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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde Aplicadas ao Aparelho Locomotor
MARIANA MALOSTE BUTEZLOFF
CONSOLIDAÇÃO ÓSSEA APÓS FRATURA DIAFISÁRIA DO FÊMUR EM RATAS
COM E SEM OSTEOPOROSE, E TRATADAS COM TERAPIA POR VIBRAÇÃO
Ribeirão Preto
2015
1
MARIANA MALOSTE BUTEZLOFF
Consolidação óssea após fratura diafisária do fêmur em ratas com e sem osteoporose, e
tratadas com terapia por vibração.
VERSÃO CORRIGIDA
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde Aplicadas ao
Aparelho Locomotor da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo, para
obtenção do título de Mestre em Ciências.
Área de concentração: Reabilitação do Aparelho
Locomotor
Orientador: Prof. Dr. José Batista Volpon
Ribeirão Preto
2015
2
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Butezloff, Mariana Maloste
Consolidação óssea após fratura diafisária do fêmur em
ratas com e sem osteoporose, e tratadas com terapia por
vibração. Ribeirão Preto, 2015.
94 f.: Il. ; 30 cm
Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração:
Reabilitação.
Orientador: Volpon, José B.
1. Fratura. 2. Osteoporose. 3. Terapia por vibração.
4. Ovariectomia. 5. Biomecânica
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FOLHA DE APROVAÇÃO
Mariana Maloste Butezloff
Consolidação óssea após fratura diafisária do fêmur em ratas com e sem osteoporose, e
tratadas com terapia por vibração.
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Saúde Aplicadas ao Aparelho
Locomotor da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, da
Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Mestre em
Ciências Médicas.
Área de Concentração: Reabilitação do Aparelho Locomotor
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof. Dr. ____________________________________________________________________
Instituição: __________________________________________________________________
Assinatura: _________________________________________________________________
Prof. Dr. ____________________________________________________________________
Instituição: __________________________________________________________________
Assinatura: _________________________________________________________________
Prof. Dr. ____________________________________________________________________
Instituição: __________________________________________________________________
Assinatura: _________________________________________________________________
Prof. Dr. ____________________________________________________________________
Instituição: __________________________________________________________________
Assinatura: _________________________________________________________________
Prof. Dr. ____________________________________________________________________
Instituição: __________________________________________________________________
Assinatura: _________________________________________________________________
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Dedicatória
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A Deus por ter me encaminhado nas escolhas corretas, e pela força concedida para trilhar o meu caminho e chegar onde estou.
Aos meus Pais Carlos e Roseli, por sempre terem me encorajado nas escolhas e por me criarem e me ensinarem a ser o que sou.
Ao meu irmão Thiago, por sempre estar ao meu lado e me mostrar que a irmandade é uma amizade acima de tudo.
Dedico este trabalho
6
Agradecimentos
7
Ao Prof. Dr. José Batista Volpon, meu orientador, por todo apoio durante o processo de
preparação da dissertação, por todos os ensinamentos e aprendizado ao longo da pesquisa e
pela paciência em todo o período de pós-graduação.
À Dra. Ariane Zamarioli, especialista do laboratório, pela ajuda na pesquisa, desde o ensino da
cirurgia experimental até as análises do projeto, por me auxiliar durante todo o mestrado, sem
poupar esforços para a conclusão da pesquisa.
À amiga Ariane Zamarioli que não poupou ajuda nesse período final, mostrando como tudo
pode ser mais bem feito. Pelos ensinamentos que, como amiga e pesquisadora, fizeram-me
crescer durante esse pequeno período de tempo. Por estar ao meu lado, nesta e em muitas
outras fases da minha vida. Obrigada, pela amizade que começou juntamente com a pesquisa e
que permanecerá além dela.
Ao Prof. Dr. Marcelo Riberto, Coordenador do Programa de Pós-graduação e Professor que,
ao me abordar no corredor durante o estágio, ajudou-me a fazer a melhor escolha que eu
poderia ter feito: continuar minha dedicação à pesquisa e permanecer no programa que me
acolheu.
Ao Prof. Dr. Manoel Damião de Sousa Neto, pela disponibilidade do Laboratório de
Morfologia do Departamento de Odontologia Restauradora da Faculdade de Odontologia de
Ribeirão Preto (FORP-USP) para realização das análises microtomográficas e à Pós-Graduanda
Graziela Bianchi Leoni pelo auxílio durante as análises.
Às amigas Lele, Elisa, Nat e Ale, por toda amizade que cresceu durante toda a faculdade e pela
irmandade que será para sempre, por me ouvirem e estarem ao meu lado sempre.
Aos amigos da XXIX de Fevereiro, pela toda força que sempre me foi ensinada e pelo
companheirismo que sempre existiu. E, principalmente, pelos colegas de seguiram a área
acadêmica que sempre me aconselham e me ajudam a ver a pesquisa com outros olhos.
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Às amigas do Laboratório, Maysa, Paulinha, Paty, Lari, pela parceria e aúxilio durante todos os
dias. Obrigada por tornarem meu dia a dia mais animado e quebrarem a rotina.
À amiga Roberta Shimano, por sempre estar disposta a me ajudar e pelo ensinamento desde a
técnica da cirurgia de ovariectomia, até todo o apoio em vários momentos.
Aos funcionários do laboratório Teresinha, Luís Henrique, Moro, Reginaldo e Lu, por toda
ajuda durante o período da pós-graduação.
Ao funcionário e amigo Francisco, por sempre me ajudar em tudo que precisei e pela amizade.
À secretária do Programa de Pós-graduação, Rita, pela paciência e pela ajuda com toda a
burocracia para que eu concluísse meu projeto.
Aos colegas de programa, que, de uma forma ou outra, estiveram presentes durante esse
período.
À CAPES, pela concessão da bolsa de mestrado e pelo auxílio congresso.
E, a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho.
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Resumo
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RESUMO
BUTEZLOFF, M. M. Consolidação óssea após fratura diafisária do fêmur em ratas com e
sem osteoporose, e tratadas com terapia por vibração. 2015. Dissertação (Mestrado) –
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015.
As fraturas secundárias à osteoporose são frequentes na população idosa e constituem problema de
saúde pública em virtude das complicações a elas associadas e à dificuldade na consolidação. O alto
índice de osteoporose e suas consequências estimulam o estudo sobre diversos recursos físicos,
mecânicos e medicamentosos que possam ser utilizados na prevenção e recuperação da perda de massa
óssea. Entre esses tratamentos há a reposição hormonal, o aumento na ingestão de cálcio, o uso de
agentes farmacológicos como os bisfosfonatos, a prática de atividade física, além do uso de recursos
mecânicos, como a plataforma vibratória. Embora a aplicação da vibração parece ter efeito benéfico
no osso osteoporótico, seus efeitos na consolidação de fratura de ossos osteoporóticos ainda não estão
suficientemente esclarecidos. Neste estudo, a qualidade do tecido e do calo ósseo foi analisada em
fêmures de ratas com osteoporose submetidas à terapia por vibração. Foram utilizadas 41 ratas Wistar,
aleatoriamente divididas em quatro grupos experimentais: (1) CON+FRAT: ratas normais, com fratura
do fêmur direito; (2) OVX+FRAT: ratas ovariectomizadas e com fratura do fêmur direito; (3)
CON+FRAT+TV: ratas normais, com fratura do fêmur direito e submetidas à terapia por vibração e;
(4) OVX+FRAT+TV: ratas ovariectomizadas, com fratura do fêmur direito e submetidas à terapia por
vibração. As ratas dos grupos OVX, OVX+FRAT e OVX+FRAT+TV foram submetidas ao
procedimento cirúrgico de ovariectomia e os animais dos outros grupos foram expostos ao mesmo
procedimento cirúrgico em que os ovários foram expostos, mas não removidos. Três meses após a
extração dos ovários (ou cirurgia simulada), os animais dos grupos CON+FRAT, OVX+FRAT,
CON+FRAT+TV e OVX+FRAT+TV foram submetidos à fratura mediodiafisária do fêmur direito
pelo método fechado. Em seguida, a fratura foi estabilizada cirurgicamente com a colocação de um fio
de Kirschner implantado intramedularmente por meio da exposição da fratura por uma mini-incisão
realizada na face lateral da coxa, sobre a fratura. Para a avaliação do calo ósseo, cada grupo
experimental foi dividido em dois subgrupos, conforme o tempo de acompanhamento pós-fratura: 14 e
28 dias. A terapia por vibração foi iniciada três dias após a produção da fratura, na frequência de
60Hz, três vezes por semana, por 20 minutos. A análise da qualidade óssea foi realizada tanto no
fêmur não fraturado (esquerdo), como no calo ósseo, pela análise da densidade e conteúdo mineral
ósseo (DXA), microtomografia (avaliação qualitativa e quantitativa da microestrutura óssea), e pela
resistência mecânica (ensaio mecânico). De acordo com os achados, as ratas ovariectomizadas
apresentaram importante perda de massa óssea, diminuição da resistência óssea e grave deterioração
da microarquitetura do osso trabecular e cortical, além da redução da densidade e do volume do calo
ósseo. Por outro lado, a terapia por vibração representou importante papel na recuperação, tanto no
osso intacto osteoporótico, como no não osteoporótico, com ou sem fratura. No osso intacto, a terapia
por vibração causou aumento da massa óssea, da resistência mecânica à fratura e significante melhora
na microarquitetura óssea trabecular e cortical. Além disso, o uso da plataforma vibratória exerceu
efeito positivo significativo na consolidação óssea das ratas ovariectomizadas, proporcionando
aumento no volume e densidade do calo. A terapia por vibração melhorou tanto a qualidade do tecido
ósseo, como do calo ósseo nas ratas ovariectomizadas.
Palavras-chave: fratura, osteoporose, terapia por vibração, ovariectomia, biomecânica.
11
Abstract
12
ABSTRACT
BUTEZLOFF, M. M. Bone healing after femoral fracture of rats with and without
osteoporosis and treated with vibration therapy. 2015. Thesis (Master Degree) – Faculty
of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo.
Secondary fractures due to osteoporosis have been commonly found in the elderly population
and may be accompanied by severe complications of bone healing. Thus, several treatments
have been proposed in order to ameliorate and treat bone loss, such as hormonal reposition,
calcium ingestion, bisphosphonate administration, physical activities, among other
mechanical modalities such as the vibration therapy. Although the effects of vibration therapy
on bone quality have been previously published, their effects on bone healing have not been
completely elucidated. Thus, in this study we assessed the effects of vibration on bone and
callus quality in ovariectomized and in intact female rats. Forty-one female Wistar rats were
randomly divided into four experimental groups: (1) CON+FRAT: rats with bone fracture; (2)
OVX+FRAT: ovariectomized rats with bone fracture; (3) CON+FRAT+TV: rats with bone
fracture, submitted to vibration therapy; (4) OVX+FRAT+TV: ovariectomized rats with bone
fracture, submitted to vibration therapy. All rats underwent either ovariectomy or sham
operation. Three months later, a fracture was created in the femoral diaphysis by the closed
method and immediately fixed with intramedullary nail. Vibration therapy began Three days
after fracture at a frequency of 60Hz, three times per week for 20 minutes. Each experimental
group was divided into two subgroups according to the period of post-fracture follow-up: 14
and 28 days. Bone quality was assessed in the non-fractured femur at the metaphyseal
junction and at the bone callus by bone mineral content and bone density (DXA), micro
tomography (qualitative and quantitative evaluation of bone microstructure), and mechanical
resistance (mechanical test). According to our findings, the ovariectomized rats exhibited a
substantial loss of bone mass and severe impairment in bone microarchitecture, both on the
intact bone tissue and on the bone callus. Conversely, whole-body vibration therapy exerted
an important role at ameliorating bone mass, bone strength and at improving trabecular and
cortical bone microstructure in the estrogen-deficient rats. Furthermore, vibration therapy
improved bone callus formation in the ovariectomized rats, where bone callus density,
strength and callus volume were increased.
Key-words: fracture, osteoporosis, vibration therapy, ovariectomy, biomechanics.
