American Journal of Plant Sciences, 2012, 3, 461-472 doi:10.4236/ajps.2012.34055 Published

Online April 2012 (http://www.SciRP.org/journal/ajps) 461

*Corresponding author.

A Comparative Testing of Cucumber mosaic virus (CMV)-Based Constructs to Generate

Virus Resistant Plants

Xinqiu Tan1, Deyong Zhang1, Charlotte Wintgens2, Peter Willingmann2, Günter Adam2,

Cornelia Heinze2

1Hunan Plant Protection Institute, Changsha, China; 2Biocentre Klein-Flottbek and Botanical

Garden, University of Hamburg, Ham-burg, Germany.

Email: cornelia.heinze@uni-hamburg.de

Received October 28th, 2011; revised November 29th, 2011; accepted February 20th, 2012

ABSTRACT

Among the viruses Cucumber mosaic virus (CMV) has been rated worldwide as one of the five

most important viruses infecting vegetable species. CMV is a tripartite virus with high sequence

variability, classified into three subgroups with 80% to 97% identical nucleotides in their coat

protein. Due to the absence of natural resistance CMV is the plant virus with longest history in

genetic engineering using pathogen induced approaches. However, the transformation and re-

generation for some very important crops like chili is difficult. Therefore it will be an advantage

to screen in model plants for gene constructs which might be independent of the target of final

transformation and other parameters having an influence on the efficiency of a biotechnological

approach. In our study we compared the resistance for all combina- tions of five different

antiviral constructs, two different transformation vectors and two model host plants. From these

approaches we identified the most effective construct which might also be applicable to

transform eventually chili plants.

Keywords: Cucumber mosaic virus; Transgenic Plant; Resistance; Comparison

1. Introduction

The chili production has an economical impact in local as well as export markets in Asia and

other parts of the world. More than one billion people consume chili in one or another form on a

daily basis. The major diseases con- tributing to low yield and a reduced quality of fruits in-

clude bacterial wilt (Ralstonia solanacearum), phy- tophthora blight (Phytophthora capsici

Leon.) powdery mildew (Leceillula rurica) and anthracnose (Colleto- trichum sp.) [1]. In

addition, several viruses are an im- portant threat to chili production [2,3]. Due to its world- wide

distribution and polyphagous vectors Cucumber mosaic virus (CMV) is one of the five most

important viruses infecting vegetable species worldwide [4-6].

CMV is the type species of the genus Cucumovirus, family Bromoviridae. It has a tripartite

ssRNA genome coding for one structural and four functional proteins. The RNA dependent

RNA-polymerase (RdRP) is en-coded on RNA 1 (ORF 1a) and RNA 2 (ORF 2a). The gene

silencing suppressor (ORF 2b) overlaps with ORF 2a. RNA 3 encodes the cell to cell movement

protein (ORF 3a) and the CP, which forms together with the RNA icosahedral particles. CMV is

classified into sub-groups Ia, Ib and II with 97 and 80% identical amino acids (aa) in the coat

protein (CP), respectively [5,7,8].

Almost all known resistance genes found in several natural sources of Capsicum sp. are partial

or polygenic [9-11] only few of them confer sustainable resistance [12,13]. Kang et al. [14]

described a single dominant gene controlling CMV resistance in peppers which was effective

against two virus isolates, however, a third one caused infection due to the extreme high

variability of CMV. Lee et al. [15] identified the CMV strain CMVP1 that infected commercially

available CMVP0 resistant pepper plants in the mid 1990th. Another promising re- sistant chili

variety, breeding line VC246 from the World Vegetable Research and Development Center

(WVRDC, Taiwan), revealed upon screening with several isolates from different serogroups five

out of 28 isolates that overcame this resistance [16].

Several transgenic CMV resistant or tolerant plants were reported using the coat protein and the

RNA repli- case gene [17] and references therein [18]. In addition, extensive studies to induce

resistance against CMV with

Copyright © 2012 SciRes. AJPS A Comparative Testing of Cucumber mosaic v irus (CMV)-

Based Constructs to Generate Virus Resistant Plants 462

truncated CP or 2a protein expressed in transgenic plants have been reported [19].

For chili, reports of tolerant plants using the coat pro- tein gene are available [20-23].

However, the biotechno- logical production of CMV resistant chili plants is diffi- cult, because

the efficient transformation on chili pepper is inhibited since the shot regeneration rate is

genotype specific [24] and the gene transfer via Agrobacterium infection into cotyledon and

hypocotyls tissue is partly blocked for unknown reasons [25]. Therefore testing the efficiency of

constructs directly in the chili lines is use- less since the transformation efficiency is very low

and/or not reproducible [26-28].

To circumvent the problem of the low transformation and regeneration efficiency we used as

model plants N. benthamiana and N. tabacum cv. Samsun for transforma-tion with five

constructs each in two different vectors and screened all combinations with up to five CMV

isolates from all subgroups Ia, Ib and II to identify constructs that conferred the immunity type of

resistance independent of model plant, virus isolate and transformation vector.

2. Materials and Methods

2.1. CMV Isolates, Maintenance and Purification

In this study five CMV isolates representing all sub- groups were included. CMVAN (subgroup

Ib) was used for generating the constructs for plant transformation. Lines were challenged with

the homologous isolate CMVAN as well as with the heterologous isolates CMVP3613 and

CMVKS44 (subgroup Ib), CMVRT52 (subgroup Ia) and the subgroup II isolate CMVPV0420.

