validaciÓn de mÉtodos analÍticos

VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS.

Es un proceso donde se establece, por estudios de laboratorio, que el método satisface los requisitos para las aplicaciones analíticas deseadas, es decir, permite evaluar su confiabilidad.

En general se consideran 3 tipos de validación:

Validación prospectiva: Para métodos analíticos nuevos.

Validación retrospectiva: Para métodos repetidamente utilizados, no validados anteriormente y de los que se tiene documentación suficiente para probar la bondad del método.

Revalidación : Es volver a validar un método al cual se le han realizado cambios que puedan afectar la bondad del método. Cambios en la síntesis del principio activo de un medicamento. Cambios en la composición del producto terminado. Cambios en el procedimiento analítico.

VALIDACIÓN: Es verificar experimentalmente y

documentalmente que un método hace lo que tiene que hacer.

CALIFICACIÓN: Es verificar las cualidades o características inherentes a un equipo.

CALIBRACIÓN : Es una parte de la calificación.

FARMACOPEAS

Los métodos descritos en monografías de farmacopeas u otros textos oficiales se consideran validados. Hay que aclarar que se aplica solo a métodos generales y a materias primas.

En cuanto a producto terminado, habrá que hacer validación del método analítico, puesto que los excipientes serán diferentes para cada fabricante.

Material recopilado con propósito docente por Gustavo Rodríguez A. Q.F. Especialista en Toxicología Forense U.de A.

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VALIDACIÓN Y BUENAS PRACTICAS DE LABORATORIO.

Instalaciones adecuadas y suficientesPersonal capacitadoEquipos apropiados, calificados (calibrados).Procedimientos adecuados para la toma de muestras.Utilización de reactivos apropiados y soluciones valoradas.Utilización de material de laboratorio (vidrio) adecuado y cumpliendo con el procedimiento estandarizado de limpieza. (calibrado el material volumétrico).Utilización de patrones y muestras de referencia correctas.

Estándar primarioEstándar secundario

Garantía de calidad de los resultados obtenidos (elaboración de documentos).Higiene y seguridad en el laboratorio.

Los estudios de validación deben ser realizados por analistas con experiencia, de tal manera que se eviten errores debido a la falta de experiencia, precisamente porque el propósito del estudio es la evaluación de errores y posible sesgo del método en sí mismo, de ahí la importancia de minimizar la variación introducida por el analista

DOCUMENTACIONProcedimientos estandarizados de trabajo. PETSOP´s : Standard Operating Procedures

FASES EN EL DESARROLLO DE UN METODO ANALITICO.

Definir las características y requerimientos que debe satisfacer el método analítico.

De acuerdo al método a seguir Volumétrico GravimétricoPotenciométricoMicrobiológicoInstrumental

Tipo de instrumentaciónGrado de especificidadGrado de sensibilidadPrecisión necesariaTiempo por análisisCosto por análisis


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Estandarización del método analítico.Comprende desde los primeros estudios de tanteo con estándares hasta la utilización de método en muestras reales.Se debe establecer los parámetros de idoneidad que garanticen el buen funcionamiento del sistema en el momento del análisis.

Validación del método analítico.Identificación de los parámetros apropiados de validación.Diseño de experimentos para la elaboración del parámetro.Determinación del cumplimiento de cada parámetro en la validación.Traducción de los resultados en el procedimiento del método.

DATOS ELEMENTALES REQUERIDOS PARA LA VALIDACION DE UN ENSAYO. Los procedimientos de valoración varían, desde determinaciones analíticas de alta exactitud, hasta la evaluación subjetiva por atributos, considerando esta variedad de los ensayos, es mas que lógico decir que los diferentes métodos de prueba requieren diferentes esquemas de validación.Las categorías más comunes de ensayos, los cuales requieren validación, son los siguientes según USP 23:

CATEGORIA I: Métodos analíticos para la cuantificación de componentes mayoritarios de materias primas a granel o ingredientes activos (incluyendo preservativos) en productos farmacéuticos terminados.

CATEGORIA II: Métodos analíticos para la determinación de impurezas en materias primas a granel o compuestos de degradación en productos farmacéuticos terminados.Estos métodos incluyen valoraciones cuantitativas y pruebas limites.

CATEGORIA III: Métodos analíticos para la determinación decaracterísticas de desempeño (por ejemplo disolución).


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CATEGORIAPARAMETRO I II III

CUANTIFICACION

ENSAYO LIMITE

ESPECIFICIDAD SI SI SI *LINEALIDAD SI SI NO *RANGO SI SI * *PRECISION SI SI NO SIEXACTITUD SI SI * *LIM. DETECCION NO NO SI *LIMITE CUANTIFICACION

NO SI NO *

* PUEDE SER REQUERIDA, DEPENDIENDO DEL ENSAYO. En el suplemento 4 de la USP 23, desaparece de la tabla anterior el criterio para ROBUSTEZ.

CARACTERISTICAS DE LA VALIDACION DE UN METODO ANALITICO SEGÚN ICH.

