desarrollo y validación de métodos analíticos para la determinación

Download Desarrollo y validación de métodos analíticos para la determinación

Post on 06-Jan-2017

216 views

Category:

Documents

0 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON

FACULTAD DE MEDICINA

DESARROLLO Y VALIDACION DE METODOS ANALITICOS PARA LA DETERMINACION DE

GATIFLOXACINA EN LIQUIDO SEMINAL DE PACIENTES CON INFERTILIDAD

M.C. LUCIA YARELI COLUNGA GONZALEZ

Como requisito parcial para obtener el Grado de DOCTOR EN CIENCIAS con Especialidad en

Qumica Biomdica

Febrero del 2005

1 0 8 0 1 2 6 6 9 9

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE NUEVO LEN

FACULTAD DE MEDICINA

DESARROLLO Y VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS PARA LA

DETERMINACIN DE GATTFLOXACINA EN LQUIDO SEMINAL DE

PACIENTES CON INFERTILIDAD

Por

M.C. LUCA YARELICOLUNGA GONZLEZ

Como requisito parcial para obtener d Grado de DOCTOR EN CIENCIAS coa Especialidad

en Qumica Biomdica

Febrero, 2005

T

^ o 5

2

DESARROLLO Y VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS PARA LA DETERMINACIN DE GATIFLOXACINA EN LQUIDO SEMINAL DE

PACIENTES CON INFERTILIDAD

Aprobacin de la Tesis:

DRA. MA. D&LA-fcU l SALA/AR CAVAZOS Director de Tesis

DR. PEDROfiLS LPEZ DE ALBA Co-Director de Tesis

DRA. NOEMI W ^ S M A N DE TORRES Comisin de Tesis

DRA. LEONOR MARIA BLANCO JEREZ Comisin de Tesis

DR. RICARDO $ ALAZAR ARANDA Comisin de Tesis

DR. DIONICIO A. GALARZA DELGADO Subdirector de Estudios de Posgrado

DESARROLLO Y VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS PARA LA

DETERMINACIN DE GATIFLOXACINA EN LQUIDO SEMINAL DE

PACIENTES CON INFERTILIDAD

Presentado por:

M.C. Luca Yareli Colunga Gonzlez

El presente trabajo se realiz en el Departamento de Qumica

Analtica de la Facultad de Medicina de la Universidad

Autnoma de Nuevo Len, bajo la asesora de la Dra. Mara de la

Luz Salazar Cavazos.

FIRMA

DIRECTOR

Dra. Ma. de la Luz Salazar Cavazos

A mis padres, Lenn Colunga Molina y

Esperanza del Carmen Gonzlez Barrn,

cuyo amor, ejemplo y proteccin han

alentado mi ser, para seguir adelante.

Honra a tu padre y a tu madre, para que tus das se

alarguen en la tierra qutJehov tu Dios te da. xodo 20:12

A Dios, porque en l, todo me es posible.

A mis padres por apoyarme, bendecirme y cuidarme desde el inicio de mi existencia.

A mi esposo por apoyar mi superacin personal y compartir metas e ideales.

A mi eterno compaero de posgrado, por hacer de los estudios de maestra y doctorado,

un reto ms sencillo (Dnde es el "posdoc"?).

A mi comisin de tesis, integrada por: Dra. Mara de la Luz Salazar Cavazos, Dr. Pedro

Luis Lpez de Alba, Dra. Noemi Herminia Waksman de Torres, Dra. Leonor Mara

Blanco Jerez y Dr. Ricardo Salazar Aranda, por su tiempo, disposicin, paciencia y

conocimientos compartidos.

A la Dra. Mara Guadalupe Gallegos de Lerma, por invitarme a participar en su

protocolo, y al personal de laboratorio de Andrologia, por "capturar" las muestras.

Ala Dra. Noemi Waksman, j efe del departamento de Qumica Analtica, par su amistad,

direccin, apoyo y deferencia.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa por el apoyo econmico personal.

A SEP-PROMEP/103.5/022346 y PAICYT CA&35-04 por el apoyo econmico para la

realizacin de esta tesis.

A todas aquellas personas, sin omisin, que me apoyaron tcnica, cientfica, moral y/o

espiritualmente durante el desarrollo de este trabajo.

RESUMEN

M.C. Luda Yareli Colunga Gonzlez Fecha de graduacia: Febrero del 2005

Universidad Autnoma de Nuevo Len

Facultad de Medicina

T t u l o d e l e s t u d i o : DESARROLLO Y VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS PARA LA DETERMINACIN DE GATIFLOXACINA EN LQUIDO SEMINAL DE PACIENTES CON INFERTILIDAD

Nmero de pginas: 107 Candidata pan i el grado de Doctor en Ciencias con especialidad en Qumica Biomdica

rea de estudio: Qumica Analtica.

Propsito y Mtodo de Estudio U Galifloxacina es una 8-metoxifluoroc|unolon&, que se ha utilizado como tratamiento de

infecciones del tracto genital masculino, causadas por Chlamydia y Mycoplasma, los cuales, se han encontrado presentes en casos de infertilidad donde la infeccin crnica es asintomtica. Por lo cual, resultan de sumo inters. Canto las pruebas para la deteccin de estos microorganismos, como las pruebas para supervisar los tratamientos empleados para su erradicacin.

El objetivo de este trabajo fue desarrollar y validar mtodos analticos para determinar gatifloxacina en liquido seminal. Las tcnicas utilizadas fueron la Espectrofluorimetra, la Espectroscopia UV-V1S y la Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (HPLC) con detectores de arregla de diodos (DAD) y de fluorescencia. Para la comparacin de los mtodos se consideraron dos parmetros: la sensibilidad y la precisin.

