VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS

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<p>VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS-</p> <p>PAGE 7</p> <p>VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS.</p> <p>Es un proceso donde se establece, por estudios de laboratorio, que el mtodo satisface los requisitos para las aplicaciones analticas deseadas, es decir, permite evaluar su confiabilidad.</p> <p>En general se consideran 3 tipos de validacin:</p> <p>Validacin prospectiva: Para mtodos analticos nuevos.</p> <p>Validacin retrospectiva: Para mtodos repetidamente utilizados, no validados anteriormente y de los que se tiene documentacin suficiente para probar la bondad del mtodo.</p> <p>Revalidacin : Es volver a validar un mtodo al cual se le han realizado cambios que puedan afectar la bondad del mtodo.</p> <p> Cambios en la sntesis del principio activo de un medicamento.</p> <p> Cambios en la composicin del producto terminado.</p> <p> Cambios en el procedimiento analtico. </p> <p>VALIDACIN:Es verificar experimentalmente y documentalmente que un mtodo hace lo que tiene que hacer.</p> <p>CALIFICACIN:Es verificar las cualidades o caractersticas inherentes a un equipo. </p> <p>CALIBRACIN :Es una parte de la calificacin.</p> <p>FARMACOPEAS</p> <p>Los mtodos descritos en monografas de farmacopeas u otros textos oficiales se consideran validados. Hay que aclarar que se aplica solo a mtodos generales y a materias primas.</p> <p>En cuanto a producto terminado, habr que hacer validacin del mtodo analtico, puesto que los excipientes sern diferentes para cada fabricante.</p> <p>VALIDACIN Y BUENAS PRACTICAS DE LABORATORIO.</p> <p>Instalaciones adecuadas y suficientes</p> <p>Personal capacitado</p> <p>Equipos apropiados, calificados (calibrados).</p> <p>Procedimientos adecuados para la toma de muestras.</p> <p>Utilizacin de reactivos apropiados y soluciones valoradas.</p> <p>Utilizacin de material de laboratorio (vidrio) adecuado y cumpliendo con el procedimiento estandarizado de limpieza. (calibrado el material volumtrico).</p> <p>Utilizacin de patrones y muestras de referencia correctas.</p> <p>Estndar primario</p> <p>Estndar secundario</p> <p>Garanta de calidad de los resultados obtenidos (elaboracin de documentos).</p> <p>Higiene y seguridad en el laboratorio.</p> <p>Los estudios de validacin deben ser realizados por analistas con experiencia, de tal manera que se eviten errores debido a la falta de experiencia, precisamente porque el propsito del estudio es la evaluacin de errores y posible sesgo del mtodo en s mismo, de ah la importancia de minimizar la variacin introducida por el analista</p> <p>DOCUMENTACION</p> <p>Procedimientos estandarizados de trabajo. PET</p> <p>SOPs : Standard Operating Procedures</p> <p>FASES EN EL DESARROLLO DE UN METODO ANALITICO. Definir las caractersticas y requerimientos que debe satisfacer el mtodo analtico.</p> <p>De acuerdo al mtodo a seguir </p> <p>Volumtrico </p> <p>Gravimtrico</p> <p>Potenciomtrico</p> <p>Microbiolgico</p> <p>Instrumental</p> <p>Tipo de instrumentacin</p> <p>Grado de especificidad</p> <p>Grado de sensibilidadPrecisin necesaria</p> <p>Tiempo por anlisis</p> <p>Costo por anlisis</p> <p> Estandarizacin del mtodo analtico.</p> <p>Comprende desde los primeros estudios de tanteo con estndares hasta la utilizacin de mtodo en muestras reales.</p> <p>Se debe establecer los parmetros de idoneidad que garanticen el buen funcionamiento del sistema en el momento del anlisis.</p> <p> Validacin del mtodo analtico.Identificacin de los parmetros apropiados de validacin.</p> <p>Diseo de experimentos para la elaboracin del parmetro.</p> <p>Determinacin del cumplimiento de cada parmetro en la validacin.</p> <p>Traduccin de los resultados en el procedimiento del mtodo.