Validación de métodos Bioanaliticos

I. INTRODUCCIÓN

Esta guía proporciona asistencia a los patrocinadores de investigación solicitudes de fármacos nuevos (IND), nuevos solicitudes de fármacos (NDA), solicitudes abreviadas de fármacos nuevos (ANDA), y suplementos de desarrollo de información bioanalítico validación del método utilizado en farmacología clínica en humanos, biodisponibilidad (BA) y bioequivalencia (BE) que requieren estudios de farmacocinética (PK) de evaluación. Esta guía también se aplica a los métodos bioanalíticos utilizados para los no-humanos farmacología / toxicología estudios y los estudios preclínicos. Para los estudios relacionados con el proceso de aprobación de medicamentos veterinarios, esta guía sólo se aplica a BA sangre y orina, BE, y los estudios PK.

La información en esta orientación se aplica generalmente a los procedimientos bioanalíticos tales como gas cromatografía (GC), de alta presión cromatografía líquida (LC), combinado GC y LC masa espectrométricos (MS), tales como los procedimientos de LC-MS, LC-MS-MS, GC-MS y GC-MS-MS realiza para la determinación cuantitativa de fármacos y / o metabolitos en matrices biológicas tal como sangre, suero, plasma, u orina. Esta orientación también se aplica a otros métodos bioanalíticos, tales como procedimientos inmunológicos y microbiológicos, y a otras matrices biológicas, tales como tejido y muestras de piel.

Esta guía ofrece recomendaciones generales para la validación de métodos bioanalíticos. La recomendaciones puede ajustarse o modificarse en función del tipo específico de método analítico utilizado.

II. ANTECEDENTES

Esta guía ha sido elaborada sobre la base de las deliberaciones de dos talleres: (1) Analítica

Métodos de validación: biodisponibilidad, bioequivalencia, y farmacocinéticas (celebradas en diciembre 3B5, 19902) y (2) los métodos bioanalíticos Validación CA Revisar Con una década de progreso (que tuvo lugar de enero 12B14, 20003).

Métodos analíticos selectivos y sensibles para la evaluación cuantitativa de fármacos y sus metabolitos (Analitos) son fundamentales para el buen desarrollo de estudios preclínicos y / o clínicos y biofarmacia estudios de farmacología. Validación del método Bioanalytical incluye todos los procedimientos que demuestren que un método particular usado para la medición cuantitativa de analitos en una matriz biológica dada, tal como sangre, plasma, suero u orina, es fiable y reproducible para el uso previsto. Los fundamentales parámetros para esta validación incluyen (1) la exactitud, precisión (2), la selectividad (3), la sensibilidad (4), (5) reproducibilidad y la estabilidad (6). La validación implica documentar, a través del uso de laboratorio específica investigaciones, que las características de funcionamiento del método son adecuados y fiables para la destina aplicaciones analíticas. La aceptabilidad de los datos analíticos se corresponde directamente con los criterios utilizado para validar el método.

Métodos publicados de análisis a menudo se modifican para adaptarse a los requisitos del laboratorio que realice el ensayo. Estas modificaciones deben ser validados para asegurar un rendimiento adecuado de la analítica método. Cuando se realizan cambios en un método validado previamente, el analista debe ejercer juicio en cuanto a la cantidad de validación adicional que se necesita. Durante el curso de un medicamento típico programa de desarrollo, un método definido bioanalítico sufre muchas modificaciones. La evolución cambios necesarios para apoyar los estudios específicos y diferentes niveles de validación demostrar la validez de un ensayo de rendimiento. Los diferentes tipos y niveles de validación se definen y se caracterizó como sigue:

A. Validación completa

· Validación completa es importante en el desarrollo e implementación de un método para bioanalítico la primera vez.

· Validación completa es importante para una entidad nueva droga.

· La validación completa del ensayo revisado es importante si metabolitos se añade a una ya existente ensayo para la cuantificación.

B. Validación Parcial

Validaciones parciales son modificaciones de los ya validados los métodos bioanalíticos. Convalidación parcial puede variar desde tan poco como uno intra-ensayo de exactitud y precisión de la determinación de una casi completa validación. Típicos cambios de métodos bioanalíticos que entran en esta categoría se incluyen, pero no están limitado a:

· Traslados método Bioanalytical entre laboratorios o analistas

· Cambio en la metodología de análisis (por ejemplo, cambio en los sistemas de detección)

· Cambio en el anticoagulante en la cosecha de fluido biológico

· Cambio en la matriz dentro de las especies (por ejemplo, el plasma humano a la orina humana)

· Modificación de los procedimientos de procesamiento de muestras

· Cambio de especies dentro de la matriz (por ejemplo, el plasma de rata a ratón plasma)

· Cambio de gama de concentración que

· Cambios en los instrumentos y / o plataformas de software

· Volumen limitado de la muestra (por ejemplo, el estudio pediátrico)

· Matrices Raras

· Selectividad demostración de un analito en la presencia de medicaciones concomitantes

· Selectividad demostración de un analito en la presencia de metabolitos específicos

C. Validación cruzada

La validación cruzada es una comparación de los parámetros de validación cuando dos o más métodos bioanalíticos se utilizan para generar los datos dentro del mismo estudio o en los diferentes estudios. Un ejemplo de validación cruzada sería una situación en la que un original método validado bioanalítico sirve como de referencia y el método bioanalítico revisado es el comparador. Las comparaciones deben hecho en ambos sentidos.

Cuando los análisis de la muestra dentro de un único estudio se llevó a cabo en más de un sitio o más de uno laboratorio, la validación cruzada con las normas de la matriz con púas y las muestras de sujetos debe realizarse en cada sitio o de laboratorio para establecer la fiabilidad entre laboratorios. La validación cruzada también deben ser considerarse cuando los datos generados utilizando diferentes técnicas analíticas (por ejemplo, LC-MS-MS vs ELISA4) en diferentes estudios se incluyen en una presentación regulatoria.

