1 GUSTAVO DELGADO Len, JULIO del 2007 Consultora FARMAMUNDI MDULO 4 LABORATORIO DE CONTROL DE CALIDAD DE MEDICAMENTOS PROYECTO FARMAMUNDI/UNAN-LEN 2 OBJETIVOS ESPECIFICOS Entrenarapersonaldelaboratorioenelusodelastcnicas quimiomtricasaplicadasalavalidacindelosmtodos analticos. Entrenaralpersonalenlaaplicacindelavalidacinconeluso de calculadoras con funciones de estadstica bsica Aplicarlavalidacindemtodosanalticosutilizadosenanlisis farmacuticos. OBJETIVO GENERAL Entrenar a personal de laboratorio en la evaluacin de los diferentes parmetros que caracterizan el desempeo de un mtodo analtico. 3 CONTENIDO INTRODUCCIN:RequisitosdelasnormasISO/IEC17025. Procedimientonormalizado..Definicindevalidacin.Parmetros quecaracterizaneldesempeodelmtodo.Reglasparala validacin. Plan de la validacin. TCNICASDELAVALIDACINATRAVSDEEJEMPLOSEN ANLISISDEAGUAS:Evaluacindelaprecisin(repetibilidady precisinintermedia).Linealidadyrango.Controldecalidaddela linealidad (elaboracin de carta de control bidimensional). Lmite de deteccinydecuantificacin.Evaluacindelaexactitud (evaluacindelbiasosesgo,efectodematriz,recobro,correccin de resultados). Sensibilidad, robustez. ESTUDIO DE CASOS: Resolucin de problemas. 4 INTRODUCCION 5 Evaluacin de la conformidad ISO 17000-11 1. Enfoque funcional - I La evaluacin de la conformidad es una serie de tres funciones que satisfacen una necesidad, o una solicitud, de demostrar que se cumplen los requisitos especificados: seleccin; determinacin, y revisin y atestacin.6 Enfoque funcional - I La evaluacin de la conformidad se puede aplicar a productos (definido de modo que incluye servicios), procesos, sistemas y personas, y tambin a aquellos organismos que prestan servicios de evaluacin de la conformidad. Por comodidad en esta norma se utiliza la expresin objeto de evaluacin de la conformidad para referirse en conjunto a cualquiera o a todas estas entidades.7 Requierevigilancia? Selecin Determi- nacin Revisin yattestacin Informacin sobre elementos seleccionados Informacin sobreel cumplimiento de requisitos especificados Cumplimiento demostrado de losrequisitos especificados Necesidad de demostrar cumplimiento de requisitos especificados S No Final A: funcin EC B: salida Clave: Evaluacin de conformidad: Enfoque funcional 8 2. SeleccinActividades de planificacin y preparacin para Recopilar o producir informacin para la funcin de determinacin Caracteristicas del organismo de EC,MuestreoRequisitos especificados(por ejemplo estandares) Procedimientos (mtodos de prueba e inspeccin)9 3. Determinacin - I Las actividades de determinacin se llevan a cabo con el fin de obtener informacin completa relativa al cumplimiento de los requisitos especificados por el organismo de evaluacin de la conformidad o su muestra. Ensayo/prueba (4.2) Inspeccin (4.3) Auditora (4.4) Evaluacin entre pares (4.5) 10 Ensayo/prueba (17000:2004, 4.2) determinacin de una o ms caractersticas de un objeto de evaluacin de la conformidad, de acuerdo con un procedimiento (3.2). NOTA El trmino ensayo/prueba se aplica en general a materiales, productos o procesos.11 Objeto y alcance de ISO17011 Para los propsitos de esta norma internacional, los OEC proveen los siguientes servicios: 1. Ensayo/prueba. 2. Inspeccin 3. Certificacin de sistemas de gestin. 4. Certificacin de productos 5. Calibracin. 12 REQUISITOS DE LA NORMA ISO/IEC 17025:2005 Diagrama de Ishikawa aplicado al items 5.4. Mtodos de ensayo y de calibracin y validacin mtodos G. Delgado 5.4. Mtodos y ValidacinMtodos de ensayo GeneralidadesEstimacin incertidumbre Validacin MtodosControl de datosSeleccinDesarrolladosNo NormalizadosMtodos y proc. apropiadosIncertidumbreInstructivos, normas, man., actualizadosVerificaciones Sofware validadosProc. Proteccin Mantenimimiento computadorasCalibracionesMedicionesTomar todos componentesNo normalizadosDiseadosNormalizados modificadosNormalizados, previa verificacinApropiado, validados13 5.4.1.Generalidades.Ellaboratoriodebeaplicarmtodosyprocedimientos apropiados para todos los ensayos o las calibraciones dentro de su alcance. Estos incluyenelmuestreo,lamanipulacin,eltransporte,elalmacenamientoyla preparacindelostemsaensayaroacalibrary,cuandocorresponda,la