TIPO DE PROCEDIMIENTO ANALITICO:1. PRUEBAS DE IDENTIFICACION2. PRUEBAS PARA LA DETERMINACION DE IMPUREZAS3. VALORACIONES TANTO DE POTENCIA Y CONTENIDO DE UN

PRINCIPIO ACTIVO, COMO DE ENSAYOS DE DISOLUCION.

TIPO DE PROCEDIMIENTO ANALITICOPARAMETRO 1 2 3

CUANTIFICACION

ENSAYO LIMITE

ESPECIFICIDAD SI SI SI SILINEALIDAD NO SI NO SIRANGO NO SI NO SIPRECISION NO SI * NO SI *EXACTITUD NO SI NO SILIM. DETECCION NO NO SI NOLIMITE CUANTIFICACION

NO SI NO NO

LA PRECISIÓN SERA DADA POR LA REPETIBILIDAD Y LA PRECISIÓN INTERMEDIA.

* CUANDO LA REPRODUCIBILIDAD HA SIDO DETERMINADA, LA PRECISIÓN INTERMEDIA NO SE REQUIERE.


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LA ROBUSTEZ DEBE SER CONSIDERADA EN LA ETAPA FINAL DEL DESARROLLO DEL METODO ANALITICO.

CARACTERISTICAS DE FUNCIONAMIENTO DE LOS METODOS ANALITICOS.

Las características de funcionamiento de un método analítico comprenden todos los datos y resultados experimentales que demuestran su aptitud para el uso al cual es destinado.

CARACTERISTICAS DE FIABILIDAD(CONFIABILIDAD)Son las que demuestran la capacidad de un método analítico para mantener los criterios fundamentales de la validación a lo largo del tiempo.Capacidad de un método para determinar el analito sin interferencia de impurezas, excipientes, productos de degradación u otras sustancias presentes en la muestra.Selectividad Especificidad

Proporcionalidad entre la concentración del analito y la respuesta del instrumento. Linealidad y rango Sensibilidad

Dispersión de una serie de resultados alrededor de un valor medio.Precisión Repetibilidad

ReproducibilidadPrecisión intermedia

Robustez Tolerancia

Diferencia entre el valor hallado en el análisis y el valor verdadero.Exactitud Porcentaje de recuperación

Cantidad mínima de analito requerida para obtener un resultado significativo.Sensibilidad Límite de detección Límite de cuantificación

PRACTICABILIDADSe evalúan en la fase del desarrollo del método analítico.Tiempo Costo Tamaño de la muestra Equipo

IDONEIDAD (SYSTEM SUITABILITY)Los parámetros de idoneidad no son de validación y se consideran dentro de las buenas practicas de laboratorio ( GLP ) analítico.


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Se aplica al conjunto de parámetros relacionados con la verificación del buen funcionamiento de los instrumentos analíticos.

Un sistema analítico es idóneo (adecuado) si responde, en el momento de su utilización, a los requisitos fijados en la validación del método.

Los instrumentos se califican. Los métodos se validan.System suitability (idoneidad) verifica el buen funcionamiento del sistema (instrumento y método) en el momento de su uso.

Este parámetro se refiere a la propiedad del método de producir una respuesta debida solo a la presencia del analito de interés, libre de interferencia de otros componentes que pueden ser excipientes de un fármaco, productos de degradación, subproductos o productos laterales de síntesis de un medicamento, metabolitos del mismo analito en fluidos biológicos.

Un aspecto importante de su aplicación, es el ámbito de utilización del método. Ciertos métodos, como los gravimétricos o volumétricos son adecuados únicamente para el análisis de macroconstituyentes de una muestra.

La mayor parte de los métodos instrumentales pueden determinar hasta trazas de sustancias.

La selección de un estándar interno adecuado es fundamental para los métodos que lo requieren, y se debe garantizar que el método sea especifico tanto para el estándar interno como para el analito problema.

La especificidad del método analítico puede determinarse de la siguiente forma:

Analizar el placebo (la formulación sin el principio activo, solo los excipientes).


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Analizar por triplicado placebo adicionado con los productos de degradación, sustancias relacionadas y sustancias de interés equivalente al 100%.

Analizar por triplicado muestras solas, solo el analito de interés.

Comparar los datos obtenidos de los análisis del placebo adicionado de la sustancia de interés y de sus sustancias relacionadas, con los obtenidos en los análisis de muestras solas.

La linealidad del método analítico se refiere a la proporcionalidad entre la concentración del analito y su respuesta, en un rango determinado.

El ensayo de linealidad puede efectuarse tanto sobre soluciones patrón del analito, como sobre muestras problema que contengan concentraciones crecientes de analito.

Realizar análisis mínimo por triplicado de soluciones con la sustancia de interés a diferentes concentraciones.El numero de soluciones puede estar comprendido entre 3 y 10, y los niveles de concentración se seleccionan de acuerdo con las cantidades esperadas de analito en la muestra.

Valoración de una materia prima.Analizar de 3 a 5 soluciones patrón a un intervalo de concentraciones comprendido entre 80 a 120 % del valor teórico.


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EL METODO SE CONSIDERA ESPECIFICO CUANDO :

AL ANALIZAR EL PLACEBO NO HAY RESPUESTA.

NO HAY NINGUNA VARIACION EN LOS RESULTADOS OBTENIDOS, AL ANALIZAR EL PLACEBO ADICIONADO Y LAS MUESTRAS SOLAS.