Todas las modificaciones deben ser evaluados para determinar el grado recomendado de validación. La laboratorio de análisis realización de farmacología / toxicología y otros estudios preclínicos para la regulación presentaciones deben cumplir con buenas prácticas de laboratorio FDA = s (GLP) 5 (21 CFR parte 58) y al sólidos principios de garantía de calidad en todo el proceso de pruebas. El método para bioanalítico humano BA, BE, PK, y los estudios de interacción farmacológica debe cumplir con los criterios establecidos en 21 CFR 320.29. La análisis de laboratorio debe tener un conjunto escrito de procedimientos normalizados de trabajo (PNT) para asegurar una sistema completo de control de calidad y seguridad. Los SOP deben abarcar todos los aspectos del análisis desde el tiempo de la muestra se recoge y se alcanza el laboratorio hasta que los resultados del análisis son los informó. Los SOP deben incluir también el mantenimiento de registros, la seguridad y la cadena de custodia de la muestra (Sistemas de rendición de cuentas que garanticen la integridad de los artículos de prueba), preparación de muestras y herramientas analíticas tales como los métodos, reactivos, equipo, instrumentación, y procedimientos para el control de calidad y verificación de resultados.

El proceso por el cual se desarrolla un método específico bioanalíticos, validado y utilizado en la rutina análisis de la muestra se puede dividir en (1) preparación de referencia estándar, (2) método bioanalítico desarrollo e implantación de procedimiento de ensayo, y (3) la aplicación de bioanalítico validado método para el análisis de drogas de rutina y los criterios de aceptación para la realización de un análisis y / o lote. Estos tres procesos se describen en las siguientes secciones de esta guía.

III. NORMA DE REFERENCIA

El análisis de los fármacos y sus metabolitos en una matriz biológica se lleva a cabo utilizando muestras adicionadas con calibración (de referencia) utilizando estándares y control de calidad (QC) muestras. La pureza de la referencia estándar que se utiliza para preparar muestras

enriquecidas pueden afectar a los datos de estudio. Por esta razón, una autenticada estándar de referencia analítico de identidad conocida y pureza se debe utilizar para preparar soluciones de conocida concentraciones. Si es posible, el patrón de referencia debe ser idéntico al analito. Cuando esto no sea posible, una forma química establecida (base o ácido libre, sal o éster) de pureza conocida se puede utilizar.

Hay tres tipos de patrones de referencia se utilizan generalmente: (1) los estándares de referencia certificados (por ejemplo, USP normas compendio), (2) los patrones de referencia suministrados comercialmente obtenido de una buena reputación fuente comercial, y / o (3) otros materiales de pureza documentado medida sintetizó mediante un análisis laboratorio o establecimiento comercial sí. La fuente y el número de lote, fecha de caducidad, certificados de análisis cuando estén disponibles, y / o evidencia interna o externamente generado de identidad y pureza debe aportarse para cada estándar de referencia.

IV. Desarrollo del método: análisis químico

El desarrollo de métodos y fase de establecimiento se define el análisis químico. La fundamental parámetros para la validación de un método bioanalítico son exactitud, precisión, selectividad, sensibilidad, reproducibilidad y la estabilidad. Las mediciones para cada analito en la matriz biológica debe ser validado. Además, la estabilidad del analito en muestras enriquecidas se debe determinar. Típico método de desarrollo y establecimiento de un método bioanalítico incluyen la determinación de (1) selectividad, (2) la exactitud, precisión, recuperación, (3) la curva de calibración, y (4) la estabilidad del analito en claveteado muestras.

A. Selectividad

La selectividad es la capacidad de un método analítico para diferenciar y cuantificar el analito en la presencia de otros componentes en la muestra. Por selectividad, análisis de muestras en blanco de la matriz apropiada biológicos (plasma, orina, u otra matriz) debe ser obtenida de al menos seis fuentes. Cada muestra en blanco debe hacerse la prueba de interferencia, y la selectividad debe ser asegurado en el límite inferior de cuantificación (LLOQ).

Las sustancias potencialmente interferentes en una matriz biológica son componentes endógenos de la matriz, metabolitos, productos de descomposición, y en el estudio actual, la medicación concomitante y otras xenobióticos exógenos. Si el método está destinado a cuantificar más de un analito, cada uno analito deben ser probados para asegurar que no hay interferencia.

B. Exactitud, Precisión y Recuperación

La precisión de un método analítico describe la cercanía de resultados de la prueba obtenidos por el método y el valor real (concentración) del analito. La precisión está determinada por duplicado análisis de muestras que contienen cantidades conocidas del analito. La precisión se debe medir utilizando un mínimo de cinco determinaciones por concentración. Un mínimo de tres concentraciones en el intervalo de concentración que se espera se recomienda. El valor medio

debe estar dentro del 15% del valor real excepto en LLOQ, donde no debe desviarse en más de 20%. La desviación de la media del valor real sirve como la medida de la precisión.

La precisión de un método analítico describe la proximidad de las medidas individuales de un analito cuando el procedimiento se aplica repetidamente para varias alícuotas de una única y homogénea volumen de matriz biológica. Precision debe medirse utilizando un mínimo de cinco determinaciones por concentración. Un mínimo de tres concentraciones en el intervalo de espera Las concentraciones se recomienda. La precisión determinada en cada nivel de concentración debe no exceda del 15% del coeficiente de variación (CV) excepto por el LLOQ, donde no debe superar el 20% de la CV. La precisión se subdivide en intraserial, intra-lote precisión o repetibilidad, que evalúa la precisión durante una serie de análisis individual, y entre distintas series, interbatch precisión o reproducibilidad, que mide la precisión con el tiempo, y pueden implicar diferentes analistas, equipos, reactivos y laboratorios.

La recuperación de un analito en un ensayo de la respuesta del detector es obtenido a partir de una cantidad de la analito añadido a y se extrae de la matriz biológica, en comparación con la respuesta del detector obtenido para la concentración real de la estándar auténtico puro. Se refiere a la recuperación de extracción de la eficiencia de un método analítico dentro de los límites de la variabilidad. Recuperación de la analito no necesita ser 100%, pero el grado de recuperación de un analito y del estándar interno debe ser coherente, preciso y reproducible. Experimentos de recuperación deben ser realizados por la comparación de los resultados analíticos para las muestras extraídas a tres concentraciones (bajo, medio, y alta) con las normas no extraídos que representan 100% de recuperación.