Virus isolates were propagated on N. glutinosa. For inoculum preparation virus particles were

purified as described [29]. Particles were checked for specific infec-tivity on the local lesion

hosts Vigna unguiculata and Chenopodium quinoa by mechanical inoculation [16]. All plants

were incubated in the greenhouse at 25 +/– 1°C with a photoperiod of 16 hours light and 8 hours

dark.

2.2. Plant Inoculation and Resistance Screening

Two leaves of plants at the 4 to 6 leaf stage were rubbed with virus particles diluted in 20 mM

phosphate buffer (pH 7) and 5% (w/v) carborundum (600 mesh). The in- fectivity of the diluted

particles was adjusted to induce 30 to 60 local lesions when using a total volume of 10 μl on

Vigna unguiculata. This dose of inoculum infected 100% of the N. benthamiana and N. tabacum

plants. For each plant-vector-insert combination 8 selection marker resistant plants of four to six

independent lines were tested in the F1 generation with one repetition. Symptom expression was

checked visually 20 and 35 days post infection (dpi) and virus presence/absence was verified by

tissue print immunoblot of transverse sections of non- inoculated leaves using coat protein-

specific polyclonal antiserum AS-0475 (Deutsche Sammlung von Mikroor- ganismen und

Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Ger- many) as described [30].

The visual screening of symptoms identified four phenotype classes: immune (no symptoms,

negative tis- sue print), tolerant (no, mild or delayed mild symptoms, positive tissue print),

recovery (early symptoms but in late infection no symptoms, positive/negative tissue print) and

susceptible (symptoms, positive tissue print). Resis- tance was defined as the sum of immune,

tolerant and recovered plants. Absence of virus was confirmed by RT- PCR as described in [8]

using primers CMV-CPfor (5’-atg gac aaa tct gra tcw mcc-3’) and CMVrev (5’-ctg gat gga caa

ccc gtt c-3’). As an internal control using primers Nadsense (5’-gatgcttcttggggcttcttgtt-3’) and

Nadantisense (5’- ctccagtcaccaacattggcataa-3’) a plant specific fragment was amplified from

total RNA simultaneously to the vi- rus specific fragment as described in [31].

2.3. Gene Constructs in pLH6000 and pBIN19 Binary Vectors and Plant Transformation

The constructs are based on the coat protein gene (CP) or the 2b gene silencing suppressor gene

including the overlapping region with the 2a of the isolate CMVAN. Genes were used either in a

translatable and/or a non- translatable form as well as in an inverted repeat form. In addition a

chimeric construct containing a translatable GFP upstream of the inverted 2b repeat was

prepared. The constructs are listed in Table 1 and the details of their generation are given in the

supporting information. The constructs were transformed using Agrobacterium tumefaciens

LBA4404 (pBIN19) or GV3101 (pLH6000) by electroporation.

Leaf discs of Nicotiana benthamiana and Nicotiana tabacum cv. Samsun nn were transformed

with Agro- bacterium tumefaciens LBA4404 according to [32] using for pLH6000 constructs

hygromycin (20 mg/l) and for pBIN19 constructs kanamycin (50 mg/l) as a selection marker,

respectively. Integration of the transgene and absence of Agrobacterium was verified by PCR.

Trans- gene F1 were identified by germinating seeds on kana- mycin (150 mg/l) and hygromycin

(100 mg/l) containing MS-agar [33] before transferring seedlings to soil.

3. Results

3.1. Description of the Constructs

Virus specific inserts were derived from subgroup Ib isolate CMVAN. The inserts of the single

gene constructs ΔCP, Δ2a2b and Δ2aΔ2b ha a length of 773 bp (ΔCP),

d

Copyright © 2012 SciRes. AJPS A Comparative Testing of Cucumber mosaic virus (CMV)-

Based Constructs to Generate Virus Resistant Plants Copyright © 2012 SciRes. AJPS 463

Table 1. Names, origin and length of viral sequences used in pLH6000 and pBIN19 binary

vectors.

construct name Origin/length (in bp) of

CMV derived sequence

Specification

ΔCP CP/773 not translatable

Δ2a2b 2a/2b/735 (641 2a/336

2b)1

2a not translatable, 2b

translatable

Δ2aΔ2b 2a/2b/735 (641 2a/336

2b)1

2a not translatable, 2b

not translatable

2bIR 2a/2b/549 (399 2a/336

2b)1

(Δ2aΔ2b) as inverted

repeat, separated by an

intron sequence

GFP_2bIR 2a/2b/549 (399 2a/336

2b)1

(2bIR) is fused at the 3

´ end of a translatable

GFP gene

BAHASA INDONESIANYA

Abstraksi

Di antara virus Cucumber mosaic virus ( CMV ) telah dinilai di seluruh dunia sebagai salah satu dari lima

virus yang paling penting menginfeksi spesies sayuran. CMV adalah virus tripartit dengan variabilitas

urutan tinggi , diklasifikasikan ke dalam tiga sub kelompok dengan 80% sampai 97 % nukleotida identik

dalam protein mantel mereka . Karena adanya resistensi CMV alami adalah virus tanaman dengan

sejarah terpanjang dalam rekayasa genetik menggunakan pendekatan diinduksi patogen . Namun,

transformasi dan re - generasi untuk beberapa tanaman yang sangat penting seperti cabai sulit . Oleh

karena itu akan menjadi keuntungan untuk layar pada tanaman model untuk konstruksi gen yang

mungkin independen dari target akhir transformasi dan parameter lain memiliki pengaruh pada efisiensi

pendekatan bioteknologi . Dalam penelitian kami dibandingkan perlawanan untuk semua kombinasi -

tions dari lima konstruksi antivirus yang berbeda , dua vektor transformasi yang berbeda dan dua

tanaman inang Model . Dari pendekatan ini kami mengidentifikasi konstruk yang paling efektif yang

mungkin juga dapat diterapkan untuk mengubah tanaman akhirnya cabai .

