HÜCRE ÖLÜM MEKANİZMALARI

Apopitoz, Otofaji, Nekroz, vd...

Dr. Nuran Türkçapar Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi İç Hastalıkları - Romatoloji Bilim Dalı Mayıs-2012

Hücre Ömrü • Vücudumuzdaki Hücre Tipleri -Yaklaşık 210 tip • Ömür -Doğum -Farklılaşma -Fonksiyon -Ölüm; İnsanlarda günde ~5x1011 hücre

programlanmış hücre ölümü =apoptoz ile yok edilir

Hücre Ömrü • Nötrofil

-6-7 saat (dolaşımda) -4 gün (dokuda) •RBC

-120 gün •Beyin nöron -50-100 yıl

İçerik •Hücre ölümünün terminoloji / sınıflaması •Apopitoz •Otofaji •Nekroz •Hücre ölüm mekanizmaları arasında geçiş •Apoptotik/Nekrotik hücrenin temizlenmesi •Hücre ölümünün immün sisteme etkileri •Hücre ölümünün önlenmesi •Diğer hücre ölüm mekanizmaları

Three Pathways of Cell Death

Hotchkiss R et al. N Engl J Med 2009;361:1570-1583

Nomenclature Committee on Cell Death (NCCD)

• NCCD-1973…………Heterofaji, otofaji, apoptoz • NCCD-2005 • NCCD-2009 • NCCD-2012 Apoptoz, otofaji, nekroz, nekroptoz, mitotik katastrofi,

pyroptosis, paraptosis, entosis ve anoikis gibi

Cell Death and Differentiation (2011), 1–14 www.nature.com/cdd

•Apoptoz ilk kez 1972 yılında Kerr, Wyllie ve Currie tarafından tanımlanmış • -Hücrelerin küçük veziküllere ayrılarak ölümleri yaprak dökümüne benzetilmiş

•Nekroz? •Apoptoz?

Yaralanmayla Ölüm X İntiharla Ölüm Nekroz X Apoptoz

ÖZELLİK NEKROZ APOPTOZ

Yol açan nedenler İskemi Hipertermi Hipoksi Litik viral enfeksiyon Toksik maddelerin yüksek konsantrasyonları Şiddetli oksidatif stres

Kemoterapi?

Büyüme faktörü eksikliği Hücre yaşlanması HIV Kanser ilaçları Radyasyon Yüksek doz glukokortikoid Fas veya TNFR–1 reseptörlerinin aktivasyonu Sitotoksik T lenfositler Çok şiddetli olmayan oksidatif stres

ÖZELLİK NEKROZ APOPTOZ

Morfolojik özellikler

Hücre membran bütünlüğünün kaybı Hücre şişmesi Organellerin parçalanması Endoplazmik retikulumun dilatasyonu Büyük vakuollerin oluşumu Hücre lizisi

İntakt hücre membranı Hücre küçülmesi Organellerde parçalanma yok Hücrenin intakt mitokondri, ribozom, nükleus parçaları ve diğer organeleri içeren membranla kaplı apoptotik cisimciklere parçalanması

ÖZELLİK NEKROZ APOPİTOZ

Biyokimyasal özellikler

Bozulmuş iyon hemostazı ATP gerekmez (pasif süreç) +4 C°’de gerçekleşebilir DNA rastgele parçalanır (agaroz jel elektroforezisinde ‘smear’ görüntüsü) Postlitik DNA fragmentasyonu

(ölümün geç safhasında)

İyi kontrollü, bazı aktivasyonların ve enzimatik basamakların olması ATP gereklidir (aktif süreç) +4 C°’de gerçekleşmez DNA internuklezomal alanlarda 180 kb çiftinin katları olacak şekilde kırılır agaroz jel elektroforezisinde merdiven görüntüsü Prelitik DNA fragmentasyonu ( erken evrede gerçekleşir)

ÖZELLİK NEKROZ APOPİTOZ Gösterme

metodu M65 ELISA assay (nekroz+apoptoz) LDH tayini Cyt C salınımı

M30 ELISA assay Caspaz-3 aktivasyon Flow sitometride Sub G1 piki

Pathways of Cellular Apoptosis

Hotchkiss R et al. N Engl J Med 2009;361:1570-1583

Mitokondriyal yaralanma veya hasarda salınan proteazlar (sistein-aspartik asit proteazlar)

Kaspazlar

-Normalde inaktive prokaspaz formunda

I. Enflamatuar Kaspazlar: 1(IL-1β), 4, 5, 11, 12,13 ve 14 II. Apoptozla ilgili kaspazlar -Başlatıcı Kaspazlar: 2, 8, 9, ve 10 (multimerik, apoptozom ve DISC) -Yürütücü Kaspazlar 3,6 ve 7 (Dimerik, başlatıcı kaspazlar ve Granzim B)

Scandinavian Journal of Immunology, 2011;73:401-7.