C. Calibración / Standard Curve

Una calibración (estándar) curva es la relación entre la respuesta del instrumento y conocido concentraciones del analito. Una curva de calibración debe ser generado para cada analito en la muestra. Un número suficiente de las normas se debe utilizar para definir adecuadamente la relación entre la concentración y la respuesta. Una curva de calibración debe ser preparada de la misma matriz biológica como las muestras en el estudio pretendía por adición con la matriz conocida concentraciones del analito. El número de normas utilizadas en la construcción de una curva de calibración será una función de la gama prevista de los valores analíticos y la naturaleza de la analito / respuesta. Las concentraciones de los estándares debe ser elegido sobre la base de la rango de concentración esperado en un estudio en particular. Una curva de calibración debe consistir en una pieza en bruto muestra (matriz de la muestra procesada sin patrón interno), una muestra cero (matriz de la muestra procesada con patrón interno), y de seis a ocho no cero muestras que cubre la esperada rango, incluyendo LLOQ.

1. Límite inferior de cuantificación (LLOQ)

El estándar más bajo de la curva de calibración debe ser aceptado como el límite de cuantificación, si se cumplen los siguientes requisitos:

C La respuesta del analito en el LLOQ debe ser al menos 5 veces la respuesta en comparación con la respuesta testigo. Pico del analito C (respuesta) deben ser identificables, discreto y reproducible conuna precisión de 20% y la exactitud de 80-120%.

2. Curva de Calibración / Standard Curve / concentración-respuesta

El modelo más simple que describa adecuadamente la relación concentración-respuesta se debe utilizar. Selección de ponderación y el uso de una ecuación de regresión complejo debe justificarse. Las siguientes condiciones se deben cumplir en el desarrollo de una curva de calibración:

C desviación # 20% de la concentración nominal de LLOQ

C # desviación del 15% de las demás normas que LLOQ de la concentración nominal

Por lo menos cuatro de los seis distintos de cero normas deben cumplir con los criterios anteriores, incluyendo el LLOQ y el estándar de calibración a la mayor concentración. Excluyendo el normas no debe cambiar el modelo utilizado.

D. Estabilidad

La estabilidad del fármaco en un fluido biológico es una función de las condiciones de almacenamiento, las propiedades químicas del fármaco, la matriz, y el sistema de recipiente. La estabilidad de un analito en una determinada sistema de la matriz y el recipiente sólo es pertinente para que el sistema de matriz y el contenedor y no debe extrapolarse a otras matrices y sistemas de contenedores. Procedimientos de Estabilidad debe evaluar la estabilidad de los analitos durante la recogida y manipulación de muestras, después de largo plazo (congelado a la almacenamiento previsto temperatura) ya corto plazo (mesa de trabajo, temperatura ambiente) de almacenamiento, y después de pasando por ciclos de hielo y deshielo y el proceso analítico. Las condiciones utilizadas en la estabilidad experimentos deben reflejar situaciones que puedan presentarse durante el manejo real de la muestra y análisis. El procedimiento también debe incluir una evaluación de la estabilidad del analito en la solución madre.

Todas las determinaciones de estabilidad debe utilizar un conjunto de muestras preparadas a partir de un stock recién hecho solución de analito en la apropiada libre de analito, libre de interferencias matriz biológica. Valores soluciones de los analitos para la evaluación de la estabilidad debe ser preparado en un disolvente apropiado a concentraciones conocidas.

1. Congelar y Descongelar Estabilidad

Estabilidad del analito debe ser determinada después de tres ciclos de congelación y descongelación. Por lo menos tres alícuotas a cada una de las concentraciones bajas y altas deben ser almacenados a la prevista temperatura de almacenamiento de 24 horas y se descongelaron a temperatura ambiente sin ayuda. ¿Cuándo completamente descongelado, las muestras deben volver a congelarse durante 12 a 24 horas bajo las mismas condiciones. El ciclo de congelación-

descongelación debe repetirse dos veces más, luego se analizó en el tercer ciclo. Si un analito es inestable a la temperatura de almacenamiento deseada, la muestra de estabilidad deben congelarse a-700C durante los tres ciclos de congelación y descongelación.

2. Corto Plazo Temperatura de Estabilidad

Tres partes alícuotas de cada una de las concentraciones bajas y altas deben ser descongeladas a habitación temperatura y se mantiene a esta temperatura de 4 a 24 horas (basado en la espera duración que las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente en el estudio previsto) y analizado.

3. Estabilidad a largo plazo

El tiempo de almacenamiento en una evaluación de la estabilidad a largo plazo debería exceder el tiempo entre la fecha de la toma de muestras primera y la fecha de análisis de la última muestra. Estabilidad a largo plazo se debe determinar mediante el almacenamiento de al menos tres alícuotas de cada uno de los bajo y alto concentraciones en las mismas condiciones que las muestras de estudio. El volumen de las muestras debe ser suficiente para el análisis en tres ocasiones separadas. Las concentraciones de todos las muestras de estabilidad debe ser comparado con la media de back-valores calculados para la normas en las concentraciones apropiadas desde el primer día de estabilidad a largo plazo pruebas.

4. De la estabilidad de la solución

La estabilidad de las soluciones madre de fármaco y el estándar interno debe ser evaluado en a temperatura ambiente durante al menos 6 horas. Si las soluciones madre son refrigerados o congelados Para El Periodo en Cuestión, la Estabilidad debe Ser documentado. Despues de la terminación de la Deseado Tiempo de storage, la Estabilidad debe Ser probada comparando el Instrumento Respuesta con la de las Soluciones Recién preparadas.

5. Post-preparativo Estabilidad

La Estabilidad de las Muestras procesadas, incluyendo El Tiempo de Residencia en El inyector automático, deberían determinar. La Estabilidad del Fármaco y el patrón interno sí debe evaluar Durante El Tiempo de Ejecucion esperado el párrafo Tamano del lote en las Muestras de Validación MEDIANTE la determination Concentraciones Sobre la base de estándares Certificación de calibración de original.

Aunque el Enfoque tradicional de la COMPARACION de los Resultados Analíticos de las Muestras almacenadas con los de las Muestras Recién preparadas sí ha mencionado en this Guía, Otra estadística los Enfoques basados en los Límites de confianza párrafo la evaluation de la Estabilidad de las Naciones Unidas analito = s en la ONU Matriz Biológica Se Puede utilizar. POE debe describir claramente el Método estadístico yNormas utilizadas. Validación Adicional Florerias INCLUIR la Investigación de Muestras de dosis Sujetos.