estimacin de la incertidumbre de la medicin as como tcnicas estadsticas para el anlisis de los datos de los ensayos o de las calibraciones. El laboratoriodebetenerinstruccionesparaelusoyelfuncionamientodetodoel equipamientopertinente,yparalamanipulacinylapreparacindelostemsa ensayar o a calibrar, o ambos, cuando la ausencia de tales instrucciones pudieran comprometerlosresultadosdelosensayosodelascalibraciones.Todaslas instrucciones, normas, manuales y datos de referencia correspondientes al trabajo dellaboratoriosedebenmanteneractualizadosydebenestarfcilmente disponiblesparaelpersonal(vase4.3).Lasdesviacionesrespectodelos mtodosdeensayoydecalibracindebenocurrirsolamentesiladesviacinha sido documentada, justificada tcnicamente, autorizada y aceptada por el cliente. REQUISITOS DE LA NORMA ISO/IEC 17025:2005 5.4 Mtodos de ensayo y de calibracin y validacin de los mtodos 14 5.4.2. Seleccin de los mtodos Ellaboratoriodebeutilizarlosmtodosdeensayoodecalibracin,incluidoslosde muestreo, que satisfagan las necesidades del cliente y que sean apropiados para los ensayos o las calibraciones que realiza. Se deben utilizar preferentemente los mtodospublicadoscomonormasinternacionales,regionalesonacionales.El laboratorio debe asegurarse de que utiliza la ltima versin vigente de la norma, a menos que no sea apropiado o posible. Cuando sea necesario, la norma debe ser complementada con detalles adicionales para asegurar una aplicacin coherente. Cuandoelclientenoespecifiqueelmtodoautilizar,ellaboratoriodebeseleccionar losmtodosapropiadosquehayansidopublicadosennormasinternacionales, regionalesonacionales,pororganizacionestcnicasreconocidas,oenlibroso revistascientficasespecializados,oespecificadosporelfabricantedelequipo. Tambinsepuedenutilizarlosmtodosdesarrolladosporellaboratorioolos mtodosadoptadosporellaboratoriosisonapropiadosparaelusoprevistoysi hansidovalidados.Elclientedebeserinformadodelmtodoelegido.El laboratoriodebeconfirmarquepuedeaplicarcorrectamentelosmtodos normalizadosantesdeutilizarlosparalosensayosolascalibraciones.Siel mtodo normalizado cambia, se debe repetir la confirmacin.Sielmtodopropuestoporelclienteseconsiderainapropiadoodesactualizado,el laboratorio debe informrselo. 15 5.4.3. Mtodos desarrollados por el laboratorio Laintroduccindelosmtodosdeensayoydecalibracindesarrolladosporel laboratorioparasupropiousodebeserunaactividadplanificadaydebeser asignada a personal calificado, provisto de los recursos adecuados. Losplanesdebenseractualizadosamedidaqueavanzaeldesarrolloysedebe asegurar una comunicacin eficaz entre todo el personal involucrado. 5.4.4. Mtodos no normalizados Cuandoseanecesarioutilizarmtodosnonormalizados,stosdebenseracordados con el cliente y deben incluir una especificacin clara de los requisitos del cliente y del objetivo del ensayo o de la calibracin. El mtodo desarrollado debe haber sido validado adecuadamente antes del uso. 16 Mtodo No Normalizado (cont) Nota:Paralosmtodosdeensayoodecalibracinnuevosesconveniente elaborarprocedimientosantesdelarealizacindelosensayosolas calibraciones,loscualesdeberancontener,comomnimo,lainformacin siguiente: *una identificacin apropiada; *el alcance; *la descripcin del tipo de tem a ensayar o a calibrar; *los parmetros o las magnitudes y los rangos a ser determinados; *los aparatos y equipos, incluidos los requisitos tcnicos de funcionamiento; *los patrones de referencia y los materiales de referencia requeridos; *lascondicionesambientalesrequeridasycualquierperodode estabilizacin que sea necesario. *la descripcin del procedimiento, incluida la siguiente informacin: -lacolocacindelasmarcasdeidentificacin,manipulacin,transporte, almacenamiento y preparacin de los tems; -las verificaciones a realizar antes de comenzar el trabajo; -laverificacindelcorrectofuncionamientodelosequiposy,cuando corresponda, su calibracin y ajuste antes de cada uso; -el mtodo de registro de las observaciones y de los resultados; -las medidas de seguridad a observar. *los criterios o requisitos para la aprobacin o el rechazo; *los datos a ser registrados y el mtodo de anlisis y de presentacin; *la incertidumbre o el procedimiento para estimar la incertidumbre. 