Para 5 niveles de concentración se podría ensayar 80, 90, 100, 110 y 120 % mínimo por triplicado.

Valoración de un principio activo en producto terminado.Analizar 5 a 7 soluciones estándar con niveles de concentración comprendidos entre el 50 al 150 % del valor teórico.Para 5 niveles de concentración se podría ensayar 50, 80, 100, 120 y 150 % mínimo por triplicado.

Si la concentración del analito puede variar ampliamente, como es el caso de ensayos de impurezas, productos de degradación, determinación de analito y de metabolitos en fluidos biológicos.Los patrones deberán abarcar todo el intervalo de concentraciones previsto.10 a 100 ppm para una impureza.10 a 200% de la concentración promedio del analito en fluidos biológicos.

Realizar para cada nivel de concentración el análisis mínimo por triplicado.

Registrar los resultados obtenidos.

Realizar los cálculos de regresión lineal por el método de los mínimos cuadrados, para saber si el gráfico obtenido es del tipo lineal.

ECUACION DE LA LINEA RECTA

Y = bX + a

Y: RESPUESTA ( VARIABLE DEPENDIENTE)X: CONCENTRACION O CANTIDAD DE ANALITO (VARIABLE

INDEPENDIENTE)b: PENDIENTEa: INTERCEPTO

XY - X Y b = ______________n______________ a = Y - b x X2 - ( X ) 2 n n XY - X Y


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r = ___________________________________n_____________________ X2 - ( X ) 2 Y2 - ( Y ) 2 n n

Valores muy elevados de r (coeficiente DE CORRELACIÓN) no deben tomarse erróneamente como indicadores de linealidad; la linealidad se demuestra estadísticamente por otros procesos que se describen a continuación:

El cuadrado del coeficiente de correlación se denomina COEFICIENTE DE DETERMINACION ( R2 ) e indica la proporción de la varianza total de Y que es explicada por el modelo lineal de regresión.La variable independiente explica En un % de la varianza total de Y.

Prueba t para el coeficiente de correlación. El valor t tabla de la DISTRIBUCION DE STUDENT para n – 2 grados de libertad, con p = 0.05 (intervalo de confianza del 95 % ).

t exp = | r | ( n – 2 ) ( 1 – r2 )

H0 : No existe correlación entre X y Y.

t experimental t tablaSe rechaza la hipótesis nula, lo cual indica que existe correlación significativa entre X y Y.

Prueba de linealidad de la pendiente b. COEFICIENTE DE REGRESION

S2y,x = _ Y 2 - a Y - b_ XY ( VARIANZA DEL

ERROR n – 2 EXPERIMENTAL TOTAL)

S2b = ______ S 2 y,x _________ _ ( VARIANZA DE LA

X2 - ( X ) 2 PENDIENTE) n

Sb = S2b


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Sb rel (%) = Sb x 100 b

Límites de confianza de la pendiente

b t tabla Sb

El valor t tabla de la DISTRIBUCION DE STUDENT para n – 2 grados de libertad, con p = 0.05 ( intervalo de confianza del 95 % ).

Prueba t para la pendiente.

El valor t tabla de la DISTRIBUCION DE STUDENT para n – 2 grados de libertad, con p = 0.05 ( intervalo de confianza del 95 % ).

H0 : b = 0

t experimental t tablaSe rechaza la hipótesis nula.Indica buena linealidad del método.

t experimental t tablaEste valor indica que la probabilidad de ser b 0 es muy elevada, superior al 95 %.

Si fuera b = 0 significaría que la recta es paralela al eje de las abscisas y no habría regresión.

SIGNIFICACION ESTADISTICA DE LA VARIANZA DE LA PENDIENTE (b)

A mayor pendiente: habrá mayor sensibilidad del método.A menor varianza de la pendiente: habrá mejor linealidad del método.

Prueba de linealidad del intercepto a. (Proporcionalidad)Indica el error sistemático del método, idealmente debe ser cero.Cuando la concentración del analito de interés sea cero, su respuesta deberá ser cero.

S2a = S2

b ( X ) 2


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Texp = │b│ Sb

n

Sa = S2a

Sa rel (%) = Sa x 100 a

Límites de confianza del interceptoa t tabla Sa El valor t tabla de la distribución de student para n – 2 grados de libertad, con p = 0.05 (intervalo de confianza del 95 %).Si estos limites cubren el cero, se cumple la condición de proporcionalidad.

Prueba t para el intercepto a.El valor t tabla de la distribución de student para n – 2 grados de libertad, con p = 0.05 (intervalo de confianza del 95 %).

t exp = │a│ Sa

H0 : a = 0

t experimental t tablaSe rechaza la hipótesis nula.Indica buena proporcionalidad del método.

t experimental t tablaEste valor indica que la probabilidad de ser a = 0 es muy elevada, superior al 95 %.

Representación gráfica de la recta de regresión.Realizar la gráfica con los datos obtenidos, que relaciona la respuesta (área, absorbancia, volumen) con la concentración o cantidad de analito. Además realizar el trazado de las hipérboles indicativas de los intervalos de confianza.


