente observar la presencia o ausencia de turbiedad en todos los
tubos de la gradilla.
2.- Realizar un muestreo aleatorio de 3 a 5 tubos por gradilla de 72 tubos.
3.- En condiciones asépticas tomar una alícuota de cada tubo y colocarla entre
porta y cubre.
4.-Observar al microscopio con el objetivo de 40X.
5.-Un resultado satisfactorio para la prueba de esterilidad es ausencia de
turbiedad, el medio debe presentar una coloración amarillo paja y cristalina,
además en la prueba de gota observada al microscopio este deberá
observarse limpio y libre de cualquier contaminación bacteriana.
Promoción de crecimiento
1.-El medio de cultivo una vez preparado, deberá incluir controles de
crecimiento.
2.-Una vez preparado el medio EMJH en condiciones asépticas se deberá
inocular 0.5 mL de cada uno de los cultivos puros de leptospiras que se
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trabajan, e incubar a 30 °C durante 3 a 4 días y revisar al microscopio con el
objetivo de 40X, para ser una prueba satisfactoria se deberá observar una
concentración considerablemente abundante de bacterias por campo.
3.-Adicionalmente se deberá incluir un control de medio sin inocular.
Almacenamiento
El medio de cultivo una vez aprobado se deberá almacenar en refrigeración a 4 ± 2
°C e identificar con nombre del medio, fecha de preparación, lote, fecha de
caducidad, número de gradilla y nombre del analista que preparó.
SOLUCIÓN DE SORENSEN
Materiales
matraz Erlenmeyer de1000 mL
probeta de 1000 mL
espátula
charola de pesaje
agitador magnético
barra magnética
Equipos
potenciómetro
balanza analítica
Reactivos
Fosfato de sodio dibásico anhidro en cristales
Fosfato de potasio monobásico anhidro cristales
Procedimiento de preparación
1.-Pesar de Na2HPO4 8.33 g + 1.09 g de KH2PO4 y disolver en 1000 mL de agua
destilada en un agitador magnético.
2.-Ajustar el pH a 7.5 ± 0.2
3.-Esterilizar a 121 °C por 20min/15 lb.
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4.-Si es necesario filtre la solución a través de 0.22 µ de esta manera la solución
se mantiene estable, generalmente esto es necesario después de transcurrida
una semana de la fecha de preparación ya que suele presentar partículas.
SOLUCIÓN DE CLORURO DE SODIO O SOLUCIÓN SALINA AL 0.85%
Material
matraz Erlenmeyer de1000 mL
espátula
charola de pesaje
probeta de 1000 mL
agitador magnético
barra magnética
filtros de 0.22 µ
Equipos
Balanza semianalítica o analítica
Reactivos
Cloruro de sodio anhidro NaCl
Procedimiento de preparación
1.-Pesar 8.5 g de NaCl y se disuelven en 1000 mL de agua destilada usando un
agitador magnético.
2.-Esterilizar a 121 °C por 20 min a 15 Libras de presión.
3.-Filtrar mediante membrana de 0.22 µ
SOLUCIÓN DE PBS
Materiales
probeta de 100 mL estéril
guantes
Equipos
gabinete de bioseguridad
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Reactivos
Solución de Sorensen
Solución salina al 0.85%
Procedimiento de preparación
Mezclar 460 mL de solución salina al 0.85% + 40 mL de solución de
Sorensen y homogeneizar. Realizar la mezcla en el interior del gabinete de
bioseguridad, para conservar la esterilidad de la solución.
Conservar a temperatura ambiente.