17 5.4.5. Validacin de los mtodos Lavalidacineslaconfirmacin,atravsdelexamenyelaportedeevidencias objetivas,dequesecumplenlosrequisitosparticularesparaunusoespecfico previsto. Ellaboratoriodebevalidarlosmtodosnonormalizados,losmtodosquediseao desarrolla,losmtodosnormalizadosempleadosfueradelalcanceprevisto,as comolasampliacionesymodificacionesdelosmtodosnormalizados,para confirmarquelosmtodossonaptosparaelfinprevisto.Lavalidacindebeser tanampliacomoseanecesarioparasatisfacerlasnecesidadesdeltipode aplicacin o del campo de aplicacin dados. Ellaboratoriodeberegistrarlosresultadosobtenidos,elprocedimientoutilizadopara la validacin y una declaracin sobre la aptitud del mtodo para el uso previsto. La gama y la exactitud de los valores que se obtienen empleando mtodos validados (porejemplo,laincertidumbredelosresultados,ellmitededeteccin,la selectividaddelmtodo,lalinealidad,ellmitederepetibilidadode reproducibilidad,larobustezanteinfluenciasexternasolasensibilidadcruzada frente a las interferencias provenientes de la matriz de la muestra o del objeto de ensayo)talcomofueronfijadasparaelusoprevisto,debenresponderalas necesidades de los clientes. 18 Validacin de mtodos (cont) NOTA 2: Es conveniente utilizar una o varias de las tcnicas siguientes para la determinacin del desempeo de un mtodo:*calibracin utilizando patrones de referencia o materiales de referencia; *comparacin con resultados obtenidos con otros mtodos; *comparaciones interlaboratorios; *evaluacin sistemtica de los factores que influyen en el resultado; *evaluacindelaincertidumbredelosresultadosbasadaenelconocimientocientficodelos principios tericos del mtodo y en la experiencia prctica. Estimacin de la incertidumbre de la medicin Unlaboratoriodecalibracin,ounlaboratoriodeensayoquerealizasuspropias calibraciones,debetenerydebeaplicarunprocedimientoparaestimarla incertidumbredelamedicinparatodaslascalibracionesytodoslostiposde calibraciones. Los laboratorios de ensayo deben tener y deben aplicar procedimientos para estimar laincertidumbredelamedicin.Enalgunoscasoslanaturalezadelmtodode ensayopuedeexcluirunclculoriguroso,metrolgicamenteyestadsticamente vlido, de la incertidumbre de medicin. En estos casos el laboratorio debe, por lo menos, tratar de identificar todos los componentes de la incertidumbre y hacer unaestimacinrazonable,ydebeasegurarsedequelaformadeinformarel resultado no d una impresin equivocada dela incertidumbre. Unaestimacin razonable se debebasaren un conocimiento del desempeo delmtodo y en el alcancedelamedicinydebehaceruso,porejemplo,delaexperiencia adquirida y de los datos de validacin anteriores. 19 VALIDACION:Verificacionesnecesariasparaasegurarlas caractersticasdeldesempeoylimitacionesdeunmtodoy demostrar que ste est cientficamente regido bajo las condiciones paralascualesdebeseraplicado.Secomparanlosparmetrosdel desempeodelmtodoconlosrequerimientosnecesariosdelos datos analticos. TECNICA: Principio cientfico til para proveer informacin sobre la composicin de una sustancia. METODO: Adaptacin de una tcnica para mediciones de parmetros analticos seleccionados. PROCEDIMIENTO: Direcciones generales escritas necesarias para utilizar un mtodo. Ejemplos: Mtodos estndares de aguas, AOAC, EPA, etc PROTOCOLO: Serie de direcciones definitivas que un laboratorio debe seguir sin excepcin para utilizar un mtodo. DEFINICIONES 20 CRITERIOS DEL DESEMPEO DE UN METODO a) Primarios: precisin, exactitud, lmite de deteccin. b) Secundarios: Linealidad, rango, lmite de cuantificacin, selectividad, sensibilidad, robustez o fortaleza del mtodo. Tipos de validacin Interna Dentro del laboratorio. Se realiza cuando se ha desarrollado nuevo mtodo o cuando se adapta o se modifica el mtodo Externa Entre laboratorios. Comparacin con al menos 8 laboratorios 21 REGLAS FUNDAMENTALES PARA LA VALIDACIN 1. Validar el mtodo completo. Desde la etapa preparatorio hasta la medicin final.2. Validar en un intervalo de concentraciones. Precisin del mtodo depende de la concentracin del analito en la solucin muestra. 