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TEST DE LINEALIDADCOEFICIENTE DE VARIACION DE LOS FACTORES DE RESPUESTA.El factor de respuesta es la relación entre la lectura (valor de la respuesta la concentración o cantidad de analito

F = RESPUESTA CONCENTRACION

En una calibración lineal los factores de respuesta deben ser semejantes entre sí y cercanos al valor de la pendiente. Por este motivo se puede tomar el coeficiente de variación de los factores de respuesta como una expresión de la linealidad.Se considera que coeficientes de variación superiores al 5 % indican falta de linealidad.

ANOVA DE LA REGRESION.ANALISIS DE VARIANZA DE LA REGRESION.

TABLA ANOVA PARA REGRESION


Fuente deVariación

Suma deCuadrados

Grados deLibertad

Cuadradomedio

f Valorp

Modelo de Regresión

SCR 1 CMR CMRCME

Residual(error)

SCE N - 2 CME

TOTAL SCT N -1

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SCT = Y i2 - ( Y i ) 2

n

SCT = b2 ( Xi – X )2

SCE = SCT - SCR

En muchos casos, es interesante comparar los resultados de la recta de regresión obtenida para el analito puro (estándar), con el correspondiente analito adicionado a la matriz. La no correspondencia de las rectas indica problemas por efecto de matriz y está relacionada con la exactitud del método. Estos efectos de matriz pueden clasificarse de acuerdo a su naturaleza en aditivos y multiplicativos. Los aditivos se refieren a un desplazamiento positivo del cero en presencia de la matriz y los multiplicativos a un cambio de la pendiente.

ANALISIS DE RESIDUALESLos residuos son la diferencia entre la respuesta medida en cada punto de la curva y la calculada a partir de la ecuación de regresión. El residuo indica el acercamiento al ajuste con los valores predichos, sus características ideales son:

Valor pequeño del residuo.Consistencia de magnitud del residuo.Ausencia de tendencias en su signo.


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El rango de un método analítico es el intervalo entre los niveles superior e inferior (incluyendo estos niveles) en los cuales se ha demostrado que son determinados con precisión, exactitud y linealidad, utilizando el método como se ha descrito.

Es el grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales cuando se aplica repetidamente a la misma muestra.

La idea de precisión, en general, viene expresada por la media para el valor central y la desviación estándar para la dispersión de los resultados.

Un estudio de precisión requiere la repetición del análisis sobre una muestra. La precisión así obtenida se denomina del método, puesto que incluye todo el procedimiento analítico, desde la


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preparación de la muestra hasta la lectura instrumental. También se puede determinar directamente la precisión del sistema instrumental, hallando la variabilidad de respuesta de una solución patrón.

La precisión es expresada matemáticamente por el coeficiente de variación (CV) o la desviación estándar relativa (RSD).

El valor aceptable de precisión de un método depende de la concentración del analito y del numero de repeticiones del análisis.

El valor de CV obtenido analizarlo en la siguiente tabla:CV máximo aceptable de un método analítico en función de los límites de aceptación del resultado y del número de replicas:

CRITERIO DE CV (%) MAXIMO ACEPTABLEACEPTACION n = 1 n = 2 n = 3 n = 4 n = 5

95 - 105 1.9 2.7 3.3 3.8 4.290 - 110 3.9 5.5 6.7 7.8 8.785 - 115 5.8 8.2 11.6 11.6 12.999 - 101 0.39 0.55 0.67 0.78 0.87

98.5 - 101.5 0.58 0.82 1.00 1.16 1.3092 - 102 0.77 1.09 1.33 1.54 1.72

En análisis de producto terminado pueden utilizarse coeficientes de variación inferiores al 2 y 3 % para el ensayo de repetibilidad y del 4 al 5 % en el ensayo de reproducibilidad.

DIFERENTES COEFICIENTES DE VARIACION EN FUNCION DEL PORCENTAJE DE ANALITO EN LA MUESTRA SEGÚN KOLTHOFF Y SEGÚN HORWITZ.

% DE ANALITO EN LA MUESTRA

CV ( %) MAXIMOKOLTHOFF

CV ( %) MAXIMOHORWITZ

100 0.1 – 0.3 250 0.3 2.210 1 2.81 2 – 5 4

0.1 5 – 10 5.70.01 – 0.001 10 8 – 11.3

0.0001 --- 16

Estos límites son orientativos y no deben interpretarse rígidamente.


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LIMITES DE CONFIANZASe pueden expresar de diferentes maneras :

De los resultados individualesMedia más o menos la desviación estándar X sMedia más o menos dos veces la desviación estándar X 2 sMedia más o menos la desviación estándar multiplicada por la t de Student X t sEstadísticamente ésta es la expresión más correcta ya que tiene en cuenta la distribución de Student cuando el número de réplicas es inferior a 30. El valor de t se halla en las tablas de Student para n – 1 grados de libertad y una significación del 95 %.

De los resultados promedioLos límites de confianza de la media de una serie de resultados son: X t s / n

Es la medida de la precisión de los resultados de un método efectuado en las mismas condiciones, sobre la misma muestra, por un mismo analista, en el mismo laboratorio, con los mismos equipos, reactivos y en el curso de la misma serie de análisis efectuados, generalmente, en un corto intervalo de tiempo durante el mismo día.

