guia técnica 1 validación de métodos y determinación de la

Validación de métodos y determinación de la incertidumbre de la medición:

“Aspectos generales sobre la validación de métodos”

GUÍA TÉCNICA N º 1 1

• Comité Editor

Boris Duffau Fabiola Rojas Isabel Guerrero Luis Roa Luis Rodríguez Marcelo Soto Marisol Aguilera Soraya Sandoval “Se agradece la colaboración prestada por el Sr. Leonardo Merino de la National Food Administration de Suecia, para la elaboración de esta Guía”

• Coordinación Edición Soraya Sandoval Sección Metrología Ambiental y de Alimentos Departamento de Salud Ambiental

• Edición Año 2010

Santiago, Diciembre de 2010.


I: INTRODUCCION

El Instituto de Salud Pública de Chile, como Laboratorio Nacional y de Referencia colabora continuamente con la Red de Laboratorios del Ambiente de las SEREMIs de Salud.

La presente guía tiene como objetivo, entregar recomendaciones a los laboratorios para realizar la validación de los métodos analíticos e introducir a estos en el concepto de incertidumbre de

la medición.


CCOONNTTEENNIIDDOO

I: INTRODUCCION 2 II: TERMINOLOGÍA 4 II: ESTADISTICA BASICA 8 IV: VALIDACION 21 A) establecer plan de validación 24 B) Desarrollo de pruebas de parámetros de validación 25 C) Evaluación de resultados de la validación 25 D) Informe de validación 26

SELECTIVIDAD 27 LINEALIDAD 28 SENSIBILIDAD 33 LIMITES 34 EXACTITUD 37 ROBUSTEZ 45 APLICABILIDAD 49

V: INCERTIDUMBRE 50 VI: ANEXOS 54 VII: BIBLIOGRAFÍA 66


II: TERMINOLOGÍA:

Adecuación al propósito: Es el grado en que la aplicabilidad de un método se ajusta a los criterios o requerimientos acordados entre el analista y el usuario final (cliente) que hace uso de los informes o datos generados a través de un método de ensayo. Es decir es la adaptación de un método para un fin previsto.

Analito: Sustancia (química, física o biológica) buscada o determinada en una muestra, que debe ser recuperada, detectada o cuantificada por el método. Aplicabilidad: Los analitos, matrices y concentraciones para los cuales puede utilizarse satisfactoriamente un método de análisis con el fin de determinar su conformidad con una norma. (Referencia: Manual Codex Alimentarius 16º Ed.)

Nota: La declaración de aplicabilidad (ámbito o campo de aplicación), además de una declaración del margen de funcionamiento satisfactorio para cada factor, puede incluir también advertencias acerca de la interferencia conocida de otros analitos, o de la inaplicabilidad a determinadas matrices y situaciones. (Referencia: Manual Codex Alimentarius 18º Ed.)

Blanco matriz: Matriz que no contiene el analito de interés u objetivo para el método seleccionado. Calibración: Operación que, en condiciones especificadas, establece primero una relación entre los valores con incertidumbres de medición proporcionados por las normas de medición y las indicaciones correspondientes con las incertidumbres de medición asociadas, y utiliza luego esta información para establecer una relación a fin de obtener un resultado de medición a partir de una indicación. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)

Nota1 : La calibración se puede expresar por medio de una declaración, una función, un diagrama, una curva o una tabla. En algunos casos puede consistir en una corrección aditiva o multiplicativa de la indicación con la incertidumbre de medición asociada. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008) Nota 2: La calibración no debe confundirse con el ajuste de un sistema de medición que a menudo se denomina erróneamente “autocalibración”, ni tampoco con la verificación de la calibración. A menudo se percibe como calibración solamente el primer paso mencionado en la definición anterior. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008) Es decir, es un procedimiento de comparación entre lo que indica un instrumento y su "valor verdadero" de acuerdo a un patrón de referencia con valor conocido.

Componente de la Incertidumbre: Cada una de las contribuciones a la incertidumbre. Criterios de aceptabilidad: Exigencias de una característica de funcionamiento o comportamiento en función de las cuales se puede determinar que un método analítico es adecuado para la finalidad perseguida y ofrece resultados confiables.


Ensayo: Operación técnica realizada de acuerdo a un procedimiento especifico, que consiste en la determinación cualitativa y/o cuantificación de una o más características (propiedades o analitos) en un determinado producto, proceso o servicio. Error aleatorio: Es aquel error inevitable que se produce por eventos únicos imposibles de controlar durante el proceso de medición. Se contrapone al concepto de error sistemático. Las fuentes de los errores aleatorios son difíciles de identificar o sus efectos no pueden corregirse del todo. Son numerosos y pequeños. Este error ocurre o esta dado por el azar. Ejemplo: Errores de apreciación, tales como el paralaje, que depende del observador y su capacidad en cuanto al límite separador del ojo. Error Sistemático: Es aquel que se produce de igual modo en todas las mediciones que se realizan de una magnitud. El error sistemático esta condicionado por algún factor distinto al azar. Ejemplo: el error de las masas patrón del laboratorio se transfiere sistemáticamente al momento de calibrar la balanza. El VIM, lo define como componente del error de medición que al reiterar las mediciones se mantiene constante o bien varia de manera predecible. Idoneidad para el fin previsto: La medida en que los datos obtenidos en un proceso de medición permiten al usuario adoptar decisiones correctas, tanto desde el punto de vista técnico como administrativo, para alcanzar un fin establecido. Incertidumbre: Parámetro asociado al resultado de una medición que caracteriza la dispersión de los valores que podrían razonablemente ser atribuidos al mensurando. Incertidumbre de la medición: Parámetro no negativo que caracteriza la dispersión de la cantidad de valores que se atribuyen a una mensurando, basándose en la información utilizada. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)

Nota: La incertidumbre de medición comprende, en general, muchos componentes. Algunos de estos pueden ser evaluados por tipo de una evaluación de: la distribución estadística de la cantidad de valores de una serie de mediciones y se pueden caracterizar por las desviaciones.

Intervalo de trabajo: Es el intervalo entre el nivel más bajo y más alto de concentración que ha sido demostrado que puede ser determinado con la precisión y exactitud requeridas para una determinada matriz.

Limite máximo permitido ((((LMP)))): Nivel máximo o tolerancia establecida para un analito en una reglamentación. Limite máximo Residual (LMR): Concentración máxima de residuos de una sustancia (plaguicida o medicamento) que se permite legalmente su uso en la superficie o parte interna de un producto alimenticio. Matriz: Es el tipo de sustancia compuesta (liquida, sólida, gaseosa) que puede o no contener al analito de interés, ejemplo: matriz de alimento, matriz ambiental, etc.


Material de Referencia Certificado (MRC): Material de referencia acompañado de documentación, emitida por un órgano autorizado, en la que se indican uno a más valores de propiedades especificadas así como la incertidumbre y rastreabilidad asociadas, con el uso de procedimientos válidos. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)

Es decir, es un material de referencia, al que se le ha asignado un contenido de analito especificado en un certificado a través de un método trazable.

Material de Referencia (MR): Material suficientemente homogéneas y estables con propiedades especificadas, que se ha establecido es idóneo para uso en la medición o en el análisis de las propiedades nominales. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)

Nota: Material homogéneo que tiene definidas sus propiedades, a través de un método validado

que puede usarse para fines analíticas (calibración de equipos, comprobación de un método, etc.). Mensurando: Cantidad destinada a la medida. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008) Método de ensayo validado: Método de ensayo aceptado para el que se han llevado a cabo estudios de validación (desempeño) con el fin de determinar su precisión y fiabilidad para un propósito específico. (Referencia: ICCVAM Guidelines for the nomination and submission of new, revised and alternative test methods, 2003). Método oficial: Es el método especificado por los organismos reglamentarios de un país, con fines de aplicaciones de normas (ejemplo; reglamento sanitario de alimentos) o estipulados por organizaciones comerciales (Referencia: FAO). Método normalizado: Método apropiado para el ensayo dentro de su alcance, publicado por organismos de normalización internacional, nacional o regional (ISO, EN, NM, ASTM, BS, DIN, IRAM, etc.) o por organizaciones reconocidas en diferentes ámbitos ( AOAC, FIL-IDF, EPA, USP etc.) Método cualitativo: Método que permite determinar la presencia o ausencia de un analito en una muestra o matriz. Método cuantitativo: Método que permite determinar la concentración de un analito presente en una muestra o matriz. Metrología: Ciencia de la medición y su aplicación. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008), es decir, es la ciencia de las mediciones o campo de los conocimientos relativos a las mediciones. Incluye cualquier tipo de medición del campo científico o tecnológico. Nivel: Es la concentración de una sustancia de interés en una solución estándar o matriz.. generalmente, se habla en términos de nivel de concentración. Plan de Validación: Documento tipo protocolo en el cual se definen las pruebas o parámetros de validación necesarios y el diseño experimental a desarrollar en base a los requerimientos del método. Requerimiento del método: Corresponde a aquellas características del métodos que son esenciales para poder aplicarlo para el fin previsto. Cuando no están establecidas por el cliente o usuario, debe definirlas el responsable del ensayo de manera confiable y científica.


Resolución: Parámetro cromatográfico que permite determinar la capacidad de separación entre 2 picos, de manera que se puedan diferenciar adecuadamente de la cromatografía los analitos de interés. Resultado de un ensayo (X): El valor final notificado de una cantidad medida o calculada, tras aplicar un procedimiento de medición, incluidos todos los procedimientos secundarios y las evaluaciones. (Referencia: Manual Codex Alimentarius 16º Ed.) Sistema Internacional de Unidades (SI): Sistema de unidades, basado en el Internacional Sistema de cantidades, sus nombres y símbolos, incluyendo una serie de prefijos y sus nombres y símbolos, así como las normas para su uso, aprobada por la Conferencia General de Pesas y Medidas (CGPM). (Referencia: VIM, JCGM 200:2008) Sub-muestra: Porción de una muestra para análisis. Testigo reactivo o blanco: Es la solución que contiene todos los reactivos usados en los mismos volúmenes y concentraciones, que son utilizados en el procesamiento de la muestra. Este blanco debe seguir todos los pasos indicados en la técnica y ayuda a detectar trazas de contaminación provenientes del material o reactivos usados. Trazabilidad metrológica: Propiedad de un resultado de medición, mediante el cual el resultado puede estar relacionado con una referencia a través de un cadena continua y documentada de calibraciones, cada que contribuyen a la incertidumbre de medición. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)

Propiedad del resultado de una medición o del valor con su incertidumbre, que puede a través de una cadena ininterrumpida de comparación relacionarse a una referencia establecida, generalmente patrones de referencia nacionales o internacionales. (Referencia: IUPAC- Nomenclature In Evaluation Of Analytical Methods Including Detection And Quantification Capabilities).

Validación: Verificación de determinados parámetros de un método en la que los requisitos especificados para estos, demuestran que el método es idóneo para un uso previsto. (Referencia: VIM, International Vocabulary for Basic and General Terms in Metrology: 2007) Valor verdadero: El grado de concordancia entre la media de un número infinito de valores reiterados de cantidad y un valor de cantidad de referencia. Veracidad: El grado de concordancia entre la expectativa relativa al resultado de un ensayo o de una medición y el valor verdadero. (Referencia: Manual Codex Alimentarius 18º Ed.) Valor de Referencia: Valor cuantitativo que se utiliza como base para la comparación con valores cuantitativos del mismo tipo. (Referencia: VIM, International Vocabulary for Basic and General Terms in Metrology: 2007)

Verificación: Suministro de prueba(s) objetiva(s) de que un elemento dado satisface el (los) requisito(s) especificado(s) . (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)

Es decir, es la comprobación experimental de que un método establecido funciona de acuerdo con las especificaciones, en las condiciones disponibles en el laboratorio usuario. Se entiende como verificación a las pruebas realizadas por un laboratorio en la rutina de trabajo que permiten comprobar y documentar la aplicabilidad y uso adecuado del método por parte del laboratorio.


II: ESTADISTICA BASICA

Para los fines de una validación, se utilizan normalmente ciertas mediciones estadísticas, que nos ayudan a establecer si el método se encuentra dentro de un parámetro aceptable, normalmente se determinan las siguientes:

Media: Conocida también como media aritmética o promedio, es la cantidad total de la variable (muestra o medida) distribuida a partes iguales entre cada observación. En términos matemáticos, es igual a la suma de todos sus valores dividida entre el número de sumandos

X = nΣ xi n

Siendo: xi = valor de una lectura. n = número de lecturas

Desviación estándar (σσσσ, S): Es el promedio de lejanía de los valores obtenidos (lecturas) respecto del promedio.