3. Validar sobre una amplia gama de matrices. Probar un mtodo dado en aguas, suelos, alimentos, muestras biolgicas, etc. 22 Especificaciones requeridas por el clienteSeleccin del mtodo apropiadoNormalizado y verificado?Planificacin de tareasExperimentos de validacin/estimacin incert.Evaluacin de informacindisponible sobrevalidacin del mtodo OK?Evaluacin de los resultados, segn especificaciones Realizar ajustesDocumentar mtodo y su validacinUtilice el mtodo con confianzaProcedimiento normalizado y reporte validacinFININICIOFlujo para la seleccin y validacin de un mtodo23 Qu es un procedimiento normalizado? Unprocedimientonormalizadoeselprotocoloestablecidoporellaboratorio, optimizado,validado,revisado,aprobadoporla(s)persona(s)autorizada(s). Tieneunaidentificacinnica.Debenespecificarselosparmetrosque caracterizaneldesempeodelmtodoatravsdelaconfirmacino verificacin (o validacin si el mtodo ha sido desarrollado en el laboratorio, si esnonormalizadoosielmtodonormalizadohasidomodificado)dequeel mtodo es apto para el ensayo requerido por el cliente.Elprocedimientonormalizadodebeserimplementadoenellaboratorioporel personalautorizado,competente,conelinstrumentaldemedicincalibradoy las condiciones ambientales ptimas. Existe mucha confusin entre validar o no un mtodo normalizado. Se supone queelmtodonormalizadoyaestvalidado,especificalosparmetrosque caracterizansudesempeo.Siunmtodonormalizadovaaseraplicadopor primeravezenellaboratorio,previamentesedebenrealizarlosprocesos correspondientesconelfindeverificaroconfirmarqueelmtodocumplecon las especificaciones que caracterizan el desempeo del mtodo. 24 FLUJOGRAMA DE NORMALIZACION DE UN PROCEDIMIENTO Definicin de parmetros analticosDiseo experimentalOptimizacinEmprica?Experiencias iterativasprogramas en computadorasModeloEvaluacin de resultadosOK?Planificacin de validacinModelo de calibracin, rango, linealidad, LD, LCPrecisin y exactitudEstabilidad del analitoProcesamiento de resultadosInforme validacin/ proc. normalizadoAnlisis de rutinaDESARROLLO DEL METODOINICIOVALIDACION DEL METODOSINOSINODocumentacin/normalizacin25 Recomendaciones (I) Mtodo por prioridad: 1. Mtodos de prueba internos y modificados 2.Mtodos de prueba con alto potencial de riesgo 3.Mtodos de prueba o productos con alto nivelde utilizacin 4.Validar primero los puntos crticos en losprocedimientos. 26 ACTIVIDADADES Ejecutor 1 2 3 4 5 6 7 8 9Diagnstico del laboratorio (recursos, disponibilidad) DT, AEnsayo de pureza de reactivos y referencias A1Verificacin de calibraciones A2Repetibiliad en mediciones (tr, f) A2Repetibilidad del mtodo (contenido de analito) A2Linealidad y rango. Repetibilidad A2Lmite de deteccin y cuantificacin A2Exactitud del mtodo A2Prueba de robustez A1,A2Implementacin de anlisis de rutina A1,A2Diseo del Control de Calidad DTEnsayos interlaboratorios (proficiency) DT, AElaboracin de un protocolo DT, AElaboracin del informe de validacin DT, ASupervisin de ejecucin de actividades DT, DGPLANIFICACIN DE LA VALIDACION27 Mtodo, equipo, sistema Muestra Resultado Preparacin de la muestraSistema de anlisisEquipo incluyehardware software Mtodo analtico Prueba del equipo calificacin del equipo Validacin del mtodo Prueba de aptitud del sistema sistema de calidad Methodenvalidierung Calibracin Validacin del software 28 Calificacin del equipo (I) 1. Calificacin del diseo (C.D., D.Q.) Define las especificaciones funcionales y operacio-nales del instrumento, y detalla las condiciones y decisionesen la seleccin y desempeo del proveedor. 29 Calificacin del equipo (II) 2. Calificacin de la construccin (C.C., C.Q.) Asegurar por parte del fabricante que el producto ha sido diseado y fabricado segn un sistema de calidad reconocido mundialmente, y que cumple con las condiciones de conformidad y seguridad . 30 Calificacin del equipo (III) 2. Calificacin de instalacin (C.I., I.Q.) Establece que el instrumento es recibido de acuerdo a como se dise y especific, que est adecuadamente instalado en el ambiente que se seleccion, y que es apropiado para la operacin del instrumento. 31 Calificacin del equipo (IV) 4. Calificacin de la aplicacin (C.A., A.Q.) El proceso en donde se demuestra que un instrumento funcionar de acuerdo a la especificacin operacional en el ambiente seleccionado. 