13
Lista de Figuras
14
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Desenho esquemático da guilhotina utilizada para produzir a fratura fechada na
diáfise femoral. A coxa do animal (aqui representada pelo fêmur) é colocada no centro
dos apoios metálicos e a guilhotina com a extremidade romba e baixada pela alavanca
acionada manualmente......................................................................................................39
Figura 2. Figura ilustrando aplataforma vibratória, onde o animal fica alojado durante o
tratamento, composta de uma caixa de acrílico, uma mesa de suporte para plataforma
vibratória, e acoplamento externo do motor que produz a energia
mecânica............................................................................................................................41
Figura 3. Figura ilustrando a radiografia realizada após o procedimento de fixação da fratura
óssea, para comprovação da adequação da redução dos fragmentos e posicionamento do
fio de Kishner de posicionamento do fio de Kishner........................................................42
Figura 4. Figura ilustrativa a região trabecular de interesse analisada pelo micro-
CT.....................................................................................................................................43
Figura 5. Figura ilustrativa a região cortical de interesse analisada pelo morto-CT................43
Figura 6. Figura ilustrativa a região do calo ósseo analisada pelo micro-CT..........................44
Figura 7. Posicionamento dos ossos (A) e (B) para realização da análise da DMO, CMO e
área do calo ósseo (C).......................................................................................................45
Figura 8. Ilustrações do ensaio mecânico de três pontos realizado na metáfise distal do fêmur
esquerdo (não fraturado) (A), e na região central do calo ósseo do fêmur direito (B).....46
Figura 9. Média e desvio padrão da massa corpórea dos animais, no início do experimento
(dia 0), após 90 dias da cirurgia de ovariectomia ou simulação (sham) para os grupos
controles e, após 14 dias de tratamento (dia 104) ou 28 dias de tratamento (dia 118) com
terapia por vibração. Os asteriscos indicam presença de diferença
significativa.......................................................................................................................48
Figura 10: Comparação entre útero de rata não-ovariectomizada (A) e ovariectomizada (B),
evidenciando a atrofia uterina dos animais submetidos à ovariectomia...........................49
Figura 11: Média e desvio-padrão da massa uterina dos animais experimentais. A diferença
significativa entre os grupos ovariectomizados e não-ovariectomizados confirma a
correta extração dos ovários e a consequente atrofia uterina causada pela ovariectomia.
Os asteriscos indicam presença de diferença significativa...............................................50
15
Figura 12: Média da densidade mineral óssea das metáfises distais dos fêmures esquerdo e
direito dos animais experimentais. É possível observar perda de massa óssea nos animais
ovariectomizados. Além disso, a terapia por vibração proporcionou aumento da DMO
nos animais submetidos à ovariectomia prévia. Os asteriscos indicam presença de
diferença significativa.......................................................................................................52
Figura 13: Média do conteúdo mineral óssea das metáfises distais dos fêmures esquerdo e
direito dos animais experimentais. É possível observar perda de massa óssea nos animais
ovariectomizados. Os asteriscos indicam presença de diferença significativa.................53
Figura 14: Média e desvio-padrão da DMO do calo ósseo. A terapia por vibração
proporcionou aumento da DMO dos animais ovariectomizados submetidos ao
tratamento. O asterisco indica presença de diferença significativa..................................53
Figura 15: Média e desvio-padrão do CMO do calo ósseo......................................................53
Figura 16: Média da área do calo analisada, comparativa entre os grupos de 104 e 118
dias....................................................................................................................................53
Figura 17: Média e desvio padrão da força máxima do fêmur. A resistência mecânica foi
menor nos animais ovariectomizados, enquanto que a terapia por vibração exerceu efeito
protetor sobre essa perda de resistência mecânica. O asterisco indica presença de
diferença significativa.......................................................................................................54
Figura 18: Microarquitetura trabecular da metáfise femoral mostrando redução expressiva de
tecido trabecular nas ratas ovariectomizadas (OVX) em comparação com animais
controle (CON). Essas alterações foram amenizadas pelo tratamento por terapia por
vibração.............................................................................................................................55
Figura 19: Média do volume ósseo total (BV), da porcentagem de tecido ósseo (BV/TV), da
quantidade de trabéculas ósseas (TbN), da espessura das trabéculas ósseas (TbTh), do
espaçamento entre as trabéculas ósseas (TbSp) e da densidade de conexão entre
múltiplas trabéculas ósseas (ConnD) dos fêmures sem fratura entre os grupos
experimentais....................................................................................................................56
Figura 20: Microestrutura óssea cortical da diáfise femoral mostrando redução de tecido
cortical nas ratas ovariectomizadas (OVX) em comparação aos animais controle (CON).
Essas alterações foram amenizadas pelo tratamento por terapia por vibração.................57
Figura 21: Média das variáveis relacionadas à microarquitetura cortical; volume cortical
(Ct.V e Ct.BV/TV), espessura cortical (Ct.Th) dos fêmures sem fratura entre os grupos
experimentais....................................................................................................................58
16
Figura 22: Imagens do calo ósseo obtidas pelo microCT, tanto no plano sagital como
transversal, mostrando que a ovariectomia (OVX) induz à redução da neoformação
óssea, com menor calo ósseo que nos grupos controle (CON) e a terapia por vibração
aumenta essa neoformação...............................................................................................59
17
Lista de Quadros
18
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Grupos experimentais............................................................................................37
19
Lista de Tabelas
20
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Média e desvio padrão do comprimento do fêmur D das ratas dos grupos de 14 e 28
dias............................................................................................................................................50
Tabela 2 - Média e desvio padrão da massa do fêmur D das ratas dos grupos de 14 e 28
dias............................................................................................................................................50
Tabela 3. Média e desvio padrão do comprimento do fêmur E das ratas dos grupos de 14 e 28
dias ......………………………………………………………………………………….......51
Tabela 4. Média e desvio padrão da massa do fêmur E das ratas dos grupos de 14 e 28
dias.….....................................................................................................................................51
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Lista de Abreviaturas,
Siglas, Símbolos e
Unidades
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LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS, SÍMBOLOS E UNIDADES
FMRP/USP Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade
de São Paulo
OVX Ovariectomia
OVX+FRAT Ovariectomia com fratura óssea
CON Controle
CON+FRAT Controle com fratura óssea
FRAT Fratura
TV Terapia por vibração
OVX+FRAT+TV Ovariectomia com fratura óssea tratado com terapia por
vibração
CON+FRAT+TV Controle com fratura óssea tratado com terapia por vibração
DMO Densidade mineral óssea
CMO Conteúdo mineral ósseo
TV Volume total
BV/TV Volume ocupado pelo osso trabecular, mineralizado ou não,
expresso como porcentagem do volume ocupado pela medula
e trabéculas ósseas
TbN Número de trabéculas ósseas por milímetro de tecido ósseo
TbTh Espessuras das trabéculas ósseas
TbSp Espaçamento entre as trabéculas ósseas
ConnD Densidade de conexão entre múltiplas trabéculas ósseas
Ct.V Volume total do osso cortical
Ct.BV/TV Volume ocupado pelo osso cortical, mineralizado ou não,
expresso como porcentagem do volume total
Ct.Th Espessura da cortical
D Direito
E Esquerdo
Micro-CT Microtomografia computadorizada
RPM Rotação por minuto
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FM Força Máxima
R Resistência
L Microlitro
m Micrometro
N Newton
Hz Hertz
kV Quilovolt
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Sumário
25
SUMÁRIO1
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 28
1.1 Tecido ósseo .............................................................................................................. 28
1.2 Remodelação óssea ................................................................................................... 29
1.3 Osteopenia e osteoporose ......................................................................................... 30
1.4 Reparo ósseo normal ............................................................................................... 31
1.5 Consolidação da fratura em ossos osteopênicos .................................................... 32
1.6 Indução de perda de massa óssea em animais experimentais .............................. 32
1.7 Efeitos osteogênicos da consolidação óssea na terapia por vibração .................. 32
2 OBJETIVOS ................................................................................................................... 35
3 MATERIAL .................................................................................................................... 37
3.1 Animais experimentais ............................................................................................ 37
3.2 Grupos experimentais .............................................................................................. 38
3.3 Os animais foram aleatoriamente divididos em quatro grupos experimentais e,
cada grupo experimental foi subdividido em dois subgrupos (Quadro 1). ................... 38
3.4 Procedimento experimental – indução cirúrgica da osteoporose ........................ 39
3.5 Procedimento experimental – fratura óssea .......................................................... 39
3.6 Procedimento experimental – tratamento com terapia por vibração ................. 41
3.7 Análise da estrutura óssea ....................................................................................... 42
3.7.1 Análise macroscópica ........................................................................................ 42
3.7.2 Microtomografia computadorizada (micro-CT) ............................................... 43
3.7.3 Densitometria óssea ........................................................................................... 45
3.7.4 Análise mecânica ............................................................................................... 46
3.8 Análise estatística dos resultados ............................................................................ 47
4 RESULTADOS ............................................................................................................... 49
4.1 Massa corpórea dos animais ................................................................................... 49
4.2 Massa uterina ........................................................................................................... 50
4.3 Análise macroscópica .............................................................................................. 51
4.4 Análise densitométrica ............................................................................................ 52
1 Normas de acordo com as diretrizes para apresentação de dissertações e teses da USP: documento
eletrônico impresso São Paulo, 2009.
26
4.4.1 Análise densitométrica na metáfise distal do fêmur ......................................... 52
4.4.2 Análise densitométrica no calo ósseo................................................................ 53
4.4.3 Análise mecânica ............................................................................................... 55
4.5 Análise microscópica ............................................................................................... 56
4.5.1 Análise da microarquitetura trabecular do fêmur sem fratura ....................... 56
4.5.2 Análise da microarquitetura do osso cortical ................................................... 58
4.5.3 Análise da microarquitetura do calo ósseo ....................................................... 59
5 DISCUSSÃO ................................................................................................................... 62
5.1 Alterações decorrentes da ovariectomia na estrutura de ossos não fraturados . 62
5.2 Alterações na consolidação óssea decorrentes da ovariectomia .......................... 64
5.3 Efeitos da terapia por vibração no tecido ósseo e na consolidação pós-fratura . 65
6 CONCLUSÕES ............................................................................................................... 69
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 71
27
Introdução
28
1 INTRODUÇÃO
Apesar dos avanços ortopédicos, as fraturas ainda apresentam anomalias de
consolidação em número crescente. Em um país desenvolvido como os Estados Unidos da
América do Norte, em que o número anual de fraturas ósseas chega a oito milhões, o impacto
clínico e financeiro das alterações da consolidação óssea no sistema de saúde é significante
(ASSIOTIS et al., 2012). Diversos fatores podem ser considerados como de risco para o
reparo ósseo normal, como idade avançada, tabagismo, doenças osteometabólicas, agentes
farmacológicos e algumas condições sistêmicas como a diabetes (DINIZ et al., 2008;
OGASAWARA et al., 2008; URABE et al., 2003).
A osteoporose está relacionada com o aumento da mortalidade secundária às fraturas,
principalmente quando afeta vértebras ou ossos do quadril (KANIS, 2001; COOPER, 1993).
Essas fraturas e as comorbidades que acompanham a osteoporose levam ao gasto anual de
13,8 bilhões de dólares nos Estados Unidos (RAY, 1997). Desta forma, têm sido
desenvolvidos esforços na tentativa de melhorar a consolidação óssea por meio de recursos
técnicos, físicos ou medicamentosos. Neste cenário, o uso da plataforma vibratória, tem se
mostrado promissor na melhora da qualidade óssea e, possivelmente, na consolidação do calo
ósseo (LEUNG et al., 2009; SHI et al., 2010).
1.1 Tecido ósseo
O tecido ósseo é o principal constituinte do esqueleto, servindo de suporte para os
tecidos moles e proteção para os órgãos vitais. A matriz óssea é composta por células e
material extracelular calcificado. Os osteócitos são células localizadas em cavidades ou
lacunas no interior da matriz. Os osteoblastos são produtores da parte orgânica da matriz, e os
osteoclastos são células gigantes, móveis e multinucleadas que reabsorvem o tecido ósseo.