S = √ nΣ i=1 (xi-X)2

n-1 Siendo: xi = valor de una lectura. X= promedio de la totalidad de lecturas. n = número de lecturas

Coeficiente de Variación (CV): Desviación estándar dividida por la media. También es conocida como desviación estándar relativa (RSD). El coeficiente de variación puede ser expresado en porcentaje:

%CV = S x100 X

Siendo: S = desviación estándar de las lecturas. X = promedio de la totalidad de lecturas.

Varianza: Es una medida de dispersión definida como el cuadrado de la desviación estándar.

S2 = nΣ i=1 (xi-X)2

n-1 Siendo: xi = valor de una lectura. X= promedio de la totalidad de lecturas. n = número de lecturas


Coeficiente de Variación de Horwitz (CV h): Es el coeficiente de variación definido por W. Horwitz, a través de la ecuación obtenida de un estudio estadístico. En dicho estudio, Horwitz después de reunir una serie de datos (provenientes de 150 ensayos de interlaboratorios organizados por AOAC), observó que el coeficiente de variación de los valores medios dados por los diferentes laboratorios aumentaban a medida que disminuía la concentración del analito. Comportándose como muestra la siguiente gráfica, conocida como la trompeta de Horwitz.

La ecuación de Horwitz, esta definida como:

CVh = 2(1-0.5.log c) ó σH = 0.02 x c 0,8495 Dónde: CV h= Coeficiente de variación de Horwitz

σ H = Desviación estándar calculada conforme al modelo de precisión de Horwitz. C= concentración del analito expresado en potencia de 10 (Ver tabla Nº 1). Este coeficiente de variación (CVh) esta expresado en potencia de 2, y la concentración media del analito expresado como potencia de 10, de esta forma independiente del analito y el método utilizado se puede estimar el CV esperado para la precisión. Tabla Nº 1:

Concentración Razón (Potencia de 10)

Unidad

100 1 100% (100 g/100 g) > 10 10

-1 > 10 % (10 g/100 g)

> 1 10-2

> 1 % (1 g/100g) > 0,1 10

-3 > 0,1 % (1 mg/g ó 0,1 g/100 g)

0,01 10-4

100 mg/kg 0,001 10

-5 10 mg/Kg

0,0001 10-6

1 mg/Kg 0,00001 10

-7 100 µg/Kg

0,000001 10-8

10 µg/Kg 0,0000001 10-9

1 µg/Kg


Distribución Normal: Distribución continua conocida también como distribución Gaussiana, la distribución de una variable normal está completamente determinada por dos parámetros, su media y

su desviación estándar, denotadas generalmente por y . La distribución normal se caracteriza por tener una única moda, que coincide con su media y su mediana. Su expresión grafica es una curva normal, cuya forma es similar a los histogramas con forma de campana, es conocida como campana de gauss que es simétrica respecto a su media y asintótica al eje de abscisas, esto hace que cualquier valor entre y es teóricamente posible. El área total bajo la curva es, por tanto, igual a 1. Para este tipo de variables existe una probabilidad de un 50% de observar un dato mayor que la media, y un 50% de observar un dato menor.

- 3σσσσ - 2σσσσ -σσσσ µµµµ +σσσσ +2σσσσ +3σσσσ • La probabilidad de que Xo caiga en el intervalo comprendido entre µ+ σ es aproximadamente 0,687

ó 68,27%.

• La probabilidad de que Xo caiga en el intervalo comprendido entre µ + 2σ es aproximadamente 0,9545 ó 95,45%.

• La probabilidad de que Xo caiga en el intervalo comprendido entre µ + 3σ es aproximadamente 0,9973 ó 99,73%.

Nivel de significancia (Alfa, αααα): Es el nivel de significación utilizado para calcular el nivel de confianza. El

nivel de confianza es igual a 100% (1 - α), es decir, un alfa (α) de 0,05 indica un nivel de confianza de 95%. Factor de cobertura: Número mayor que uno por lo que una combinación de incertidumbre en la medición estándar se multiplica a obtener una incertidumbre expandida de medida. Un factor de cobertura suele ser simbolizada k. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)


Pruebas de Significancia

Es frecuente utilizar pruebas de significancia estadísticas durante el proceso de validación de los métodos analíticos en este sentido, se aplican comúnmente las siguientes: 1. Prueba t- student para identificar errores sistemáticos (sesgo). 2. Prueba F-Fisher para identificar errores aleatorios (precisiones). Al hacer una prueba de significancia se comprueba la veracidad de una hipótesis experimental, llamada

“hipótesis alternativa” (H1, si hay diferencia,) con respecto a la hipótesis nula (H0, no hay diferencia).

Es la hipótesis alternativa la que determina el número de colas. Si la hipótesis alternativa contiene la

frase “mayor que” ó “menor que”, la prueba es de una-cola. Si la hipótesis alternativa contiene la frase

”no es igual que”, la prueba es de dos-colas. (Fuente: National Food Administration of Sweden)

1. “La media es igual al valor dado” (H0: μ = x0) versus “la media no es igual al valor dado” (H1:μ ≠ x0) � dos-colas 2. “La media es igual al valor dado” (H0: μ = x0) versus “la media es menor que el valor dado” (H1:μ < x0) � una-cola 3. “La media es igual al valor dado” (H0: μ = x0) versus “la media es mayor que el valor dado” (H1:μ > x0) � una-cola

Una forma practica de decidir es respondiendo a dos preguntas: t-Test

1. Son las medias iguales? Dos-colas 2. Son las medias diferentes (puede una media ser mayor o menor a la otra)? Una-cola

F-Test

1. Son las varianzas diferentes? Dos-colas 2. Es la varianza 1 mayor que la varianza 2? Una-cola


Prueba t-Student

Esta prueba permite comparar las medias de dos grupo de datos y determinar si entre estos parámetros las diferencias son estadísticamente significativas.

En la prueba t , se procede a determinar el valor t de student calculado, obtenido de la experiencia analítica, y este valor posteriormente se compara con el llamado valor crítico, este valor critico se obtiene de la tabla de t-student para un determinado porcentaje de confiabilidad (normalmente se utiliza el 95%

de confianza, es decir, un valor α de 0,05). Si no existen diferencias significativas entre 2 grupos, el t calculado debería ser inferior al t critico (o conocido también como t de tabla).

El siguiente ejemplo, trata de explicar la afirmación realizada anteriormente: Un atleta desea realizar un salto con garrocha, para lo cual, él realiza un calculo de con que velocidad y con que fuerza (t calculado) debe realizar la prueba de atletismo, a fin de saltar correctamente la altura establecida para la competencia (t critico).

Si el t calculado es inferior al t crítico, entonces, no existirá una diferencias significativa que permita superar al t critico, y el atleta no podrá realizar el salto.


Si el valor t calculado es superior al t crítico, entonces, existirá una diferencia significativa que permitirá superar al t crítico, y el atleta podrá realizar el salto.

Para explicar de mejor manera la prueba de t-Student, hemos incluido los siguientes ejemplos:

EJEMPLO 1: Prueba t-Student para 2 variables independientes

Se realiza el análisis de una muestra de flúor en agua bajo el método de cromatografía iónica en Laboratorio 1 y por EIS en Laboratorio 2. Los resultados obtenidos en mg/L de F- , fueron:

Nivel Grupo/Experiencia

Observaciones 1 2

1 4,5 5,3

2 5,2 6,8

3 5,0 6,9

4 6,4 7,1

5 6,0 7,7

6 7,1 ---

Experiencia 1: n1=6 Media X1=5,70 Desviación estándar S1= 0,9716 grados de libertad gl1= 5 Experiencia 2: n2=5 Media X2= 6,76 Desviación estándar S2 = 0,8877 grados de libertad gl2= 4 Se determina el valor t calculado (t calc):

t calc = X1 - X2 .

S1 2 (n1-1) + S2

2 (n2-1) . 1 + 1 n1+ n2-2 n1 n2


t calc = 5,70 - 6,76 .

(0,9716) 2 (6-1) + (0,8877)

2 (5-1) . 1 + 1 6 + 5 - 2 6 5

t calc = -1,06 .

(0,93524) . (0,1667 + 0,2) t calc = 1,06 = 3,09. 0,34292

Se desea determinar si son iguales las medias de la experiencia 1 y 2. Para esto se procede luego a

determinar el t critico en la tabla t-student para α=0,05.

En la intersección se lee: valor crítico para t, que es t crit= 2,262.

2 colas 80% 90% 95%

αααα/2 v

0.10 0.05 0.025

1 3.078 6.314 12.706

2 1.886 2.920 4.303

3 1.638 2.353 3.182

4 1.533 2.132 2.776

5 1.476 2.015 2.571

6 1.440 1.943 2.447

7 1.415 1.895 2.365

8 1.397 1.860 2.306

9 1.383 1.833 2.262

10 1.372 1.812 2.228

Se procede a comparar el t crítico y el t calculado, t calc= 3,09.

Se observa. t calc > t crit .Concluimos que existen diferencias significativas. Por lo cual el resultado se acepta.


EJEMPLO 2: Prueba t-student para 2 variables correlacionadas o pareadas

Se realiza el análisis de una muestra de turbiedad en agua, el método utilizado es el turbidimétrico, la experiencia se realiza en 2 días diferentes:


Observaciones A B

x ∆∆∆∆

1 4 3 1

2 5 2 3

3 6 1 5

4 6 2 4

5 4 3 1

Experiencia : observaciones pareadas n=5

Media X ∆= 2,8 Desviación estándar S = 1,789 grados de libertad gl= 4

Se determina el valor t calculado (t calc):

X ∆ = Σ ( xA –xB) t calc = X∆ .

n (S/√n)

Se calcula: X ∆ = 1 +3 +5+ 4+1 = 2,8 y luego se determina el t calculado; 5

t calc = 2,8 .= = 3,48

1,789/ √5 Se desea demostrar si existen diferencias significativas entre la experiencia A y B. Entonces, se procede

luego a determinar el t critico en la tabla t-student para α=0,05 para 2 colas. En la intersección se lee: valor crítico para t, que es t crit= 2,776.

2 colas 80% 90% 95%

αααα/2 v

0.10 0.05 0.025

1 3.078 6.314 12.706

2 1.886 2.920 4.303

3 1.638 2.353 3.182

4 1.533 2.132 2.776

5 1.476 2.015 2.571

Se procede a comparar el t crítico y el t calculado, t calc= 3,48. Se observa que t calc > t crit. Concluimos que existen diferencias significativas. Por lo cual no es aceptable.


EJEMPLO 3: Prueba t-student para comparación de muestreal versus un valor de referencia

Se analiza de un material de referencia certificado de hierro en cereal, se realizan 4 replicas, el método utilizado es absorción atómica llama, los resultados obtenidos en mg/Kg son:

Observaciones Valor obtenido

1 5,8

2 6,1

3 6,4

4 6,2

El valor asignado, informado en el certificado del MRC es; µ = 6,3 mg/Kg

Experiencia : Observaciones pareadas n=4 Media X = 6,05

Desviación estándar S = 0,387 grados de libertad (ν o gl)= 3 Se determina el valor t calculado (t calc):

t calc = X - µ .

(S/√n)

t calc = 6,05 – 6,3 .= = 1,292

0,387/ √4

Se procede luego a determinar el t critico en la tabla t-student para α=0,05.

En la intersección se lee: valor crítico para t, que es t crit= 3,182.

2 colas 80% 90% 95%

αααα/2 v

0.10 0.05 0.025

1 3.078 6.314 12.706

2 1.886 2.920 4.303

3 1.638 2.353 3.182

4 1.533 2.132 2.776

Se procede a comparar el t crítico y el t calculado, t calc= 1,292.

Se observa que: t calc < t crit . Concluimos que no existen diferencias significativas. Por lo cual el resultado se acepta.


Prueba F (de Fisher)

Prueba en la que el estadístico utilizado sigue una distribución F si la hipótesis nula no puede ser rechazada. En estadística aplicada se prueban muchas hipótesis mediante el test F, entre ellas: La hipótesis nula=Ho de que las medias de múltiples poblaciones normalmente distribuidas y con la misma desviación estándar son iguales. Esta es, quizás, la más conocida de las hipótesis verificada mediante el test F y el problema más simple del análisis de varianza. Y la hipótesis de que las desviaciones estándar de dos poblaciones normalmente distribuidas son iguales.