32 Calificacin del equipo (V) 5. Calificacin del funcionamiento (C.F., P.Q.) El proceso en donde se demuestra que un instrumento funciona de acuerdo a la especificacin adecuada para su uso rutinario. 33 Calificacin del equipo (VI) 6. Calificacin del mantenimiento (C.M., M.Q.) El proceso de revisin peridica. Cualquierreparacin, ajuste, y otro servicio debe ser debidamente registrado en la documentacin correspondiente. 34 PRECISION35 MEDIDAS DE LA PRECISION Definiciones Repetibilidad. Precisin esperada bajo las mejores condiciones, a intervalos cortos de tiempo (en un mismo da) en un mismo laboratorio, efectuado por el operador designado con el mismo instrumentoPrecisin intermedia (ISO 1994). Grado de dispersin de resultados obtenidos en diferentes tiempos (en diferentes das) de un ensayo o anlisis, efectuado por el mismo operador y el mismo instrumento . Reproducibilidad. Precisin esperada para la medicin de un analito en una muestra, efectuada en diferentes laboratorios, a diferentes tiempos, por diferentes operadores y con diferentes instrumentos. 36 Diseo de datos para la estimacin de la repetibilidad y la precisin intermedia. RplicasDas 1 23 .jp 1 2 3 : m xij Medias S2 S21 S22S23 . S2j. S2p 1x2x3xjxpx37 INTERPRETACION DE RESULTADOS PRECISION ANOVA . . .2 1= = x x. . .2 1x x=Repetibilidad RSD% Precisin Intermedia Control Cx x.A outlier A A Estable 4 das B Revisin Nuevos estndar Varianzas iguales ? SI NO A B 38 niDa 1Da 2Da 3Da 4Da 5 10.212292110.203246480.224911550.211939740.23549286 20.216705520.216662730.23266560.216953850.23973896 30.217384280.218054540.233005030.229068030.24091835 40.218627060.21875840.233626410.234688160.24958395 50.222733560.220819610.241192170.236643390.2510824 60.226325850.222698550.246096460.237572080.25457247 70.229853150.227040260.256309690.237596740.2731622 80.22986310.227748750.262578670.239362020.27506941 90.238246820.232577240.264962270.246673660.28589554 100.240025080.242069820.275254730.251734320.28632261 EVALUACION DE LA PRECISIN EN LA DETERMINACIN DE ARSENICO EN AGUAS SUBTERRNEASPOR AA DE LLAMA Absorbancias medidas durante 5 das de una muestra de agua conteniendo 24 ppm de arsnico total.39 A) Test de Bartlett Parmetro a calcular ((

|.|

\|= = =21211ikiikiiLnS LnSCM v vvi: grados de libertad de cada serie de resultados S2i: es la desviacin estndar de cada serieS2 varianza agrupada, est dado por la siguiente expresin: SSi ii22= vvCriterio: si Mr0.95 , las varianzas son heterogneas (hay heterocedasticidad) APLICACIN NUMRICA Para problema anterior, son las varianzas homogneas? 41 23456 239.087.5142202266 315.427.839.250.762.0 49.615.520.625.229.5 57.1510.813.716.318.7 65.828.3410.412.113.7 74.996.948.449.710.8 84.436.007.188.129.03 94.035.346.317.117.80 103.724.855.676.346.92 k v Test de Hartley. Comparacin de Varianzas Tabla de valores de r al 95 % de nivel de confianza. k es el nmero de varianzas y v son los grados de libertad para cualquier serie. 42 Resultados del Test de Bartlett: M = 6.44 Es menor que la _2 0.95 =9.49 Las varianzas son homogneas hay repetibilidad. Evaluacin de la repetibilidad y la precisin intermedia se realiza a travs del ANOVA 1F. Resultados del Test de Hartley: rc= 4.27 r0.95= 7.11 Se verifica que las varianzas son homogneas 43 Fuente de variacionS.C.G.L.C.M.Fc F1-o/2

o=0.05 Entre das0.0094849740.00237111.89553.01 residual (intra-das)0.00897027450.000199total0.0184552449TABLA ANOVA 1F0.20.220.240.260.280.30 2 4 6 8 10Existen diferencias entre los das. Se observa que las medias varan mucho en los ltimos 3 das.Graficando los intervalos de confianza por da se pueden ver dnde estn las diferencias.A Das44 Repetibilidad: expresada como RSD% a partir de la raz de C.M. residual y la media global de las absorbancias. RSDr%= 5.94Precisin intermedia como varianza:Existen diferencias significativas entre las medias. Puede existir un error sistemtico al pasar de un da a otro. El suministro de energa fallaba frecuentemente durante el desarrollo de los experimentos. Cada serie de experimentos se realiz sin ninguna interrupcin de la energa. Esto confirma que para la repetibilidad o varianza intra-das la precisin de la medicin fue la misma. No as en las medias por da.Componente de la varianza entre das sD2=0.00022;p es el nmero de das; N es el nmero total de mediciones. = 10 |||||.|