Kata kunci : Cucumber mosaic virus , Tanaman transgenik , Resistance ; Perbandingan

1 . pengantar

Cabai produksi memiliki dampak ekonomis dalam lokal maupun pasar ekspor di Asia dan bagian

dunia lainnya . Lebih dari satu miliar orang mengkonsumsi cabai dalam satu atau bentuk lain

setiap hari . Penyakit utama con - tributing hasil yang rendah dan berkurangnya kualitas buah-

buahan di - clude layu bakteri ( Ralstonia solanacearum ) , phy - tophthora hawar ( Phytophthora

capsici Leon . ) Embun tepung ( Leceillula rurica ) dan antraknosa ( Colleto - trichum sp . ) [ 1 ] .

Selain itu, beberapa virus merupakan ancaman yang amat penting bagi cabai produksi [ 2,3 ] .

Karena distribusi di seluruh dunia dan polifagus vektor virus mosaik Ketimun ( CMV )

merupakan salah satu dari lima virus yang paling penting menginfeksi spesies sayuran di seluruh

dunia [ 4-6 ] .

CMV adalah spesies jenis Cucumovirus genus , keluarga Bromoviridae . Memiliki ssRNA

genom tripartit coding untuk satu protein struktural fungsional dan empat . RNA dependent RNA

polimerase - ( RdRP ) adalah en- kode pada RNA 1 ( ORF 1a ) dan RNA 2 ( ORF 2a ) . Gen

supresor membungkam ( ORF 2b ) tumpang tindih dengan ORF 2a . RNA 3 mengkodekan

protein sel untuk gerakan sel ( ORF 3a ) dan CP , yang membentuk bersama-sama dengan

partikel ikosahedral RNA . CMV diklasifikasikan menjadi sub-kelompok Ia, Ib dan II dengan 97

dan 80 % identik asam amino ( aa ) dalam protein mantel ( CP ) , masing-masing [ 5,7,8 ] .

Hampir semua gen resistensi dikenal ditemukan di beberapa sumber alami Capsicum sp . parsial

atau poligenik [ 9-11 ] hanya sedikit dari mereka memberi perlawanan berkelanjutan [ 12,13 ] .

Kang et al . [ 14 ] menggambarkan sebuah gen tunggal yang dominan mengendalikan resistensi

CMV pada paprika yang efektif terhadap dua isolat virus , bagaimanapun, sepertiga disebabkan

infeksi karena variabilitas tinggi ekstrim CMV . Lee et al . [ 15 ] mengidentifikasi CMV

ketegangan CMVP1 yang terinfeksi tersedia secara komersial CMVP0 tanaman cabai tahan pada

pertengahan 1990 . Lain yang menjanjikan berbagai cabai ulang sistant , peternakan garis VC246

dari World Sayuran Pusat Penelitian dan Pengembangan ( WVRDC , Taiwan ) , mengungkapkan

pada skrining dengan beberapa isolat dari serogrup berbeda lima dari 28 isolat yang mengatasi

perlawanan ini [ 16 ] .

Beberapa tanaman transgenik tahan CMV atau toleran dilaporkan menggunakan protein mantel

dan gen ditiru - kasus RNA [ 17 ] dan referensi di dalamnya [ 18 ] . Selain itu, studi yang luas

untuk mendorong perlawanan terhadap CMV dengan

Hak Cipta © 2012 SciRes . AJPS Sebuah Pengujian Perbandingan Cucumber mosaik v irus

( CMV ) Berbasis Konstruk Menghasilkan Virus Tahan Tanaman 462

CP terpotong atau protein 2a dinyatakan dalam tanaman transgenik telah dilaporkan [ 19 ] .

Untuk cabai, laporan tanaman yang toleran menggunakan mantel gen pro -proteinnya tersedia

[ 20-23 ] . Namun, produksi biotechno - logis CMV tahan tanaman cabai diffi - kultus , karena

transformasi yang efisien pada cabai terhambat karena tingkat regenerasi shot genotipe tertentu

[ 24 ] dan transfer gen melalui infeksi Agrobacterium ke kotiledon dan jaringan hipokotil adalah

sebagian diblokir untuk alasan yang tidak diketahui [ 25 ] . Oleh karena itu pengujian efisiensi

konstruksi langsung di garis cabai adalah penggunaan kurang sejak efisiensi transformasi sangat

rendah dan / atau tidak direproduksi [ 26-28 ] .

Untuk menghindari masalah transformasi rendah dan efisiensi regenerasi kami digunakan

sebagai tanaman model yang N. benthamiana dan N. tabacum cv . Samsun untuk transformasi

tion dengan lima konstruksi masing-masing dalam dua vektor yang berbeda dan disaring semua

kombinasi dengan sampai lima CMV isolat dari semua subkelompok Ia, Ib dan II untuk

mengidentifikasi konstruksi yang diberikan jenis kekebalan ketahanan independen tanaman

model , virus mengisolasi dan transformasi vector.