Para explicar de mejor manera la prueba de Fischer, hemos incluido el siguiente ejemplo:

Se realiza la medición de sulfatos en una muestra de agua en dos días diferentes.


Observaciones 1 2

1 C1,1 C2,1

2 C1,2 C2,2

3 C1,3 C2,3

4 C1,4 C2,4

5 C1,5 C2,5

6 C1,6 C2,6

7 C1,7 C2,7

8 C1,8 C2,8

9 C1,9 C2,9

10 C1,10 C2,10

11 -- C2,11

12 -- C2,12

13 -- C2,13

14 -- C2,14

Experiencia 1: n1=10 Media 1=14,9 Varianza 1= 26,4 Experiencia 2: n2=14 Media 2= 16,2 Varianza 2 = 12,7

Si se intenta un test de t-student con estos valores hay que verificar si las 2 varianzas no son significativamente diferentes; por que si son diferentes, el test de t-student no podrá ser utilizado. ¿Que se hace?

1) Determinar los grados de libertad de la experiencia 1: n-1 = 10-1=9 2) Determinar los grados de libertad de la experiencia 1: n-2 = 14-1=13


3) Dividir la varianza más grande por la más pequeña:

F= Varianza mayor = Varianza 1 = 26,4 = 2.079 Varianza menor Varianza 2 12,7 4) Para saber si 2,079 indica que la varianza obtenida en la experiencia 2 es menor que la obtenida en la experiencia 1, uno va a la Tabla F (Ver Anexo nº 4) y coloca los grados de libertad (gl) del numerador (9)

en la fila horizontal, y del denominador (13) en la columna, para un valor de α = 0,05, 1 cola:

gl 1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 161.44622 199.49948 215.70668 224.58335 230.16037 233.98752 236.76694 238.88424 240.54316

2 18,51 19,00 19,16 19.24673 19.29629 19.32949 19.35314 19.37087 19.38474

3 10,13 9,55 9,28 9.11717 9.01343 8.94067 8.88673 8.84523 8.81232

4 7,71 6,94 6,59 6.38823 6.25607 6.16313 6.09421 6.04103 5.99880

5 6,61 5,79 5,41 5.19216 5.05034 4.95029 4.87586 4.81833 4.77246

6 5,99 5,14 4,76 4.53369 4.38737 4.28386 4.20667 4.14681 4.09901

7 5,59 4,74 4,35 4.12031 3.97152 3.86598 3.78705 3.72572 3.67667

8 5,32 4,46 4,07 3.83785 3.68750 3.58058 3.50046 3.43810 3.38812

9 5,12 4,26 4,07 3.63309 3.48166 3.37376 3.29274 3.22959 3.17890

10 4,96 4,10 3,86 3.47805 3.32584 3.21718 3.13547 3.07166 3.02038

11 4,84 3,98 3,71 3.35669 3.20388 3.09461 3.01233 2.94798 2.89622

12 4,75 3,89 3,59 3.25916 3.10587 2.99612 2.91335 2.84857 2.79638

13 4,67 3,81 3,49 3.17912 3.02543 2.91527 2.83210 2.76691 2.71436

En la intersección se lee: valor crítico para F, que es F crit= 2,71.

Se procede a comparar el F crítico y el F calculado, F calc= 2,079,

Se observa. F crit > F calc.

Concluimos que las dos varianzas no son significativamente diferentes. Por lo tanto, hacer el test de t es una decisión legítima.


Análisis de Varianza

El análisis de varianza, también conocido como ANOVA, es el análisis estadístico en el cual se compara más de dos medias entre sí. Para ese fin, se debe proceder a comparar las diferencias entre cada grupo y las observaciones realizadas. Ejemplo:

Experiencia n’

n= Observaciones Método A Método B Método C

1 8,5 9,9 7,4

2 9,2 10,0 8,0

3 7,8 11,1 8,6

N= número de observaciones totales = 3 x 3 = 9 Se procede a calcular la sumatoria de las observaciones de experiencia (o grupo):

Calculo Método A Método B Método C Σ

Σ xi 25,5 31,0 24,0 Σ Σ xi = 25,5 + 31,0+24,0= 80,5

Σ xi2 217,73 321,22 192,72 Σ Σ xi2 = 217,73 + 321,22 +192,72= 731,67

Suma total de los cuadrados es:

SCT = Σ Σ xi2 – (Σ Σ x)2 = 731,67 – (80,5)2 = 11,642

N 9 Grados de libertad totales = gl total= N-1 =9-1 =8 Suma cuadrados entre grupos:

SCB = (Σ xA)2 + (Σ xB)2 + (Σ xC)2 - (Σ Σ x)2 = (25,5)2 + (31,0)2 + (24,0)2 – (80,5)2 = 9,0553

nA nB nC N 3 3 3 9 Grados de libertad entre grupos (ej.: métodos) = gl B = n’-1 = 3-1 = 2


Suma cuadrados residuales o dentro del grupo, es decir , dentro de los métodos: Se realiza por simple resta, es decir:

SC w = SCT - SDCB = 11,642 – 9,05553 = 2,58647

Grados de libertad dentro del grupo = gl total - gl B = 8- 2 = 6

Resumiendo obtuvimos:

Origen de la Varianza Grados de libertad (gl) Sumas cuadráticas (SC) Cuadrados medios (CM)

Entre grupos (B) 2 9,0553 4,5278

Dentro del grupo (W) 6 2,58647 0,4311

Total (T) 8 11,642 -----

Aplicando la prueba F, se obtiene:

F calc = ( SCB/glB) = ( 9,05553/2) = 4,5278 = 10,5

(SCw/ glw) ( 2,58647/6) 0,4311

Se determina el valor F crítico de Tabla F (Ver Anexo nº 4) y coloca los grados de libertad (gl) del

numerador (2) en la fila horizontal, y del denominador (6) en la columna, para un valor de α = 0,05, 1 cola:

gl 1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 161.44622 199.49948 215.70668 224.58335 230.16037 233.98752 236.76694 238.88424 240.54316

2 18,51 19,00 19,16 19.24673 19.29629 19.32949 19.35314 19.37087 19.38474

3 10,13 9,55 9,28 9.11717 9.01343 8.94067 8.88673 8.84523 8.81232

4 7,71 6,94 6,59 6.38823 6.25607 6.16313 6.09421 6.04103 5.99880

5 6,61 5,79 5,41 5.19216 5.05034 4.95029 4.87586 4.81833 4.77246

6 5,99 5,14 4,76 4.53369 4.38737 4.28386 4.20667 4.14681 4.09901

En la intersección se lee: valor crítico para F, que es F crit= 5,14.

Se procede a comparar el F critico y el F calculado. F calc = 10,50

Se observa que F calc > F crit . Se concluye que hay diferencias significativas entre los 3 métodos.


IV: VALIDACION

La validación de un método analítico es un paso fundamental para asegurar que los resultados entregado por dicho método son confiable. Cuando se realiza la validación de un método por parte del laboratorio, lo que se busca es poder determinar con fundamento estadístico que el método es adecuado para los fines previstos. En este sentido, es importante que para el proceso de validación se asigne a un responsable de realizar dicha tarea. De manera que, la validación se efectúe en forma metódica, ordenada, trazable y confiable. Es importante que el laboratorio tenga claridad antes de iniciar la validación de cuales son los requerimientos del método para establecer el alcance de la validación. Es esencial, entonces conocer el método a validar y su aplicabilidad, es decir, el analito, su concentración (nivel, LMP, LMR, etc.) y la matriz (o matrices) en las cuales se desea utilizar. En general, se establece que el laboratorio DEBE validar:

1. Métodos no normalizados: Corresponden a métodos desarrollados por el laboratorio o método nuevos (ejemplo: publicado en revista científica), o bien, a métodos que tradicionalmente se han utilizado en el laboratorio pero que no están normalizados.

2. Método normalizado con una modificación significativa. Cuando se trata de un método empleado tradicionalmente por el laboratorio que no este normalizado, se puede realizar una Validación Retrospectiva, es decir, en base a los datos experimentales que el laboratorio dispone, para la cual se realizará la recopilación de la mayor cantidad de datos históricos disponibles, para luego realizar un proceso de ordenamiento y selección de los datos recopilados, estos datos pueden ser: curvas de calibración, resultados de ensayos, cartas de control, ensayos de aptitud, etc. A través de estos, se deberán determinar los parámetros de validación, y evaluar si los resultados obtenidos para los fines de la son aceptable. En caso de ser un método nuevo (o uno antiguo del que no se dispongan de datos suficientes) se debe realizar una Validación Prospectiva, generando a través de análisis datos experimentales. En algunos casos se puede realizar lo que se conoce como validación menor o verificación cuando se trate de:

1. Métodos normalizados. 2. Métodos normalizados usados fuera de su alcance propuesto. Ejemplo: uso en otra matriz. 3. Ampliaciones y modificaciones menores de métodos normalizados. Ejemplo: uso en otros

analitos. 4. Cuando se trate de métodos previamente validados, que haya sufrido alguna alteración

significativa por lo cual deben volver a evaluarse. Estas variaciones pueden ser; cambio de equipo, cambio de componentes de equipo como columnas, detectores, cambio analista, cambio de la matriz que contiene la muestra o de nivel de concentración del analito de interés, entre otros.


La verificación, tiene generalmente como objetivo, el comprobar que el laboratorio domina el método de ensayo normalizado y lo utiliza correctamente, en caso de tratarse de un método normalizado modificado para la verificación se requiere solo realizar aquellas pruebas que indiquen que la variación realizada no afecta el ensayo. En ocasiones, lo que se busca a través de una validación es demostrar que un método es equivalente a otro. El objetivo de la validación y la verificación, es demostrar que el método utilizado por un laboratorio es adecuado para la aplicación en la que se propone utilizar, así, como también demostrar que las modificaciones que pudieron haberse realizado no afectan su desempeño, ni la confiabilidad de los resultados por este entregado.


Definición del método a Validar: Cuali o Cuantitativo-Analito-matriz-Concentración-Principio

Tipo de Método

Normalizado Normalizado Modificado

No Normalizado Tradicional : usado por el

Laboratorio hace años

Validación Prospectiva Validación

Retrospectiva Verificación

Establecer Parámetros a Evaluar

Establecer Pruebas Experimentales

Establecer Criterios de Aceptabilidad

Sí No Se trata de un método normalizado?

Tiene una modificación significativa?

No

Sí

No Normalizado: Nuevo o

Desarrollado por el laboratorio

recientemente

Desarrollar Pruebas Experimentales

Evaluar resultados

INFORME DE VALIDACIÓN

REVISIÓN DE INFORME

Comparar resultados versus criterios


En relación a los parámetros de validación o verificación estos deberán determinarse de acuerdo al tipo de método. Para este fin la siguiente tabla puede ser utilizada como guía: Tabla Nº 2

METODO CUANTITATIVO PARAMETRO A EVALUAR

CARACTERISTICA(S)

METODO CUALITATIVO NORMALIZADO MODIFICADO NUEVO

SELECTIVIDAD Identificación analito Interferencia de matriz

Sí No Sí Sí

LINEALIDAD Rango lineal

No Sí Sí Sí

SENSIBILIDAD Pendiente

No Sí o No Sí Sí

LIMITES Critico (LC) Detección (LOD) Cuantificación (LOQ)

Sí Sí o No

Sí Sí

PRECISION Repetibilidad Reproducibilidad

No Sí Sí Sí

VERACIDAD Sesgo (s) Recuperación (R)

No Sí o No Sí o No

Sí

ROBUSTEZ Test de Youden y Steiner

No No Sí o No

Sí

APLICABILIDAD ------------- Sí

Sí Sí Sí

De acuerdo a los antecedentes anteriormente mencionados, el responsable de la validación o verificación deberá así elaborar el Plan de Validación que se va a realizar.

a) ESTABLECER PLAN DE VALIDACIÓN

Se entiende como Plan de Validación, a un documento (tipo protocolo) en el cual se definen previamente a la experiencia; las pruebas o parámetros de validación necesarios y el diseño experimental a desarrollar en base a los requerimientos del método. El “Plan de Validación” deberá contener a lo menos:

• Alcance de la validación (método, analito, matrices y requerimientos del método

• Diseño experimental: Establecer la(s) muestra(s) a ser analizada(s): testigos reactivos, blanco matriz, material certificados, material control, material(es) de referencia certificado, matrices de las muestras, muestras sin fortificar, muestras fortificadas, etc. El (los) parámetro(s) y pruebas a desarrollar, en caso, de que la prueba no sea una convencional, sino diseñada por el responsable, también deberá indicarse en el documento. Número de análisis requeridos para cada prueba y/o parámetro. Criterios de aceptabilidad para cada parámetro de validación. Analista(s) responsable de realizar la(s) prueba(s) analítica(s).