Juntos, esses tipos celulares realizam o processo de remodelação e manutenção do
metabolismo ósseo (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). A reparação óssea consiste na
formação de osso novo, associado à reabsorção de osso antigo e ocorre permanentemente no
esqueleto. Entretanto, a ocorrência de uma fratura faz com que haja uma proliferação óssea
localizada, chamada calo ósseo, cujo objetivo é restabelecer a continuidade física entre os
fragmentos fraturados e, assim, recuperar a integridade mecânica da região.
A arquitetura óssea é composta de ossos do tipo trabecular e do tipo cortical
29
(MUNDY, 2000). No primeiro, as trabéculas estão dispersas em várias direções e se
interconectam formando espaços entre elas e constituindo uma resistente rede aos esforços
mecânicos. As lacunas existentes entre as trabéculas ósseas são preenchidas pela medula
óssea (KALFAS, 2001). Este tipo de osso predomina nas extremidades do osso longo e em
alguns ossos curtos ou irregulares como aqueles das mãos, pés e coluna vertebral. O osso
cortical é compacto e atua na manutenção da integridade estrutural, com predomínio na região
central do osso longo (diáfise). É formado por lamelas sobrepostas, relativamente paralelas,
com mínimo espaço entre elas. Microscopicamente, cada trabécula apresenta uma estrutura
peculiar formada pela sobreposição de vários anéis concêntricos que contêm os osteócitos
(Este sistema é chamado haversiano (CORONHO et al., 2001)).
A microestrutura óssea trabecular e cortical apresentam uma formação em escala
microscópica e tridimensional da estrutura óssea, caracterizada pela microgeometria e pela
densidade mineral óssea. Assim, um dos métodos atualmente mais utilizados para essa
quantificação é a microtomografia computadorizada que permite a análise independente do
osso trabecular e do cortical, além da análise quantitativa do calo ósseo formado pós-fratura
(BURGHARDT et al., 2011).
1.2 Remodelação óssea
É contínuo o processo de remodelação óssea (RIGGS, 2000), explicado pela
deposição e reabsorção de material na estrutura óssea, em taxas relativamente baixas,
ocorrendo tanto no osso cortical, como no trabecular (SARAIVA; LAZARETTI-CASTRO,
2002). Neste processo a formação óssea ocorre em ciclos orquestrados pelas células
osteoprogenitoras, em resposta a estímulos mecânicos e bioquímicos. Em situações
fisiológicas, a reabsorção e a formação são fenômenos acoplados e dependentes, e o
predomínio de um sobre o outro pode acarretar ganho ou perda de massa óssea (HANLEY,
2000; KONG et al., 1999).
Segundo Aires (2008), até a idade aproximada de quarenta anos, o equilíbrio entre
neoformação e reabsorção óssea é mantido. A partir dessa idade há discreto predomínio da
reabsorção sobre a formação óssea caracterizando, ao longo dos anos, um estado osteopênico
fisiológico. Nas mulheres este estado é acentuado após a menopausa, principalmente pela
redução dos níveis de estrógeno. O estrógeno modifica as expressões de genes de substâncias
30
como colágeno tipo I, fosfatase alcalina, osteopontina, osteocalcina e osteonectina
(OKAZAKI et al., 2002). Além disso, este hormônio promove a diferenciação osteoblástica,
aumentando a síntese e a mineralização da matriz óssea (TOMKINSON et al., 1998; BLAND,
2000); estimula a apoptose dos osteoclastos e mantém os osteócitos viáveis (TOMKINSON et
al., 1997; D’AMELIO et al., 2008). Nas mulheres após a menopausa os osteoblastos estão
ativos, porém, não são capazes de reconstruir completamente as cavidades ósseas
reabsorvidas pelos osteoclastos; com isso, é acentuada a perda óssea (NECO, 1994).
Os fatores que controlam a reabsorção óssea não estão totalmente esclarecidos.
Acredita-se que a ativação do reparo ósseo seja um processo controlado por fatores locais
bioquímicos e físicos) e sistêmicos (atividade física, hormônio paratireoideo, calcitonina e
hormônios sexuais, etc) (FERNANDES, WHEBA, MELO, 1996). Considera-se que a
deficiência do hormônio estrogênio seja o principal fator de risco para a osteoporose em
mulheres no período pós-menopausa. Além disso, esse tipo de osteoporose está associado à
má absorção intestinal de cálcio, à redução da síntese de vitamina D ativa e ao desequilíbrio
com perda de cálcio (KOBAYASHI, HARA, AKIYAMA, 2002; ZHANG et al., 2008).
1.3 Osteopenia e osteoporose
A osteoporose é definida como doença esquelética sistêmica que tem como
consequência a redução de massa e deterioração microarquitetural do tecido ósseo,
caracterizada pelo aumento da fragilidade óssea e susceptibilidade a fraturas (FERNANDES,
WHEBA, MELO, 1996).
É grande a atenção dada à osteoporose na mulher, por atingir grande parte da
população feminina após a menopausa (FERNANDES, WHEBA, MELO, 1996). Em
mulheres acima de quarenta anos, a osteoporose é decorrente da privação hormonal, alteração
do metabolismo geral, perda de massa óssea com aumento da reabsorção sobre a formação e,
perda de massa muscular, juntamente com a diminuição da atividade física (SMITH,
GILLIGAN, 1989; ZAKI, 2014). Após a menopausa, a perda óssea é predominantemente de
osso trabecular, seguindo-se de osso cortical (BANDEIRA et al., 2000).
A função principal do estrógeno no esqueleto humano, é diminuir o processo de
remodelação e reabsorção óssea enquanto mantém a formação óssea (CAULEY, 2015. Riggs
e colaboradores (1986) demonstraram que mulheres no período da menopausa, o processo de
31
formação óssea é alterado, gerando diminuição na formação óssea e aumento na reabsorção,
acarretando perda de massa óssea. Essa perda integral é de seis por cento no primeiro ano e de
2,5% no segundo ano (RIGGS et al. 1986). Cauley (2015) observou que no período de dois a
cinco anos pós menopausa a perda de massa óssea na coluna lombar e no colo do fêmur em
mulheres é respectivamente 10,6% e 9,1%, predispondo à fratura.
1.4 Reparo ósseo normal
A fratura de um osso longo apresenta duas principais consequências: perda da
continuidade do osso e incapacidade funcional (MERLOZ,2011), que deverão ser recuperadas
com o reparo da fratura. Este processo é considerado complexo e multifásico, envolvendo a
atividade coordenada de diversos tipos de células (DINIZ et al., 2008; KAYAL et al., 2009;
FAZZALARI, 2011)
O processo de reparo da fratura inicia-se pelo hematoma formado em resposta à lesão
dos tecidos. O periósteo é ativado, por um mecanismo de formação óssea intramembranosa
que delimita e isola o meio da fratura, conhecido como foco de fratura. Células
osteoprogenitoras são recrutadas e chegam ao local da lesão, onde proliferam e diferenciam-se
em condrócitos e osteoblastos. Os condrócitos produzem cartilagem, formam o calo ósseo
mole que, em seguida, sofre calcificação, tornando-se mais resistente e protegendo o local
fraturado. Segue-se a apoptose dos condrócitos e, simultaneamente, os condroclastos
começam a absorver tecido cartilaginoso mineralizado que é, depois, substituído por osso
jovem ou entrelaçado (woven bone). A partir do periósteo surgem fibroblastos que vão se
ossificar por mecanismo intramembranoso. Por último, e em longo prazo, o tecido ósseo sofre
remodelação cujo objetivo é recuperar a anatomia e as funções originais do osso fraturado
(KAYAL et al., 2009; FAZZALARI, 2011)
Em termos mecânicos, esse sistema em cascata que é desencadeado após a fratura
contribui para a união das extremidades da fraura, que ocorre pela combinação da ossificação
endocondral e intramembranosa (FAZZALARI, 2011), garantindo a formação do calo ósseo,
que consiste de tecido regenerado, que preenche o espaço entre dois fragmentos ósseos
(MERLOZ, 2011) e recupera a integridade mecânica desfeita pela fratura.
Aceita-se que haja três tipos diferentes de calos ósseos: o calo externo ou periférico, o
calo medular e o calo trabecular primário (MCKIBBIN, 1978; MERLOZ,2011).
32
1.5 Consolidação da fratura em ossos osteopênicos
A fratura é uma das principais complicações da osteoporose, resultando, entre outros
aspectos, em incapacidade e dependência física (GIANNOTTI et al., 2013). Há estudos que
sugerem que a idade avançada dificulta a consolidação de fraturas (GRUBER et al., 2006), e a
má qualidade óssea presente em pacientes com osteoporose acarreta atraso na consolidação
(CHAO et al., 2004).
A restauração da propriedade mecânica óssea, com base na carga máxima e na energia
absorvida, é significativamente menor nas ratas pós ovariectomizadas (HE et al., 2011).
1.6 Indução de perda de massa óssea em animais experimentais
A ovariectomia é o método mais utilizado para induzir os efeitos da menopausa em
animais. Por reduzir a secreção estrogênica (BONNET et al., 2007; FUCHS et al., 2007) esse
modelo animal reproduz, em ratas, alguns efeitos similares encontrados nas mulheres pós-
menopausa (KALU, 1991; THOMPSON et al., 1995).
Thompson e colaboradores (1995) observaram que, após duas semanas de
ovariectomia, foi possível verificar diminuição significativa do volume do osso trabecular da
região proximal da tíbia de ratas, em virtude da perda e adelgaçamento das trabéculas. Essas
modificações induzidas pela ovariectomia, assemelham-se às alterações em mulheres como
enfraquecimento e fragilidade óssea (WHO, 1998). No entanto, a osteopenia pós-ovariectomia
é mais comumente estudada em torno do segundo ou terceiro mês pós-operatório (KEILER,
2012; SIMÕES et al., 2008), sendo que após este tempo a perda de massa óssea se estabiliza.
1.7 Efeitos osteogênicos da consolidação óssea na terapia por vibração
A terapia por vibração é recurso que mostra que a vibração de baixa magnitude e alta
frequência proporciona estímulos mecânicos positivos no combate à osteopenia instalada
(GILSANZ et al., 2006; RUBIN et al., 2004).
Segundo Gilsanz e colaboradores (2006) e Rubin e colaboradores (2004), a vibração
exerce efeito osteogênico sobre a qualidade óssea, como observado por Novak e
33
colaboradores (2014), em ratos adultos. Outros efeitos positivos também são obtidos em
pacientes, como aumento na circulação sanguínea dos membros e aumento na área transversal
das fibras musculares (XIE, RUBIN e JUDEX, 2008), além do aumento na resistência óssea
(ZAKI, 2014).
Atualmente reconhece-se uma propriedade existente em vários tecidos, e entre eles o
ósseo, genericamente chamada de mecanotransdução, que consiste em transformar estímulos
mecânicos em respostas biológicas positivas, contribuindo para o trofismo dos tecidos (XIE,
RUBIN e JUDEX, 2008). Em verdade, o reconhecimento do efeito do estímulo mecânico na
qualidade óssea foi reconhecida há muitos anos pela lei de Wolff, em 1870 (RUBIN et al.,
2001), que diz que o osso adapta sua estrutura às condições de carregamento a ele submetidos
(RUFF, HOLT e TRINKAUS, 2006).
O esqueleto é submetido constantemente a cargas mecânicas em virtude da força
gravitacional (peso-rolamento) e da contração muscular, o que estimula a remodelação óssea
através da mecanotransdução. Neste processo há respostas bioquímicas, resultando em
alterações na expressão gênica, função e morfologia celular, e na formação da matriz
extracelular (LUU et al., 2009). Os osteócitos são células ósseas que detectam esses sinais
mecânicos e modulam as taxas de formação e de reabsorção óssea, por meio da estimulação
da atividade dos osteoblastos e osteoclastos (LUU et al., 2009). Assim, a atividade física
resulta em estimulação mecânica que fortalece o tecido ósseo (BURR et al., 2002;
SHIGUEMOTO et al., 2012).