Bahan dan Metode

2.1 . CMV Isolat , Pemeliharaan dan Pemurnian

Dalam penelitian ini lima CMV isolat yang mewakili semua sub - kelompok yang disertakan .

CMVAN ( subkelompok Ib ) digunakan untuk menghasilkan konstruksi untuk transformasi

tanaman . Garis ditantang dengan homolog mengisolasi CMVAN serta dengan isolat heterolog

CMVP3613 dan CMVKS44 ( Ib subkelompok ) , CMVRT52 ( subkelompok Ia) dan II

subkelompok mengisolasi CMVPV0420 .

Virus isolat yang disebarkan pada N. glutinosa . Untuk persiapan inokulum partikel virus

dimurnikan seperti yang dijelaskan [ 29 ] . Partikel diperiksa untuk infeksi tertentu tivity pada

lesi host lokal Vigna unguiculata dan Chenopodium quinoa dengan inokulasi mekanis [ 16 ] .

Semua tanaman diinkubasi di rumah kaca pada 25 + / - 1 ° C dengan penyinaran 16 jam terang

dan 8 jam gelap.

2.2 . Inokulasi tanaman Pemutaran dan Perlawanan

Dua daun tanaman pada tahap daun 4 sampai 6 yang digosok dengan partikel virus diencerkan

dalam 20 mM buffer fosfat ( pH 7 ) dan 5 % ( b / v ) carborundum ( 600 mesh) . Di- Infektifitas

partikel dilusian telah disesuaikan untuk mendorong 30 sampai 60 lesi lokal ketika menggunakan

total volume 10 ml pada Vigna unguiculata . Ini dosis inokulum menginfeksi 100 % dari N.

benthamiana dan tanaman N. tabacum . Untuk setiap tanaman - vektor - insert kombinasi 8

seleksi tanaman tahan penanda 4-6 garis independen yang diuji dalam generasi F1 dengan satu

pengulangan. Ekspresi gejala diperiksa secara visual 20 dan 35 hari pasca infeksi ( dpi ) dan

virus ada / tidaknya telah diverifikasi oleh jaringan cetak Immunoblot bagian melintang daun

non - diinokulasi menggunakan mantel protein spesifik antiserum poliklonal AS- 0475

( Deutsche Sammlung von Mikroor - ganismen und Zellkulturen GmbH , Braunschweig , Ger -

banyak ) seperti yang dijelaskan [ 30 ] .

Visual skrining gejala mengidentifikasi empat kelas fenotipe : kekebalan (tidak ada gejala ,

negatif tis - sue cetak) , toleran ( tidak, gejala ringan ringan atau tertunda , cetak jaringan

positif) , pemulihan ( gejala awal, tapi di akhir infeksi tanpa gejala , positif / cetak negatif

jaringan ) dan rentan ( gejala , cetak jaringan positif) . Perlawanan didefinisikan sebagai jumlah

dari kekebalan tubuh , toleran dan pulih tanaman . Tidak adanya virus dikonfirmasi oleh RT -

PCR seperti yang dijelaskan dalam [ 8 ] menggunakan primer CMV - CPfor ( 5' - atg GAC aaa

TCT gra TCW pks - 3 ' ) dan CMVrev ( 5' - ctg gat gga caa ccc tetes c - 3 ' ) . Sebagai

pengendalian internal menggunakan primer Nadsense ( 5' - gatgcttcttggggcttcttgtt - 3 ' ) dan

Nadantisense ( 5' - ctccagtcaccaacattggcataa - 3 ' ) sebuah fragmen spesifik tanaman

diamplifikasi dari RNA total bersamaan pada fragmen spesifik vi - rus seperti yang dijelaskan

dalam [ 31 ] .

2.3 . Gene Membangun di pLH6000 dan pBIN19 Vektor Biner dan Transformasi Tanaman

Konstruksi didasarkan pada protein gen coat ( CP ) atau gen 2b membungkam gen supresor

termasuk wilayah tumpang tindih dengan 2a dari isolat CMVAN . Gen yang digunakan baik

dalam diterjemahkan dan / atau bentuk non -diterjemahkan serta dalam bentuk ulangi terbalik .

Selain membangun sebuah chimeric mengandung GFP diterjemahkan hulu ulangi 2b terbalik

disiapkan . Konstruksi yang tercantum dalam Tabel 1 dan rincian generasi mereka diberikan

dalam informasi pendukung . Konstruksi yang ditransformasi menggunakan Agrobacterium

tumefaciens LBA4404 ( pBIN19 ) atau GV3101 ( pLH6000 ) oleh elektroporasi .

Cakram Daun Nicotiana tabacum Nicotiana benthamiana dan cv . Samsun nn diubah dengan

Agro - bakteri tumefaciens LBA4404 menurut [ 32 ] gunakan untuk pLH6000 konstruksi

higromisin ( 20 mg / l ) dan untuk pBIN19 konstruksi kanamisin ( 50 mg / l ) sebagai penanda

seleksi, masing-masing. Integrasi transgen dan tidak adanya Agrobacterium telah diverifikasi

oleh PCR . Trans- gen F1 diidentifikasi dengan kecambah pada kana - Mycin ( 150 mg / l ) dan

higromisin ( 100 mg / l ) yang mengandung MS -agar [ 33 ] sebelum mentransfer bibit ke dalam

tanah .