• Materiales, insumos y equipos necesarios para desarrollar la validación.

• Responsable de la Validación, fecha o tiempo programado para realizar la validación y fecha de elaboración del plan.

Cualquier modificación realizada al plan de validación, durante el proceso, debe quedar debidamente documentada. En anexo Nº 1, Se muestra un formato de plan de validación. En el anexo Nº 6, se incluye un ejemplo de esquema de trabajo de cómo se desarrolla un plan de validación para un método normalizado.

b) DESARROLLO DE PRUEBAS DE PARÁMETROS DE VALIDACIÓN

Para el desarrollo de las pruebas de validación, los analistas a cargo deberán conocer el procedimiento de método de ensayo y el número de ensayos o mediciones a realizar de acuerdo a lo establecido en el plan de validación. (IMPORTANTE: El personal responsable de realizar los análisis se encuentre debidamente calificado, y

los equipos asociados al método deberían encontrarse calibrados o controlados antes de su uso.)

Los resultados obtenidos en cada prueba deben ser debidamente registrados y almacenados. Los ensayos o mediciones realizadas serán con el fin de poder realizar las siguientes pruebas de parámetros de validación:

Selectividad Linealidad Sensibilidad Limites Exactitud Precisión Robustez Aplicabilidad

El analista o responsable de la validación deberá con los resultados obtenidos de cada prueba realizar los cálculos matemáticos, comparativos y/o estadísticos correspondientes a cada ensayo para lo cual podrá utilizar para ese fin un software estadístico, calculadora o una planilla de cálculo (ejemplo: Excel). C) EVALUAR RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN Se deberá evaluar para cada parámetro de validación, si los resultados de las pruebas son satisfactorios, es decir, si cumplen con los criterios de aceptabilidad establecidos en el plan, se considera que el método es aceptable.


D) INFORME DE VALIDACIÓN El responsable de la validación, deberá realizar un informe en el cual presentará los resultados obtenidos y conclusiones. El informe debe contener la declaración de la aplicabilidad del método. En el anexo Nº 2, se entrega un modelo tipo de informe de validación. El laboratorio debe tener disponible el procedimiento usado para la validación, y una declaración acerca de que el método se ajusta para el uso propuesto. Este informe deberá ser revisado por una tercera persona que tenga conocimiento en el área, y que no haya formado parte del proceso de validación. En dicha revisión se deberá establecer si los criterios de aceptabilidad establecidos en el plan son aceptables, y si el método es idóneo para el fin previsto.


SELECTIVIDAD La selectividad es el grado en que un método puede cuantificar o cualificar al analito en presencia de interferentes. Estos interferentes normal o frecuentemente se encuentran en la matriz de interés. La prueba de selectividad puede diseñarse de acuerdo al método, en el caso de cromatografía la resolución entrega información sobre la selectividad del método, en el caso de espectrofotometría el espectro de absorción o un espectro de masas entrega información al respecto, en especial cuando es comparado en presencia de una interferencia. Una prueba de Selectividad comúnmente utilizada, consiste en analizar un mínimo de tres testigo reactivos, tres blancos de matriz y tres muestras o estándares de concentración conocida del analito de interés. Se deben comparar las lecturas (señales de medición) obtenidas para cada caso, y observar si existen variaciones entre los testigos reactivos, blancos de matrices y estándares o muestras con analito. Si se encuentran diferencias significativas deberán ser identificadas y en lo posible eliminadas.


LINEALIDAD La linealidad es la capacidad de un método de análisis, dentro de un determinado intervalo, de dar una respuesta o resultados instrumentales que sean proporcionales a la cantidad del analito que se habrá de determinar en la muestra de laboratorio. Con el fin de determinar el rango lineal se puede realizar mediante un gráfico de concentración versus respuesta, que se conoce como Función Respuesta (normalmente llamada recta de calibrado). Ésta se establece cada día con una cierta cantidad de valores formados por un blanco y los patrones de trabajos limpios de valor teórico conocido, que cubran el intervalo de trabajo. En este sentido se recomienda abarcar valores desde cercano al cero y valores superiores al LMP o al valor de interés. El número de puntos a analizar deberá ser establecido por el analista (en general, se utiliza un mínimo de 4 valores). Luego de realizar el grafico se puede observar el comportamiento de la curva y establecer cualitativamente el rango lineal (fig.1). Después de establecer el comportamiento lineal del método se deberá realizar la Curva de trabajo o curva de calibración (fig.2). Graficar los datos de concentración de los estándares de calibración estimados (X) v/s la lectura observada (Y).

Fig. 1 Fig.2 Evaluar los estimadores de regresión lineal del gráfico: la pendiente (m), el coeficiente de correlación (r

ó ϒ) y el punto de corte (intercepto) con el eje de las Y (L0).

Y= X x m + Lo


En general el criterio de aceptación cualitativo que se usa para determinar la linealidad es el coeficiente de correlación: El coeficiente de correlación indica el grado de relación entre la variable concentración (X) y la variable respuesta (Y) de la curva de calibración. Los valores máximos que puede alcanzar son –1 y 1. El valor máximo de 1 indica una correlación positiva perfecta (entre X e Y) con una pendiente positiva. Cuando r=0, no existe correlación alguna, independencia total de los valores X e Y En la práctica si r tiene un valor cercano a uno (1), esto significa que existe correlación con una probabilidad elevada. Para una curva de calibración o trabajo, es recomendable que el coeficiente de correlación obtenido sea mayor o igual a 0.999, aunque para el caso de trazas se admite un valor igual o mayor que 0.99.

r = _S x y S x · S y S x y = i = 1 Σ

n x i · yi - ( x p r o m · yprom ) n

S x = √ ( (Σ x i2 / n) - ( x p r o m

2 ) )

S y = √ ( (Σ y i2 / n) - ( y p r o m

2 ) )

Coeficiente de correlación (γ o r): r > 0.99 Coeficiente de correlación al cuadrado r2 > 0.99. Se puede realizar una evaluación de curva de calibración global (construida con más de una curva de calibración de las mismas características) en la cual se puede realizar una evaluación estadística de prueba t-Student, como un mejor indicador del modelo lineal. Se calcula un valor de t con n-2 grados de libertad y se compara con el valor tabulado de t para el nivel de confianza requerido (α = 0.05), dos-colas, en este caso para un “n” que depende de los niveles de calibración. Se desea probar si existe entonces una correlación significativa: La hipótesis nula H0 es que no existe correlación entre X e Y. Si el valor observado de tr es mayor que tcri, se rechaza la hipótesis nula H0, siendo la correlación lineal significativa con la probabilidad calculada.

tr = | r | √(n-2) √ (1- r2)

Donde:

tr = Valor del estimador t Student obtenido para el coeficiente de correlación | r | = Valor absoluto del coeficiente de correlación n – 2 = Número de grados de libertad r

2 = Valor del coeficiente de determinación


Ejemplo:

Nivel Conc

mg/L Área

1 Área

2 Área

3 A

Promedio

Desviación Estándar

S CV %

Varianza

1 13,4 43,8 44,2 44,1 44,0 0,2 0,4 0,0 2 26,6 86,2 86,1 87,6 86,7 0,8 1,0 0,7 3 40,8 131,2 132,7 133,6 132,5 1,2 0,9 1,4 4 54,7 181,7 180,7 178,6 180,3 1,6 0,9 2,5 5 68,6 221,6 224,2 221,8 222,5 1,4 0,6 2,0

n= Nº de niveles= 5 r= coeficiente de correlación= 0,99985 r= coeficiente de determinación= 0,9997 sustituyendo los valores: t r = | r | √(n-2) = I 0,99985 I*√(5-2)= I 0,99985 I*√3 = 99.985

√ (1- r2) √ (1-0,9997) √0,0003


El valor t critico obtenido de la tabla para: 3 grados de libertad, un α = 0.05 y 2 colas es:

2 colas 80% 90% 95%

αααα/2 v

0.10 0.05 0.025

1 3.078 6.314 12.706

2 1.886 2.920 4.303

3 1.638 2.353 3.182

4 1.533 2.132 2.776

t crit = 3,182

Se observa que el valor observado de tr (es decir el t calculado) es mayor que tcrit (99,85 > 3,182),

por lo cual se rechaza la hipótesis nula Ho, siendo la correlación lineal significativa con la

probabilidad calculada.

En cuanto al rango de aplicabilidad, el Codex Alimentarius ha establecido que respecto al LMP el Intervalo mínimo aplicable es: Respecto de un LMP ≥ 0,1 ppm, [LMP - 3 SR , LMP + 3 SR ]. Respecto de un LMP < 0,1 ppm, [LMP - 2 SR , LMP + 2 SR ]. Siendo SR la desviación estándar de la reproducibilidad. Ejemplo: El LMP para mercurio en sal es de 0,1 mg/Kg, por lo cual se aplicaría la ecuación de Horwitz para determinar la SR prevista a este nivel que es igual a 10-7

CVR (%) = 100 · SR = 2 C−0,1505 c

Al despejar la ecuación obtendríamos lo siguiente:

SR = c· 2 C−0,1505

100 c= Es el LMP en mg/Kg es decir; 0,1 C= Es cociente de concentración es decir la concentración expresada en potencia de 10.


Sustituyendo obtendríamos:

SR = 0,1· 2 (0,0000001)−0,1505 = 0,0233 100

Entonces:

Para un LMP ≥ 0,1 ppm se aplica el criterio: [LMP - 3 SR , LMP + 3 SR ].

Es decir: LMP + 3 SR = 0,1 + (3·0,0233) = 0,1 + (0,07) 0,1 + 0,07 = 0,17 mg/Kg 0,1 – 0,07 = 0,03 mg/kg Entonces el rango que se requería del método para que fuera aceptable debería estar a lo menos entre 0,03 y 0,17 mg/Kg. Para coeficientes de concentración < 10-7, se aplica la teoría de Thompson, esto es, CVR% = 22 % por lo tanto, SR = 0,22 · LMP Ejemplo: El Codex Alimentarius señala que para un LMP = 0,01 mg/kg , es decir, para una concentración de 10-8, es decir < 10-7: El rango de aceptabilidad seria: LMP + 2 SR= 0,01 ± 2· SR = 0,01 ± 2 · (0,22 · LMP) = 0,01 ± 0,44 · 0,01 = 0,01 ± 0,0044 mg/kg El rango mínimo aplicable para un LM de 0,01 mg/kg es, por lo tanto, 0,006-0,014 mg/kg.


SENSIBILIDAD La sensibilidad es el cociente entre el cambio en la indicación de un sistema de medición y el cambio correspondiente en el valor de la cantidad objeto de la medición. En una regresión lineal la sensibilidad corresponde a la pendiente (m) de la recta de calibración.

Se calcula como:

m = ΣXi Yi - (Σ Xi ΣYi/ n)

ΣX2 i - ((ΣXi)2 /n)

El valor de sensibilidad obtenido [m] debe permitir una adecuada discriminación de los valores de concentración en base a la lectura. En figura Nº 3, se puede observar que mientras más próxima al eje de las Y esté la recta, significa que a ligeros cambios en las concentraciones esperadas habrá grandes variaciones en los resultados de las lecturas observadas [m2] En el caso de [m3] grandes cambios en la concentración no son significativos para la lectura.

Fig. 3 Se dice, que un método es sensible cuando una pequeña variación de concentración determina una gran variación de respuesta. La sensibilidad permite observar la capacidad de respuesta instrumental frente a una determinada cantidad de analito. En el tiempo, visualiza como se comporta el instrumento.