E. Principios de Validación de Metodos Establecimiento Bioanalytical y

· Los Lista de parámetros FUNDAMENTALES párr asegurar la aceptabilidad de la ejecucion de las Naciones Unidas Validación de Metodos bioanalíticos hijo la exactitud, la PRECISIÓN, selectividad, sensibilidad, reproducibilidad y la Estabilidad.

· Una Descripción Específica y detallada del Método bioanalítico debe Escrito servicio. ESTO Puede Ser-en- La Forma De Un protocolo sanitario, plan de Estudio, Informe y / o SOP.

· Cada paso en el Método servicios investigado párrafo debe determinar el Grado en Que ambiental, Matriz, material, o de las variables de Procedure pueden afectar a la estimación de analito en la Matriz desde el Momento de la Recogida del material de Hasta e incluyendo El Tiempo de Análisis.

· Puede Ser Importante Tener en Cuenta la variabilidad de la Matriz debido a la Naturaleza fisiológica de la Muestra. En el Caso de LC-MS-MS procedimientos basados en Medidas apropiadas Debén servicios adoptado párr Garantizar la Falta de Efectos de la Matriz a lo largo de la Aplicación del Método, especialmente si la Naturaleza de los Cambios de la Matriz de la Matriz utilizada Durante la Validación del Método.

· Un Método bioanalíticos Debén servicios validados Por El BSG o application. Todos Experimentos utilizados párrafo HACER afirmaciones o extraer Conclusiones about la Validez del Método Debén servicios presentados en Informe de las Naciones Unidas (informe Método de Validación).

· Siempre que sea posible, la misma matriz biológica como la matriz en las muestras intencionales debería ser usado para propósitos de validación. (Para los tejidos de disponibilidad limitada, como la médula ósea, matrices de proxy fisiológicamente apropiados puede ser sustituido.)

· La estabilidad del analito (fármaco y / o metabolito) en la matriz durante la recolección proceso y el período de almacenamiento de la muestra debe ser evaluado, preferiblemente antes de la muestra análisis.

· Para los compuestos con metabolitos potencialmente lábiles, la estabilidad del analito en la matriz de sujetos tratados (o especies) deben ser confirmados.

· La exactitud, precisión, reproducibilidad, función de respuesta, y la selectividad del método para sustancias endógenas, metabolitos y productos de degradación deben ser conocidos establecido para la matriz biológica. Para la selectividad, no debe haber evidencia de que el sustancia, ser cuantificados es el analito deseado.

· El rango de concentración en el que se determina el analito debe ser definida en el bioanalítico método, basado en la evaluación de las muestras reales de serie en toda la gama, incluyendo su variación estadística. Esto define la curva estándar.

· Un número suficiente de las normas debe ser utilizado para definir adecuadamente la relación entre la concentración y la respuesta. La relación entre la respuesta y la concentración Debe

demostrarse que ser continua y reproducible. El número de normas utilizadas debería ser una función de la gama dinámica y la naturaleza de la concentración-respuesta relación. En muchos casos, de seis a ocho concentraciones (con exclusión de los valores en blanco) puede definir la curva estándar. Las concentraciones más estandarizadas se puede recomendar para no lineal que para las relaciones lineales.

· La capacidad para diluir las muestras originalmente por encima del límite superior de la curva estándar debe ser demostrada por la exactitud y precisión los parámetros en la validación.

· En consideración de análisis de alto rendimiento, incluyendo pero no limitado a la multiplexación, multicolumna, y sistemas paralelos, suficientes muestras de control de calidad se debe utilizar para asegurar el control del ensayo. El número de muestras de control de calidad para asegurar el control correcto del ensayo debe ser determinado con base en el tamaño de ejecución. La colocación de las muestras de control de calidad deben ser juiciosamente considerado en la ejecución.

· Para los métodos bioanalíticos se considere válido, los criterios específicos de aceptación se debe establecer en avance y lograr la exactitud y la precisión para la validación de muestras de QC más el rango de las normas.

F. Recomendaciones específicas para la validación de métodos

· La curva estándar matricial debe constar de un mínimo de seis puntos estándar, excluyendo espacios en blanco, utilizando muestras individuales o repetido. La curva estándar debe cubrir el toda la gama de concentraciones esperadas.

Accesorio · curva estándar se determina aplicando el modelo más simple que adecuadamente describe la relación concentración-respuesta utilizando ponderación adecuada y estadística pruebas de bondad de ajuste.

· LLOQ es la concentración más baja de la curva estándar que se puede medir con exactitud y precisión adecuadas. El LLOQ deben establecerse con al menos cinco muestras independientes de estándares y determinar el coeficiente de variación y / o intervalo de confianza apropiado. El LLOQ debe servir como la concentración más baja en la curva estándar y no se debe confundir con el límite de detección y / o el control de calidad baja muestra. El más alto nivel se define el límite superior de cuantificación (ULOQ) de un método analítico.

· Para la validación del método bioanalíticos, la exactitud y la precisión debe ser determinada con un mínimo de cinco determinaciones por nivel de concentración (con exclusión de las muestras en blanco).

El valor promedio debería ser de ± 15% del valor teórico, excepto en LLOQ, donde se no debe diferir en más de ± 20%. La precisión en torno al valor medio no debe exceda del 15% de la CV, a excepción de LLOQ, donde no debe exceder del 20% de la CV.

Otros métodos de evaluación de la exactitud y precisión que cumplen estos límites pueden ser igualmente aceptable.

· La exactitud y la precisión con la que concentraciones conocidas de analito en la matriz biológica puede ser determinado debe ser demostrada. Esto se puede lograr mediante análisis de reproducir juegos de muestras de concentraciones conocidas de analito C QC muestras C a partir de una matriz biológica equivalente. Como mínimo, tres concentraciones que representa el entero rango de la curva estándar debe ser estudiado: una dentro de 3 veces el límite inferior de cuantificación (LLOQ) (muestra de control de calidad baja), uno cerca del centro (QC medio), y otro cerca de la parte superior límite de la curva estándar (QC alta).

· Informaron los datos de validación del método y la determinación de la exactitud y la precisión deben incluyen todos los valores atípicos, sin embargo, los cálculos de exactitud y precisión excluyendo los valores que están estadísticamente determinado como valores extremos también pueden ser reportados.

· La estabilidad del analito en la matriz biológica a temperaturas de almacenamiento deben ser destinados establecido. La influencia de los ciclos de congelación y descongelación-(un mínimo de tres ciclos a las dos concentraciones por triplicado) deberán ser estudiados.