El siguiente estudio lo realiza un solo analista.Se pueden utilizar de 3 a 5 niveles de concentración, el numero de repeticiones debería ser superior a 5 para cada nivel.

Se realiza el análisis de muestras en el mismo laboratorio, el mismo día, en el mismo equipo y el mismo analista. Cada nivel de concentración se analiza 6 veces.


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Es la medida de la precisión de los resultados de un método analítico cuando es realizado sobre una misma muestra pero en condiciones diferentes tales como en diferentes laboratorios, por diferentes analistas, en diferentes equipos y en diferentes días.

Un ensayo de reproducibilidad debe estudiar las principales condiciones de variabilidad del método analítico.

Los análisis de las muestras se pueden realizar por triplicado con tres niveles de concentración, utilizando para ello 2 laboratorios diferentes, 2 equipos diferentes, donde los análisis sean realizados por 3 personas diferentes, durante 4 días diferentes.

La reproducibilidad global se determina por el coeficiente de variación. Si se desea estudiar el efecto de cada uno de los factores (diferentes analistas, equipo, día) por separado, se debe realizar un análisis de varianza (ANOVA).

Número de determinaciones : Valor medio global : S :CV de reproducibilidad :

Fue previamente conocida como parte de la tolerancia.El atributo evalúa la confiabilidad del método en diferentes ambientes operacionales que los usados durante el desarrollo del método.


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El objetivo es asegurar que el método producirá los mismos resultados cuando muestras similares son analizadas una vez que la fase de desarrollo del método ha terminado.Dependiendo del tiempo y los recursos, el método puede ser probado en el mismo laboratorio, en diferentes días, por diferentes analistas y en diferentes instrumentos. La precisión en el método analítico puede ser parcialmente asegurada con unas buenas especificaciones para la idoneidad del sistema.

Indica la capacidad del método analítico para dar resultados lo más próximos posibles al valor real.

Si la diferencia entre el valor hallado y el valor real es pequeña, la exactitud es buena. Una diferencia grande significa que la exactitud es inadecuada y revela la existencia de errores determinados o sistemáticos que deberían corregirse.

Matemáticamente la exactitud se expresa como el porcentaje de recuperación de la cantidad de analito presente en la muestra.

Estadísticamente suele efectuarse un test de student para determinar si el valor medio hallado y el valor considerado como verdadero no difieren significativamente para un grado de probabilidad del 95 % con n – 1 grados de libertad.

Normalmente se calcula para todos los niveles de concentración. texp = VR – X n s


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VR : Valor real

Sí texperimental ttablas

Indica que el método analítico tiene la exactitud requerida.

La formula anterior se puede utilizar también con porcentajes de recuperación. Basta

con sustituir el valor medio X por el porcentaje de recuperación R, el valor VR por 100y la desviación estándar s por el coeficiente de variación CV.

texp = 100 – R n CV

DETERMINACION DE LA EXACTITUD

ANÁLISIS REPETITIVO DE UNA MUESTRA DE CONCENTRACIÓN UNICA CONOCIDA.

La muestra, generalmente, será un placebo al que se le añade una concentración conocida de analito patrón. Se analiza varias veces de 6 a 10 repeticiones y se evalúa la exactitud por uno de los siguientes métodos.

- Los resultados expresados como porcentaje de recuperación y se efectúa con una

prueba t de Student.

- Se pueden comparar los resultados del placebo con analito, con los del analito solo a la misma concentración. ( Comparing two-samples en el STATGRAPHICS).

ANALISIS REPETITIVO DE VARIAS MUESTRAS DE CONCENTRACIONES DIFERENTES CONOCIDAS.

Si la proporción de analito en la muestra varia notablemente (rango amplio) o se requiere un estudio de exactitud riguroso, deberá evaluarse este parámetro para diferentes concentraciones del analito.Un diseño habitual utiliza 3 concentraciones (alta, media, baja) dentro del rango de linealidad, cada una se analiza por triplicado.


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A partir de un placebo se preparan 3 muestras por adición de cantidades exactas de analito correspondiente a cada nivel de concentración.Calcular el porcentaje halladoCalcular la media del porcentaje hallado sVarianza

Para determinar si el factor concentración tiene alguna influencia en los resultados, se utiliza una prueba de igualdad de varianzas para varios grupos de muestras del mismo tamaño.Utilizando la prueba G de COCHRAN

Gexp = ____S2max___________

S21 + S2

2 + S23

Gtablas con p= 0.05 K = 3 n = 3

Gexp Gtablas

Significa que las varianzas de las 3 concentraciones utilizadas son equivalentes (iguales).El factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados.

Para hallar si la exactitud es aceptable, se expresan los resultados como porcentaje de recuperación y se aplica una prueba t de Student.

texp = 100 – R n CV

Sí texp ttablas

No hay diferencia significativa, confirmando la buena exactitud del método.

Es la capacidad de un método analítico de registrar ligeras variaciones de concentración.


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SENSIBILIDAD DE CALIBRADOEs la igual a la pendiente de la recta de calibración.