LIMITES Se debe tener en consideración los siguientes parámetros: Valor critico, limite detección (LOD) y limite de cuantificación (LOQ). Valor critico (LC): El valor de la concentración o cantidad neta que en caso de superarse da lugar, para una probabilidad de error dada α, a la decisión de que la concentración o cantidad del analito presente en el material analizado es superior a la contenida en el material testigo (Referencia: Codex

Alimentarius).

Se recomienda para su cálculo a lo menos seis mediciones de blanco matriz o testigo reactivo.

LC = t (1-α;ν) x So Sí : t ( 0.05,∞) → 1,645 LC = 1,645 x So

Donde: t = t-Student 1-α= probabilidad b v= Grados de libertad So = Desviación estándar de las lecturas del blanco matriz o testigo reactivo. Un resultado inferior al LC que determine la decisión “no detectado” no deberá interpretarse como demostración de que el analito está ausente. No se recomienda notificar tal resultado como “cero” o como < LOD. Deberá hacerse constar en todo los casos el valor estimado y su incertidumbre. Límite de detección (LOD): Concentración o cantidad real del analito presente en el material objeto de análisis que llevará, con una probabilidad (1-β), a la conclusión de que la concentración o cantidad del analito es mayor en el material analizado que en el material testigo (Referencia del Manual del Codex Alimentarius ). Se recomienda para su cálculo a lo menos seis mediciones de blanco matriz , testigo reactivo o concentración estimada cercana al blanco.

LOD = 2 t (1-α;ν) x So Sí : t ( 0.05,∞) → 1,645 LOD = 3,29 x So

LOD = 3,29So, cuando la incertidumbre del valor medio (esperado) del material testigo es insignificante, α=β = 0,05 y el valor estimado tiene una distribución normal con una varianza constante conocida. Un criterio de aceptación adecuado es LC < LOD < LMP. En general también se sugiere, para un LMP > 0,1 ppm un LOD < 1/10 LMP y para un LMP <0,1 ppm un LOD < 1/5 LMP.

Límite de cuantificación (LOQ): Una característica del funcionamiento del método que suele expresarse como señal del valor (verdadero) de la medición que producirá estimaciones con una desviación estándar relativa (RSD) generalmente de 10 % (o 6 %). El LOQ se calcula mediante la siguiente fórmula:

LOQ = 10 So


Se recomienda para su cálculo a lo menos seis mediciones de blanco matriz , testigo reactivo o concentración estimada cercana al blanco.

En este caso, el LOQ es exactamente 3,04 veces el límite de detección, dada la normalidad y α= β = 0,05. En el LOQ es posible lograr una identificación positiva con un nivel de confianza razonable. Un criterio de aceptación adecuado es LC < LOD<< LOQ <LMP. En general también se sugiere, para un LMP > 0,1 ppm un LOQ < 1/5 LMP y para un LMP <0,1 ppm un LOQ < 2/5 LMP. Ejemplo ejercicio de límites: Para el analito mercurio en marisco fresco el limite máximo permisible es 0,5 mg/Kg. Se realiza la experiencia de medir 10 veces el blanco matriz:

Medición Resultado

mg/Kg

1 0,05

2 0,05

3 0,03

4 0,04

5 0,05

6 0,03

7 0,01

8 0,05

9 0,05

10 0,04

La desviación estándar obtenida para los blancos: So = 0,013 Por lo cual el LC seria: LC = 1,645 x 0,013 = 0,022 mg/Kg Por lo cual el LOD seria: LOD = 3,29 x 0,013 = 0,044 mg/Kg Se puede observar que se cumple que el LC es inferior al LOD, ya que 0,022 < 0,044. El LMP establecido por el analito es de 0,5 ppm es decir es > 0,1 ppm, por lo cual el LOD debe ser < 1/10 del LMP, es decir, debe ser inferior o igual a una décima parte de 0,5.

(0,5 mg/L/10) = 0,05 mg/Kg

0,044 mg/L es inferior a 0,05 mgKgL , por lo cual se estaría aceptando el LOD calculado de acuerdo al criterio de aceptación establecido. Si el LOQ seria: LOD = 10 x 0,013 = 0,13 mg/Kg


Para un LMP de 0,5 ppm un LOQ < 1/5 LMP , es decir , se debe determinar el (LMP/5) , que es : 0,5/5 de 0,1 mg/Kg. Por lo cual no se estaría cumpliendo el criterio pues 0,13mg/Kg es mayor 0,1 mg/Kg. El LOQ no sería aceptable para el campo de aplicabilidad que le quiere dar al método. En este sentido se pude tomar la decisión de buscar otro método que cumpla con estos requisitos para este fin previsto o aceptar su aplicabilidad, considerando en la declaración de la aplicabilidad estas reservas u observaciones en cuanto a su LOQ. Es importante realizar posteriormente la experiencia analítica de la determinación del analito en el nivel de concentración determinado para el LOD o LOQ, es decir evidenciar resultados experimentales, que demuestren la validez del resultado obtenido.


EXACTITUD

El manual del Codex Alimentarius define la exactitud como el grado de concordancia entre el resultado de un ensayo y el valor de referencia. El término “exactitud”, esta aplicado a un conjunto de resultados de un ensayo, y supone una combinación de componentes aleatorios y un componente común de error sistemático o sesgo. Cuando se aplica a un método de ensayo, el término “exactitud” se refiere a una combinación de veracidad y precisión. En el siguiente esquema de “Tiro al Blanco”, ampliamente utilizado para ejemplificar esto, los punto u orificios equivaldrían a los resultados analíticos y el circulo rojo al centro el rango en el cual se espera este el valor de referencia (o verdadero).

Como se puede observar entre más veraz y preciso sea un resultado analítico, es más exacto.


VERACIDAD: Determina el grado de coincidencia existente entre el valor medio obtenido de una serie de resultados y un valor de referencia aceptado.

La veracidad puede ser determinada por sesgo o recuperación. a) Sesgo (s): La diferencia entre la expectativa relativa a los resultados de un ensayo o una medición y el valor verdadero. En la práctica el valor convencional de cantidad puede sustituir el valor verdadero. El sesgo es el error sistemático total en contraposición al error aleatorio. Para determinar el sesgo puede utilizarse material de referencia, material fortificado, material control, material ensayo de aptitud: Para este fin, se debe medir un analito de concentración conocido y se determina la diferencia en valor absoluto entre el valor conocido y la media del valor obtenido. Una diferencia sistemática importante en relación al valor de referencia aceptado se refleja en un mayor valor del sesgo, cuanto más pequeño es el sesgo, mayor veracidad indica el método.

s= X -Xa Donde: s= sesgo X = lectura obtenida o valor promedio de las lecturas obtenidas. Xa = valor asignado, valor certificado del material de referencia o valor esperado. Para evaluar el sesgo, se debe realizar la prueba t, en la cual el tobs < t crit:

t calc = [ Xa –X] S x √n

Donde : t calc= t observado o calculado Xa = Valor esperado o valor certificado en concentración X= Promedio de valores leídos u observados en concentración S= Desviación estándar n= Número de lecturas o valores observados. Buscar t- Student teórico en tabla ( Anexo II) para grados de libertad (v) y el porcentaje de seguridad

deseado ( 1-α) para un error α. Usualmente se trabaja con un valor de 0,05.


Ejemplo ejercicio de sesgo: Para un valor asignado de un material de referencia certificado de 20,1 mg/L de N-NO2, los valores obtenidos son:

Lectura

Resultado mg/L

(X-Xa) Sesgo

s

1 20,4 20,4-20,1 0,3

2 20,8 20,8-20,1 0,7

3 20,6 20,6-20,1 0,5

4 20,0 20,0-20,1 -0,1

5 20,4 20,4-20,1 0,3

6 20,6 20,6-20,1 0,5

7 20,5 20,5-20,1 0,4

8 19,9 19,9-20,1 -0,2

9 20,3 20,3-20,1 0,2

10 20,3 20,3-20,1 0,2

Desviación estándar S = 0,27 Promedio de las lecturas X= 20,38

Valor asignado a la muestra Xa= 20,1 Número de lecturas n= 10 √n = √10 = 3,162

t calc = [ Xa –X] = [20,1-20,38] = 0,32

0,27 x √10 Se desea establecer si existe una diferencia significativa entre el valor obtenido de la experiencia analítica y el valor de referencia. Entonces, para determinar el t teórico o critico para grados de libertad

de n-1 ( es decir de 10-1=9) , un valor α =0,05 y 2 colas, se extrae de tabla el t critico que es de 2,262,

cumpliéndose que tcalc < t crit , ya que 0,32 < 2,262. Es decir; no hay diferencias significativas.

2 colas 80% 90% 95%

αααα/2 v

0.10 0.05 0.025

1 3.078 6.314 12.706

2 1.886 2.920 4.303

3 1.638 2.353 3.182

4 1.533 2.132 2.776

5 1.476 2.015 2.571

6 1.440 1.943 2.447

7 1.415 1.895 2.365

8 1.397 1.860 2.306

9 1.383 1.833 2.262

10 1.372 1.812 2.228

“A través del ejercicio se puede observar que para la medición de Nitritos en agua el sesgo obtenido para el método utilizado es aceptable, y por lo tanto su veracidad es aceptable”.


b) Recuperación (R): Es la fracción de la sustancia agregada a la muestra (muestra fortificada) antes del análisis, al ser analizadas muestras fortificadas y sin fortificar. La recuperación permite ver el rendimiento de un método analítico en cuanto al proceso de extracción y la cantidad del analito existente en la muestra original. Por lo cual, la recuperación esta intrínsecamente relacionada a las características de la matriz de la muestra. Se recomienda realizar a lo menos 6 mediciones de cada uno en lo posible en tres niveles. Se debe considerar al elegir estos niveles el rango de la curva de calibración del método, el LOD y el LMP establecido. De manera que los niveles seleccionados permitan entregar la mejor información posible respecto a la capacidad de recuperación del método, en cuanto a estos valores criticos. Se calcula de la siguiente manera:

R = Ce –Co Ca

Siendo: R= Recuperación Ce = es la concentración de analito de la muestra enriquecida. C0 = es la concentración de analito medida en la muestra sin adicionar. Ca = es la concentración de analito adicionado a la muestra enriquecida. Se puede igualmente expresar en porcentaje de recuperación (%R): se calcula de la siguiente manera:

%R = [ R ] x 100 En caso de evaluar la recuperación, se deberá realizar prueba t , en la cual el tcalc<t crit:

t calc = [ 100 – %R]

S x √n Donde : t calc= t observado o calculado R= Recuperación S= Desviación estándar de las lecturas del porcentaje de recuperación n= Nº de lecturas o valores observados Buscar t-Student teórico en tabla ( Anexo II) para grados de libertad (v) y el porcentaje de seguridad

deseado ( 1-α) para un error α de 0,05, es decir con un 95% de confianza. Si el tcalc> tcrit (hay diferencia estadísticamente significativa), los resultados reportados deberán ser corregidos.


Si el tcalc ≤ tcrit (no hay diferencia estadísticamente significativa), no es necesario ninguna corrección. El Criterio de aceptación en base al valor obtenido para el porcentaje de recuperación puede utilizarse los criterios de AOAC. En caso de utilizar criterio de AOAC ( Ver Anexo III), se debe buscar en tabla de acuerdo a la concentración esperada del analito y si el % R obtenido de la experiencia analítica, se encuentra dentro del rango de %R teóricos esperados.

En caso que se cuente con un MRC utilizar el rango de aceptabilidad señalado en el certificado como criterio de aceptabilidad. Es decir, el valor determinado analíticamente deberá encontrase dentro del rango de tolerancia establecido a través de certificado, es decir, del limite superior (LS) o limite inferior (LI).

Cabe señalar que el Codex Alimentarius señala que existen directrices relativas a los intervalos previstos de recuperación en áreas específicas de análisis, como por ejemplo: Residuos de plaguicidas (RP) o residuos de medicamentos veterinarios (RMV). En casos en los que se haya demostrado que la recuperación es una función de la matriz, podrán aplicarse otros requisitos especificados.

Ejemplo de Ejercicio de Recuperación: Se utilizo fortificó una muestra de carne de marisco a una concentración 15 mg/100g de Cadmio y se analizo por fotometría de absorción atómica.