Stuermer e colaboradores (2010), Komrakova e colaboradores (2013) e Wehrle e
colaboradores (2015) observaram que a terapia por vibração apresentou melhora na
consolidação de defeitos ósseos provocados em ratas osteoporóticas. No entanto, os autores
utilizaram o modelo de perfuração óssea, em que não há a formação de calo ósseo por
ossificações endocondral e sim intramembranosa. Leung e colaboradores (2009) e Shi e
colaboradores (2010) concluíram que a terapia por vibração acelera o processo de
consolidação óssea, formação do calo ósseo, remodelação, mineralização e restauração
mecânica. Por outro lado, Wolf e colaboradores (2001) não observaram resultados positivos
da terapia por vibração na consolidação de defeito ósseo.
34
Objetivos
35
2 OBJETIVOS
Avaliar as alterações do tecido e do calo ósseo pós fratura de fêmures osteoporóticos
de ratas ovariectomizadas.
Investigar os efeitos da terapia por vibração tanto no tecido ósseo normal como no
calo ósseo desses animais no reparo da fratura.
Material e Métodos
37
3 MATERIAL
3.1 Animais experimentais
Todos os procedimentos experimentais envolvidos nesse estudo foram aprovados pela
Comissão de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
da Universidade de São Paulo (processo nº 013/2014).
Foram utilizadas ratas (Rattus Norvegicus albinus), variedade Wistar, com idade de
sete semanas, nulíparas, com a massa corporal variando entre 220g e 270g, fornecidas pelo
Biotério Central da Prefeitura do Campus de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo e
alojada no Biotério do Laboratório de Bioengenharia da FMRP/USP. Os animais passaram
por adaptação durante uma semana e permaneceram em gaiolas coletivas, sem restrição de
acesso à água e ração. A temperatura ambiente foi controlada entre 22ºC e 24oC, controle de
claro/escuro (12 x 12 horas) e controle da umidade relativa do ar em 55%±10. Diariamente
foram avaliadas as condições de estresse do animal pela presença ou não de pigmentos de
porfirina ao redor dos olhos e mucosas faciais, além de observação do comportamento animal
(autolimpeza, atividade espontânea, reatividade e sono).
Os cuidados diários foram de acordo com o guia para cuidados e uso de animais de
laboratório (Animal models as tools in ethical biomedical research, edição 2010).
38
3.2 Grupos experimentais
3.3 Os animais foram aleatoriamente divididos em quatro grupos experimentais e,
cada grupo experimental foi subdividido em dois subgrupos (Quadro 1).
Quadro 1 - Grupos experimentais.
Grupos Subgrupos
CON+FRAT
Grupo controle com
fratura óssea
Ratas normais, com fratura
óssea
CON+FRAT1 (n=6) – ratas normais com
fratura óssea observadas por 14 dias, pós-
fratura óssea
CON+FRAT2 (n=5) – ratas normais com
fratura óssea observadas por 28 dias, pós-
fratura óssea
OVX+FRAT
Grupo ovariectomia e
fratura óssea
Ratas ovariectomizadas com
fratura óssea
OVX+FRAT1 (n=5) – ratas
ovariectomizadas com fratura óssea
observadas por 14 dias, pós-fratura óssea
OVX+FRAT2 (n=5) – ratas
ovariectomizadas com fratura óssea
observadas por 28 dias, pós-fratura óssea
CON+FRAT+TV
Grupo controle com
fratura óssea e
tratamento com terapia
por vibração
Ratas normais, com fratura
óssea e tratamento com terapia
por vibração
CON+FRAT+TV1 (n=5) – ratas normais,
com fratura óssea e tratamento com terapia
por vibração e observadas por 14 dias, pós-
fratura óssea
CON+FRAT+TV2 (n=4) – ratas normais,
com fratura óssea e tratamento com terapia
por vibração e observadas por 28 dias, pós-
fratura óssea
OVX+FRAT+TV
Grupo ovariectomia
com fratura óssea e
tratamento com terapia
por vibração
Ratas ovariectomizadas, com
fratura óssea e tratamento com
terapia por vibração
OVX+FRAT+TV1 (n=6) – ratas
ovariectomizadas, com fratura óssea e
tratamento com terapia por vibração e
observadas por 14 dias, pós-fratura óssea
OVX+FRAT+TV2 (n=5) – ratas
ovariectomizadas, com fratura óssea e
tratamento com terapia por vibração e
observadas por 28 dias, pós-fratura óssea
O período experimental consistiu em 104 dias ou 118 dias. Composto da seguinte
maneira: dia 0 os animais foram submetidos ao procedimento de ovariectomia ou cirurgia
simulada, após 90 dias os animais foram submetidos ao procedimento de fratura óssea. Após
o procedimento de fratura os animais foram observados ou tratados por 14 ou 28 dias,
totalizando 104 ou 118 dias de acordo com os subgrupos do experimento.
39
3.4 Procedimento experimental – indução cirúrgica da osteoporose
Os animais foram anestesiados por meio da combinação 1:1 de xilazina (6 mg/kg) e
quetamina (60 mg/kg), aplicada por via intramuscular na região glútea (0,1mg/100g). O
procedimento cirúrgico foi de acordo com as técnicas rotineiras de assepsia e antissepsia. A
técnica cirúrgica para a retirada de ambos ovários foi realizada segundo Zarrow e
colaboradores (1964). Inicialmente foi feita a tricotomia na região dorso-ventral do animal
entre o rebordo costal inferior e o início da pelve, seguida da antissepsia dessa região com
solução alcoólica 1% de polivinil-pirrolidona-iodo. Foi realizada uma incisão retilínea,
transversal, de aproximadamente 1,0 cm de comprimento na pele e tecido subcutâneo, cerca
de 1,0 cm da linha mediana entre o rebordo costal inferior e o início da pelve. A parede
muscular composta pela fáscia aponeurótica e músculo abdominal oblíquo foi divulsionada
até ser obtido acesso à cavidade retroperitoneal e identificado o ovário. Em seguida, foi
realizada a evisceração do corno uterino. A extremidade da tuba uterina foi ligada com fio
cirúrgico multifilamento reabsorvível sintético – ácido poliglicólico (4-0) e os ovários foram
retirados. A evisceração foi desfeita e realizada a sutura da parede muscular e pele com fios
não-absorvíveis de náilon (3-0). Todo o procedimento foi repetido para o lado oposto
(SIMÕES et al., 2008). Para analgesia os animais receberam dipirona (80µL de uma diluição
1:5 em solução estéril de 0,9% de NaCl, subcutâneamente, na região dorsal) a cada oito horas
por cinco dias após a cirurgia. A primeira dose de dipirona foi administrada 15 minutos antes
de ser iniciado o procedimento cirúrgico. Nos animais com operação simulada foram
realizados todos os passos cirúrgicos, exceto a ressecção dos ovários.
3.5 Procedimento experimental – fratura óssea
Após 90 dias da ovariectomia foi provocada uma fratura na região diafisária do fêmur
direito, pelo método fechado e realizada a fixação dos fragmentos ósseos com um fio de aço
flexível colocado intramedularmente.
Para isso, os animais foram anestesiados por meio da combinação (1:1; 0,1mg/100g)
de xilazina (6 mg/kg) e quetamina (60 mg/kg), aplicada por via intramuscular na região
glútea. Todo o membro pélvico direito foi tricotomizado e recebeu a aplicação de solução
alcoólica 1% de polivinil-pirrolidona-iodo.
40
A fratura foi realizada pelo método da guilhotina de lâmina romba, especialmente
confeccionada para este propósito (Figura 1). A coxa do animal foi apoiada nas extremidades
de suporte da guilhotina e tracionada, de modo a posicionar seu terço médio sob a porção
romba da guilhotina que, por acionamento manual foi baixada, até perda da resistência
(geralmente acompanhada de um estalido).
Figura 1. Desenho esquemático da guilhotina utilizada para produzir a fratura fechada na diáfise femoral. A
coxa do animal (aqui representada pelo fêmur) é colocada no centro dos apoios metálicos e a guilhotina com a
extremidade romba e baixada pela alavanca acionada manualmente.
Em seguida, o animal foi retirado da guilhotina e colocado em mesa cirúrgica em
decúbito lateral esquerdo, sendo feita antissepsia de todo o membro pélvico direito com
solução alcoólica 1% de polivinil-pirrolidona-iodo.
Foi feito um mini acesso cirúrgico na face lateral na coxa, sobre fratura, realizada a
dissecção pelo septo intermuscular até o foco da fratura, que foi minimamente exposta. A
ocorrência e adequação da fratura foi confirmada sob visão direta. Em seguida, um fio de
Kirschner de 1,0 mm de espessura foi introduzido pelo canal medular do fragmento proximal,
até sair pela pele na face lateral da raiz da coxa, onde foi feita uma incisão de mais ou menos
1,0 cm. A fratura foi reduzida por observação direta e o fio de Kirschner foi avançado em
sentido contrário pelo canal medular do fragmento distal até ser sentido pela palpação da pele
entre os côndilos do joelho. Após isso, o fio foi recuado até que a saliência desaparecesse. A
adequação da redução da fratura, bem como sua estabilidade foi conferida, e o excesso do fio
de Kirschner que saiu pela região pélvica foi cortado, sua extremidade dobrada em forma de
gancho e introduzida sob a musculatura, junto do trocanter maior. Ainda com o animal
anestesiado, foi feita uma radiografia digital da coxa (incidência anteroposterior e perfil, com
distância de 115cm entre foco e o chassis (cassete) digital (Kodak-View 24x30 cm), com
41
parâmetros de 5 mA e 44 kV em aparelho portátil de radiografias (Siemens- Unimax 2B,- Rio
de Janeiro- Brasil), com o objetivo de comprovar as adequações da fratura e da fixação. As
incisões na região pélvica e lateral da coxa foram suturadas por planos, até a pele, com pontos
separados de náilon três zeros. Na região operada foi aplicada uma substância antimutilante
(Adestro, SP, Brazil2) para impedir a autofagia.
Os animais recuperaram-se da anestesia em ambiente aquecido e receberam dipirona
(80µL de uma diluição 1:5 em solução estéril de 0,9% de NaCl), por via subcutânea
administrada a cada oito horas por cinco dias pós-fratura, sendo que a primeira dose foi
aplicada 15 minutos antes da realização da fratura. Uma vez recuperadas, as ratas foram
mantidas em gaiolas individuais, de acordo com as normas técnicas do biotério.
Foram excluídos os animais que apresentaram fraturas cominutivas (mais de três
fragmentos), com localização inadequada, incompletas, oblíquas longas ou fixadas
inadequadamente. Da mesma forma, foram excluídos animais que apresentaram infecção,
perda da redução da fatura, qualquer alteração da saúde geral, ou alterações permanentes da
marcha no membro operado.
Tanto os animais ovariectomizados, como os controles (operação simulada) foram
mantidos por um período de 90 dias para o início da fase seguinte que corresponde à produção
da fratura. Depois disso foram mantidos por 14 ou 28 dias, conforme o subgrupo.
3.6 Procedimento experimental – tratamento com terapia por vibração
Os animais foram posicionados em compartimentos individuais da plataforma
vibratória (Figura 2) e submetidos aos efeitos mecânicos da vibração, com frequência de
60Hz e amplitude de deslocamento vertical de 1,0 mm (ZAMARIOLI et al., 2012). A terapia
foi iniciada três dias após a fratura e aplicada durante 20 minutos, três vezes por semana, por
14 ou 28 dias, de acordo com o subgrupo experimental.
2 Composto de água deionizada, propilenoglicol, benzoato de denatônio e metilparabeno
42
Figura 2. Figura ilustrando a aplataforma vibratória, formada por uma mesa de suporte que tem na sua parte
inferior o motor e o mecanismo de produção da vibração que é transmitido à gaiola onde os animais são
mantidos.
3.7 Análise da estrutura óssea
A eutanásia ocorreu com dose excessiva do anestésico Tiopental® aplicada por via
intraperitoneal. Depois, ambos os fêmures foram dissecados e mantidos em etanol 70% para
análises macroscópica, densitométrica, microtomográfica e de resistência mecânica.
Atravé de uma laparotomia o útero das ratas foi exposto, removido, limpo das partes
moles aderentes e pesado.