</p> <p>DATOS ELEMENTALES REQUERIDOS PARA LA VALIDACION DE UN ENSAYO.</p> <p>Los procedimientos de valoracin varan, desde determinaciones analticas de alta exactitud, hasta la evaluacin subjetiva por atributos, considerando esta variedad de los ensayos, es mas que lgico decir que los diferentes mtodos de prueba requieren diferentes esquemas de validacin.</p> <p>Las categoras ms comunes de ensayos, los cuales requieren validacin, son los siguientes segn USP 23:</p> <p>CATEGORIA I:Mtodos analticos para la cuantificacin de componentes mayoritarios de materias primas a granel o ingredientes activos (incluyendo preservativos) en productos farmacuticos terminados.</p> <p>CATEGORIA II:Mtodos analticos para la determinacin de impurezas en materias primas a granel o compuestos de degradacin en productos farmacuticos terminados.</p> <p>Estos mtodos incluyen valoraciones cuantitativas y pruebas limites.</p> <p>CATEGORIA III:Mtodos analticos para la determinacin de</p> <p>caractersticas de desempeo (por ejemplo disolucin).</p> <p>CATEGORIA</p> <p>PARAMETROIIIIII</p> <p>CUANTIFICACIONENSAYO LIMITE</p> <p>ESPECIFICIDADSISISI*</p> <p>LINEALIDADSISINO*</p> <p>RANGOSISI**</p> <p>PRECISIONSISINOSI</p> <p>EXACTITUDSISI**</p> <p>LIM. DETECCIONNONOSI*</p> <p>LIMITE CUANTIFICACIONNOSINO*</p> <p>* PUEDE SER REQUERIDA, DEPENDIENDO DEL ENSAYO. </p> <p>En el suplemento 4 de la USP 23, desaparece de la tabla anterior el criterio para ROBUSTEZ. </p> <p>CARACTERISTICAS DE LA VALIDACION DE UN METODO ANALITICO SEGN ICH.</p> <p>TIPO DE PROCEDIMIENTO ANALITICO:1. PRUEBAS DE IDENTIFICACION</p> <p>2. PRUEBAS PARA LA DETERMINACION DE IMPUREZAS</p> <p>3. VALORACIONES TANTO DE POTENCIA Y CONTENIDO DE UNPRINCIPIO ACTIVO, COMO DE ENSAYOS DE DISOLUCION.</p> <p>TIPO DE PROCEDIMIENTO ANALITICO</p> <p>PARAMETRO123</p> <p>CUANTIFICACIONENSAYO LIMITE</p> <p>ESPECIFICIDADSISISISI</p> <p>LINEALIDADNOSINOSI</p> <p>RANGONOSINOSI</p> <p>PRECISIONNOSI *NOSI *</p> <p>EXACTITUDNOSINOSI</p> <p>LIM. DETECCIONNONOSINO</p> <p>LIMITE CUANTIFICACIONNOSINONO</p> <p>LA PRECISIN SERA DADA POR LA REPETIBILIDAD Y LA PRECISIN INTERMEDIA.</p> <p>*CUANDO LA REPRODUCIBILIDAD HA SIDO DETERMINADA, LA </p> <p>PRECISIN INTERMEDIA NO SE REQUIERE.</p> <p>LA ROBUSTEZ DEBE SER CONSIDERADA EN LA ETAPA FINAL DEL DESARROLLO DEL METODO ANALITICO.</p> <p>CARACTERISTICAS DE FUNCIONAMIENTO DE LOS METODOS ANALITICOS.</p> <p>Las caractersticas de funcionamiento de un mtodo analtico comprenden todos los datos y resultados experimentales que demuestran su aptitud para el uso al cual es destinado. </p> <p> CARACTERISTICAS DE FIABILIDAD</p> <p>(CONFIABILIDAD)</p> <p>Son las que demuestran la capacidad de un mtodo analtico para mantener los criterios fundamentales de la validacin a lo largo del tiempo.</p> <p>Capacidad de un mtodo para determinar el analito sin interferencia de impurezas, excipientes, productos de degradacin u otras sustancias presentes en la muestra.</p> <p>Selectividad</p> <p>Especificidad </p> <p>Proporcionalidad entre la concentracin del analito y la respuesta del instrumento.</p> <p> Linealidad y rango</p> <p> Sensibilidad</p> <p>Dispersin de una serie de resultados alrededor de un valor medio.</p> <p>Precisin</p> <p>Repetibilidad</p> <p>Reproducibilidad</p> <p>Precisin intermedia</p> <p>Robustez</p> <p>Tolerancia</p> <p>Diferencia entre el valor hallado en el anlisis y el valor verdadero.</p> <p>Exactitud</p> <p>Porcentaje de recuperacin</p> <p>Cantidad mnima de analito requerida para obtener un resultado significativo.</p> <p>SensibilidadLmite de deteccinLmite de cuantificacin</p> <p> PRACTICABILIDAD</p> <p>Se evalan en la fase del desarrollo del mtodo analtico.</p> <p>Tiempo </p> <p>Costo</p> <p>Tamao de la muestra </p> <p>Equipo </p> <p> IDONEIDAD (SYSTEM SUITABILITY)</p> <p>Los parmetros de idoneidad no son de validacin y se consideran dentro de las buenas practicas de laboratorio ( GLP ) analtico.