SENSIBILIDAD ANALITICAEs la sensibilidad de calibrado dividida por la desviación estándar de la respuesta.

Mientras que la sensibilidad de calibrado es constante, dentro de un intervalo determinado, la sensibilidad analítica varia con la concentración del analito, puesto que la precisión cambia con la cantidad de analito presente en la muestra.

Es la menor concentración o cantidad de analito detectable con razonable certeza por un procedimiento analítico, pero no necesariamente cuantificado.

Un resultado positivo no es suficiente para que el analista considere como detectado un analito. Se requiere conocer el límite de detección en las condiciones del método. De lo contrario se puede incurrir en un falso positivo.


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El límite de detección es un parámetro de gran interés en ensayos límite, análisis de trazas, contaminantes y productos de degradación.Los términos cualitativos ( menor cantidad detectable) del tipo “ausencia de “ o “resultado negativo (no detectado)”, tienen su expresión numérica en el límite de detección. Es más correcto expresar “menos de 1 ppm de” que no “ausencia de “.

DETERMINACIÓN DEL LÍMITE DE DETECCIÓN

BASADO EN LA EVALUACIÓN VISUAL

Puede ser usado tanto para métodos no instrumentales como instrumentales.El límite de detección es determinado por el análisis de muestras de concentraciones conocidas del analito.

BASADO EN LA RELACIÓN SEÑAL / RUIDO

Para métodos instrumentales donde la línea base presenta ruido.Se compara la respuesta del blanco de la muestra, con la respuesta de muestras preparadas por la adición de pequeñas cantidades de analito al blanco.Para ello primero se obtiene el nivel medio de ruido del blanco, y se multiplica por 2 o 3 para el límite de detección, estos valores se comparan con las respuestas de la serie de blancos con analito, hallándose finalmente la concentración de analito que corresponde al valor de la señal.

ESTIMACIÓN DEL LÍMITE DE DETECCIÓN MEDIANTE EL VALOR DE LA ORDENADA EN EL ORIGEN

Si la recta de calibración del ensayo de linealidad (Y = bX + a) se ha confeccionado con un rango de concentraciones bajo (0 a 25 %), se admite utilizar el valor del intercepto para estimar, aproximadamente, el límite de detección expresado en las mismas unidades que las abscisas en la recta de calibración.

LÍMITE DE = 3 a___ DETECCIÓN b ANALISIS REPETIDO DEL BLANCO EN LA MUESTRA


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Se analizan una serie de blancos de la muestra ( n 10) y se calcula la media Y y la desviación estándar s de las respuestas obtenidas. A partir de estos valores, existen diferentes expresiones en las que interviene la sensibilidad ( pendiente de la recta de calibración b).

Las fórmulas a utilizar varían en función del procedimiento: Métodos con corrección de lectura frente al blancoEste es el caso de muchos procedimientos espectroscópicos (UV / VIS) en los que la lectura de la muestra se obtienen por comparación con un blanco.

LÍMITE DE = 3 s DETECCIÓN b

Métodos sin corrección de lectura frente al blanco Este es el caso de los procedimientos cromatográficos (GC, HPLC ) . LÍMITE DE = Y + 3 s DETECCIÓN b

El grado de ajuste de la recta de calibración: si el ajuste es defectuoso intervienen las desviaciones estándar de la pendiente sb

y del término independiente sa

Las fórmulas anteriores sólo son válidas si la mayor fuente de error es la desviación estándar del blanco s, es decir si: s >> sa y sb

Cuando los tests de linealidad y proporcionalidad de la recta de calibración revelan falta de ajuste hay que sustituir la desviación estándar del blanco s en las fórmulas anteriores por la siguiente expresión: s

2 + sa2 + ( a )2 sb

2

bEsta expresión tiene en cuenta los errores por falta de linealidad y la existencia de sesgo.Cuando el ajuste de la recta es muy defectuoso, la estimación obtenida con esta fórmula será poco confiable; al no presentar ninguna ventaja, es preferible en este caso determinar el límite de


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detección por un método que tenga menos trabajo experimental ( relación señal/ruido).

DEL NÚMERO DE RÉPLICAS QUE SE EFECTÚAN AL ANALIZAR LA MUESTRA PROBLEMA.

Si en el método analítico se efectúa la medición final por duplicado o triplicado, disminuye la incertidumbre de la medición y mejora la precisión. Por éste motivo el límite de detección es menor y se introduce el factor 1 / n.

n: número de mediciones en las fórmulas anteriores.

LÍMITE DE = 3 s ___ 1 ___ DETECCIÓN b n

LÍMITE DE = Y + 3 s __ 1 ___ DETECCIÓN b n

DETERMINACION POR EXTRAPOLACION A CONCENTRACION CERO DE MUESTRAS QUE CONTIENEN BAJAS CONCENTRACIONES DE ANALITO.

En primer lugar y partiendo de las respuestas de cada concentración, se extrapolará gráfica o matemáticamente la respuesta para concentración cero, la cual se tomará como estimación de un blanco hipotético Y.

A continuación, se determinará la desviación estándar de la respuesta a concentración cero, extrapolación gráfica o matemática, la cual se tomará como estimación de la desviación estándar de la respuesta de un hipotético blanco s .