3.7.1 Análise macroscópica
Após a dissecção do fêmur, o fio de Kirschner foi retirado, os ossos foram pesados e o
comprimento longitudinal foi medido com paquímetro digital (Mitutoyo®,
). Os pares de
fêmures de cada animal foram radiografados, imediatamente após a cirugia de fixação da
fratura ainda sob anestesia, por técnica digital em incidências póstero-anterior e perfil (com
uma distância de 115cm entre foco e o chassis (cassete) digital, marca Kodak-View 24x30cm,
com parâmetros de 5 mA e 44 kV em aparelho portátil de radiografias, marca Siemens-
Unimax 2B,-Rio de Janeiro- Brasil)
43
Figura 3. Figura ilustrando a radiografia realizada imediatamente após o procedimento de fixação da fratura óssea,
para comprovação da adequação da redução dos fragmentos e posicionamento do fio de Kishner.
3.7.2 Microtomografia computadorizada (micro-CT)
A microtomografia computadorizada (micro-CT) foi realizada em microtomógrafo
SkyScanTM
(modelo 40, Brüttisellen, Suíça), do Laboratório de Endodontologia da Faculdade
de Odontologia de Ribeirão Preto-USP, Brasil.
Este método é caracterizado pela análise tridimensional da estrutura óssea,
evidenciando a microgeometria e a densidade mineral óssea. Permite a análise independente
do osso trabecular e do cortical (BURGHARDT et al., 2011), além da análise quantitativa do
calo ósseo formado pós-fratura.
A microtomografia foi feita com a utilização do microtomógrafo composto por um
tubo de raios-X de microfoco com fonte de alta tensão (100kV), um porta amostras, onde o
osso foi posicionado e um detector baseado em uma câmera CCD de 11Mp conectado a um
computador para controle da aquisição de dados com software para reconstrução, visualização
e análise quantitativa de imagens em 2D e em 3D.
O tecido trabecular da metáfise distal do fêmur sem fratura foi analisado por uma
extensão de 3,0 mm proximal apartir da cartilagem de crescimento distal do fêmur. Os
parâmetros analisados foram: volume ósseo total (BV), em mm3; volume ocupado pelo osso
trabecular, mineralizado ou não, expresso como porcentagem do volume ocupado pela medula
e trabéculas ósseas (BV/TV), em %; número de trabéculas ósseas por milímetro de tecido
(TbN), em no/mm; espessuras das trabéculas ósseas (TbTh), em m; espaçamento entre as
trabéculas ósseas (TbSp), em m; e densidade de conexão entre múltiplas trabéculas ósseas
44
(ConnD), em mm3. Quanto maior os valores de BV, BV/TV, TbN, TbTh e ConnD, melhor a
qualidade da estrutura do tecido ósseo. Por outro lado, quanto maior o valor de TbSp, pior a
qualidade óssea.
Figura 4. Figura ilustrativa da região trabecular de interesse na extremidade distal do fêmur analisada pelo
micro-CT.
A microarquitetura cortical foi analisada na diáfise do fêmur, 8,0 mm proximalmente à
placa de crescimento distal, em uma extensão de 2,0 mm. Os parâmetros avaliados foram
volume cortical (Ct.V, em mm3, Ct.BV/TV, em %) e espessura cortical (Ct.Th, em m).
Figura 5. Figura ilustrativa da região cortical de interesse analisada pelo micro-CT.
45
O volume do calo foi analisado com o software CTAn, sendo que a área total do calo
ósseo foi selecionada como região de interesse para cálculo do volume, em
mm3.
Figura 6. Figura ilustrativa da região de interesse correspondente ao calo ósseo analisada pelo
micro-CT.
3.7.3 Densitometria óssea
A densitometria mineral óssea foi realizada com dupla emissão de raios-X (DXA) e
realizada no Laboratório de Bioengenharia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, com
o densitômetro Lunar DPX-IQ (Lunar; software version 4.7e, GE Healthcare, Chalfont St.
Giles, United Kingdom), pelo método de absorciometria bifotônica de raios-X (DXA,
abreviação em inglês: Dual-energy X-ray Absorptiometry). Os ossos foram posicionados no
equipamento e escaneados em todo o comprimento.
A análise foi realizada na metáfise distal dos fêmures direito e esquerdo e no calo
ósseo. Para isso, foram utilizados como região de interesse quadrados de 0,90cm2 nas
metáfises distais, posicionados imediatamente proximal à cartilagem de crescimento distal.
Na região diafisária dos fêmures fraturados foram utilizados como região de interesse figuras
geométricas de tamanhos e formas variáveis que pudessem conter todo o calo ósseo. Os
46
valores de DMO (densidade mineral ósseo), CMO (conteúdo mineral ósseo) e área do calo
ósseo foram analisados com base nas regiões de interesse avaliadas.
Figura 7. Ilustração do posicionamento dos ossos para realização do exame de densitometria.
3.7.4 Análise mecânica
Após a determinação da densidade óssea e da realização da microtomografia
computadorizada, os fêmures foram submetidos ao ensaio mecânico na máquina universal de
ensaios (EMIC®
- 10000N, Equipamentos e Sistemas de Ensaio LTDA, São José dos Pinhais-
PR) no Laboratório de Bioengenharia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP.
Em ambos os fêmures, o ensaio mecânico realizado foi o de flexão em três pontos. No
fêmur esquerdo (sem fratura) a região analisada foi sobre a metáfise distal e no fêmur direito
(com fratura) o teste mecânico foi realizado sobre a região central do calo ósseo. Para
realização dos testes mecânicos, os ossos foram posicionados sobre suporte com dois apoios
(com vão livre de 7,0 mm), posicionados na base fixa da máquina de ensaio e a carga
mecânica aplicada na face anterior do fêmur por meio de acessório com ponta romba afixada
à base móvel da máquina (Figura 8). Durante os ensaios foi utilizada célula de carga de 500
N, com aplicação de carga no sentido vertical até a falência mecânica do osso, utilizando
velocidade de aplicação de 1,mm/min. O parâmetro estudado foi força máxima, calculada a
partir da curva carga x deslocamento, obtida em tempo real durante o ensaio (software TESC,
versão 13.4).
47
Figura 8. Ilustrações do ensaio mecânico de três pontos realizado na metáfise distal do fêmur esquerdo
(não fraturado) (A), e na região central do calo ósseo do fêmur direito (B).
3.8 Análise estatística dos resultados
Inicialmente, os valores dos parâmetros foram submetidos ao teste de normalidade
para verificar se apresentavam distribuição paramétrica. O modelo linear generalizado
(General Linear Models (PROC GLM) foi utilizado para comparar os dados entre os grupos
experimentais. O pós-teste de Tukey foi aplicado para a múltipla comparação entre os grupos.
O nível de significância foi de 5% (p0,05).
Resultados
49
4 RESULTADOS
As complicações pós-operatórias foram comuns nos grupos experimentais e
resultaram na exclusão de 29 animais (34%): 14 animais morreram durante a indução
anestésica e 15 animais foram submetidos à eutanásia. Das 14 mortes, seis (43%) ocorreram
por indução anestésica durante a cirurgia de ovariectomia e oito (57%) durante o
procedimento cirúrgico de fratura e fixação. Das quinze eutanásias, onze (73%) foram devido
à fratura excessivamente cominutivas e quatro (27%) pela migração excessiva do fio de
Kirschner. Não houve caso de infecção ou deiscência da ferida operatória ou casos de fixação
indadequada. Os resultados apresentados foram baseados nos 41 animais sobreviventes.
4.1 Massa corpórea dos animais
As médias e os desvios padrão da massa corpórea dos animais, por grupo
experimental, estão apresentados na Figura 9. Os animais foram pesados semanalmente desde
o início do experimento até a eutanásia.
Figura 9: Média e desvio padrão da massa corpórea dos animais, no início do experimento (dia 0), após 90 dias
da cirurgia de ovariectomia ou simulação (sham) para os grupos controles e, após 14 dias de tratamento (dia 104)
ou 28 dias de tratamento (dia 118) com terapia por vibração. Os asteriscos indicam presença de diferença significativa.
Não foi observada diferença estatística entre a massa corpórea dos animais no início
do experimento (261,0±21,1g no grupo CON+FRAT; 246,0±13,7g no grupo OVX+FRAT;
266,6±21,6g no grupo CON+FRAT+TV e 252,5±29,6g no grupo OVX+FRAT+TV; p>0.05).
Três meses após o procedimento cirúrgico de ovariectomia (para os grupos OVX e
cirurgia simulada para os grupos CON) os animais dos grupos ovariectomizados apresentaram
um aumento de 15% na massa corpórea em comparação aos animais dos grupos controles
50
(386,0±34,6g no grupo CON+FRAT; 442,6±30,7g no grupo OVX+FRAT; 382,2±56,9g no
grupo CON+FRAT+TV e 474,0±61,6g no grupo OVX+FRAT+TV; p<0,05). Com relação ao
ganho de massa corpórea, na comparação entre o dia zero e 90, os animais dos grupos
controle apresentaram ganho de 48% na massa corpórea enquanto que para os animais
ovariectomizados o aumento foi de 80%.
Com relação ao período pós-fratura, foi observada diminuição na massa corporal. No
entanto, o ganho de massa corpórea das ratas ovariectomizadas manteve-se maior que o das
ratas controle.
4.2 Massa uterina
Pela inspeção visual durante a dissecção foi possível observar a atrofia uterina nas
ratas ovariectomizadas.
Figura 10. Comparação entre útero de rata não-ovariectomizada (A) e ovariectomizada (B), ilustrando a atrofia
uterina causada pela ovariectomia.
As médias e os desvios padrão das massas dos úteros estão apresentados na figura 11.
É possível observar que a massa uterina é significativamente inferior nos grupos submetidos à
ovariectomia (p<0,05), confirmando a atrofia uterina após a ovariectomia.
51
Figura 11. Média e desvio-padrão da massa uterina dos animais experimentais. A diferença significativa entre os
grupos ovariectomizados e não-ovariectomizados confirma a extração dos ovários e a consequente atrofia uterina
causada por ela. Os asteriscos indicam presença de diferença estatisticamente significativa.
4.3 Análise macroscópica
As médias e os desvios padrão das medidas dos fêmures direito e esquerdo dos
animais estão apresentados nas Tabelas 1, 2, 3 e 4.
Tabela 1. Média e desvio padrão do comprimento do fêmur direito das ratas dos grupos de 104 e 118 dias.
Grupo
OVX
CON+FRAT
OVX+FRAT
CON+FRAT+TV
OVX+FRAT+TV
104
dias 39.75±1.36mm 35.70±2.16mm 34.24±1.72mm 33.97±2.68mm 36.19±1.94mm
118
dias 38.87±1.79mm 33.78±1.57mm 33.75±2.18mm 37.02±1.22mm 34.97±1.81mm
Tabela 2. Média e desvio padrão da massa do fêmur direito das ratas dos grupos de 104 e 118 dias.
Grupo
OVX
CON+FRAT
OVX+FRAT
CON+FRAT+TV
OVX+FRAT+TV
104
dias 1.54±0.14g 1.64±0.21g 2.01±0.44g 1.85±0.16g 1.88±0.39g
118
dias 1.30±0.09g 1.70±036g 1.65±0.27g 2.04±0.15g 1.78±0.35g
52
Tabela 3: Média e desvio padrão do comprimento do fêmur esquerdo das ratas dos grupos de 104 e 118 dias.
Grupo
OVX
CON+FRAT
OVX+FRAT
CON+FRAT+TV
OVX+FRAT+TV
104
dias 39.73±1.36mm 38.60±1.40mm 38.16±1.62mm 37.23±2.91mm 39.13±1.42mm
118
dias 39.01±1.24mm 35.45±2.79mm 37.08±3.09mm 39.54±1.04mm 39.31±0.95mm
Tabela 4. Média e desvio padrão da massa do fêmur esquerdo das ratas dos grupos de 104 e 118 dias.