\|((

=== =1/ ) (2 ^~1 122pN n NSrnCM CMsi jijr DD2 2 2) ( r D T Is s s + =RSDI%=8.3Poca precisin intermedia : 45 CONTROL DE CALIDAD DE LA REPETIBILIDAD Y LAS MEDIAS POR DAS LC =S B LIS B LS34==Lmite central: Lmites superior e inferior: Lmites de promedios LC+A3Sprom0.251066320.251066320.251066320.251066320.25106632 LC-A3Sprom0.224389930.224389930.224389930.224389930.22438993 Lmites deDesv. Estd. B3* Sprom0.02340990.02340990.02340990.02340990.0234099 B4* Sprom0.003810910.003810910.003810910.003810910.00381091 Para SrPara medias X LC~=S A LC LIS A LC LS33 =+ =Media global 00.0050.010.0150.020.0251 2 3 4 5 6DiaS0.20.210.220.230.240.250.260.271 2 3 4 5 6DiaRi proomedioRepetibilidadMedias46 0.975 1.032 1.099 1.182 1.287 1.427 1.628 1.954 2.659 A3 10 9 8 7 6 5 4 3 2 n 1.7160.284 1.7610.239 1.8150.185 1.8820.118 1.9700.030 2.0890 2.2660 2.5680 3.2670 B4B3 Factores utilizados en las cartas de control para la repetibilidad y las medias 47 APLICACION NUMERICASe quiere hacer un estudio de la precisin del mtodo voltameperomtrico en la determinacin de plomo en sangre. Para ello se prepar una muestra y se analizdurante 4 das consecutivos. Los resultados se muestran en la siguiente tabla. RplicasDas 12 3 4 1 2 3 10.5 10.510.610.6 10.4 10.810.810.5 10.310.610.510.3 Media S Evale la precisin de los resultados. Exprese la repetibilidad como desviacin estndar relativa %.Grafique los intervalos de confianza y elabore una carta de control. Interprete los resultados. 48 LINEALIDAD Y RANGO 49 Definiciones Linealidad: funcin de calibracin de un mtodo que responde a una lnea recta. Rango: intervalo de concentraciones donde la funcin de calibracin es lineal. Es el intervalo de concentracin analtico para la determinacin del analito en la muestra. 50 Valores caractersticos de dispersin de la curva de calibracin Desviacin estndar. residual (Dispersin de los valores de medicin en relacin de la recta de regresin):( )2 nyysn1 iiyx== 2 ny x b y a ysi i i2iyx = Precisin del modelo de calibracin o del mtodo para regresin lineal simple: 100 %/ysRSDy x=medicionescalculados valores y==iyCoeficiente de variacin del mtodo relacionadoal centro del intervalo de trabajo 51 Intervalo de confianza de un valor de y calculadoYk

( )( )=+ = Aniiky x f kx xx xns t Y122/ ; 975 . 0152 Intervalo de confianza de la curva de regresin y valores outliers. Extrapolacin con menos precisin. -20246810-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10XYI.C. en() es lo ms estrecho. En este punto, la prediccin es la ms precisa

y ; xGrfica con Yk Ayk Yk: Punto definido en la recta de regresin 53 Funcin de analisis Calibracin: Se determina el valor desconocido de medicin a travs del valor de concentracin Anlisis: Se determina la concentracin desconocida a travs del valor de medicin conocido.La funcin de anlisis es la inversa de la funcin de calibracin.x b a y + =ba yx=0 2 4 6 8 0123456789 Conc. Valor de medicin 54 ANOVA EN REGRESIN LINEAL Suma de cuadrados, fuente de variacin FrmulasGrados delibertad SST, Total yi2 n SSM , Median1 SScorr ,M corregidan-1 SSmodel, Modelop-1 SSRs, Residualn-p SSLOF, Falta de ajustef-p SSpe , Err. Exp. puron-f 2y( )2 y yi( )2 y yi( )2i iy y( )2i iy y( )2i iy yn: nmero de lecturas en y; p: nmero de coeficientes de regresin; f: niveles de concentracin55 Diseo experimental ANOVA en ARL SSTSSMSScorrSSmodelSSRSSLOFSSpen n-1 1 p-1 n-p f-p n-f 56 Identificacin de variablesx b b y1 0 + =iyyy x iyyi 57 Ejemplo Los datos para una curva de calibracin en la determinacin voltamperomtrica de hierro son los siguientes: X /ppm: 0, 1, 2, 2Y/A: 0.3, 2.2, 3, 4