3 . hasil

3.1 . Deskripsi Konstruk

Virus sisipan khusus yang berasal dari Ib subkelompok mengisolasi CMVAN . Menyisipkan dari

gen tunggal membangun ΔCP , Δ2a2b dan Δ2aΔ2b ha panjang 773 bp ( ΔCP ) ,

Sebuah Pengujian Perbandingan virus mosaik Ketimun ( CMV ) Berbasis Konstruk untuk

Menghasilkan Tanaman Tahan Virus

739 bp ( Δ2a2b ) dan 738 bp ( Δ2aΔ2b ) . Dalam membangun ΔCP kodon start ATG diubah

menjadi GGT dan Δ2aΔ2b membangun adenin dari kodon start dari membungkam penekan 2b

telah dihapus sehingga non - diterjemahkan CP - dan Δ2aΔ2b - gen masing-masing . Terbalik

ulangi membangun 2bIR dan GFP_2bIR didasarkan pada Δ2aΔ2b membangun tidak

mengandung diterjemahkan ORF . Satu-satunya gen diterjemahkan dari semua konstruksi adalah

membungkam penekan 2b dalam Δ2a2b membangun . ΔCP ini didasarkan pada RNA 3

sementara semua 2b dan Δ2b mengandung con - struct didasarkan pada urutan RNA 2 . Sebuah

deskripsi yang lebih de - ekor dari prosedur kloning diberikan dalam informasi pendukung .

Karena resistensi antibiotik konflik-konflik konstruksi berdasarkan pLH6000 diubah dengan

Agrobacterium galur GV3101 , sedangkan pBIN19 konstruksi diperkenalkan ke tanaman dengan

Agrobacte - rium regangan LBA4404 .

3.2. Urutan Perbandingan Virus Sisipan khusus dengan Daerah Masing-masing dari Isolat

Heterologous Digunakan untuk Skrining Perlawanan

Semua Ib isolat subkelompok (KS44, P3613) digunakan untuk skrining ketahanan heterolo-gous

menunjukkan identitas asam nukleat dari 90% - 93% untuk wilayah Δ2a2b bila dibandingkan

dengan wilayah masing-masing CMVAN, sedangkan untuk subkelompok Ia mengisolasi

CMVRT52 identitas adalah 86 % dan subkelompok II mengisolasi CMVPV0420 69% bila

dibandingkan dengan CMVAN. Untuk wilayah 2b identitas Ib isolat berkisar antara 88% dan

92%, subkelompok Ia mengisolasi CMVRT52 menunjukkan 84% dan subkelompok II

mengisolasi identitas CMVPV0420 65%. Kira-kira gradasi yang sama dalam identitas hadir pada

gen CP, 93% - 96% untuk isolat Ib, 91% untuk IA dan 76% nukleotida identik untuk sub-

kelompok II mengisolasi masing-masing. Identitas yang summa-disahkan pada Tabel 2.

3.3. Analisis Garis Transgenik

Secara total, 249 baris dipilih dari kalus independen berubah dengan lima konstruksi menyimpan

urutan virus atau chi-meric baik dalam vektor pLH6000 atau pBIN19. Sebagai kontrol tanaman

disajikan berubah dengan baik vektor kosong atau vektor dengan GFP sebagai insert. Semua

garis kontrol menunjukkan tanda-tanda infeksi dan menjadi in-fected sebanding dengan tanaman

non-berubah.

Integrasi stabil telah diverifikasi oleh PCR dan dengan pola Segre-gation setelah polinasi diri

dari orangtua gen-timbangkan dan selanjutnya perkecambahan biji pada medium selektif. Bibit

dari garis mengikuti pola segregasi 3:1 (nilai kepercayaan X2 P0.05 ≤ 3,84) dipindahkan ke

dalam tanah di rumah kaca untuk ketahanan pengujian. Setiap baris diuji dengan 4 tanaman

individu dan pengujian diulang.

3.4 . Pengaruh Spesies Tanaman dan Vector pada Perlawanan Ketika Inokulasi dengan homolog

Isolat CMVAN

Keseluruhan perlawanan dari N. benthamiana ( 31 % tanaman imun , Tabel 3 ( a) jalur 11 ) dan

N. tabacum cv . Samsun ( 20 % tanaman kekebalan tubuh, Tabel 3 ( b ) , line 11 ) dif - fered . Di

N. benthamiana semua gen tunggal membangun ΔCP , Δ2a2b dan Δ2aΔ2b berubah dengan

pLH6000 vec - tor menghasilkan 34 % sampai 50 % tanaman kekebalan berasal dari 14 baris

( Tabel 3 ( a) , baris 1-3 ) sedangkan tidak ada tanaman kekebalan yang diperoleh dari 14 baris

menyembunyikan sisipan yang sama tetapi berubah dengan pBIN19 vektor . Juga ada tanaman

kekebalan diperoleh ketika diubah dengan pLH6000 dan pBIN19 di N. tabacum ( Tabel 3 ( b ) ,

garis 1-3 dan 6 - 8 ) .