Grupo
OVX
CON+FRAT
OVX+FRAT
CON+FRAT+TV
OVX+FRAT+TV
104
dias 1.51±0.19g 1.30±0.06g 1.42±0.09g 1.39±0.13g 1.42±0.15g
118
dias 1.28±0.11g 1.25±0.08g 1.29±0.22g 1.33±0.19g 1.46±0.21g
Com relação à massa óssea e comprimento dos fêmures, não foi possível observar
diferença significativa entre os grupos experimentais, tanto no fêmur direito como no fêmur
esquerdo.
4.4 Análise densitométrica
4.4.1 Análise densitométrica na metáfise distal do fêmur
Houve redução de 39% e 34% na densidade mineral óssea analisada nas metáfises
distais dos fêmures esquerdos e direito, respectivamente nos grupos 14 e 28 dias (Figura 12).
Quanto ao conteúdo mineral ósseo essa redução foi de 35% e 31%, respectivamente (Figura
13). Ambas as comparações foram entre os grupos OVX+FRAT e CON+FRAT.
A terapia por vibração levou ao aumento na densidade mineral óssea de 27% no fêmur
esquerdo e de 21% no fêmur direito, após 14 dias da ovariectomia (Figura 12). Com relação
ao conteúdo mineral ósseo, houve aumento de 28% na metáfise distal do fêmur esquerdo dos
animais do grupo OVX+FRAT+TV (14 dias pós-fratura, Figura 13).
A terapia por vibração não apresentou efeito positivo significativo nos animais não-
ovariectomizados e no grupo ovariecomizado de vinte e oito dias (Figura 12 e 13).
53
Figura 12. Média da densidade mineral óssea das metáfises distais dos fêmures esquerdo e direito dos animais
experimentais. É possível observar diminuição de massa óssea nos animais ovariectomizados. Além disso, a
terapia por vibração causou aumento da DMO nos animais submetidos à ovariectomia prévia. Os asteriscos
indicam presença de diferença estatisticamente significativa.
Figura 13. Média do conteúdo mineral óssea das metáfises distais dos fêmures esquerdo e direito dos animais
experimentais. Houve diminuição da massa óssea nos animais ovariectomizados. Os asteriscos indicam presença
de diferença estatisticamente significativa.
4.4.2 Análise densitométrica no calo ósseo
A comparação da DMO, CMO e área do calo ósseo entre os grupos experimentais está
apresentada nas figuras 14, 15 e 16, respectivamente. Foi possível observar que no grupo
ovariectomizado houve redução de 20% do conteúdo mineral ósseo em relação ao grupo
controle (Figura 15), além de redução de 6% na área do calo (Figura 16). A terapia por
vibração causou aumento estatisticamente significativo de 20% (p<0,05) em relação à
densidade mineral ósseo do grupo OVX+FRAT+TV, comparadas com o grupo
CON+FRAT+TV em relação aos grupos não tratados (Figura 14).
54
A terapia por vibração não causou aumento estatisticamente significativo nos animais não-
ovariectomizados (Figuras 14, 15 e 16).
Figura 14. Média e desvio-padrão da DMO do calo ósseo. A terapia por vibração causou aumento da DMO dos
animais ovariectomizados tratados. O asterisco indica presença de diferença estatisticamente significativa.
Figura 15. Valores médios e desvio-padrão do CMO do calo ósseo.
Figura 16. Valores médios da área do calo analisada, comparativa entre os grupos de 104 e 118 dias.
55
4.4.3 Análise mecânica
A média e o desvio padrão da força máxima estão apresentados na figura 17. Houve
redução da força máxima nos animais submetidos à ovariectomia e, embora não significativa,
a terapia por vibração parece ter exercido efeito osteogênico tanto, no osso osteoporótico
intacto (fêmur esquerdo), como no calo ósseo (fêmur direito).
Figura 17. Média e desvio padrão da força máxima do fêmur. A resistência mecânica foi menor nos animais
ovariectomizados, enquanto que a terapia por vibração exerceu efeito protetor sobre essa perda de resistência
mecânica. O asterisco indica presença de diferença estatisticamente significativa.
Por meio do ensaio mecânico a força máxima mensurada na metáfise distal dos
fêmures esquerdos foi significativamente menor (16%, p>0,05) entre os grupos OVX +FRAT
e CON+FRAT 14 dias. A diferença entre o grupo OVX tratado e o grupo OVX não tratado
não foi estatisticamente significante, mas o grupo OVX+FRAT+TV apresentou aumento de
13% na força máxima em relação ao grupo OVX+FRAT.
Esse aumento também pôde ser notado com relação ao calo ósseo (fêmur direito): a
terapia por vibração proporcionou melhora na força máxima do calo ósseo entre os grupos
OVX+FRAT+TV e OVX+FRAT 14 e 28 dias com aumento de 27% e de 38%,
respectivamente. Nos grupos controle o efeito positivo da terapia por vibração no calo ósseo
não foi observado.
56
4.5 Análise microscópica
Com a tomografia computadorizada foi possível observar toda a estrutura do osso
trabecular e do osso cortical dos fêmures esquerdos (sem fratura), bem como dos calos ósseos
dos fêmures direitos.
4.5.1 Análise da microarquitetura trabecular do fêmur sem fratura
A figura 18 apresenta as imagens tridimensionais das trabéculas ósseas e a figura 19
apresenta as comparações dos resultados quantitativos da microestrutura trabecular (BV,
BV/TV, Tb.N, Tb.Th, Tb.Sp e Conn.D).
A ovariectomia causou deterioração da microarquitetura trabecular das metáfises
femorais, com redução expressiva do número e espessura das trabéculas ósseas, além de
maior espaçamento entre elas. Adicionalmente, a terapia por vibração parece ter minimizado a
perda de tecido trabecular nos animais ovariectomizados (OVX+FRAT+TV), mas não nos
animais do grupo controle (CON+FRAT+TV).
Figura 18. Microarquitetura trabecular da metáfise femoral distal mostrando redução expressiva do osso
trabecular nas ratas ovariectomizadas com fratura (OVX+FRAT), em comparação com animais controle com
fratura (CON+FRAT). Essas alterações foram amenizadas pelo tratamento por terapia por vibração
(OVX+FRAT+TV).
A deterioração trabecular em decorrência da deficiência estrogênica pode ser
confirmada pela quantificação da microarquitetura trabecular nos gráficos da Figura 19. No
período de 14 dias pós-fratura óssea, a ovariectomia reduziu significativamente a
microarquitetura trabecular (redução de 98% no BV, 98% no BV/TV, 96% no Tb.N, 33% na
Tb.Th e 97% na Conn.D, além do aumento de 150% no Tb.Sp) em comparação ao grupo de
57
animais não-ovariectomizados. No período experimental de 28 dias, pós-fratura óssea, as
alterações da microarquitetura trabecular decorrentes da supressão estrogênica persistiram
(redução de 97% no BV, 97% no BV/TV, 96% no Tb.N, 23% na Tb.Th e 97% na Conn.D,
além de aumentar o Tb.Sp em 155%).
Com relação aos grupos ovariectomizados tratados (OVX+FRAT+TV) houve melhora
na microarquitetura trabecular em relação aos grupos não tratados (OVX+FRAT). Este
aumento ocorreu tanto nos grupos de 14 dias pós-fratura (aumento de 158% no BV, 144% no
BV/TV, 116% no Tb.N, 13% na Tb.Th e 69% na Conn.D, além da redução de 11% no
Tb.Sp), como nos grupos de 28 dias pós-fratura (aumento de 113% no BV, 73% no BV/TV,
52% no Tb.N, 13% na Tb.Th e redução de 50% na Conn.D, Figura 15).
Figura 19. Média do volume ósseo total (BV), da porcentagem de tecido ósseo (BV/TV), da quantidade de
trabéculas ósseas (TbN), da espessura das trabéculas ósseas (TbTh), do espaçamento entre as trabéculas ósseas
(TbSp) e da densidade de conexão entre múltiplas trabéculas ósseas (ConnD) dos fêmures sem fratura entre os
grupos experimentais.
58
4.5.2 Análise da microarquitetura do osso cortical
A figura 20 apresenta as imagens tridimensionais do osso cortical não fraturado. A
ovariectomia causou diminuição do volume no córtex diafisário do fêmur esquerdo, porém
essa redução não foi tão notável quanto na região trabecular.
Figura 20. Microestrutura óssea cortical da diáfise femoral mostrando redução de tecido cortical nas ratas
ovariectomizadas (OVX) em comparação aos animais controle (CON). Essas alterações foram amenizadas pelo
tratamento por terapia por vibração.
As alterações da estrutura cortical em decorrência da diminuição estrogênica podem
ser confirmadas pela análise quantitativa dos parâmetros microtomográficos, ilustrados na
Figura 21. Após 104 dias da ovariectomia houve redução de 13% no Ct.V, 23% no Ct.BV/TV
e 13% na Ct.Th, em comparação aos animais controle. Estas alterações não ocorreram no
período de 118 dias pós-ovariectomia.
A figura 21 ilustra o efeito osteogênico da terapia por vibração no aumento do tecido
ósseo cortical nos animais ovariectomizados (OVX+FRAT+TV). No grupo tratado por 14
dias pós-fratura, a terapia por vibração aumentou em 25% o Ct.V e em 7% a Ct.Th. No
período de 28 dias, esse aumento foi de 24% no Ct.V e de 10% no Ct.BV/TV (OVX+FRAT
versus OVX+FRAT+TV).
59
Figura 21. Média e desvio-padrão das variáveis relacionadas à microarquitetura cortical; volume cortical (Ct.V e
Ct.BV/TV), espessura cortical (Ct.Th) dos fêmures sem fratura entre os grupos experimentais.
4.5.3 Análise da microarquitetura do calo ósseo
Na figura 22 estão representadas imagens microtomográficas representativas do calo
ósseo nos diferentes grupos experimentais. Após 14 dias da fratura, a ovariectomia reduziu
em 56% o volume do calo ósseo dos animais do grupo OVX+FRAT, em relação ao grupo
CON+FRAT. No entanto, a terapia por vibração aumentou em mais de três vezes o volume
ósseo das ratas ovariectomizadas (OVX+FRAT+TV), em comparação com o grupo
OVX+FRAT. No período de 28 dias pós-fratura a redução do volume do calo ósseo nos
animais ovariectomizados persistiu (13%), mas a diferença entre os grupos CON+FRAT e
OVX+FRAT foi menor. A terapia por vibração aumentou em 128% o volume do calo ósseo
nos animais do grupo OVX+FRAT+TV em comparação com os animais do grupo
OVX+FRAT. A terapia por vibração não exerceu o mesmo efeito osteogênico nos animais do
grupo controle, em que houve aumento discreto de 17% no volume do calo apenas no grupo
tratado por 14 dias.
60
Figura 22. Imagens do calo ósseo obtidas pelo micro-CT nos diferentes grupos, tanto no plano sagital (figuras
superiores), como transversal (figuras inferiores), mostrando que a ovariectomia (OVX) induziu à redução da
neoformação óssea, com produção de menor calo ósseo que nos grupos controle (CON). A terapia por vibração
aumentou essa neoformação.
Discussão
62
5 DISCUSSÃO
O estrógeno é o principal hormônio regulador do metabolismo ósseo, com atuação
direta nas células ósseas, o que resulta em diminuição na reabsorção e aumento na formação
óssea (CAULEY, 2014). A menopausa é acompanhada de supressão de estrógeno, que por
sua vez está associada à osteoporose (GEUSENS et al.,1986; RIGGS et al., 1986;
FINKELSTEIN et al., 2008). Em virtude da diminuição do estrógeno há grande perda de
massa óssea, com alterações na microarquitetura do osso trabecular e cortical, resistência
óssea, densidade mineral óssea, além de alterações sistêmicas e hormonais. Muitos modelos
experimentais foram desenvolvidos para simular as condições da osteoporose pós-supressão
estrogênica. A ovariectomia tem sido o modelo mais empregado para essa finalidade há
muitos anos (ZARROW et al., 1964) e descrito por Kalu e colaboradores (1989).
A ovariectomia em ratas está bem estabelecida como modelo animal de deficiência de
estrógeno, levando à osteopenia acentuada e, segundo alguns autores, à osteoporose (JEE e
YAO, 2001; MOSEKILDE, 1995). Este procedimento cirúrgico induz à rápida perda de
massa óssea, deterioração trabecular óssea e diminuição da resistência à fratura, simulando as
alterações ósseas observadas em mulheres no período pós-menopausa (KHOSLA, OURSLER
e MONROE, 2012).