Apoptozun ekstrensek yolu DR: TNF-R1, CD95/Fas Ligandlar: TRAIL-R1/DR4, TRAIL-R2/DR5, FasL

DISC

MOMP

Apoptozom

Apoptozun intrensek yolu

Scandinavian Journal of Immunology, 2011;73:401-7.

•Antiapoptotik Bcl–2 üyeleri, aminoasit sıraları en az üç dört bölgede Bcl-2’ye benzerlik gösterir. •Proapoptotik Bcl-2’lerin hepsinde sadece BH3 bölgesi vardır. (BH3-only)

Apoptozu baskılayan genler

Apoptozu indükleyen genler (Proapoptotik)

A1 Bcl-2 Bcl-xL Bcl-W Mcl-1 Nr-13 Ced-9

BAX BAK BOK Bcl-xs BAD BIK BID BIM NOXA BMF PUMA

Bcl-2 Ailesi: MOMP’un düzenlenmesi

Proapoptotik ve Antiapoptotik Proteinler Arasındaki Özgün Bağlanma

• BIM, BID ve PUMA: Tüm anti-apoptotik proteinlere bağlanır • BAD: BcL2, BcL-W ve BcL-XL’ bağlanır • NOXA: MCL-1’ e spesifik

• BAX ve BAK -mitokondriyal membranda por oluşumu -cyt-c salınımı -apoptozom oluşumu

Kaspaz 9 Kaspaz 3,6,7

Apoptozun Evreleri Sağlıklı hücre

ÖLÜM SİNYALİ (ekstrensek veya intrensek)

Ölüme gidiş (reversibl)

YÜRÜTÜCÜ (irreversibl)

Ölü hücre

YUTULMA (makrofajlar, komşu hücreler)

PARÇALANMA

Hücreler yaşam ve ölüm arasında dengelenir

HASAR Fizyolojik ölüm sinyaller

ÖLÜM SİNYALİ

PROAPOPTOTİK PROTEİNLER

ANİIAPOPTOTİK PROTEİNLER

ÖLÜM

APOPTOZ: embriyogenezdeki önemi

Morfogenez (aşırı hücrelerin yok edilmesi):

Seleksiyon (fonksiyonu olmayan hücrelerin yok edilmesi):

APOPTOZ: embriyogenezdeki önemi

İmmünite (self reaktif hücrelerin yok edilmesi):

Self antijeni tanıyan hücrelerl

Organ büyüklüğü (fazla hücrelerin yok edilmesi):

APOPTOZ: yetişkindeki önemi Doku remodeling (artık gerekli olmayan hücrelerin yok edilmesi):

meme glandı gebelik, laktasyon küçülme (gebelik ve laktasyon yoksa)

Apoptoz

Apoptoz - Testosterone

Prostat gland

APOPTOZ: yetişkindeki önemi Doku remodeling (artık gerekli olmayan hücrelerin eliminasyonu):

İstirahatteki lenfositler + antijen (enfeksiyon gibi) - Antijen (yenilenme, vs)

Apoptoz

APOPTOZ: yetişkindeki önemi Organ ölçüsü ve fonksiyonunun sağlanması:

Apoptoz + hücre bölünmesi

Apoptozla yok olan hücreler bölünmeyle replase edilir

X

OPTIMAL FONKSİYON (SAĞLIKTA)

APOPTOZ

APOPTOZ

YAŞLANMA

Nörodejenerasyon, kanser, …..

Apoptoz: Hastalıkta • Kanser: -TP53 geni: PUMA, NOVA, BAX gibi proapoptotik proteinlerin

sentezini uyarır -Imatinib: proapoptotik BIM ve BID’yi artırarak KML tedavisinde -ABT-737; antiapoptotik hücrelere bağlanarak fonks bozar • İmmün sistem: tolerans (BH3-only protein BIM, fas) ve otoimmünite • Nörolojik hastalıklar (YD’da hipoksik beyin hasarı) • Hepatit; HCV (kaspaz inh IDN-6556 ile ALT ve AST’de azalma) • Kardiyovasküler Hastalıklar • Sepsis

Otofaji

• “kendini yeme” • Fizyolojik: -Ölümcül olmayan strese adaptif yanıt -Metabolizmanın düzenlenmesi, morfogenez, hücre farklılaşması,

yaşlanma, hücre ölümü ve hücre içi patojenlerin yok edilmesi • Patolojik: -Kontrolsüz otofaji kritik proteinlerin tüketilmesi kaspaz

bağımsız hücre ölümü Otofagazom sayısında artış olmasına rağmen ölen hücrelerde:

Kompanzasyon? / Otofajiyiye bağlı ölüm?