· La estabilidad del analito en la matriz a temperatura ambiente deben ser evaluados durante un tiempo período igual a la preparación de la muestra típico, manipulación de la muestra, y los tiempos de ejecución de análisis.

· Reinyección reproducibilidad debe ser evaluado para determinar si una serie de análisis podría ser volvieron a analizar en el caso de fallo del instrumento.

· La especificidad de la metodología de ensayo debe ser establecida utilizando un mínimo de seis fuentes independientes de la misma matriz. Para la masa con guión basado en la espectrometría de métodos, sin embargo, las pruebas seis matrices independientes para la interferencia puede no ser importante.

En el caso de LC-MS y los procedimientos de LC-MS-MS-basados, efectos de matriz debe ser investigado para asegurar que la precisión, selectividad, sensibilidad y no se verá comprometida. Método de selectividad deberían ser evaluados durante el desarrollo del método y en todo método validación y puede continuar durante toda la aplicación del método para el estudio de muestras reales.

· Aceptación / rechazo de los criterios de las normas de púas, calibración de matriz con sede y validación Muestras de control de calidad deben basarse en la nominal (teórica) concentración de analitos. Los criterios específicos se puede configurar con antelación y consigue la exactitud y precisión sobre el rango de los estándares, si así se desea.

V. El desarrollo del método: MICROBIOLÓGICO Y la unión del ligando- ENSAYOS

Muchos de los parámetros de validación bioanalíticos y principios descritos anteriormente también son aplicables a Los ensayos microbiológicos y de unión a ligando-. Sin embargo, estos ensayos tienen algunas características únicas que deben tenerse en cuenta durante la validación del método.

A. Cuestiones de Selectividad

Como en los métodos cromatográficos, ensayos microbiológicos y de unión a ligando-se debe mostrar ser selectivo para el analito. Las siguientes recomendaciones para hacer frente a dos selectividad temas deben ser considerados:

1. La interferencia de sustancias Physiochemically similares al analito · La reactividad cruzada de metabolitos, medicación concomitante, o endógenos compuestos deben ser evaluados individualmente y en combinación con el analito de interés.

· Cuando sea posible, el inmunoensayo se debe comparar con una referencia validado método (como LC-MS), utilizando muestras efectuados y criterios predeterminados para de acuerdo exactitud de inmunoensayo y método de referencia.

· La linealidad dilucional a la norma de referencia deben ser evaluados utilizando estudio (Incurridos) muestras.

Selectividad · puede ser mejorado para algunos analitos mediante la incorporación de separación pasos antes de inmunoensayo.

2. Matrix relacionados con el analito efectos

· La curva estándar en fluidos biológicos deben ser comparados con el estándar en tampón para detectar los efectos de la matriz.

· Paralelismo de las muestras del estudio diluidas deben ser evaluados con los estándares diluidos a detectar los efectos de la matriz.

Unión · no específica debe ser determinada.

B. Cuestiones de cuantificación

Curvas estándar microbiológicas y de imunoassay son inherentemente no lineal y, en general, más puntos de concentración se puede recomendar para definir el ajuste en el rango de la curva estándar de para ensayos químicos. Además de sus características no lineales, la respuesta de error relación de las curvas de calibración de inmunoensayo es una función no constante de la respuesta media (Heteroscadisticity). Por estas razones, un mínimo de seis concentraciones de los calibradores no cero, por duplicado, se recomienda. La relación de concentración-respuesta es más a menudo equipados a un 4 - modelo logístico o 5-parámetro, aunque otros pueden ser utilizados con la validación adecuada. La el uso de puntos de anclaje en los extremos asintóticas de alta y baja concentración de la norma curva puede mejorar el ajuste de la curva general.

Generalmente, estos puntos de anclaje será a concentraciones por debajo de la LLOQ establecido y por encima de la ULOQ establecido. Siempre que sea posible, los calibradores deben ser preparados en la misma matriz que las muestras de estudio o en una matriz alternativa de rendimiento equivalente. Tanto ULOQ y LLOQ debe ser definido por precisión aceptable, precisión, o los criterios de intervalos de confianza basados en los requisitos del estudio.

Para todos los ensayos el factor clave es la exactitud de los resultados presentados. Esta precisión puede sermejorarse mediante el uso de muestras repetidas. En el caso en que las muestras repetidas deben estar medido durante la validación para mejorar la precisión, el mismo procedimiento debe ser seguido como para las muestras desconocidas.

Las recomendaciones siguientes se aplican a los problemas de cuantificación:

· Si la separación se utiliza antes del ensayo para las muestras de estudio, pero no para los estándares, es importante establecer recuperación y utilizarlo en la determinación de resultados. Los posibles enfoques para evaluar la eficiencia y la reproducibilidad de recuperación son (1) el uso de analito trazador radiomarcado (cantidad demasiado pequeña para afectar el ensayo), (2) el avance establecimiento de recuperación reproducible, (3) la el uso de un patrón interno que no es reconocido por el anticuerpo, pero se puede medir por Otra técnica.

· Reactivos clave, tales como anticuerpos, trazador, estándar de referencia, y de la matriz debe estar caracterizado apropiadamente y se almacena en condiciones definidas.

· Las evaluaciones de la estabilidad del analito debe llevarse a cabo en la matriz verdadero estudio (por ejemplo, no debe utilizar una matriz de pelado para eliminar interferencias endógenas).

· Criterio de aceptación: Como mínimo el 67% (4 de 6) de las muestras de control de calidad deben estar dentro del 15% de su respectivo valor nominal, el 33% de las muestras de control de calidad (no todas las repeticiones en el mismo concentración) pueden estar fuera de 15% del valor nominal. En ciertas situaciones, más amplio criterios de aceptación puede estar justificada.

· Reoptimización Ensayo o validación puede ser importante cuando se producen cambios en la clave reactivos, como sigue:

Analito marcado (marcador)

· Binding debe reoptimized.

· Rendimiento debe ser verificada con curva estándar y QC.

Anticuerpo

· Llave reactividad cruzada debe ser revisado.

· Tracer experimentos anteriores deben repetirse.

Matriz

· Tracer experimentos anteriores deben repetirse.