Neste estudo utilizamos a ovariectomia como modelo experimental de indução de
osteoporose decorrente da supressão estrogênica. A confirmação da remoção dos ovários
ocorreu na necropsia dos animais (CARBONEL et al., 2011). Além disso, nas ratas
ovariectomizadas foi constatada grande atrofia uterina, com redução da massa uterina em 80
por cento. Aumento na massa corpórea também é um achado relevante com relação aos
animais submetidos à ovariectomia (KOMRAKOVA et al., 2013; STUERMER et al., 2010;
ZHAO et al., 2013). Nossa investigação mostrou que as ratas ovariectomizadas apresentaram
aumento de 80% na massa corpórea após três meses de deficiência estrogênica, enquanto os
animais do grupo controle apresentaram ganho de 48% de massa corporal, no mesmo período.
5.1 Alterações decorrentes da ovariectomia na estrutura de ossos não fraturados
Este estudo mostrou que a ovariectomia provocou alterações significativas no tecido
ósseo íntegro (sem fratura), com redução significativa de 16% na massa óssea, de 4% na
resistência mecânica, além de importante deterioração da microarquitetura óssea. Embora
63
essas alterações tenham sido mais expressivas no osso trabecular (osso esponjoso), a
ovariectomia também induziu alterações no osso lamelar (cortical). No osso esponjoso houve
redução do volume trabecular, do número e espessura das trabéculas, da densidade de
conexão entre elas, além do aumento no espaçamento intertrabecular. No osso cortical houve
redução do volume e da espessura. Estes achados estão de acordo com aqueles descritos por
outros autores que mostraram as mudanças deletérias causadas no tecido ósseo de mulheres
pós-menopausa (CAULEY, 2014; KHOSLA, OURSLER e MONROE, 2012), bem como a
osteoporose induzida através da redução do estrógeno em modelos animais (JEE e YAO,
2001; RUBIN et al., 2001).
No presente estudo o período de 104 dias (90 dias pós-ovariectomia + 14 dias de
seguimento pós-fratura fratura) e 118 dias (90 dias pós-ovariectomia + 28 dias de seguimento
pós-fratura) acarretaram perda de 39% e 16%, respectivamente na densidade mineral óssea. O
conteúdo mineral ósseo também apresentou redução expressiva de 36% após 104 dias de
ovariectomia. Nossos resultados estão em acordo com estudos prévios, que também
mostraram os efeitos deletérios da ovariectomia no tecido ósseo (NOVAK et al., 2014;
WEHRLE et al., 2015).
Os achados microscópicos deste estudo estão de acordo com evidências
densitométricas de perda de massa óssea induzida pela ovariectomia, concordando com
Wherle colaboradores (2015), Komrakova e colaboradores (2013), Stuermer e colaboradores
(2010) e He e claboradores (2011). De fato, a ovariectomia acarretou redução significativa da
microarquitetura óssea, tanto nas trabéculas do osso esponjoso, como nas trabéculas do osso
cortical. Segundo Stuermer e colaboradores (2010) há perda óssea nos dois tipos de osso após
70 dias de ovariectomia. He e colaboradores (2011) avaliaram a perda de massa óssea em
menor período de tempo de ovariectomia, e concluíram que 30 dias de supressão estrogênica
são suficientes para gerar alterações estruturais do tecido ósseo trabecular e cortical.
Nossos resultados mostram que, em comparação com o osso normal, 104 dias pós-
ovariectomia houve redução de 98% no volume trabecular, 96% no número de trabéculas,
33% na espessura trabecular e 97% na densidade de conexão intertrabecular, além do
aumento de 150% no espaçamento entre as trabéculas. Resultados similares, mas em menores
proporções foram observados no osso cortical, no mesmo período de supressão estrogênica:
redução de 23% no volume cortical e 13% na espessura do córtex. No período de 118 dias
pós-ovariectomia a deterioração trabecular persistiu, com redução de 97% no volume
trabecular, 96% no número de trabéculas, 23% na espessura trabecular e 97% na densidade de
conexão intertrabecular, além do aumento de 155% no espaçamento entre as trabéculas.
64
Curiosamente, não foi observada alteração cortical após 118 dias de ovariectomia, o
que pode estar relacionado com o aumento de 3% na massa corpórea das ratas
ovariectomizadas nos períodos subsequentes à ovariectomia. O ganho da massa corpórea do
animal com consequente maior solicitação óssea pode justificar os achados da resistência
mecânica óssea em relação à fratura durante o ensaio mecânico. Enquanto que, no período de
104 dias pós-ovariectomia houve redução de 16% na força máxima, no período de 118 dias
essa diferença não foi observada.
5.2 Alterações na consolidação óssea decorrentes da ovariectomia
A supressão estrogênica não atua somente na qualidade óssea de ossos intactos, sem
fratura mas também age sobre a consolidação óssea que é negativamente afetada em mulheres
pós-menopáusicas (SCHILCHER et al., 2014; SINGER et al., 2015; ZOFKOVA,
NEMCIKOVA e KUKLIK, 2015) e em animais submetidos à ovariectomia (HE et al., 2011;
KOMRAKOVA et al., 2013; STUERMER et al., 2010; WEHRLE et al., 2015). Muitos
fatores influenciam a alteração do reparo ósseo normal, como idade avançada, alterações
hormonais, tabagismo, doenças osteometabólicas, agentes farmacológicos e algumas
condições sistêmicas como a diabetes (URABE et al., 2003; DINIZ et al., 2008;
OGASAWARA et al., 2008)
Diversos estudos experimentais foram desenvolvidos para investigar os efeitos da
supressão estrogênica na consolidação do tecido ósseo pós-lesão. No entanto, esses métodos
utilizaram modelos como pequenas osteotomias (KOMRAKOVA et al., 2013; STUERMER
et al., 2010; WEHRLE et al., 2015) ou perfurações ósseas (HE et al., 2011), que podem não
simular todos os eventos fisiológicos comumente observados em uma fratura completa.
Em nosso estudo produzimos fratura óssea pelo método fechado por meio de trauma
mecânico. Esse tipo de fratura, assim como os eventos fisiológicos envolvidos para o reparo
ósseo, provavelmente são mais semelhantes às fraturas observadas clinicamente.
Leung e colaboradores (2009) utilizaram modelo semelhante ao nosso para produção
da fratura fechada e posterior estudo da consolidação óssea, no entanto, avaliaram ratos
controle sem perda de massa óssea.
Em nosso estudo a ovariectomia reduziu a formação do calo ósseo em 19% e a área do
calo em 6%, mostrando o atraso na formação e mineralização óssea do calo. No período de
duas semanas pós-fratura, houve redução de 19% na densidade do calo ósseo nos animais
65
ovariectomizados e, essa redução aumentou para 34% no período de quatro semanas pós-
fratura. No período de duas semanas pós-fratura, houve redução de 16% no conteúdo mineral
do calo ósseo nos animais ovariectomizados. Estes achados estão de acordo com Shi e
colaboradores (2010) que concluíram que a deficiência de estrógeno está relacionada a
alterações na consolidação óssea. Wehrle e colaboradores (2015) comprovaram redução de
91% na densidade do calo ósseo de animais submetidos à osteotomia.
5.3 Efeitos da terapia por vibração no tecido ósseo e na consolidação pós-fratura
Conhecendo os efeitos deletérios da supressão estrogênica na qualidade óssea, sabe-se
que a osteoporose é um dos fatores relacionados com o risco de fratura, o que reduz
significativamente a qualidade de vida e aumenta a taxa de morbidade e mortalidade
(GAUMET et al., 1996).
Desta forma, há esforços na tentativa de melhorar a consolidação óssea por meio de
recursos não farmacológicos, sendo um desses recursos a aplicação da vibração. O efeito
osteogênico da terapia por vibração no tecido ósseo parece estar bem definido na literatura,
embora ainda haja grande divergência de resultados em decorrência da grande variação entre
os programas de treinamento; frequência e amplitude da plataforma vibratória, além da
duração e frequência do tratamento (NOWAK et al., 2014; RUBIN et al., 2001; VANLEENE
e SHEFELBINE, 2013; ZHOU et al., 2015).
Neste estudo a terapia por vibração aplicada após a fratura proporcionou aumento de
27% na densidade e no conteúdo mineral óssea do fêmur esquerdo (não fraturado) dos
animais ovariectomizados. Em relação à microarquitetura do calo ósseo, a terapia por
vibração mostrou-se eficaz em minimizar as alterações decorrentes da ovariectomia; a
vibração proporcionou aumento significativo de 158% no volume trabecular, 116% no
número de trabéculas, 13% na espessura das trabéculas, 69% na densidade de conexões
intertrabeculares, além de redução de 11% no espaçamento entre as lamelas. Alterações
positivas no mesmo período também foram observadas no osso cortical, porém em menor
intensidade, sendo que a vibração aumentou o volume cortical em 25%. No período de 28 dias
pós-fratura, a vibração proporcionou aumento significativo de 113% no volume trabecular,
52% no número de trabéculas e 13% na espessura das trabéculas. Alterações positivas no
mesmo período também foram observadas no osso cortical, porém em menor escala, sendo
que a vibração aumentou seu volume em 24%.
66
Além das alterações densitométricas e microestruturais, a terapia por vibração
aumentou em 13% a resistência mecânica do osso.
Embora a terapia por vibração tenha desempenhado melhora expressiva na qualidade
de ossos osteoporóticos de ratas ovariectomizadas, resultados semelhantes não foram
observados nos grupos controles. Ou seja, a importante atuação da terapia por vibração como
recurso osteogênico parece ocorrer em situações onde a perda de massa óssea está instalada.
Assim, nos ossos normais seu efeito osteogênico não foi significativo. Reforçando este
achado, Stuermer e colaboradores (2010) concluíram que a terapia por vibração exerceu maior
efeito em ossos osteoporóticos de ratas ovariectomizadas que em ratas não-ovariectomizadas.
Diante dos resultados positivos da terapia por vibração no tecido ósseo osteoporótico
íntegro, diversos autores também investigaram os efeitos da vibração na consolidação de
fraturas. Embora haja divergências de resultados em virtude da variação metodológica,
estudos apontam resultado benéfico da vibração na consolidação óssea (KOMRAKOVA et
al., 2013; LEUNG et al., 2009; SHI et al., 2010; STUERMER et al., 2010; WEHRLE et al.,
2015). Em nosso estudo a terapia por vibração aplicada 14 dias após a fratura proporcionou
aumento de 21% na densidade e 28% no conteúdo mineral do calo ósseo das ratas
ovariectomizadas. Além disso, houve aumento de 317% no volume do calo. Quando aplicada
28 dias pós-fratura, a terapia por vibração causou aumento de 7% na densidade e 10% no
conteúdo mineral do calo ósseo das ratas ovariectomizadas. Além disso, houve aumento de
128% no volume do calo.
Komrakova e colaboradores (2013) e Wehrle e colaboradores (2015) observaram que a
terapia por vibração apresentou melhora na consolidação de defeitos ósseos provocados em
ratas osteoporóticas. Stuermer e colaboradores (2010) estudaram o efeito da terapia por
vibração em ossos de ratas ovariectomizadas, encontrando aumento significativo na densidade
mineral óssea. No entanto, esses autores utilizaram o modelo de perfuração óssea, em que não
há a formação de calo ósseo por ossificações endocondral e sim intramembranosa. Leung e
colaboradores (2009) e Shi e colaboradores (2010) concluíram que a terapia por vibração
acelerou o processo de consolidação óssea, a formação do calo ósseo, remodelação,
mineralização e restauração mecânica. Entretanto, Shi e colaboradores aplicaram a terapia por
vibração cinco vezes por semana, o que não é muito realista na realidade clínica.
Embora a terapia por vibração tenha desempenhado melhoras expressivas na qualidade
dos calos ósseos de ratas ovariectomizadas os resultados obtidos nos grupos controles não
foram relevantes, ou seja, a terapia por vibração não apresentou papel relevante como
67
acelerador da consolidação de fraturas em ossos normais, quando comparados com ossos
osteoporóticos.