The 2bIR membangun kloning pLH6000 menghasilkan 42,5 % kekebalan benthamiana tanaman

N. ( Tabel 3 ( a) , baris 4 ) , sementara semua tujuh jalur N. tabacum rentan terhadap infeksi

CMV saat berubah dengan pLH6000 vektor ( Tabel 3 ( b ) , baris 4 ) . Efek hanya mengamati

adalah pemulihan tujuh pabrik . Hasil yang sama diperoleh dengan menggunakan pBIN19 vektor

( Tabel 3 ( a) , jalur 9 dan Tabel 3 ( b ) , line 9 ) . Dari N. benthamiana tanaman berubah dengan

pBIN19 28 % tanaman kekebalan diperoleh . Dari garis-garis ini satu baris adalah 100 % kebal

terhadap infeksi.

Singkatnya , N. benthamiana garis menunjukkan lebih banyak tanaman imun ketika

ditransformasi dengan gen tunggal - atau 2bIR - konstruksi dari sebanding garis N. tabacum .

Transformasi N. benthamiana tanaman dengan gen tunggal konstruksi menyebabkan resistensi

ketika menggunakan pLH6000 vektor tetapi tidak dengan pBIN19 vektor . Ketika

membandingkan tanaman berubah dengan mengulang membangun terbalik ( 2bIR ) kedua

spesies tanaman , N. benthamiana dan N. ta - bacum , menunjukkan tanaman kekebalan tubuh,

namun dalam kombinasi benthamiana tanaman N. dan pLH6000 vektor weobtained dengan 42,5

% nilai tertinggi dari tanaman kekebalan tubuh .

Berbeda dengan tingginya angka kekebalan N. bentha - miana tanaman , bila ditransformasi

dengan gen tunggal atau konstruksi berulang dalam - verted ( 2bIR ) menggunakan pLH6000 vec

- tor , hanya satu dari 24 tanaman dari tiga baris tidak terinfeksi menyembunyikan 2bIR

membangun diapit hulu oleh GFP gen ( GFP_2bIR , Tabel 3 ( a) , baris 5 ) . Semua jenis /

kombinasi vektor host lain menghasilkan sejumlah besar tanaman yang tahan berkisar antara 34

% dan 87 % ( Tabel 3 ( a) , baris 10 dan Tabel 3 ( b ) , jalur 5 dan 10 ) . Dengan pengecualian

dari N. benthamiana/pLH6000 kombinasi dengan semua kombinasi host / vektor lainnya

menjadi-tween satu dan empat baris menghasilkan 100 % tanaman kekebalan tubuh .

3.5 . Pengujian Garis kekebalan dengan Isolat heterolog dari Subkelompok Ib , Ia dan II

Hanya tanaman garis yang diamati 100 % kebal terhadap CMVAN ditantang dengan isolat

heterolog dari subkelompok 1b ( CMVP3613 dan CMVKS44 ) , 1a ( CMVRT52 ) dan II

( CMVPV0420 ) .

Dengan pengecualian dari satu tanaman yang menjadi di - fected ( Tabel 4B , baris 3 ) tiga

lainnya N. bentha - miana dan garis tanaman N. tabacum berubah dengan GFP_2bIR di pBIN19

dan pLH6000 , masing-masing, yang kebal terhadap infeksi ketika ditantang dengan 1b iso -

lambatnya CMVP3613 dan CMVKS44 ( Tabel 4A - D , baris 2 dan 3 ) . Sebuah persentase yang

lebih rendah dari kekebalan tanaman N. tabacum , antara 12,5 % sampai 100 % , diperoleh dari

garis berubah dengan pBIN19 vektor (Tabel 4E , F , jalur 2 dan 3 ) .

Ketika tanaman baris diubah dengan GFP_2bIR di pBIN19 ditantang dengan 1A subkelompok

( CMVRT52 ) dan subkelompok II ( CMVPV0420 ) isolat benthamiana tanaman N.

menunjukkan 87,5 % sampai 100 % tanaman kekebalan ( Tabel 4A dan B , jalur 4 dan 5 )

sedangkan N tanaman tabacum . menunjukkan tidak lebih dari 37,5 % tanaman kekebalan

( Tabel 4C - F , jalur 4 dan 5 ) . Tanaman N. tabacum berubah dengan GFP_ 2bIR di pBIN19

menjadi benar-benar terinfeksi dengan sero - kelompok II mengisolasi PV0420 (Tabel 4E dan F ,

baris 5 ) .

Singkatnya , N. benthamiana tanaman berubah dengan GFP_2bIR di pBIN19 menunjukkan

jumlah tertinggi tanaman kekebalan tubuh ketika ditantang dengan isolat dari semua

subkelompok .

4 . diskusi

Pertahanan terhadap infeksi virus berdasarkan membungkam gen mungkin merupakan hasil dari

strategi yang berbeda . Seperti terakhir [ 34 ] jalur cytoplasmatic penting dalam infeksi virus .

Endogen messenger RNA jalur negatif mengatur ekspresi gen virus dan penindasan transkripsi

virus mungkin akibat dari siRNA dipandu metilasi DNA , yang dapat diaktifkan melalui

memperkenalkan - tion transgen . Karena jenis tanaman yang berbeda dan bahkan kultivar yang

berbeda memiliki latar belakang genetik yang berbeda , mereka mungkin menanggapi virus yang

sama dengan cara yang berbeda meskipun sedang berubah dengan antivirus yang sama con -

struct .