Experimentos método de desarrollo debe incluir un mínimo de seis corridas durante varios días, con al menos cuatro concentraciones (LLOQ, baja, media y alta) se analizaron por duplicado en cada serie.

VI. Aplicación del método validado para el análisis de drogas RUTINA

Los ensayos de todas las muestras de un analito en una matriz biológica debe ser completado dentro del período de tiempo de que los datos de estabilidad están disponibles. En general, las muestras biológicas pueden ser analizados con una sola determinación sin análisis por duplicado o replicado si el método de ensayo tiene una variabilidad aceptable como definida por los datos de validación. Esto es cierto para los procedimientos en los que variabilidades de precisión y exactitud rutinariamente caen dentro de los límites de tolerancia aceptables. Para un procedimiento difícil con un analito lábil donde la alta especificaciones de precisión y exactitud puede ser difícil de conseguir, o incluso duplicar los análisis por triplicado se puede realizar para una mejor estimación de analito Una curva de calibración debe ser generado para cada analito a las muestras de ensayo en cada serie de análisis y se debe utilizar para calcular la concentración del analito en las muestras desconocidas en el funcionamiento. La muestras enriquecidas pueden contener más de un analito. Una serie de análisis puede consistir en las muestras de control de calidad, patrones de calibración, y, o bien (1) todas las muestras procesadas a ser analizada como un lote o una (2) lote compuesto de muestras procesadas desconocidos de uno o más voluntarios en un estudio. La calibración (Estándar) de la curva debe cubrir el rango esperado desconocido concentración de la muestra, además de un calibrador muestra en LLOQ. Estimación de la concentración en muestras desconocidas por extrapolación de los curvas estándar por debajo de LLOQ o por encima del más alto nivel, no se recomienda. En su lugar, la curva estándar debe ser redefinida o muestras con mayor concentración debe ser diluido y volverse a analizar. Es preferible analizar todas las muestras del estudio de un sujeto en una sola corrida.

Una vez que el método de análisis ha sido validado para su uso rutinario, la exactitud y la precisión debe ser monitoreado regularmente para garantizar que el método sigue llevando a cabo satisfactoriamente. Para lograr este objetivo, un número de muestras de control de calidad preparadas por separado deben ser analizados con la prueba de procesado muestras a intervalos basado en el número total de muestras. Las muestras de control de calidad por duplicado en tres concentraciones (uno cerca de la LLOQ (es decir, # 3 x LLOQ), uno en el rango medio, y uno cerca del extremo alto de la gama) se debe incorporar, en cada ensayo. El número de muestras de control de calidad (en múltiplos de tres) dependerá del número total de muestras en el período previo. Los resultados de las muestras QC proporcionar la base de aceptar o rechazar la ejecución. Al menos cuatro de cada muestras de QC Seis deberían estar dentro de "15% de los su valor nominal correspondiente. Dos de las muestras de QC seis pueden estar fuera del "15% de sus respectivos valor nominal, pero no ambas a la misma concentración.

Las siguientes recomendaciones deben tenerse en cuenta en la aplicación de un método bioanalítico a las drogas de rutina análisis:

· Una curva estándar matricial debe constar de un mínimo de seis puntos estándar, excluyendo espacios en blanco (ya sea solo o réplica), que cubre toda la gama.

· Respuesta Función: Normalmente, el ajuste de la curva misma ponderación, y la bondad del ajuste determinarse durante la validación antes del estudio se debe utilizar para la curva estándar en el estudio. Función de respuesta está determinada por las pruebas estadísticas apropiadas sobre la base de la actual puntos estándar durante cada carrera en la validación. Los cambios en la función de respuesta relación entre la validación antes del estudio y validación corrida rutinaria indican el potencial problemas.

· Las muestras de control de calidad se debe utilizar para aceptar o rechazar la ejecución. Estas muestras de control de calidad son la matriz enriquecida con analito.

· Aptitud del sistema: Basado en el analito y la técnica, un procedimiento operativo específico (o muestra) debe ser identificados para asegurar un funcionamiento óptimo del sistema utilizado.

· Cualquier diluciones de muestras requeridas deben usar como matriz (por ejemplo, un ser humano a) obviando la necesidad de incorporar reales dentro de los estudios de dilución de muestras de control de calidad de la matriz.

· Repita Análisis: Es importante establecer un POE o guía para el análisis de repetición y criterios de aceptación. Este SOP o directriz debe explicar las razones de la repetición de la muestra análisis. Las razones para repetir los análisis podrían incluir el análisis de repetición clínico o preclínico muestras para fines de regulación, análisis de repetición incoherente, muestras fuera del ensayo rango, los errores de procesamiento de muestras, falla del equipo, cromatografía pobre e inconsistente los datos farmacocinéticos. Reassays debe hacerse por triplicado si el volumen de la muestra lo permita. La justificación para el análisis de repetición y la denuncia de los análisis de repetición debe ser claramente documentado.

· Los datos de muestra Reintegración: Una guía para el SOP o muestra la reintegración de datos debe ser establecido. Este SOP o directriz debe explicar las razones de la reintegración y la forma en la reintegración se va a realizar. El fundamento para la reinserción debe ser claramente descrito y documentado. Los datos originales y la reintegración debe ser reportado.

Criterios de Aceptación para la ejecución

Los siguientes criterios de aceptación deben ser considerados para la aceptación de la corrida analítica:

· Patrones y las muestras de control de calidad se pueden preparar a partir de la solución stock de spiking mismo, siempre que la estabilidad de la solución y la precisión han sido verificadas. Una única fuente de matriz también se pueden usar, selectividad proporcionada ha sido verificada.

· Muestras de la curva estándar, blancos, QC, y las muestras del estudio se pueden organizar según se considere apropiado dentro de la ejecución.

Colocación · de patrones y muestras de control de calidad dentro de una serie debe ser diseñado para detectar ensayo variar con el paso de la carrera.

· Matriz basados en muestras de calibración estándar: 75%, o un mínimo de seis normas, cuando back-calculada (incluyendo ULOQ) debe estar dentro del ± 15%, excepto para LLOQ, cuando debe ser de ± 20% del valor nominal. Los valores que caen fuera de estos límites se puede descartar, siempre y cuando no cambie el modelo establecido.

· Los criterios de aceptación para la exactitud y precisión como se indica en la sección IV.F, "Specific Recomendación para la validación de métodos, "debe ser proporcionada tanto para el día intra e intra-run experimento.