Conociendo Y y s se aplicarán las fórmulas anteriores según el caso.


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Es la menor concentración o cantidad de analito que puede ser determinada con aceptable precisión y exactitud bajo las condiciones experimentales establecidas.Es un término cuantitativo que expresa la menor cantidad medible.

DETERMINACIÓN DEL LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN

BASADO EN LA EVALUACIÓN VISUAL

Puede ser usado tanto para métodos no instrumentales como instrumentales.El límite de cuantificación es determinado por el análisis de muestras de concentraciones conocidas del analizo.

BASADO EN LA RELACIÓN SEÑAL / RUIDO

Para métodos instrumentales donde la línea base presenta ruido.Se compara la respuesta del blanco de la muestra, con la respuesta de muestras preparadas por la adición de pequeñas cantidades de analito al blanco.Para ello primero se obtiene el nivel medio de ruido del blanco, y se multiplica por 10 para el límite de cuantificación, estos valores se comparan con las respuestas de la serie de blancos con analito, hallándose finalmente la concentración de analito que corresponde al valor de la señal.

ESTIMACIÓN DEL LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN MEDIANTE EL VALOR DE LA ORDENADA EN EL ORIGEN

Si la recta de calibración del ensayo de linealidad (Y= bX + a) se ha confeccionado con un rango de concentraciones bajo (0 a 25%), se admite utilizar el valor del intercepto para estimar, aproximadamente, el límite de cuantificación expresado en las mismas unidades que las abscisas en la recta de calibración.


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LÍMITE DE = 3 a___ CUANTIFICACIÓN b ANALISIS REPETIDO DEL BLANCO EN LA MUESTRA

Se analizan una serie de blancos de la muestra ( n 10) y se calcula la media Y y la desviación estándar s de las respuestas obtenidas. A partir de estos valores, existen diferentes expresiones en las que interviene la sensibilidad (pendiente de la recta de calibración b).

Las fórmulas a utilizar varían en función del procedimiento: Métodos con corrección de lectura frente al blancoEste es el caso de muchos procedimientos espectroscópicos (UV / VIS) en los que la lectura de la muestra se obtienen por comparación con un blanco.

LÍMITE DE = 10 s CUANTIFICACIÓN b

Métodos sin corrección de lectura frente al blanco Este es el caso de los procedimientos cromatográficos (GC, HPLC). LÍMITE DE = Y + 10 s CUANTIFICACIÓN b

El grado de ajuste de la recta de calibración: si el ajuste es defectuoso intervienen las desviaciones estándar de la pendiente sb

y del término independiente sa

Las fórmulas anteriores sólo son válidas si la mayor fuente de error es la desviación estándar del blanco s, es decir si: s >> sa y sb

Cuando los tests de linealidad y proporcionalidad de la recta de calibración revelan falta de ajuste hay que sustituir la desviación estándar del blanco s en las fórmulas anteriores por la siguiente expresión:

s 2 + sa

2 + ( a )2 sb2


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b

Esta expresión tiene en cuenta los errores por falta de linealidad y la existencia de sesgo.Cuando el ajuste de la recta es muy defectuoso, la estimación obtenida con esta fórmula será poco confiable; al no presentar ninguna ventaja, es preferible en este caso determinar el límite de cuantificación por un método que tenga menos trabajo experimental ( relación señal/ruido).

DEL NÚMERO DE RÉPLICAS QUE SE EFECTÚAN AL ANALIZAR LA MUESTRA PROBLEMA.

Si en el método analítico se efectúa la medición final por duplicado o triplicado, disminuye la incertidumbre de la medición y mejora la precisión. Por éste motivo el límite de cuantificación es menor y se introduce el factor 1 / n.

n: número de mediciones en las fórmulas anteriores.

LÍMITE DE = 10 s ___ 1 ___ CUANTIFICACIÓN b n

LÍMITE DE = Y + 10 s ___ 1 ___ CUANTIFICACIÓN b n

DETERMINACION POR EXTRAPOLACION A CONCENTRACION CERO DE MUESTRAS QUE CONTIENEN BAJAS CONCENTRACIONES DE ANALITO.

En primer lugar y partiendo de las respuestas de cada concentración, se extrapolará gráfica o matemáticamente la respuesta para concentración cero, la cual se tomará como estimación de un hipotético blanco Y.

A continuación, se determinará la desviación estándar de la respuesta a concentración cero, extrapolación gráfica o matemática, la cual se tomará como estimación de la desviación estándar de la respuesta de un hipotético blanco s .


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Conociendo Y y s se aplicarán las fórmulas anteriores según el caso.

Es una medida de la capacidad de un método analítico, para permanecer inafectado por pequeñas variaciones deliberadas en los parámetros del método y que dan indicación de su confiabilidad durante el uso normal.

Para ello se introducen deliberadamente variaciones razonables en la condiciones experimentales y se observa su influencia. Por lo general, no se estudia cada variable una a una sino que se introducen varios cambios a la vez de forma que se puedan investigar los efectos de cada uno de ellos. Con un programa cuidadosamente planificado se pueden investigar muchas variables con pocas determinaciones.