Otofaji

Otofajinin Klinik Etkileri • Otofagazomun düzenlenmesi: -PI3K -Beclin (BH3-only) -Rapamisin analogları (mTOR’u baskılayarak otofajiyi uyarır) • Nörodejeneratif hastalıklar (Huntington hastalığı) • Kanser: onkogenler (PI3K, AKT, BCL2 ve mTOR gibi)otofajiyi

baskıladığı, tümör süpressör genler (PTEN, TSC2 ve HIF1A gibi) ise otofajiyi uyarır

• Otofaji ilişkılı gen kaybı farelerde GIS tm ve lenfoma; insanlarda hepatoselluler CA ve İB Ca

• Hidroksiklorakin, intralizozomal pH artırarak otofajiyi engeller ancak ölüme gidişi kolaylaştırır

Nekroz

• Yunanca, • Nekroz=ceset

Nekrozun Mediatörleri • ROS • Ca+2 • PARP (poli-ADP-Riboz Polimeraz) • Calpain’ler (kalsiyumla aktive nonlizozomal proteazlar)

Apoptotik/Nekrotik Hücrelerin Uzaklaştırılması • CD31-, CD47- ve CD46- ; fagositoz (+)

Apoptoz/Nekroz Klirens ve İmmün Sistem • Apoptotik hücrelerin fagositozu= Anti-inflamatuar sitokinleri uyarırken

(IL-10, TGFβ, PGE2), proinflamatuar (IL-1β, IL-8, TNFα ve LT-B4)sitokinleri baskılar; tolerans

• Nekrotik hücrelerin fagositlerle etkileşimi TLR aracılı NF-κB aktive eder; proinflamasyon, T hücre aracılı otoreaktif B hücre akt; otoimmünite

• Nekrotik hücrelerden DAMP’lar; özellikle nükleer DNA bağlayıcı proteinlerden HMGB1; TLR-2, TLR-4 ve TLR-9 ile etkileşir; makrofaj ve DC’de proinflamatuar ve antijen sunma özelliklerini artırır;otoimmünite

• DNA’nın uygun parçalanması ve DAMP’ın inaktivasyonu; tolerans • Apoptozun eksik yürütülmesi, apoptotik hücrelerin verimsiz yutulması

ve sindirimi; otoimmünite • Makrofaj ve DC’lerin TLR aracılı uyarılmasında, nükleik asitler ko-sit etki

ile apoptoza bağlı toleransı kırdığı, T hücre aracılı otoreaktif B hücrelerinde akt; otoimmünite

Nekroz Programlanma mı yoksa Regülasyon mu? = Nekroptoz

• Sanıldığından daha düzenli • DAMP (HMGB1 gibi) molekülleri dolaşıma girip doğal immün sistemi

uyarabilir; nöbetçi görev • Belli hücre yüzey reseptörleri ile başlatılabilir -TNF (yüksek konsantrasyonlarda hepatositlerde nekroz) • Nekroz engellenebilir -Serpinin (proteaz inh), nekrozu engelleyerek programlayabilir • Alkilleyici DNA hasarı, toksinler veya DR’lerinin ligasyonuyla başlayan

ve nekroza doğru giden basamaklarda; genetik/farmakolojik müdahale, kaspazların baskılanması,özellikle kaspaz 8)RIP 1 ve RIP3’ün yıkılamaması; nekroz sonlanamaz

Apoptoz/Nekroz Klirens ve İmmün Sistem

• Opsonizasyon Bozukluğu; otoimmünite -C1q eks; SLE -MFG-E8-farelerde; anti-DNA ve APL ab ile lupus benzeri

hastalık • Sindirim aşamasında DNA yıkımı önemlidir -CAD ve DNAaz eks, lizozomlarda biriken DNA fagositlerde

proinflamasyon; otoimmünite -CAD- farelerde yüksek otoab düzeyli SLE benzeri hastalık

Hücre ölümünün immünmodülatuar etkileri

• Apoptotik Hücreler: anerji veya immünsüpresyon

• Nekrotik Hücreler: enflamasyon

Apoptotik hücre Parazitemi ve peritonite bağlı ölüm

Parazitemide azalma ve canlı

DAMP (HMGB1)