· Muestras de Control de Calidad: Las muestras de control de calidad duplicada (por lo menos una vez) a un mínimo de tres concentraciones (uno dentro de 3x de la LLOQ (QC bajo), uno en el rango medio (middle QC), y uno se aproxima el extremo superior de la gama (QC alta)) deben ser incorporados en cada ejecución. Los resultados de las muestras QC proporcionar la base de aceptar o rechazar la ejecución.

Como mínimo el 67% (cuatro de seis) de las muestras de control de calidad deben estar dentro del 15% de su respectivo nominales (teórico); valores de 33% de las muestras de control de calidad (no todas las repeticiones en el mismo concentración) pueden estar fuera del ± 15% del valor nominal. Un intervalo de confianza enfoque dando una precisión comparable y la precisión es una alternativa adecuada.

El número mínimo de muestras (en múltiplos de tres) debe ser de al menos 5% del número de muestras desconocidas o seis QC totales, lo que sea mayor.

· Las muestras que implican múltiples analitos no debe ser rechazada en base a los datos de uno analito no ajustarse a los criterios de aceptación.

· Los datos de carreras rechazados no necesitan ser documentados, pero el hecho de que una carrera fue rechazada y la razón del fallo debe ser registrado.

VII. DOCUMENTACIÓN

La validez de un método analítico debe ser establecido y verificado por estudios de laboratorio, y documentación de finalización con éxito de estos estudios deberá indicarse la validación de pruebas informar. SOP generales y específicos y el mantenimiento de registros bien son una parte esencial de una validación método analítico. Los datos generados para el establecimiento y método bioanalítico QC deben ser los documentados y disponibles para la auditoría de datos y de control. Documentación para la presentación a la Agencia debe incluir (1) información sumaria, (2) el desarrollo de métodos y de establecimiento, (3) bioanalítico informes de la aplicación de

cualquiera de los métodos para el análisis de rutina de muestras, y (4) otra información aplicable al desarrollo del método y el establecimiento y / o para el análisis de muestras de rutina.

A. Resumen de Información

La información del resumen debe incluir:

· Cuadro sinóptico de los informes de validación, incluyendo la validación del método analítico, parcial revalidación y validación cruzada informes. La tabla debe estar en secuencia cronológica, y incluyen el método de ensayo de código de identificación, tipo de ensayo, y la razón de la nueva método o validación adicional (por ejemplo, para disminuir el límite de cuantificación).

· Tabla resumen con una lista, por protocolo, los métodos de ensayo utilizados. El número de protocolo, protocolo título, tipo de ensayo, el código de ensayo método de identificación y el código de informe bioanalítica debe ser proporcionada.

· Un cuadro sinóptico que permite referencias cruzadas de los códigos de identificación de múltiples deberá ser previstas (por ejemplo, cuando un ensayo tiene códigos diferentes para el método de ensayo, informes de validación y los informes bioanalíticos, especialmente cuando el patrocinador y un laboratorio contratado asignar códigos diferentes).

B. Documentación para el Establecimiento Método

Documentación para el desarrollo del método y el establecimiento debe incluir:

· Una descripción operativa del método analítico

· Evidencia de la pureza y la identidad de las normas de drogas, las normas de metabolitos, e internos estándares utilizados en experimentos de validación

· Una descripción de los estudios de estabilidad y los datos de apoyo

· Una descripción de los experimentos realizados para determinar la exactitud, precisión, recuperación, selectividad, límite de cuantificación, la curva de calibración (ecuaciones y funciones de ponderación utilizados, si lo hay), y los datos relevantes obtenidos de estos estudios

· Documentación de intra-e inter-ensayo de precisión y exactitud

· En las presentaciones de NDA, información sobre los datos del estudio de validación cruzada, en su caso

· Cromatogramas legibles anotados o espectrogramas de masas, en su caso

· Cualquier desviación de los SOP, protocolos o GLP (si procede), y la justificación de desviaciones

C. Aplicación de Análisis de Medicamentos de rutina

La documentación de la aplicación de métodos validados bioanalíticos para el análisis de drogas de rutina debe incluir:

· Evidencia de la pureza y la identidad de las normas de drogas, las normas de metabolitos, e internos estándares utilizados en los análisis de rutina

· Las tablas de resumen con información sobre el procesamiento de muestras y almacenamiento. Las tablas deben incluir la identificación de la muestra, fechas de recogida, almacenamiento antes del envío, la información sobre lote envío, almacenamiento y antes del análisis. La información debe incluir fechas, horas, condición de la muestra, y cualquier desviación de los protocolos.

· Las tablas de resumen de pistas de análisis de muestras clínicas o preclínicas. La información debe incluyen realiza la prueba de identificación, fecha y hora del análisis, el método de ensayo, según los analistas, el inicio y finalización, duración, equipos importantes y cambios significativos, y los posibles problemas o desviación del método establecido.

· Ecuaciones utiliza para volver a calcular los resultados

· Tablas de datos de la curva de calibración utilizados en el análisis de muestras de curva de calibración y resumen datos

· Información resumida sobre los valores intra-e inter-ensayo de las muestras de control de calidad y datos sobre intra e inter-ensayo de exactitud y precisión de las curvas de calibración y muestras de control de calidad utilizados para aceptar el proceso analítico. Gráficos de control de calidad y análisis de tendencias, además de los datos brutos y estadísticas de resumen se anima.

· Tablas de datos de ciclos de análisis de muestras clínicas o preclínicas. Las tablas deben incluir ensayo de identificación de ejecución, identificación de la muestra, datos brutos y los resultados calculados de nuevo, Códigos de integración y / u otros códigos de reporte.

· Completar cromatogramas serie de 5B20% de los sujetos con los estándares y las muestras de control de calidad a partir de esos funcionamientos analíticos. Para fundamentales los estudios de bioequivalencia para la comercialización, cromatogramas de 20% de los sujetos en serie seleccionados deben ser incluidos. En otros estudios, cromatogramas del 5% de los sujetos seleccionados al azar en cada estudio deben ser incluidos.

Los sujetos cuya cromatogramas deben ser presentados deben definirse antes del análisis de las muestras clínicas.