Aquellos factores que ejerza un efecto dominante sobre la variación de los resultados deberán ser objeto de un control riguroso en el método analítico. Para los que se expresan numéricamente ( temperaturas, flujos, pH, tiempos) se indicaran el rango de trabajo. Las variables cualitativas ( calidades de material y reactivos) deberán definirse detalladamente.

Uno de los principales factores a tener en cuenta, que muchas veces justifica por si solo la realización de un estudio de robustez, es la evaluación de la estabilidad del analizo en la solución de medida, para determinar el periodo de tiempo que puede conservarse antes de proceder a su análisis sin comprometer la precisión.


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Este estudio es especialmente importante cuando se realizan análisis de series grandes de muestras y el tiempo transcurrido entre el primer análisis y el ultimo es largo, o bien cuando se han recogido distintas muestras a lo largo de un cierto periodo de tiempo y se pretende analizar el analizo en todas ellas al final de dicho periodo. Normalmente este estudio de estabilidad se realiza a temperatura ambiente durante un periodo de tiempo de 24 horas.

Para diseñar un estudio de robustez con varios factores de variabilidad se puede recurrir al esquema de Youden y Steiner.

La tabla de Youden y Steiner otorga dos valores a siete factores diferentes. En mayúsculas aparecen los valores normales para cada factor ( A,B,C,D,E,F,G) y en minúsculas los valores alternativos (a,b,c,d,e,f,g). Se efectúan 8 análisis de la muestra y cada análisis es una combinación diferente de los factores. Para cada factor existen 4 combinaciones ( AAAA) y 4 combinaciones ( aaaa).

Los resultados se indican por las letras “ s,t,u,v,w,x,y,z”.La comparación de las medias de los resultados revela en efecto, de cambiar el valor normal por el alternativo. Por ejemplo, el efecto de cambiar el factor A por a se determina restando la media(s + t + u + v )/4 de la media ( w + x + y + z) /4.

Ocho combinaciones de siete factores en un estudio de robustez.F E

1 2 3 4 5 6 7 8

A/a A A A A a a a aB/b B B b b B B b bC/c C c C c C c C cD/d D D d d d d D DE/e E e E e e E e EF/f F f f F F f f FG/g G g g G g G G g

RESULTADO

s t u v w x y z

F : FACTOR E : ENSAYO

DIFERENCIAS PARA CADA FACTOR

VA = ¼ ( s + t + u + v) – ¼ ( w + x + y + z ) = A – aVB = ¼ ( s + t + w + x) – ¼ (u + v + y + z ) = B – bVC = ¼ ( s + u + w + y) – ¼ ( t + v + x + z ) = C – cVD = ¼ ( s + t + y + z) – ¼ ( u + v + w + x ) = D – d


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VE = ¼ ( s + u + x + z) – ¼ ( t + v + w + y ) = E – eVF = ¼ ( s + v + w + z) – ¼ ( t + u + x + y ) = F – fVG = ¼ ( s + v + x + y) – ¼ ( t + u + w + z ) = G – g

A continuación se hace una lista de estas diferencias ordenándolas de mayor a menor.Puede ocurrir que existan una o dos diferencias claramente superiores, lo cual significa que los respectivos factores ejercen una influencia dominante sobre la precisión de los resultados y deberán ser objeto de un control riguroso en el método analítico.

Para decidir si un factor tiene una influencia importante, suele compararse el valor hallado en el cuadro de diferencias (VA, VB, VC,

VD, VE, VF, VG ) con la expresión S 2 siendo S el valor de la desviación estándar hallada en el estudio de repetibilidad. Las diferencias (VA, VB, VC, VD, VE, VF, VG ) superiores en valor absoluto a S 2 se consideran significativas.

Cuando el numero de variables a estudiar es inferior a 7 se puede utilizar igualmente el cuadrado de Youden y Steiner aplicando una ligera modificación. Supongamos que solo se estudian 6 variables y queda por determinar, por tanto, los valores de los factores G y g. Al factor g se le asocia una operación sin sentido analítico y al factor G la omisión de esta operación. . Las diferencias entre G y g, lógicamente, deben ser irrelevantes.

Es el grado de reproducibilidad de los ensayos de prueba obtenidos por análisis de las mismas muestras bajo una variedad de condiciones normales de ensayo, tales como diferentes laboratorios, diferentes analistas, diferentes instrumentos, diferentes lotes de reactivos, diferentes tiempos parciales, diferentes temperaturas, diferentes días, etc.Es normalmente expresada como la falta de influencia de los resultados de pruebas de variables operacionales y ambientales del método analítico.***


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Es una medida de la reproducibilidad de los resultados bajo condiciones operacionales normales de laboratorio a laboratorio y de analista a analista.Es determinada por análisis de alicuotas de lotes homogéneos en diferentes laboratorios, por diferentes analistas, usando condiciones operacionales y ambientales que pueden diferir pero están aun dentro de los parámetros especificados para el ensayo.El grado de reproducibilidad de los resultados de la prueba son luego determinados como una función de las variables del ensayo. Esta reproducibilidad puede ser comparada a la precisión del ensayo bajo condiciones normales para obtener una medida de la tolerancia del método analítico.


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validaciÓn de mÉtodos analÍticos

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