</p> <p>Se aplica al conjunto de parmetros relacionados con la verificacin del buen funcionamiento de los instrumentos analticos.</p> <p>Un sistema analtico es idneo (adecuado) si responde, en el momento de su utilizacin, a los requisitos fijados en la validacin del mtodo.</p> <p>Los instrumentos se califican. </p> <p>Los mtodos se validan.</p> <p>System suitability (idoneidad) verifica el buen funcionamiento del sistema (instrumento y mtodo) en el momento de su uso.</p> <p>Este parmetro se refiere a la propiedad del mtodo de producir una respuesta debida solo a la presencia del analito de inters, libre de interferencia de otros componentes que pueden ser excipientes de un frmaco, productos de degradacin, subproductos o productos laterales de sntesis de un medicamento, metabolitos del mismo analito en fluidos biolgicos.</p> <p>Un aspecto importante de su aplicacin, es el mbito de utilizacin del mtodo. Ciertos mtodos, como los gravimtricos o volumtricos son adecuados nicamente para el anlisis de macroconstituyentes de una muestra.</p> <p>La mayor parte de los mtodos instrumentales pueden determinar hasta trazas de sustancias.</p> <p>La seleccin de un estndar interno adecuado es fundamental para los mtodos que lo requieren, y se debe garantizar que el mtodo sea especifico tanto para el estndar interno como para el analito problema. </p> <p>La especificidad del mtodo analtico puede determinarse de la siguiente forma:</p> <p>Analizar el placebo (la formulacin sin el principio activo, solo los excipientes).</p> <p>Analizar por triplicado placebo adicionado con los productos de degradacin, sustancias relacionadas y sustancias de inters equivalente al 100%.</p> <p>Analizar por triplicado muestras solas, solo el analito de inters.</p> <p>Comparar los datos obtenidos de los anlisis del placebo adicionado de la sustancia de inters y de sus sustancias relacionadas, con los obtenidos en los anlisis de muestras solas.</p> <p>La linealidad del mtodo analtico se refiere a la proporcionalidad entre la concentracin del analito y su respuesta, en un rango determinado.</p> <p>El ensayo de linealidad puede efectuarse tanto sobre soluciones patrn del analito, como sobre muestras problema que contengan concentraciones crecientes de analito.</p> <p>Realizar anlisis mnimo por triplicado de soluciones con la sustancia de inters a diferentes concentraciones.</p> <p>El numero de soluciones puede estar comprendido entre 3 y 10, y los niveles de concentracin se seleccionan de acuerdo con las cantidades esperadas de analito en la muestra.</p> <p>Valoracin de una materia prima.</p> <p>Analizar de 3 a 5 soluciones patrn a un intervalo de concentraciones comprendido entre 80 a 120 % del valor terico.</p> <p>Para 5 niveles de concentracin se podra ensayar 80, 90, 100, 110 y 120 % mnimo por triplicado.</p> <p>Valoracin de un principio activo en producto terminado.</p> <p>Analizar 5 a 7 soluciones estndar con niveles de concentracin comprendidos entre el 50 al 150 % del valor terico.</p> <p>Para 5 niveles de concentracin se podra ensayar 50, 80, 100, 120 y 150 % mnimo por triplicado.</p> <p>Si la concentracin del analito puede variar ampliamente, como es el caso de ensayos de impurezas, productos de degradacin, determinacin de analito y de metabolitos en fluidos biolgicos.</p> <p>Los patrones debern abarcar todo el intervalo de concentraciones previsto.</p> <p>10 a 100 ppm para una impureza.</p> <p>10 a 200% de la concentracin promedio del analito en fluidos biolgicos.</p> <p>Realizar para cada nivel de concentracin el anlisis mnimo por triplicado.</p> <p>Registrar los resultados obtenidos.</p> <p>Realizar los clculos de regresin lineal por el mtodo de los mnimos cuadrados, para saber si el grfico obtenido es del tipo lineal.