Lectura Co Ca Ce R %R

1 0,1 15,0 15,0 0,993 99,3

2 0,0 15,0 14,0 0,933 93,3

3 0,1 15,0 13,0 0,860 86,0

4 0,1 15,0 16,0 1,060 106,0

5 0,0 15,0 14,0 0,933 93,3

6 0,2 15,0 13,0 0,853 85,3

El promedio obtenido del porcentaje de recuperación es de : %R = 93,9 i) De acuerdo a tabla de AOAC al nivel de 10 ppm el valor aceptable es de 80 a 110 %R por lo cual el valor obtenido en la experiencia seria aceptable para el nivel medido en la matriz analizada. ii) En caso de utilizar como criterio de aceptabilidad la prueba t, entonces, la determinación del valor de t calculado, sería: Desviación estándar del % R, S%R = 7,90

Mediciones, n=6

t calc = [ 100 – 93,9] =0,315

7,90 x√6


Se desea determinar si existe diferencia significativa entre el valor de % recuperación determinado y el

10% de Recuperación. Para determinar el t critico para grados de libertad de ν= n-1 ( es decir de 6-

1=5), 2 colas y un valor α =0,05 , se extrae de tabla t-student:

2 colas 80% 90% 95%

αααα/2 v

0.10 0.05 0.025

1 3.078 6.314 12.706

2 1.886 2.920 4.303

3 1.638 2.353 3.182

4 1.533 2.132 2.776

5 1.476 2.015 2.571

6 1.440 1.943 2.447

El t teórico o critico es de 2,015, cumpliéndose que tcalc < t crit , ya que 0,315 < 2,571. Es decir no existen diferencias significativas.

PRECISION: La precisión podrá establecerse en términos de repetibilidad y reproducibilidad. El grado de precisión se expresa habitualmente en términos de imprecisión y se calcula como desviación estándar de los resultados (Referencia: Manual Codex Alimentarius 18º Ed.).

a) Repetibilidad: Es la precisión bajo las condiciones de repetibilidad, es decir, condiciones donde

los resultados de análisis independientes se obtienen con el mismo método en ítems de análisis idénticos en el mismo laboratorio por el mismo operador utilizando el mismo equipamiento dentro de intervalos cortos de tiempo. Se puede determinar registrando a lo menos 6 mediciones bajo las mismas condiciones (mismo operador, mismo aparato, mismo laboratorio y en corto intervalo de tiempo) de un analito en un Material de Referencia. Calcular la Desviación Estándar (Sr) y el porcentaje de coeficiente de variación (CVr%).

b) Reproducibilidad: Es la precisión bajo las condiciones de reproducibilidad, es decir, condiciones

donde los resultados de los análisis se obtienen con el mismo método en ítem idénticos de análisis en condiciones diferentes ya sea de laboratorio, diferentes operadores, usando distintos equipos, entre otros.

Para determinar la precisión de la reproducibilidad intralaboratorio (Ri) ( es decir, la precisión dentro de un laboratorio), se sugiere realizar 3 mediciones de un Material de Referencia (MRC o material control) una vez por cada semana o el comportamiento de la curva de calibración en 3 días distintos. También, se puede determinar registrando a lo menos 10 mediciones en días distintos, o en un mismo día cambiando a lo menos una condición analítica (ejemplo: operador, aparato, reactivos y largo intervalo de tiempo) de un analito en un Material de Referencia. Calcular la desviación estándar (SRi)y el porcentaje de coeficiente de variación (CVRi%).


Cuando se desea determinar la reproducibilidad interlaboratorios para fines de validación de un método, deben participar diferentes laboratorios, se debe tener en consideración que estos utilicen el mismo método y misma muestra, en un intervalo de tiempo preferentemente establecido, se determina de este modo la desviación estándar de los resultados obtenidos por los diferentes laboratorios (SR).

El criterio de aceptabilidad para la precisión se puede hacer en base a coeficiente de variación de Horwitz :

CVh% = 2 (1-0.5)log C ó también se expresa como; CVh%= 0,02 x c 0.8495 Donde: C= valor nominal del analito expresado en potencia de 10, ejemplo 1ppm = 1mg/L =10-6 En este sentido se establece para la repetibilidad, el CVr% obtenido debe ser < (CVh%/2). En el caso de la reproducibilidad interlaboratorio el CVR% <CVh%, para la reproducibilidad interna (intralaboratorio) CVRi% < (2CVh%/3).

El Codex menciona que para coeficientes de concentración < 10-7

, se aplica la teoría de Horwitz-Thompson, esto es, CV

T = 22%.

En cuanto a la repetibilidad podríamos señalar el siguiente ejemplo: Se realizó la medición simultánea (mismo día) de 10 sub-muestras para el analito (organofosforados) de un material de referencia de tomate de 1,2 mg/Kg, obteniéndose los siguientes resultados:

Lectura C obtenida

mg/kg

1 1,08

2 1,07 3 0,84

4 0,83

5 0,94

6 0,87

7 1,02

8 1,06

9 0,95

10 0,88

Promedio obtenido X= 0,95 mg/Kg La desviación estándar obtenida es de Sr = 0,099 mg/Kg El coeficiente de variación porcentual obtenido es CV% =10,41%


Si el valor asignado es de 1 mg/Kg , para el calculo de Coeficiente de variación porcentual de horwitz , el valor nominal del analito es equivalente a 0,00000120, es decir a 1,2 x 10-6. y el CV%hr para repetibilidad es la mitad del valor calculado del CV%h .

CVh% = 2 (1-0.5)log 0,0000012 = 7,78% 2

De acuerdo a Horwitz el CV% para repetibilidad es de 7,78%. Por lo cual se cumple el criterio de aceptabilidad establecido. En caso que se desee se puede realizar el estudio de reproducibilidad y repetibilidad, a través de un análisis de varianza (ver anexo Nº III). El estudio ANOVA (de factores totalmente anidados y homogéneos) consiste en el análisis simple de varianza de las desviaciones estándar para cada uno de los niveles de ensayo, para su determinación se podrá utilizar si se dispone de un software estadístico o una planilla Excel. Ejemplo de estudio de reproducibilidad: Se realizó el análisis de varianza a 10 muestras de sulfatos en aguas 1 mg/L en un total de 10 experiencias.

Lectura Fecha C obtenida mg/L

1 día 1 1,08

2 día 1 1,07

3 día 2 1,00

4 día 3 1,10

5 día 4 0,99

6 día 5 1,00

7 día 6 1,02

8 día 8 1,05

9 día 8 1,06

10 día 8 1,09

Promedio obtenido X= 0,95 mg/Kg La desviación estándar obtenida es de SRi = 0,041 mg/Kg El coeficiente de variación porcentual obtenido es CVRi% =3,88% El coeficiente de variación porcentual de Horwitz es:

CVhRi% = 2 x 2 (1-0.5)log 0,0000010 = 10,67%

3 De acuerdo a Horwitz el CV% para reproducibilidad es de 10,67%. Por lo cual se cumple el criterio de

aceptabilidad establecido, ya que . CVRi% < CVhRi%


ROBUSTEZ

La robustez es una medida de la capacidad de un procedimiento analítico de no ser afectado por variaciones pequeñas pero deliberadas de los parámetros del método; proporciona una indicación de la fiabilidad del procedimiento en un uso normal. En este sentido el objetivo de la prueba de robustez es optimizar el método analítico desarrollado o implementado por el laboratorio, y describir bajo que condiciones analíticas ( incluidas sus tolerancias), se pueden obtener a través de este resultados confiables. Un método de ensayo es más robusto entre menos se vean afectados sus resultados frente a una modificación de las condiciones analíticas. Entre las condiciones analíticas que podrían afectar a un método se encuentran:

• Analistas

• Equipos

• Reactivos

• pH • temperatura.

• Tiempo de reacción.

• Estabilidad de la muestra.

• Otros. Para esta determinación se aplica el Test de Youden y Steiner para la evaluación de la robustez de un método químico analítico. Este procedimiento permite evaluar el efecto de siete variables con sólo ocho análisis de una muestra. Para proceder a realizar el estudio de robustez se deben identificar aquellos factores del método que posiblemente afectarían los resultados finales obtenidos a través de este.

Estas factores están presentes habitualmente en el método (ejemplo: temperatura, composición de fase móvil o soluciones reactivas, pH de solución, tamaño de celda espectrofotométrica, flujo gas carrier, split, etc.). Para estudiar la robustez se procede a exponer a cada factor a un estudio de variable, es decir se expone a una variación respecto de la establecida en el método, es decir, cada variable se estudia mediante un valor alto (A, B,...,G) y otro bajo (a,b,...,g). Una vez establecidos estos valores se diseñan ocho pruebas de ensayo como, por ejemplo, muestra la tabla Nº 3.

Los factores a estudiar no deben ser necesariamente siete; puede considerarse un número menor de variables. Esto no afectará el balance del diseño del experimento, pero es importante considerar que siempre se den llevar a cabo los ocho pruebas de ensayo indicado.

Los resultados de la experiencia analítica obtenidos con las variaciones realizadas en estas 8 pruebas se representan con las letras s hasta la z.


A partir de los resultados puede calcularse el efecto de cada una de las variables haciendo la media de los cuatro análisis que contienen la variable en su valor más alto (mayúscula) y aquellas que corresponden al valor más bajo (minúscula). Así, para evaluar el efecto de la primera variable obsérvese que:

(s + t +u +v) = 4A = A y (w + x + y +z) = 4a = a

4 4 4 4

Es decir, la media de los resultados (s + t + u + v) equivalen a “A” porque las seis restantes variables presentes en estos cuatro resultados se anulan entre sí como consecuencia de que existen siempre dos mayúsculas y dos minúsculas de cada variable. Análogamente, la media de los resultados (w + x + y + z) equivalen a “a”. Para cualquier otra variable se puede proceder de manera similar, tal como muestra la tabla siguiente: Tabla Nº 3: Prueba de Robustez de Younden y Steiner

Se deben establecer las siete comparaciones posibles, es decir las diferencias entre la variable de mayor valor versus la de menor valor:

(A – a), (B – b), (C – c), (D – d), (E – e), (F – f) y (G – g) De este modo se puede conocer el efecto de cada variable. En este sentido, cuanto mayor sea la

diferencia de los resultados entre el valor mayor y el valor menor (∆ = X-x), mayor influencia tendrá dicha variable en el método analítico. Como criterio de aceptación para la robustez del método se considera que la diferencia entre el valor alto y el valor bajo sea superior a √2 de la desviación estándar de la precisión del método (S), es decir:

( X-x ) < √2 S.

ANALISIS Valor de la condición variable

1 2 3 4 5 6 7 8

A,a A A A A a a a a

B,b B B B b B b b b

C,c C c C c C c C c

D.d D D d d d d D D

E,e E e E e e E e E

F,f F f f F F f f F

G,g G g g G g G G g

RESULTADOS s t u v w x y z


Una información adicional de este test de Youden es que la desviación estándar de los resultados s a z constituye una medida excelente de la imprecisión previsible del método cuando se utiliza para el análisis de rutina, ya que este procedimiento introduce deliberadamente el tipo de variación en las variables que puede esperarse que ocurra durante el empleo normal del método.

Ejemplo: Robustez para turbiedad.

CONDICIÓN VARIABLE ANALISIS

Tipo Clave Valor Alto X

Valor Bajo x 1 2 3 4 5 6 7 8

Temperatura, ºC A,a 22 15 22 22 22 22 15 15 15 15

Cubeta, tipo B,b 1 2 1 1 2 2 1 1 2 2

Tiempo Agitación, seg C,c 60 30 60 30 60 30 60 30 60 30

Tiempo Lectura, seg D,d 30 0 30 30 0 0 0 0 30 30

Siliconado E,e si no si no si no no si no si

Volumen, mL F,f 30 25 30 25 25 30 30 25 25 30

Estabilización equipo, h G,g 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0

s t u v w x y z

RESULTADOS (NTU) 20,1 20,7 22,0 21,3 22,3 22,2 20,6 21,1

Para las variables A y a : Donde el promedio de A se calcula: 20,1 + 20,7 + 22,0 + 21,3 = 21,0 4 Donde el promedio de a se calcula: 22,3 + 22,2 + 20,6 + 21,1 = 21,6 4

Para las variables B y b : Donde el promedio de B se calcula: 20,1 + 20,7 + 22,3 + 22,2 = 21,3 4

Donde el promedio de b se calcula: 22,0 + 21,3 + 20,6 + 21,1 = 21,3 4

Condición Variable Resultados Diferencia Comparación

Valor Alto X Valor Bajo x Promedio X Promedio x ∆(X-x) ∆ < √2 DS

A a 21,0 21,6 0,525 No Sensible a Variable

B b 21,3 21,3 0,075 No Sensible a Variable

C c 21,3 21,3 0,075 No Sensible a Variable

D d 20,6 22,0 1,325 Sensible a Variable

E e 21,4 21,2 0,125 No Sensible a Variable

F f 21,2 21,4 0,175 No Sensible a Variable

G g 21,1 21,5 0,475 No Sensible a Variable


S: 0,813 √2 S: 1,150 Por lo tanto las variables sensibles, no deberán modificarse las variables que se establecieron como sensibles en el estudio de robustez, y se deberá mantener el valor nominal establecido en el método, para dicha condición.