El tratamiento de muestra empleado fue la precipitacin de protenas con acetonitrilo. Con el mtodo de Espectrofluorimetra, se encontr un limite de cuantificacin 0.2 pg/mL. La precisin del mtodo fue de 1.3 % y el porcentaje de recuperacin de 62 % 10. La tcnica de Espectroscopia UV-VIS no fue lo suficientemente sensible para la determinacin del frmaco en la matriz biolgica. Y por ltimo, empleando HPLC. los lmites de cuantificacin para el DAD y de fluorescencia fueron 2 J y 0.03 ng/mL, respectivamente, la precisin de los mtodos fue de 3.4 % para DAD y 2.8 % para fluorescencia. El porcentaje de recuperacin fue de 95 % 10 para ambos. Las muestras de lquido seminal son estables al menos por 60 dias en congelacin a10 eC.

Conclusiones y Contribuciones El mtodo desarrollado y validado para HPLC con detector de fluorescencia presenta mayor

sensibilidad El mtodo desarrollado y validado por Espectrofluorimetrfa es m i s rpido, sencillo y econmico. Ambos permiten la cuantificacin de gatifloxacina en lquido seminal de pacientes en tratamiento y podran aplicarse a otras muestras biolgicas, si se desarrolla el tratamiento para las mismas.

FIRMA DEL DIRECTOR

Capitulo Pgina

1. INTRODUCCIN 1

1.1 Quinolonas 2

1.2 Fluoroquino lonas 4

1.2.1 Relacin estructura actividad 5

1.2.2 Efectos adversos 6

1.3 Gatifloxacina 8

1.3.1 Propiedades tsicas y qumicas 8

1.3.2 Relacin estructuia actividad 9

13 .3 Efectos adversos 10

1.3.4 Fanuacocintica 1 ]

1.3.4.1 Absorcin 11

1.3.4.2 Distribucin 12

1.3.4.3 Metabolismo 12

1.3.4.4 Eliminacin 13

1.3.5 Farmacodinamia 14

13.6 Mecanismo de accin 14

13.1 Mecanismos de resistencia ' 16

1.3 8 Actividad in vitro

1.4 Chlamydia y Mycoptasma 18

1.5 Caractersticas del Lquido Seminal en Condiciones Normales 19

1.5.1 Caractersticas Morfolgicas Normales del Espermatozoide 21

1.5.2 Alteraciones del Lquido Seminal en la Infeccin por Chlamydia y/o Mycoplasma 23

1.5.3 Esquemas Generales de Tratamiento para Chlamydia y/o Mycopktsma 24

1.6 Antecedentes 25

1.6.1 Mtodos para Determinar Gatifloxacina 27

1.6.2 Presencia de Aditivos en la Fase Mvil 30

1.6.2.1 Reactivos de par inico de la misma carga que la muestra 30

1.6.2.2 Cromatografa de Ion-supresin 31

1.7 Justificacin 32

l .8 Hiptesis 32

1.9 Objetivo General 32

1.10 Objetivos Especficos 33

2 MATERIALES Y MTODOS 34

2.1 Equipo 34

2.2 Material 35

2.3 Reactivos 35

2.4 Mtodos 36

2.4.1 Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin con Detectores de Arreglo de Diodos y de Fluorescencia 36

2.4.1.1 Condiciones Cromatogrficas 36

2.4.2 Tratamiento de la Muestra 28

2.4.2.1 Fraccionamiento de la Muestra 38

2 4.2.2 Preparacin de la Muestra 38

2.4.2.2.1 Extraccin en Fase Slida 38

2.4.2.2.2 Desproteinizacin con acetonitnlo 39

2.4.3 Construccin de Curvas de Calibracin para HPLC con DAD y Fluorescencia en Lquido Seminal 40

2.4.4 Espectroscopia UV-VIS 40

2.4.4.1 Seleccin del Disolvente 40

2 4.4.2. Efecto en el Espectro de Absorcin debido a la Variacin del pH 41

2.4.4.3 Anlisis de iatifloxacina por Espectroscopia UV-VIS 41

2 4.5 Espectrofl uorimetria 42

2 4.5.1 Anlisis de Gatifloxacina por Espectrofluorimetra 42

2.4.5.2 Efecto en el Espectro de Emisin debido a La Variacin de pH 42

2 4.6 Validacin del Mtodo 43

2.4.6.1 Lmealidad 43

2 4.6.2 Lmite de Deteccin 43

2.4 6.3 Lmite de Cuantificacin 43

2.4.6.4 Precisin 46

246.5 Exactitud 47

2.4.6.6 Robustez 47

2.4.6.7 Estabilidad de la Muestra 51

2.4.7 Comparacin de los Mtodos de Anlisis 51

2 4.8 Cuantificacin de Gatifloxacina en Lquido Seminal de Pacientes 52

3 RESULTADOS 53

3.1 Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin con Detectores de Arreglo de Diodos y de Fluorescencia 53

3.2 Tratamiento de la Muestra 55

3.2.1 Fraccionamiento de la Muestra 55

3.2.2 Preparacin de la Muestra 55

3.2.2.1 Extraccin en Fase Sda 56

3.2.2.2 Despfoteinizacin con Acetonitrilo 57

3.3 Validacin de HPLC con DAD y Fluorescencia eo Lquido Seminal. 57

3.3.1 HPLC con DAD 57

3.3.1.1 Cromato grama 57

3.3.1.2 Linealidad, Lmites de Deteccin y Cuantificacin 58

3.3.1.3 Precisin y Porcentajes de Recuperacin 59

3.3.1.4 Robustez 59

3.3.1 5 Selectividad 61

3.3 .2 HPLC con Detector de Fluorescencia 61

3.3.2.1 Cromato grama 61

3.3.2.2. Linealidad, Limites de Deteccin y Cuantificacin 62

Recommended

View more >