58 X mg/Lyp1yp2yp3yp4y promedioSyi 100.193888760.18906120.205886930.189594060.194607740.00782385 200.368639770.386041390.381413920.375749820.377961220.00750533 300.57959140.57476220.577154170.573399680.576226860.00272753 400.776285590.766128780.77884530.786247650.776876830.0083178 501.004893820.952977960.983412190.986272990.981889240.02149891 601.169928331.164537391.177577451.175284971.171832030.00582433 Estudio del Modelo Lineal de calibracin en la determinacin de un pesticida por GC-FID en aguas contaminadas, utilizando tetracosano (30ppm) como estndar interno.Razn de reas de pico, rplicas, promedio y desviacin estndar para diferentes concentraciones de estndar de pesticida. Test de homogeneidad de varianzas:Bartley:M= 11.07 y _2=11.09 Hartley: rc= 62.12 y r0.95= 62.00 Varianzas son heterogneas ?. Aplicamos la regresin ponderada 59 Pendiente (b1)0.01957821 Intercepto (b0)-9.74E-03 Coeficienter20.99957032 Varianza Residual (S2x/y)1.9616E-05 S(b0)0.00618558 S(b1)0.00020296 Resultados de la regresin ponderada Buena linealidad: 99.96%Test de significancia del intercepto: La hiptesis nula es H0: b0=0 y el valor calculado de t es tc = 1.58. Al comparar con el valor 2.776 correspondiente a t0.975y 4 grados de libertad, se observa que es menor, lo que significa que la hiptesis nula es aceptada y se puede afirmar que la lnea pasa por el origen. En estas condiciones el modelo de la curva de calibracin es: p= 0.019578 X 00bcSbt =60 VERIFICACION DEL AJUSTE LINEAL Para verificar la validez del modelo lineal, se aplica el ANOVA SSREG y yij ij= ( )2SSR y yij ij= ( )2MSSSREGp=1SSSRn p2=VariacinSuma de cuadradosGLCuadrtica media Modelo Regresin P-1 n-p totalcMSMSF=Clculo de Fc Si Fc > F(p-1,n-p) el modelose ajusta a una lnea recta61 Fuente VariacinglSCvarianzasFcF0.95 Regresin10.75930.75931842510.01 Residual40.00024E-05 Total50.765 RESULTADOS DE ANOVA PARA LA REGRESIN El modelo es lineal. 00.20.40.60.811.21.40 20 40 60 80mg/L estandar CocanaRazn reas de pico62 =ii issvv22100 %2 2/+=i iy xglobaly ws S nRSD0.000142 2.3 % La precisin del modelo se mide por la desviacin estndar global (incluye la varianza residual S2x/y y la varianza agrupada s2 asociada a las reas de pico) relativa al promedio ponderado de la razn de las reas de los picos de los estndares. Precisin del modelo linealBUENA PRECISION RSD%< 5 % 63 -0.008-0.006-0.004-0.00200.0020.0040.0060.0080.010 20 40 60 80Verificacin de linealidad por grfica de residuales e res SE OBSERVA LA TENDENCIA A LA PERIDIOCIDAD, INDICANDO LA LINEALIDAD.64 Control de Calidad de la Curva de Calibracin La repetibilidad de la curva de calibracin se realiza a travs de la carta de control representada por el intercepto y la pendiente con sus intervalos de confianza, a como se muestra en la figura siguiente: Elipse correlaciona b0 y b1 Ab0 = (F0.975; 1,n-2 S2b0) Ab1 = (F0.975; 1,n-2 S2b1) b0 b1 b0-Ab0 b0+Ab0 b1-Ab1 b1+Ab1 Se elabora la curva de calibracin con 10 puntos. Con los coeficientes del modelo y sus intervalos de confianza se elabora la carta de control. Luego se repite la curva de calibracin durante un perodo de 5 das, y los valores de b0 y b1se ubican en la carta de control. Los puntos deben quedar dentro de la elipse. 65 Descripcin del modelo de control de calidad Intervalo de confianza simultneo de b0 y b1 est dado por Mendel y Linnig (Anal. Chem. 29 (1957) 743): = + + 02 , 2222)1 1(2)1 1)(0 0( 22)0 0(nF s aix a aix a n o o o o = + +0 2 22 , 22 2 21 1 020 n i iF s x A x A A nAA0 = a0 - o0 A1 = a1 o1 A0 A1 Los puntos (A0,A1) deben caer dentro 66 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 0.0105 0.034 0.0615 0.086 0.1158 0.1377 0.1549 0.1897 0.2105 0.2383 0.2661 CA Grfico de control b1, b00.001250.006250.011250.016250.003 0.0031 0.0032 0.0033pendiente (b1)intercepto (b0)b1 0.00316898

0.0032 b0 0.01005909

0.0104 CC para linealidad de hierro en aguas 67 LIMITE DE DETECCION Y DE CUANTIFICACION 68 Estimacin de LD Y LC a partir de la repetibilidad de la seal del blanco (o matriz de la muestra) comparado con una seal producida por un estndar de concentracin muy diluida, donde seal sea ms de 3 veces la del ruido. A partir de lecturas de blanco y un estndar diluido EstdEstdYblanco blancoCYS YLD29 . 3 +=