· Motivos de muestras que faltan

· Documentación para análisis repetidos. La documentación debe incluir la inicial y repita los resultados del análisis, el resultado comunicado, la identificación ensayo largo, el motivo de la repetición análisis, el solicitante de la análisis de repetición, y el gestor de la que se autoriza reanálisis. Repita el análisis de una muestra clínica o preclínica se debe realizar solamente bajo un SOP predefinido.

· Documentación de los datos reinsertados. La documentación debe incluir la inicial y repita resultados de la integración, el método utilizado para la reintegración, el resultado comunicado, se realiza la prueba identificación, el motivo de la reintegración, el solicitante de la reintegración y la gestor autoriza la reintegración. Reintegración de una muestra clínica o preclínica debe ser realizar solamente bajo un SOP predefinido.

· Las desviaciones del protocolo de análisis o SOP, con razones y justificaciones para la desviaciones

D. Otra información

Otra información pertinente para el desarrollo de métodos tanto y el establecimiento y / o la rutina análisis de la muestra pueden incluir:

· Las listas de abreviaturas y los códigos adicionales usados, incluidos los códigos de condición de la muestra, Códigos de integración, y los códigos de presentación de informes

· Las listas de referencias y copias legibles de las referencias

· SOPs o protocolos que cubren las siguientes áreas:

· Calibración estándar de aceptación o rechazo de los criterios

· Aceptación o rechazo curva de calibración criterios

· Muestra de control de calidad y ensayo de ejecutar los criterios de aceptación o rechazo

· Criterios de aceptación para los valores reportados cuando todas las muestras desconocidas se analizaron por duplicar

· Designaciones ejemplo de código, incluyendo los códigos de muestra clínica o preclínica y bioensayo código de ejemplo

· Asignación de muestras clínicas o preclínicas a los lotes de ensayo

· Toma de muestras, procesamiento y almacenamiento

· Repita los análisis de las muestras

· Reintegración de las muestras

GLOSARIO

Precisión: El grado de proximidad entre el valor determinado para el verdadero valor nominal o conocido bajo las condiciones prescritas. Esto a veces se denomina veracidad.

Analito: un resto químico específico que está siendo medido, que puede ser el medicamento intacto, biomolécula o su producto derivado, metabolito, y / o degradación en una matriz biológica.

Analítica de ejecución (o lotes): Un conjunto completo de análisis y estudio de muestras con el número adecuado de normas y QC para su validación. Hay varias pistas (o lotes) se puede completar en un día, o una ejecutar (o lote) puede tardar varios días en completarse.

Biológica matriz: Un material discreto de origen biológico que puede ser muestreada y procesada en un de manera reproducible. Ejemplos son sangre, suero, plasma, orina, heces, saliva, esputo, y varios tejidos discretos.

Estándar de calibración: una matriz biológica a la que ha sido una cantidad conocida de analito añadido o se disparó. Los patrones de calibración se utilizan para construir las curvas de calibración a partir de la cual las concentraciones de los analitos en QC y en el estudio de muestras desconocidas se determinan.

Estándar interno: Compuesto de ensayo (s) (por ejemplo, estructuralmente similar compuesto analógico, estables marcado) añadido a los estándares de calibración y las muestras de ambos a una concentración conocida y constante para facilitar la cuantificación del analito (s) objetivo.

Límite de detección (LOD): La menor concentración de un analito que el procedimiento bioanalítico fiable puede diferenciarse de ruido de fondo.

Límite inferior de cuantificación (LLOQ): La cantidad más baja de un analito en una muestra que puede ser determinarse cuantitativamente con precisión y exactitud adecuada.

Efecto de la matriz: la alteración directa o indirecta o de interferencia en la respuesta debido a la presencia de analitos deseados (para análisis) u otras substancias que interfieren en la muestra.

Método: Una descripción completa de todos los procedimientos utilizados en el análisis de la muestra.

Precisión: El grado de concordancia (grado de dispersión) entre una serie de mediciones obtenido a partir de un muestreo múltiple de la muestra homogénea mismo bajo las condiciones prescritas.

Procesado: El extracto final (antes del análisis instrumental) de una muestra que ha sido sometida a diversas manipulaciones (por ejemplo, extracción, dilución, concentración).

Cuantificación rango: El rango de concentración, incluyendo ULOQ y LLOQ, que puede ser confiablemente y reproducible cuantificado con exactitud y precisión a través del uso de una operación de concentración-respuesta relación.

Recuperación: La eficacia de la extracción de un proceso analítico, expresada como un porcentaje de la conocida cantidad de un analito llevado a través de los pasos de extracción de muestras y procesamiento del método.

Reproducibilidad: La precisión entre dos laboratorios. También representa la precisión del método bajo las mismas condiciones de funcionamiento durante un período corto de tiempo.

Ejemplo: Un término que abarca controles genéricos, blancos, incógnitas, y las muestras procesadas, como se describe a continuación:

Blanco: Una muestra de una matriz biológica a la que no se han añadido analitos que se utiliza para evaluar la especificidad del método de bioanálisis.

Muestra de control de calidad (QC): Una muestra de púas utiliza para supervisar el rendimiento de un método bioanalítico y para evaluar la integridad y la validez de los resultados de la desconocida muestras analizadas en un lote individual.

Desconocido: Una muestra biológica que es el objeto del análisis.

Selectividad: La capacidad del método de bioanálisis para medir y diferenciar los analitos en la presencia de componentes que se pueden esperar a estar presente. Estos podrían incluir metabolitos, impurezas, productos de degradación, o componentes de la matriz.

Estabilidad: La estabilidad química de un analito en una matriz dada bajo condiciones específicas de tiempo dado intervalos.

Curva estándar: La relación entre el valor de la respuesta experimental y analítica de la concentración (también llamado una curva de calibración).

Aptitud del sistema: Determinación de rendimiento del instrumento (por ejemplo, sensibilidad y cromatográficos retención) por el análisis de un estándar de referencia antes de ejecutar el lote analítico.

Límite superior de cuantificación (ULOQ): La cantidad más alta de un analito en una muestra que puede ser determinarse cuantitativamente con precisión y exactitud.

Validación: Lleno de validación: Establecimiento de los parámetros de validación para aplicar al análisis de la muestra para la método bioanalítico para cada analito.

Parcial de validación: La modificación de métodos validados bioanalíticos que no requieren necesariamente para la revalidación completa.

Cross-validación: validación de parámetros de comparación de dos métodos bioanalíticos.