APLICABILIDAD Se utiliza el término de Aplicabilidad, cuando un método de análisis puede utilizarse satisfactoriamente para los analitos, matrices y concentraciones previstas. La declaración de aplicabilidad (o ámbito de aplicación), además de una declaración del margen de funcionamiento satisfactorio para cada factor, puede incluir también advertencias acerca de la interferencia conocida de otros analitos, o de la inaplicabilidad a determinadas matrices y situaciones. Es decir, la aplicabilidad consiste en una declaración de las especificaciones del rendimiento del método, que se entrega en el informe de validación y que normalmente incluye la siguiente información: • La identidad de la sustancia analizada, incluyendo en su caso, de especiación (por ejemplo, "el arsénico total",”metil-mercurio”). • El intervalo de concentraciones cubierto por la validación (por ejemplo, "0-50 ppm") • Una especificación de la gama de las matrices del material de prueba cubierto por la validación (por ejemplo,"marisco", “productos lácteos”, etc.). • La aplicación prevista y de sus requisitos de incertidumbre críticos. (ejemplo: análisis de residuos de plaguicidas en frutas cítricas de acuerdo al reglamento sanitario de alimentos). En este sentido, la prueba de aplicabilidad, consiste en el ámbito de aplicación del método declarado por el responsable de la validación, una vez concluida esta. En aquellos casos que se trate de un método normalizado u oficializado, esta declaración se realiza de acuerdo a los antecedentes bibliográficos o normativos del método.


V: INCERTIDUMBRE La incertidumbre de una medición es el parámetro asociado al resultado, es decir, caracteriza la dispersión de los valores que razonablemente pueden ser atribuidos al mesurando. En este sentido, es importante que para un método validado o verificado por el laboratorio, se realice la determinación de las diferentes fuentes o componentes de la incertidumbre de la medición presentes: a) Muestreo b) Efectos de la muestra: tipo de matriz, almacenamiento, etc. c) Sesgos Instrumentales: Las debidas a las características de los equipos utilizados para realizar las medidas tales como: deriva, resolución, magnitudes de influencia. Ejemplo: temperatura d) Pureza de Reactivos: materiales de referencia, preparación de estándares. e) Analista: Las debidas a la serie de mediciones: variaciones en observaciones repetidas bajo condiciones aparentemente iguales. Ejemplo: paralelaje f) Condiciones de medición: Las debidas al certificado de calibración: en él se establecen las correcciones y las incertidumbres asociadas a ellas, para un valor de k determinado, en las condiciones de calibración. Ejemplo: material volumétrico, etc. g) Condiciones de medición: temperatura, humedad, etc. h) Otras: Método (por ejemplo al interpolar en una recta), tablas (por ejemplo las constantes), pesada, alícuota, efectos computacionales, etc. Generalmente para el análisis de las fuentes de incertidumbre se utiliza el diagrama de espina de pescado u otro tipo de diseño esquemático que permita con facilidad identificar las fuentes de incertidumbre presentes durante el proceso analítico. Ejemplo:


La incertidumbre de la medición comprende, en general, muchos componentes. Algunos de estos pueden ser evaluados por tipo.

Para este fin el laboratorio deberá realizar una evaluación de las incertidumbres tipo A y B que están presentes en el método: Evaluación de incertidumbre tipo A: Evaluación de un componente por un análisis estadístico de los valores de mediciones obtenidos en condiciones de medición definidas. Ejemplo: realizar varias mediciones en condiciones de repetibilidad. Evaluación de incertidumbre tipo B: Evaluación de un componente incertidumbre de la medición realizada por otros medios distinto a los del tipo A. Ejemplos: La evaluación basada en la información, obtenidos a partir de un certificado de calibración, obtenidos a partir de los límites deducirse a través de personal la experiencia, etc. En general, la incertidumbre esta dada por los errores sistemáticos y aleatorios presentes en el ensayo analítico.

Fuente: National Food Administration of Sweden.


La determinación de la incertidumbre incluye generalmente 4 pasos, el primero como se ha dicho anteriormente corresponde a la determinación de las fuentes, el segundo en expresar los componentes en una incertidumbre estándar , el tercero combinar las diferentes incertidumbres y el cuarto paso es la determinación de la incertidumbre expandida es decir, multiplicar la incertidumbre combinada por un factor de cobertura de k = 2, a fin de entregar un 95% de confianza, y así establecer el intervalo entorno al resultado de la medición en el cual se puede esperar que se incluya la mayor fracción de la distribución de los valores que se pueden atribuir razonablemente al mesurando.

Los resultados obtenido se expresaran como por ejemplo: 178 µg/L + 14 µg/L , que corresponde a 178

µg/L + ( 2x7 µg/L), es decir, el resultado entregado, corresponde a un intervalo de “a ± 2u” que representa un nivel de confianza del 95 % dentro del cual se encontraría el valor real. En algunos casos pueden existir mayores exigencias en cuanto al valor del factor de cobertura utilizado para obtener la incertidumbre expandida, pudiéndose solicitar o requerir un k = 3, a fin de entregar un 99,7 % de confianza, esto generalmente se puede solicitar frente a determinados contaminantes o residuos.

La determinación de la incertidumbre realizada por el laboratorio debe estar debidamente documentada. Para demostrar que un método analítico es adecuado para el fin previsto, el laboratorio deberá demostrar a través de una evidencia objetiva que el método analítico ha sido adecuadamente validado o verificado. En este sentido, el laboratorio debe demostrar que las características de desempeño del método analítico utilizado, son adecuadas para el uso destinado:


Fuente: National Food Administration of Sweden.


VI: ANEXOS ANEXO Nº 1: FORMATO TIPO DE PLAN DE VALIDACION

PLAN DE VALIDACION

Nº:_____

1) Alcance de la validación: Método: Analito: Matrices: Requerimientos del método:

Tipo: Validación retrospectiva � Validación prospectiva � Verificación � Procedimiento de validación: 2) Diseño experimental:

[Señalar Matrices de las muestras:, Testigos reactivos, Blanco matriz, Material de referencia y/o Material de referencia certificado, Muestras fortificadas y niveles de fortificación. Indicar las prueba(s) y parámetro(s) de validación a evaluar, número de análisis requeridos según prueba(s) y criterios de aceptabilidad para cada parámetro de validación Señalar analista(s) responsable de realizar la(s) prueba(s) analítica(s) y Fecha(s)

programadas]

página x de y :


3) Materiales, insumos y equipos necesarios para desarrollar la validación:

Plan de validación elaborado por Firma Fecha Elaboración

Nombre: Cargo:

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Comentarios, observaciones o modificaciones al plan:

Fecha Firma

Página x de y


ANEXO Nº 2: FORMATO TIPO DE INFORME DE VALIDACION

INFORME DE VALIDACION DE MÉTODO DE ENSAYO Nº Validación:__________

IDENTIFICACIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO VALIDADO

Nombre completo del método:

Tipo Método: Cualitativo Cuantitativo Normalizado Normalizado modificado No Normalizado Nuevo

Analito: Unidades: Matriz (o matrices):

Responsable Validación: Firma: Fecha:

IDENTIFICACIÓN DE MATERIALES, INSUMO O EQUIPOS EMPLEADOS

Equipos involucrados: (Nombre, marca, modelo, número de identificación, tipo de columnas, tipo de detectores, etc.)

Soluciones estándares y/o patrones involucrados: (Nombre, marca, modelo, número de identificación,

concentraciones, etc.)

Material de Referencia: (Nombre, marca, código de identificación, valores asignadas, unidades, etc.)

Material de Referencia Certificado: (Nombre, marca, Cód. identificación, Nº certificado, valores asignadas, unidades,

trazabilidad , etc.)

página x de y


PARÁMETROS DE VALIDACIÓN

Pruebas realizadas: Selectividad Linealidad Sensibilidad Límites Exactitud: Veracidad Precisión Robustez Otros:

RESULTADOS DE LAS PRUEBAS EXPERIMENTALES REALIZADAS

Linealidad

Descripción : (Breve descripción de la experiencia analítica).

Tipo de calibración: Calibración externa Calibración en matriz

Calibración externa estándar interno (SI) Calibración en matriz estándar interno (SI)

Ecuación recta: Intervalos de confianza : ICm máx.: min.: ICLo máx.: min.:

Valor obtenido Criterio de Aceptabilidad

Rango Lineal:

Coeficiente de Correlación (γγγγ):

Comentarios:

Sensibilidad

Descripción : (Breve descripción de la experiencia analítica).

Valor obtenido Criterio de Aceptabilidad

pendiente, m :

Concentración característica:

Comentarios:

página x de y


Limites:

Descripción (Breve descripción de la experiencia analítica).

Valor obtenido (unidades) Criterio de Aceptabilidad

Limite critico, LC:

Limite detección, LOD:

Limite de cuantificación, LOQ:

Comentarios:

SELECTIVIDAD



Longitud de onda (λmáx.)

Longitud de onda (λem)/ (λex)

Masa monitoreada

Transicion(es) monitoreda (s)

% Falsos positivos

% Falsos negativos

Interferencia(s) Conocida(s): Corrección(es) a Interferencias:

Comentarios:

EXACTITUD

Precisión


Precisión en condiciones de Repetibilidad

Nivel/concentración (unidades) SD r % CV r Criterio de Aceptabilidad

Comentarios:

página x de y


Precisión en Condiciones de Reproducibilidad

Nivel/concentración (unidades) SD Ri % CV Ri Criterio de Aceptabilidad

Comentarios:


Precisión del método %RSD

Horrat

Comentarios:

Veracidad



Lectura obtenida, X

Sesgo, s:

t-Student, t:

Comentarios:

Reproducibilidad

Nivel/concentración (unidades) R % R tobs Criterio(s) de Aceptabilidad

Comentarios:

página x de y


ROBUSTEZ


Variables

A,a B,b C,c D.d E,e F,f G,g

Resultados

s t u v w x y z S sz

(X-x) Valor obtenido (unidades) Criterio de Aceptabilidad

∆ A,a

∆B,b

∆C,c

∆D.d

∆E,e

∆F,f

∆G,g

APLICABILIDAD

(Declaración del campo de aplicación del método: analito, rango de trabajo, unidades, matrices y advertencias acerca de la interferencia

conocida en las cuales se ha demostrado la validación).