Farklı Hücre Ölüm Modları Arasında Geçiş

Hücre Ölümünün Önlenmesi

• Teknik olarak zor • Genellikle birden fazla ölüme neden olan uyarıların

koordinasyonuyla eş zamanlı oluşur • İskemi-reperfüzyon, ROS, aşırı Ca+2, proteazların

aktivasyonu • Nekrozdan sorumlu güçlü proteazlardan; calpein ve

cathepsin inh. hayvan modellerinde nekrozu azaltmıştır • Nicorandil (mitokondriyal ATP’ye duyarlı K+ kanalları üzerine

etkili, kardiyoprotektif);by-pass cerrahisine giden hastalarda operasyon sonrası serum troponin T seviyelerini düşürmektedir

• Huntington hastalığı, Parkinson, Alzheimer ve ALS’de antiapoptotik ve otofajiyi artıran ilaçlar araştırılmaktadır

Nekroptoz

Nekroptoz • RIPK-1 (Receptor-interacting protein kinase 1) ve RIPK-3 -İskemi-reperfüzyon hasarı -Pankreatit -Fotoreseptör hücre kaybı -İntestinal hücre kaybı -Enfeksiyonlarda RIPK-1 ve RIPK-3 aktivitesi artar

Mitotik Katastrofi • Anormal mitoza bağlı hücre ölümü; anormal veya eşit olmayan

kromozomlar • Kanser hücrelerinde • Mikrotübülleri de-stabilize eden veya DNA hasarına neden olan ilaçlar • Hücre ölümü gn metafaz veya hemen öncesinde olur

Pyroptosis • ‘pyro’ = ateş • Kaspaz 1 ile kontrol edilen enflamasyona bağlı hücre ölümüdür • Doğal immünite; PAMP, PRR ve DAMPs • İnflamazom oluşumu • IL-1β ve IL-18 • DNA yıkılımıyla oluşan yapısal değişimler, sitokin aktivasyonuna bağlı

mabranlarda porlar oluşur • L. pneumophilia, Salmonella ve Shigella/otoinflamatuar hastalıklar ve IBD gibi

Paraptosis

• Nörodejeneratif hastalıklarda

• Sitoplazmada aşırı vakuolizasyon, mitokondri ve ER’da şişme

• Nukleer kromatin kompakt hale gelir ve parçalanır

• Non-apoptotik • ILGF-1 ve Peptit

Nörotransmitter madde P gibi faktörler ile uyarılır

• Nur77 ve arrestin 2 gibi proteinkinaz ile düzenlenir

Entosis

• Memeli epitel hücrelerinde sık • Hücre matriks yapısından ayrılır • Non-apoptotik • Fagositik olmayan

mekanizmalarla (Ro GTPaz ve Rock), bir hücre diğerinin içine girer

• Non-otofajik mekanizmayla girdiği hücrenin lizozomuyla parçalanır

• Metastaik kanser hastalarının plevral sıvı örneklerinde

Anoikis

•Yunan dilinde evsiz anlamında

•Hücre onu destekleyen matriks yapısından ayrılır ve diğer hücrelerle teması kaybolur

•Apoptotik bir hücre ölümüdür

Cornification • Sitoplazmada organellerin kaybı • Plazma membranı modifiye olur • Stratum granulozumda keratohiyalin

granülleri içinde lipid birikimi • Ekstrasellüler alana lipidlerin extrusion • proteaz aktivasyonu ile desquamasyon

(corneocytes’lerin kaybı) • Cornification veya ‘keratinizasyon’

bariyer fonksiyonu oluşturmak üzere cilde özel bir durumdur.

• Bazal epidermal tabakada yaralanmayla (UV, radyasyon vs) apoptoz uyarılabilr; ancak kornifikasyon, üst tabakalarda daha fazladır (granüler tabaka ve stratum corneum).

• Kaspaz-14 ile epitelial kornifikasyon

Özetle

• Niçin nöronlar gibi bazı hücreler iskemik hücre ölümüne diğerlerinden daha hassas?

• Hücre belli bir ölüm tipini nasıl seçer? • Hücre ölümü birinden diğerine nasıl geçer? • Hücrenin ölüm yolunu belirleyen kriterler nelerdir? • Ne zaman hücrede ölüm geri dönülmez olur?

Apoptotic Cells in Thymus, Liver, and Intestine

Hotchkiss R et al. N Engl J Med 2009;361:1570-1583

Apoptotic and Necrotic Cell Death

Hotchkiss R et al. N Engl J Med 2009;361:1570-1583

Electron-Microscopical Detection of Autophagic and Necrotic Cell Death

Hotchkiss R et al. N Engl J Med 2009;361:1570-1583