EstdEstdYblanco blancoCYS YLC10 +=NYEstdYblanco 1191.445.218 2207.779.228 3207.085.07 4175.54.222 5187.826.044 6187.897.229 7179.425.744 8179.065.355 92007.099 10208.135.972 Y promedio 192.4116.1181 SY 12.61046781.41894871 Datos en V obtenidos CG-FID para un pesticida en un efluente de aguas residuales. Cstd= 4 ppm. LD=0.22 LC=0.42 69 Proceso de evaluacin del LD y de LC usando las tcnicas GC y HPLC Estndarystd > 3 R de Cstd Seal de Ruido (R) YR 3 >RstdYYystd Medido de pico a pico 70 LIMITE DE DETECCION A PARTIR DE LA CURVA DE CALIBRACIN POR ADICIN DE ESTNDAR 1029 . 3bS YLDb blanco +=1010bS YLCb blanco +=56.76 380 0.9999 10.119 1.46 0.25 ParmetroPendiente b1 Intercepto b0 Coeficienter2 Var. Residual S2x/y Sb0 Sb1 0 10 20 30 40 379.7 934.9 1520.2 2057.4 2655.1 Cstd/ppm 28.1 252.4 157.6 385.4 267.9 Y/VSY 0.1 mL de muestra de agua contaminada. Estndar de pesticida de 1000 ppm LD= 0.19 LC= 0.37 71 Agua destilada TIEMPO R ystd LD Caso de absorcin atmica,espectrofotometra UV/V. 72 R C ( )22/=ny ySiy xClculo de LD a travs de la varianza residual de la curva de calibracin por adicin patrn. x b b y1 0 + =1/29 . 3bS YLDy x Std +=En un dominio de concentraciones de la linealidad. Se dice que la varianza residual es debida a efectos de la matriz y el ruido instrumental.73 APLICACION NUMERICA En la determinacin voltamperomtrica de hipoclorito en aguas, se realiza una curva de calibracin de soluciones estndares puros, Los resultados para la preparacin de la curva son los siguientes datos: ppm0.51.03.06.0 A0.180.410.710.91 Encuentre el modelo de calibracin. Calcule la desviacin estndar del intercepto. Evale los valores de LD y LC. Comente los resultados.74 EXACTITUD DEL METODO 75 EXACTITUD DE UN METODO Para evaluar la exactitud de un mtodo se utilizan muestras de referencia certificadas (trazables con patrones internacionales). El bias o sesgo es una medida del error sistemtico y se calcula como la desviacin(c) de un resultado o promedio de resultados (x) con respecto al valor de referencia expresado como porcentaje. c= (x-)100/ Se hace una comparacin entre los resultados obtenidos por el mtodo y el valor de referencia (utilizando la prueba de hiptesis) y si hay diferencias significativas se evala el error sistemtico. APLICACION NUMERICA Se quiere evaluar la exactitud del mtodo de Kjeldhal para la determinacin del porcentaje de nitrgeno en una muestra vegetal certificada que declara 21.81% de nitrgeno. Los resultados obtenidos son los siguientes: 20.89, 21.00, 21.1, 20.89, 21.00. Existen errores sistemticos? En caso afirmativo, cul es el bias? Corregir resultado. 76 DETECCION DE ERRORES SISTEMATICOS POR REGRESION LINEAL Si se correlacionan los valores de referencia de muestras certificadas a diferentes niveles de contenido del analito con los resultados del mtodo a ensayar, es posible detectar errores constantes y proporcionales. Los criterios son los siguientes: b0 = 0b1 = 1Ninguno 00 = b11 = b00 = b11 = b00 = b 11 = bErrores Proporcionales Constantes Los dos tipos 77 APLICACION NUMERICA Se quiere evaluar la exactitud de la determinacin de nitrgeno por el mtodo de Kjeldahl. Se utilizan 4 muestras vegetales de referencia con diferentes niveles de contenido de nitrgeno. Los resultados se presentan en la siguiente tabla: Resultados8.125.373.457.21 Referencia8.205.103.106.85 Existen errores sistemticos? De Qu tipo? Indicaciones para la solucin: calcular los parmetros de regresin b0 y b1. Plantear las hiptesis b0=0 y b1=1. Calcular el parmetro tc y compararlo con el valor t0.975. El parmetro tc se calcula por las siguientes ecuaciones: 000bcSbt=111bcSbt=( )=22/ 21x xSSiy xb78 RECOBRADO Y EVALUACION DE INTERFERENCIAS (EFECTO DE MATRIZ) Los componentes de la matriz pueden provocar un efecto depresor o intensificador de la seal analtica o efecto de matriz. Para minimizar este efecto se utiliza el mtodo de adicin patrn en la curva de calibracin. Cx=|b0/b1| =b0+b1C 79 Deteccin del efecto de matriz y porcentaje de recobrado AP CCN Concentraciones seal AP CCN seal Concentraciones ap=b0+b1C ccn=b0+b1C Efecto depresor Efecto intensificador Rc>100 Rc2Sy las interacciones son significativas 88 N0 ExperimentosO FM OxFM'Y- PPB B11 2 3 PROM Y S1 -1 -1 1 4.76828 4.9696 5.59679 5.11155 0.43212 1 -1 -1 5.73631 5.4375 5.20886 5.460877 0.26453 -1 1 -1 5.78117 5.3524 5.45704 5.530203 0.22364 1 1 1 5.65369 5.7652 5.58096 5.6666 0.0928EFECTOS EFO0.24286167EFFM0.31218833EFOxFM-0.1064650.50647122 2 S= -0,6-0,4-0,200,20,40,6EFO EFFM EFOxFMEFECTO DE 2 FACTORES(ANALISTA, COLUMNADE CADMIO) EN LA DETERMINACIN DE NITRATOS EN AGUAS