ANEXOS

(Anexar al presente informe los documentos necesarios para respaldar la información, los registros o reportes entregados por el equipo y copia

de la planillas de cálculos generadas en el proceso analítico):

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Revisado por: Validación: Firma Fecha

Nombre: Cargo:

Aceptada � Rechazada �

OBSERVACIONES

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

página x de y


ANEXO Nº 3: TABLA DE LA DISTRIBUCIÓN t-Student

2 colas

80% 90% 95% 98% 99%

αααα/2 v

0.10 0.05 0.025 0,01 0,0015

1 cola

90% 95% 97.5% 99% 99,5%

αααα v

0.10 0.05 0.025 0,01 0,0015

1 3.078 6.314 12.706 31.821 63.657

2 1.886 2.920 4.303 6.965 9.925

3 1.638 2.353 3.182 4.541 5.841

4 1.533 2.132 2.776 3.747 4.604

5 1.476 2.015 2.571 3.365 4.032

6 1.440 1.943 2.447 3.143 3.707

7 1.415 1.895 2.365 2.998 3.499

8 1.397 1.860 2.306 2.896 3.355

9 1.383 1.833 2.262 2.821 3.250

10 1.372 1.812 2.228 2.764 3.169

11 1.363 1.796 2.201 2.718 3.106

12 1.356 1.782 2.179 2.681 3.055

13 1.350 1.771 2.160 2.650 3.012

14 1.345 1.761 2.145 2.624 2.977

15 1.341 1.753 2.131 2.602 2.947

16 1.337 1.746 2.120 2.583 2.921

17 1.333 1.740 2.110 2.567 2.898

18 1.330 1.734 2.101 2.552 2.878

19 1.328 1.729 2.093 2.539 2.861

20 1.325 1.725 2.086 2.528 2.845

21 1.323 1.721 2.080 2.518 2.831

22 1.321 1.717 2.074 2.508 2.819

23 1.319 1.714 2.069 2.500 2.807

24 1.318 1.711 2.064 2.492 2.797

25 1.316 1.708 2.060 2.485 2.787

26 1.315 1.706 2.056 2.479 2.779

27 1.314 1.703 2.052 2.473 2.771

28 1.313 1.701 2.048 2.467 2.763

29 1.311 1.699 2.045 2.462 2.756

30 1.310 1.697 2.042 2.457 2.750

40 1.303 1.684 2.021 2.423 2.704

60 1.296 1.671 2.000 2.390 2.660

120 1.289 1.658 1.980 2.358 2.617

∞∞∞∞ 1.282 1.645 1.960 2.326 2.576


ANEXO Nº 4: TABLA F F DISTRIBUCIÓN (α= 0,05)

Grados de libertad del numerador F crítico 2 3 4 5 6 7 8 9 10 20

1 161.44622 199.49948 215.70668 224.58335 230.16037 233.98752 236.76694 238.88424 240.54316 241.88193

2 18.51276 19.00003 19.16419 19.24673 19.29629 19.32949 19.35314 19.37087 19.38474 19.39588

3 10.12796 9.55208 9.27662 9.11717 9.01343 8.94067 8.88673 8.84523 8.81232 8.78549

4 7.70865 6.94428 6.59139 6.38823 6.25607 6.16313 6.09421 6.04103 5.99880 5.96435

5 6.60788 5.78615 5.40945 5.19216 5.05034 4.95029 4.87586 4.81833 4.77246 4.73506

6 5.98737 5.14325 4.75706 4.53369 4.38737 4.28386 4.20667 4.14681 4.09901 4.05996

7 5.59146 4.73742 4.34683 4.12031 3.97152 3.86598 3.78705 3.72572 3.67667 3.63653

8 5.31764 4.45897 4.06618 3.83785 3.68750 3.58058 3.50046 3.43810 3.38812 3.34717

9 5.11736 4.25649 3.86254 3.63309 3.48166 3.37376 3.29274 3.22959 3.17890 3.13727

10 4.96459 4.10282 3.70827 3.47805 3.32584 3.21718 3.13547 3.07166 3.02038 2.97824

11 4.84434 3.98231 3.58743 3.35669 3.20388 3.09461 3.01233 2.94798 2.89622 2.85362

12 4.74722 3.88529 3.49030 3.25916 3.10587 2.99612 2.91335 2.84857 2.79638 2.75339

13 4.66719 3.80557 3.41053 3.17912 3.02543 2.91527 2.83210 2.76691 2.71436 2.67102

14 4.60011 3.73889 3.34389 3.11225 2.95825 2.84773 2.76420 2.69867 2.64579 2.60216

15 4.54307 3.68232 3.28738 3.05557 2.90130 2.79046 2.70663 2.64080 2.58763 2.54371

16 4.49400 3.63372 3.23887 3.00692 2.85241 2.74131 2.65720 2.59109 2.53767 2.49351

17 4.45132 3.59154 3.19677 2.96471 2.81000 2.69866 2.61430 2.54796 2.49429 2.44992

18 4.41386 3.55456 3.15991 2.92775 2.77285 2.66130 2.57672 2.51016 2.45628 2.41170

19 4.38075 3.52189 3.12735 2.89511 2.74006 2.62832 2.54354 2.47677 2.42270 2.37793

20 4.35125 3.49283 3.09839 2.86608 2.71089 2.59898 2.51401 2.44707 2.39282 2.34787

21 4.32479 3.46679 3.07247 2.84010 2.68478 2.57271 2.48758 2.42046 2.36605 2.32095

22 4.30094 3.44336 3.04912 2.81671 2.66127 2.54906 2.46377 2.39650 2.34193 2.29669

23 4.27934 3.42213 3.02800 2.79554 2.64 2.52766 2.44223 2.37481 2.32011 2.27472

24 4.25968 3.40283 3.00879 2.77629 2.62065 2.50819 2.42263 2.35508 2.30024 2.25474

25 4.24170 3.38520 2.99124 2.75871 2.60299 2.49041 2.40473 2.33706 2.28210 2.23648

26 4.22520 3.36901 2.97516 2.74260 2.58679 2.47411 2.38831 2.32053 2.26545 2.21972

27 4.21001 3.35413 2.96035 2.72777 2.57189 2.45911 2.37321 2.30531 2.25013 2.20430

28 4.19598 3.34039 2.94668 2.71407 2.55812 2.44526 2.35926 2.29127 2.23598 2.19004

29 4.18297 3.32766 2.93403 2.70140 2.54538 2.43244 2.34634 2.27825 2.22288 2.17685

Gra

do

s d

e li

be

rtad

de

l de

no

min

ado

r

30 4.17089 3.31583 2.92228 2.68963 2.53355 2.42052 2.33435 2.26616 2.21070 2.16458


ANEXO Nº 4: TABLA DE % DE RECUPERACION

ANALITO UNIDAD

RECUPERACIÓN ESTIMADO (%)

100 100%

98 – 102

10 10%

98 – 102

1 1%

97 - 103

0,1 0,10%

95 – 105

0,01 100 ppm

90 – 107

0,001 10 ppm

80 – 110

0,0001 1 ppm

80 – 110

0,00001 100 ppb

80 – 110

0,000001 10 ppb

60 – 115

0,0000001 1 ppb

40 – 120

Fuentes: Manual del Codex Alimentarius


ANEXO Nº 5: TABLA DE HORWITZ

CONCENTRACIÓN REPETIBILIDAD CV%r

REPRODUCIBILIDAD INTERNA CV%R

1 ppt

1 / 1012 1,00E-12 64,0 85,3

10 ppt

10 / 1012 1,00E-11 45,3 60,3

100 ppt

100 / 1012 1,00E-10 32,0 42,7

1 ppb

1 / 109 1,00E-09 22,6 30,2

10 ppb

10 / 109 1,00E-08 16,0 21,3

100 ppb

100 / 109 1,00E-07 11,3 15,1

1 ppm

1 / 106 1,00E-06 8,00 10,7

10 ppm

10 / 106 1,00E-05 5,66 7,54

100 ppm

100 / 106 1,00E-04 4,00 5,33

1000 ppm

1000 / 106 1,00E-03 2,83 3,77

1%

1 / 102 1,00E-02 2,00 2,67

10%

10 / 102 1,00E-01 1,41 1,89


ANEXO Nº 6: EJEMPLO DE ESQUEMA GENERAL PARA EL DESARROLLO DE UN PLAN DE VALIDACION DE UN MÉTODO NORMALIZADO

El siguiente es un esquema que muestra un ejemplo de cómo se desarrollo el plan de validación de un método y como se establecieron los correspondientes criterios de aceptabilidad.

Linealidad: Realizar 3 curvas de calibración con 4 estándares incluido el blanco, determinar el valor de coeficiente de correlación promedio de las 3 curvas. Criterio de aceptabilidad: r > 0,99

Limites: Realizar 10 ensayos de medición de una matriz de muestra en un nivel de concentración cercano al LOD esperado, determinar la desviación estándar de las concentraciones obtenidas (So) , calcular el valor de LOD como LOD= 3,29 x So . Criterio de aceptabilidad: para un LMP > 0,1 ppm un LOD < 1/10 LMP y para un LMP <0,1 ppm un LOD < 1/5 LMP.

Precisión: a) Repetibilidad: Realizar en un mismo día 10 ensayos de medición de una matriz de muestra en un nivel de concentración, en lo posible en el nivel medio de la curva, determinar el promedio de las concentraciones obtenidas (X) y la desviación estándar de las concentraciones obtenidas (Sr). Determinar el CVr%. Criterio de aceptabilidad: CVh = (2(1-0.5.log c))/2 , en el cual c es el valor de la concentración del analito expresado en potencia de 10 (Ver tabla Nº 1). b) Reproducibilidad: Realizar en un total de 10 días 10 ensayos de medición de una matriz de muestra en un nivel de concentración, en lo posible en el nivel medio de la curva, determinar el promedio de las concentraciones obtenidas (X) y la desviación estándar de las concentraciones obtenidas (SRi). Determinar el CVRi%. Criterio de aceptabilidad: CVRi = 2x(2(1-0.5.log c))/3, en el cual c es el valor de la concentración del analito expresado en potencia de 10 (Ver tabla Nº 1).

Veracidad: Dependiendo a las características del método y acceso a material de referencia determinar el sesgo o la recuperación. a) Sesgo: Determinar en un mismo día a lo menos 6 mediciones (n) de un material de referencia o material de referencia certificado, determinar el promedio (X) y desviación estándar (S)de las concentraciones obtenidas de las 6 mediciones, luego calcular el valor del sesgo del valor promedio (X)

respecto del valor asignado (Xa), como s= X -Xa, determinar el valor de t calculado para el sesgo, comparar con el t critico (5,95%) que es 2,571. Criterio de aceptabilidad: Si t calc < t crit , el sesgo es aceptable. b) Recuperación: Medir una matriz de muestra blanco, determinar el promedio de las concentraciones obtenidas para Co. Posteriormente realizar un fortificado en dicha matriz blanco en un nivel de concentración (Ca) cercano al LMP o punto medio de la curva de calibración. Tomar 6 sub-muestras del material fortificado y realizar el ensayo analítico, determinar el promedio de la concentración del analito en la muestra fortificada (Ce). Calcular el % de recuperación obtenido.

Criterio de aceptabilidad: Si el %R se encuentra dentro del rango de %R según AOAC para el nivel de fortificación realizado (Ca), es aceptable.

“DECLARACION DE LA APLICABILIDAD DEL MÉTODO: El método normalizado X es aplicable para el análisis del analito Y en la matriz(ces) Z en el rango de A a B unidades de concentración.”


VI: BIBLIOGRAFÍA

1. Aguirre L, et al. Validación de métodos analíticos, Asociación Española de Farmacéuticos de Industria, Barcelona, 2001, parte II

2. Diseño experimental del Estudio de Validación de Métodos Analíticos. Swedish National

Food Administration. Research & Development Department. Leonardo Merino.

3. Estudio de Validación de Métodos Analíticos (Una guía práctica para laboratorios Químicos). Swedish National Food Administration. 2007.

4. Estadística y Quimiometría para Química Analítica. James N. Miller, Jane C. Miller.

Pearson. 4a Edition. 2002.

5. Guide to Quality in Analytical Chemistry An Aid to Accreditation. CITAC/EURACHEM GUIDE. 2002.

6. Handbook for calculation of measurement uncertainty in environmental laboratories.

Edition 2. B. Magnusson et al. NT TECHN REPORT 537.

7. Manual de Procedimiento- Comisión del Codex Alimentarius- 19º Edición- OMS/FAO.

8. Lloyd A. Currie, “Nomenclature In Evaluation Of Analytical Methods Including Detection And

Quantification Capabilities”. IUPAC. Vol. 67, No. 10, pp. 1699-1723, 1995.

9. M. Thompson, S.L.R. Ellison and R. Wood. “Harmonized Guidelines For Single-

Laboratory Validation Of Methods Of Analysis” Pure Appl. Chem., 74, (5) 835 – 855 (2002).

10. Official Methods of Analysis of AOAC International. 18 th Edition, 2005. Appendix E:

Laboratory Quality Assurance.

11. Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. EURACHEM/CITAC Guide CG4. Second Edition. QUAM:2000.1.

12. Validación de Métodos de análisis químicos Procedimiento NMKL No. 4 (1996). Versión

Español 1 , febrero 1997

13. VAM Project 3.2.1 Development and harmonization of measurement Uncertainty Principles. Part (d): Protocol for uncertainty evaluation from validation data. January 2000. LGC/VAM/1998/088.


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Comité Editor: Boris Duffau, Fabiola Rojas, Isabel Guerrero, Luis Roa, Luis Rodríguez, Marcelo Soto, Marisol Aguilera, Soraya Sandoval.

Coordinación Edición: Soraya Sandoval

guia técnica 1 validación de métodos y determinación de la

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