Host ini ketergantungan menjadi jelas dalam penelitian kami saat menggunakan gen tunggal

membangun ΔCP , Δ2a2b dan Δ2aΔ2b dan terbalik ulangi membangun ( 2bIR ) . Tanaman imun

hanya didapat ketika benthamiana tanaman N. diubah , terlepas dari translatability dari transgen

dan asal segmen genom . Benthamiana tanaman N. mengekspresikan fungsional asam salisilat

non ( SA ) diinduksi RdRP . Yang et al . [ 35 ] dibahas bahwa karena RdRP hilang SDE 1 -

seperti RdRP pro - duces meningkatnya jumlah Sirnas dari kolam RNA menyimpang di N.

benthamiana . Hal ini mungkin menyebabkan pembungkaman gen hiperaktif dan mungkin

menjelaskan superi - Sebagian Besar N. benthamiana garis transgenik dibandingkan dengan yang

N. tabacum .

Karena konflik resistensi antibiotik con - struct berdasarkan pLH6000 diubah dengan Agro -

bakteri regangan GV3101 , sedangkan pBIN19 konstruksi diubah dengan ketegangan LBA4404 .

Ini berarti bahwa pengaruh pada ketahanan vektor dan strain Agro - bakteri harus dibahas

bersama-sama .

Waterhouse dkk . [ 36 ] diringkas bahwa hanya pada tanaman dengan beberapa , salinan alkohol

transgen co - penindasan dan resistensi virus dapat diamati . Dari data tidak dipublikasikan [ 37 ]

yang menyatakan bahwa jumlah salinan dalam lokus tunggal berkorelasi dengan strain

Agrobacterium , yang memiliki efisiensi yang berbeda untuk membuat sisipan T - DNA tunggal

atau multicopy . Hal ini didukung oleh pengamatan kami bahwa hanya untuk pLH6000

konstruksi pola segrega - tion 15:01 diamati , menunjukkan menyisipkan multi- copy pada dua

lokus yang berbeda ( data tidak ditampilkan ) .

Menurut [ 37 ] ada kemungkinan , bahwa strain GV3101 tidak menghasilkan sel-sel tumbuhan

dengan lebih dari satu salinan dalam lokus tunggal diatur dalam array tandem . Sebagai

membungkam gen konsekuensi-quence dan ketahanan ditingkatkan ketika membandingkan gen

tunggal membangun ΔCP , Δ2a2b dan Δ2aΔ2b . Pengiriman T - DNA juga mungkin menjadi

konsekuensi dari stabilitas dan efisiensi replikasi di Agrobacte - rium karena asal replikasi vektor

, yang pVS1 dari Pseudomonas untuk pLH6000 [ 38 ] dan RK2 untuk pBIN 19 [ 39 ] . The pVS1

asal replikasi menjamin persistensi plasmid baik dalam Agrobacterium sp . [ 38 ] . Namun,

karena kita tidak memeriksa multicopy penyisipan , penjelasan ini untuk ketahanan signifikan

lebih tinggi re - induk sangat spekulatif .

Hal ini , bagaimanapun , meyakinkan bahwa baik translatability maupun asal segmen genom

( ΔCP dari RNA 3 dan semua yang mengandung konstruksi 2b dari RNA 2 ) dari trans - formed

konstruksi tampaknya mempengaruhi infeksi virus .

Di sisi lain pengaruh strain Agrobacterium dan / atau vektor tidak jelas ketika membandingkan

tanaman berubah dengan mengulang terbalik 2bIR con - struct . Jelas, dampak dari sisipan

multicopy mungkin berkurang , karena membangun sendiri menyediakan dsRNA . Hal ini sesuai

baik dengan temuan dari [ 40 ] yang membuktikan keunggulan dsRNA membangun untuk

mendapatkan perlawanan terhadap CMV . Membangun mereka , berdasarkan urutan CP dan

berubah menjadi N. tabacum , menghasilkan 25 sampai 35 % tanaman tahan , tergantung pada

promotor untuk ekspresi transgen . Chen et al . [ 41 ] diperpanjang studi mereka ke beberapa

konstruksi berdasarkan CP serta urutan 2a2b dalam varian panjang atau pendek dan

membandingkan resistensi dicapai dalam tanaman transgenik mereka trans - dibentuk dengan

daerah masing-masing virus sebagai konstruksi gen tunggal . Perbedaan antara mereka dan

tanaman trans - genic kita ditransformasi dengan gen tunggal 2a2b con - struct dalam kombinasi

dengan pBIN19 sebagai vektor dan N. benthamiana adalah panjang bagian virus konstruksi

mereka dan CMV isolat digunakan untuk transformasi dan menantang . Perbedaan panjang

urutan virus mungkin menjelaskan bahwa kita tidak mendapatkan tanaman yang tahan sementara

[ 41 ] diperoleh antara 11 dan tanaman tahan 21 % dalam percobaan mereka . Menggunakan

urutan CP untuk transformasi , baik [ 41 ] atau kami punya tahan N. benthamiana tanaman bila

menggunakan pBIN19 vektor sys - tem .

Chen et al . [ 41 ] menggunakan CMV berbasis RNA2 terbalik ulangi membangun berisi 3

'bagian dari gen 2a dan 2b gen . Variasi ketahanan transgenik N. benthamiana tanaman mereka

terhadap CMV mengungkapkan bahwa perbedaan-perbedaan mungkin karena panjang dari dua

sekuens yang mereka gunakan . Ulangi terbalik panjang mereka ( LIR ) meliputi 1.534 bp dan

resistensi diinduksi pada 75% dari tanaman, sedangkan ulangi terbalik kecil mereka ( SIR )

tertutup 490 bp dan -diproduksi hanya tanaman yang tahan 30 % . Hambatan dari SIR adalah

sesuai baik dengan data 2bIR con - struct kami dengan panjang urutan virus 549 bp . Dalam

penelitian kami , frekuensi perlawanan berkisar antara 30 % sampai 40 % di N. benthamiana

tanaman berasal dari pLH6000 - 2bIR dan pBIN19 - 2bIR .