</p> <p>ECUACION DE LA LINEA RECTA</p> <p>Y = bX + a</p> <p> EQ Y:RESPUESTA ( VARIABLE DEPENDIENTE)</p> <p>X:CONCENTRACION O CANTIDAD DE ANALITO (VARIABLE </p> <p>INDEPENDIENTE)</p> <p>b:PENDIENTE</p> <p>a:INTERCEPTO</p> <p> ( XY - (X (Y b = ______________n______________ a = (Y - b (x (X2 - ( (X ) 2 n n</p> <p> ( XY - (X (Y r = ___________________________________n_____________________ </p> <p> (X2 - ( (X ) 2 (Y2 - ( (Y ) 2 n nValores muy elevados de r (coeficiente DE CORRELACIN) no deben tomarse errneamente como indicadores de linealidad; la linealidad se demuestra estadsticamente por otros procesos que se describen a continuacin:</p> <p>El cuadrado del coeficiente de correlacin se denomina COEFICIENTE DE DETERMINACION ( R2 ) e indica la proporcin de la varianza total de Y que es explicada por el modelo lineal de regresin.</p> <p>La variable independiente explica En un % de la varianza total de Y.</p> <p> Prueba t para el coeficiente de correlacin. </p> <p>El valor t tabla de la DISTRIBUCION DE STUDENT para n 2 grados de libertad, con p = 0.05 (intervalo de confianza del 95 % ).</p> <p>t exp = | r | ( ( n 2 ) ( ( 1 r2 )H0 : No existe correlacin entre X y Y.</p> <p>t experimental ( t tabla</p> <p>Se rechaza la hiptesis nula, lo cual indica que existe correlacin significativa entre X y Y.</p> <p> Prueba de linealidad de la pendiente b.</p> <p> COEFICIENTE DE REGRESION</p> <p>S2y,x = _(Y2 - a (Y - b_(XY ( VARIANZA DEL ERROR </p> <p> n 2 EXPERIMENTAL TOTAL) S2b = ______ S2y,x _________ _ ( VARIANZA DE LA (X2 - ( (X ) 2 PENDIENTE) n </p> <p> Sb = S2b Sb rel (%) = Sb x 100 b</p> <p>Lmites de confianza de la pendiente</p> <p>b ( t tabla Sb </p> <p>El valor t tabla de la DISTRIBUCION DE STUDENT para n 2 grados de libertad, con p = 0.05 ( intervalo de confianza del 95 % ).</p> <p> Prueba t para la pendiente.El valor t tabla de la DISTRIBUCION DE STUDENT para n 2 grados de libertad, con p = 0.05 ( intervalo de confianza del 95 % ).</p> <p>H0 : b = 0t experimental ( t tabla</p> <p>Se rechaza la hiptesis nula.</p> <p>Indica buena linealidad del mtodo. t experimental ( t tablaEste valor indica que la probabilidad de ser b ( 0 es muy elevada, superior al 95 %.</p> <p>Si fuera b = 0 significara que la recta es paralela al eje de las abscisas y no habra regresin.</p> <p>SIGNIFICACION ESTADISTICA DE LA VARIANZA </p> <p>DE LA PENDIENTE (b)</p> <p>A mayor pendiente:habr mayor sensibilidad del mtodo.</p> <p>A menor varianza de la pendiente: habr mejor linealidad del mtodo.</p> <p> Prueba de linealidad del intercepto a.(Proporcionalidad)Indica el error sistemtico del mtodo, idealmente debe ser cero.</p> <p>Cuando la concentracin del analito de inters sea cero, su respuesta deber ser cero.</p> <p>S2a = S2b ( (X ) 2 </p> <p> n </p> <p> Sa = S2a Sa rel (%) = Sa x 100 a</p> <p>Lmites de confianza del intercepto</p> <p>a ( t tabla Sa </p> <p>El valor t tabla de la distribucin de student para n 2 grados de libertad, con </p> <p>p = 0.05 (intervalo de confianza del 95 %).</p> <p>Si estos limites cubren el cero, se cumple la condicin de proporcionalidad.</p> <p>Prueba t para el intercepto a.</p> <p>El valor t tabla de la distribucin de student para n 2 grados de libertad, con </p> <p>p = 0.05 (intervalo de confianza del 95 %).</p> <p>t exp = a Sa </p> <p>H0 : a = 0 </p> <p>t experimental ( t tabla</p> <p>Se rechaza la hiptesis nula.</p> <p>Indica buena proporcionalidad del mtodo. t experimental ( t tablaEste valor indica que la probabilidad de ser a = 0 es muy elevada, superior al 95 %.</p> <p> Representacin grfica de la recta de regresin.</p> <p>Realizar la grfica con los datos obtenidos, que relaciona la respuesta (rea, absorbancia, volumen) con la concentracin o cantidad de analito. Adems realizar el tr...</p>