Ketika membandingkan resistensi yang disebabkan oleh 2bIR dengan yang GFP_2bIR ,

perangkat tambahan untuk yang kedua jelas diamati pada kedua spesies tembakau. The

meningkatkan -pemerintah konsisten dengan hasil yang diperoleh oleh orang lain , yang menyatu

GFP dengan fragmen tunggal atau peptida dari gen N dari TSWV dan melaporkan peningkatan

ketahanan pada tanaman tembakau [ 42,43 ] . Sementara semua konstruksi lain trans - dibentuk

dengan pLH6000 vektor di N. benthamiana kembali berkonsultasi dalam jumlah tertinggi

tanaman kekebalan , pertunjukan-per tanaman ini / kombinasi vektor menggunakan 2bIR GFP_

sebagai insert antivirus mengakibatkan rendahnya jumlah tanaman kekebalan . Pengamatan ini

tidak dapat dijelaskan oleh kami .

Menurut model ambang gen membungkam [ 44 ] tampak mungkin, bahwa gen GFP

menstabilkan mRNA 2bIR dan mencegah degradasi cepat , atau di lipatan pengangkutan mRNA

dari nukleus ke sitoplasma untuk memicu respon pertahanan dsRNA - resistensi dimediasi lebih

efisien . Mungkin efeknya tidak karena urutan GFP sendiri , karena [ 45 ] menunjukkan efek

yang sama disebabkan oleh perpaduan dari gen pena dari Po - tato virus Y ( PVY ) dengan

fluoresensi gen protein biru dan [ 30 ] sekering omong kosong urutan ke protein gen N Tomat

Spotted Wilt Virus ( TSWV ) . Namun, urutan omong kosong yang digunakan oleh [ 30 ] adalah

diterjemahkan dan tidak dapat dikesampingkan bahwa efek itu protein daripada RNAi

dimediasi . Inokulum dosis ketergantungan untuk melanggar perlawanan didukung oleh

pengamatan kita terhadap infeksi 100 % saat inokulasi garis GFP_2bIR 1 dan 6 dengan dua

metode yang berbeda . Kekebalan dari 100 % menantang tanaman diperoleh dengan inokulasi

mekanis , sedangkan inokulasi dengan mencangkok pecah perlawanan ( data tidak

ditampilkan ) . Efek yang sama telah ditunjukkan oleh [ 46 ] di Solanum lycopersicum L.

Sehubungan dengan pernyataan [ 47 ] bahwa untuk RNA resistensi medi -diciptakan minimal 90

% nukleotida identik diperlukan , hasil kami tidak biasa . Tak satu pun dari isolat het - erologous

dari subkelompok Ia dan II melakukan terpenuhi kondisi ini . Namun , hamparan umum 23

nukleotida dilestarikan ( data tidak ditampilkan ) mungkin telah menyebabkan variabel derajat

imunitas RNAi . Tak satu pun dari baris dengan 100 % kekebalan terhadap tantangan dengan

virus homolog mengisolasi CMVAN digunakan untuk transformasi , mengungkapkan tingkat

yang sama resistensi ketika ditantang dengan non - homolog isolat . Hanya N. benthamiana

tanaman trans - dibentuk dengan pBIN19 - GFP_2bIR membangun menunjukkan 87,5 % sampai

100 % tanaman kekebalan tubuh ketika ditantang dengan isolat dari subkelompok Ib , Ia dan II .

Semua jalur lain yang kebal terhadap homolog mengisolasi menunjukkan tingkat yang lebih

rendah dari resistensi ketika ditantang dengan isolat non - homo- logous . Mungkin , tingkat

identitas urutan memiliki efek yang sama sebagai dosis inokulum untuk efek perlawanan .

Sebuah penjelasan yang mungkin mungkin efisiensi berbeda - ent dari membungkam gen akibat

rendahnya identitas se-quence antara transgen dan virus tantangan- lenging , semua digunakan

sebagai inokulum dengan infektivitas tertentu sebanding.

Dari perbandingan kita dapat menyimpulkan bahwa jenis insert berpengaruh tertinggi untuk

generasi tanaman imun . Namun , juga sistem vektor / Agrobacterium tampaknya sangat penting

- setidaknya ketika virus menantang bukan homolog satu.

5. Ucapan Terima Kasih

Bantuan teknis terampil Mrs Mehrmann untuk laboratorium dan Mrs George untuk pekerjaan

rumah kaca diakui. Kami berterima kasih kepada Koleksi Jerman Mi-croorganisms dan Budaya

Cell (DSMZ) untuk menyediakan poliklonal dan monoklonal CMV antiserum. Pekerjaan itu

bagian dari proyek 2001.7860.8-001.00/contract No 81.051.899 didanai oleh Deutsche

Gesellschaft für Technische Zusammenarbeit GmbH (GTZ, Jerman). PW mengakui dukungan

keuangan dari Ham-burger Senat für Arbeit und Soziales.