Com base em nossos resultados, a terapia por vibração exerceu importante papel na
melhora da qualidade do tecido e do calo ósseo em situações em que a perda de massa óssea
já esteja instalada. Estes resultados sugerem que este recurso possa ser incorporado nos
programas de reabilitação para estimular a formação óssea, nas condições estudadas nesta
investigação.
Conclusões
6 CONCLUSÕES
A aplicação da vibração foi eficaz em minimizar as deteriorações causadas pela
deficiência estrogênica, tanto no osso íntegro, como no calo ósseo, acelerando o processo de
consolidação e mineralização do calo ósseo na fase mais precoce. Este processo ocorreu de
maneira bastante evidente na fase de reparação óssea de calo mole, mas não na fase de calo
duro.
Referências
71
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77
Manuscrito
WHOLE-BODY VIBRATION IMPROVES BONE HEALING STATUS AND BONE
QUALITY IN RATS WITH OVARIECTOMY-INDUCED OSTEOPOROSIS
Mariana M Butezloff, PT1, Ariane Zamarioli, PT, PhD
2; Graziela B Leoni, DDS
3, Manoel D
Sousa-Neto, DDS, PhD4; José B Volpon, MD, PhD
5
1Mariana Maloste Butezloff, PT, Fellow Master degree
2Ariane Zamarioli, PT, PhD. Research Fellow
3 Graziela Bianchi Leoni, DDS, Fellow PhD degree
4 Manoel Damião Sousa-Neto, DDS, PhD
5Jose Batista Volpon, MD, PhD. Full Professor
1,2,3Department of Biomechanics, Medicine and Rehabilitation, Faculty of Medicine of Ribeirao
Preto, University of Sao Paulo, Brazil
4,5Department of Endodontology, Faculty of Odontology of Ribeirao Preto, University of Sao
Paulo, Brazil
Corresponding author:
Ariane Zamarioli, PT, PhD
Laboratory of Bioengineering - Department of Biomechanics, Medicine and Rehabilitation
Faculty of Medicine of Ribeirao Preto, University of Sao Paulo
3900 Av Bandeirantes, Ribeirão Preto, SP 14049-900. Brazil
Tel/Fax: 55-16-36302-3272 / 36020225
Email: [email protected]
79
ABSTRACT
Purpose to investigate vibration therapy on femoral bone healing fractures both in intact and
ovariectomized rats.
Methods Twenty-eight seven-week-old ovariectomized Wistar rats and twenty-eight intact
age-matched control rats comprised four groups: [1] Control rats with femoral fracture (CON,
n=14), [2] Ovariectomized rats with femoral fracture (OVX, n=14), [3] Control rats with femoral
fracture, which underwent vibration therapy (CON+VT, n=14) and, [4] OVX rats with femoral
fracture, which underwent vibration therapy (OVX+VT, n=14). Three months after ovariectomy,
a closed complete fracture was produced at the mid-diaphysis of the right femur which was
stabilized with a 1-mm-diameter Kirschner wire was introduced into the medullary canal. X-ray
was taken to confirm the fracture alignment and fixation. Three days later the OVX+VT rats and
their age-matched controls (CON+VT) underwent whole-body vibration therapy (1mm vertical
displacement, 60Hz frequency for 20 minutes, three times per week for either 14 or 28 days). At
14 and 28 days post-fracture, seven rats from each group were killed and the femurs harvested to
be analyzed by tridimensional microstructure analysis (microCT), bone mineral density and
mechanical test. Results the ovariectomized rats exhibited a substantial loss of bone mass and
severe impairment in bone microarchitecture, both on the non fractured bone femur and on the
bone callus. Conversely, whole-body vibration therapy exerted an important role at ameliorating
bone mass, bone strength and at improving trabecular and cortical bone microstructure in the
estrogen-deficient rats. Conclusion vibration therapy improved bone callus formation in the
ovariectomized rats, where bone callus density, strength and callus volume were increased.
Keywords Ovariectomized rat · Osteoporosis · Bone · Bone healing · Physical and
rehabilitation medicine · Whole-body vibration
80
Introduction
It is well known that estrogen plays an important role as a bone metabolism regulator,
exerting direct effects on the bone cells, resulting decreased bone resorption while bone
formation is maintained (Cauley, 2014). Thus, several studies show that menopause
accompanying depletion of estrogen is associated with osteoporosis (Geusens et al., 1986;
Riggs et al., 1986; Finkelstein et al., 2008).
The rat ovariectomy is a well-established small animal model to study bone loss due to
estrogen deficiency (Mosekilde, 1995; Jee e Yao, 2001). The ovariectomy induces a rapid loss
of trabecular bone mass and strength, which mimics the bone changes following menopause
in humans (Khosla et al., 2012). Bone healing quality is also impaired with estrogen
suppression. Clinical and experimental studies have shown that bone healing is delayed or
impaired in both postmenopausal women and estrogen depletion-induced osteoporotic
animals (He et al., 2011). Bone healing is a specialized repair process, which involves a
cascade of events, including inflammation reaction, callus mineralization and callus
remodeling (Einhorn, 1998; 2005). Several mechanisms are responsible for these events in
post-menopausal women and in post-ovariectomized animals.
It has been recently demonstrated that the dysregulation of estrogen receptors expression
in ovariectomized animals (OVX) impairs bone healing (i.e. reduction of angiogenic factors;
reduction of bone formation marker and increased bone resorption) (He et al., 2011), leading
to a delayed bone healing or non-union. On the other hand, micromovements at the fracture
site seems to stimulate bone formation and fracture repair (Yamaji et al., 2001). Therefore,
controlled mechanical conditions may exert beneficial effects on bone fracture healing.
Several studies have demonstrated the osteogenic effect of vibration therapy on both
humans (Pang et al., 2013; Gomez-Cabello et al., 2014; Liphardt et al., 2015) and
experimental animals (Rubin et al., 2001; Vanleene e Shefelbine, 2013; Zhou et al., 2015).
However, literature has not been yet completely elucidated about the effects of vibration
therapy on the fracture healing. Previous authors have reported the effects of whole-body
vibration therapy on the bone osteotomy (Stuermer et al., 2010; Komrakova et al., 2013;
Wehrle et al., 2015), but none of them investigated its effects on bone secondary healing via
callus formation in complete fracture. Therefore, the purpose of this work was to assess the
effects of vibration therapy on the bone tissue and on the bone callus in both intact and
ovariectomized rats.
81
Methods
Animals
Fifty-six seven-week-old female Wistar rats (Rattus norvegicus albinus; body mass,
210±10 g) were used in this study and were kept under standard laboratory conditions (room
temperature 22±2ºC, humidity 55±5%, 12-h light-dark cycles). Young adult rats were fed
unrestrictedly with standard laboratory animal chow, containing 1.15% calcium and 0.88%
phosphorus; they were offered water ad libitum. The experimental protocol and all of the
animal care described herein were previously approved by the Animal Care and Use
Committee of our Institution. After one week of acclimatization, the animals were randomly
assigned to one of four groups: [1] Control rats with provoked femoral fracture (CON, n=14),
[2] Ovariectomized rats with provoked femoral fracture (OVX, n=14), [3] Control rats with
provoked femoral fracture, which underwent whole body vibration therapy (CON+VT, n=14)
and [4] OVX rats with provoked femoral fracture, which underwent whole body vibration
therapy (OVX+VT, n=14).
Ovariectomy and Post-operative Care
Rats were anesthetized with an intramuscular injection of xylazin (0.2 mL/kg) and
ketamine (0.4 mL/kg) mixture and submitted to bilateral extraction of ovaries through a
dorsolateral approach (Simoes et al., 2008). Age-matched control rats were submitted to a
sham surgery, where ovaries were only surgically exposed but not disturbed. After operation,
animals were housed in regular cages (four rats per cage) with o restriction to the access of
water and chow. All rats received intramuscular buprenorphine (0.03 mg/kg) twice a day for
five days for post-operative pain.
Closed Femoral Fracture, Surgery and Post-operative Care
Three months after ovariectomy (or sham surgery) animals were anesthetized and
underwent femoral fracture followed by surgical procedure for bone fragment stabilization.
Firstly, the right forelimb was shaved and then disinfected with 70% alcohol. Subsequently,
the rat was placed in a device especially manufactured to perform a closed fracture in the mid-
femur. For this, the animal right tight was firmly hold on two metallic supports and a lever
mechanism was lowered so that a blunt blade aimed at the mid-tight (third class lever). Then,
a force was applied until a lacking of resistance was felt and an abnormal movement was felt
at the fracture site. Next, the animal was removed from the device and a 10% polyvinyl
pyrrolidone-iodine was applied to the right pelvis and entire hindlimb. Under ordinary
82
surgical isolation a mini-incision was made on the lateral part of the tight, at the fracture level,
and through the intermuscular septum the fracture was carefully exposed and inspected. Then,
a 1-mm Kirschner wire was introduced into the medullary canal of the proximal fragment
until its tip protruded through the skin, just above the trochanteric region. The fracture was
reduced and the distal tip of the K wire was advanced until it reached the condylar region. The
exceeding portion of the K wire on the pelvic region was bent, cut and undermined close to
the major trochanter. A digital X-ray was taken to check for the fracture reduction and
fixation. The surgical incision was closed with absorbable suture and the incision was sprayed
with a solution (Adestro, SP, Brazil) to avoid self-mutilation.
Any fractures not consistent with standardized location criterion (mid-diaphyseal) or
grossly comminuted were excluded. The animals were then housed in individual cages and
were provided water and food ad libitum. Post-operation daily care consisted of skin
examination, range of motion assessment and edema inspection. All rats received
intramuscular buprenorphine (0.03 mg/kg) twice a day for five days for post-operative pain
and were weekly weighed.
Whole-body Vibration Therapy
Three days after surgery, the OVX+VT rats and their age-matched controls (CON+VT)
were submitted to whole-body vibration therapy, with vertical displacement of 1mm at a
frequency of 60Hz. Therapy was performed three days per week for 20 minutes per session
for either 14 or 28 days (Falcai et al., 2014).
Experimental Analysis
On days 14 and 28 following surgery, seven rats from each group were killed with
thiopental overdose and the femurs harvested in preparation for tridimensional microstructure
analysis, mechanical tests and bone mineral density assessment.
Assessment of Areal Bone Mineral Density (BMD) and Bone Mineral Content (BMC)
The femur was isolated and the BMD and BMC were assessed ex-vivo by dual energy x-
ray absorptiometry (DXA) using a Lunar DPX-IQ Densitometer (Lunar; software version
4.7e, GE Healthcare, Chalfont St. Giles, United Kingdom). Prior to DXA scanning the K-wire
nail was removed while taking great care to not disrupt the fracture site and callus. The
isolated bones were scanned with the anterior surface facing up. Regions of interest (14 x 16
pixels) were analyzed at the distal femoral metaphysis, both on the right and left forelimbs.
83
BMD at the callus was also assessed by varying ROI size, according to the callus volume.
Scanning reproducibility, assessed by root mean square coefficient of variation (RMS-CV)
was 4%.
Microarchitectural Analysis
A high-resolution desktop micro-CT system (SkyScan 1174v2; Bruker-microCT,
Kontich, Belgium) was used to quantify the BMD and the three-dimensional
microarchitecture parameters in the femur. The specimens were scanned using 50 kV and 800
mA, with the aid of a 0.5-mm-thick aluminum filter to optimize the contrast, a rotation step of
1°, three-frame averaging and an isotropic resolution of 26.7 µm. Images of each specimen
were reconstructed with dedicated software (NRecon version 1.6.3; Bruker-microCT),
providing axial cross-sections of the inner structures of the samples.
In the non-fractured bone, two regions of interest were made, one at the femoral distal
metaphysis, which mainly contains trabecular bone and, another at the mid-diaphysis, which
mainly contains cortical bone. The reconstruction of the metaphysis was selected manually
starting just proximally from the growth plate for an extension of 3 mm. The reconstruction of
the diaphysis was defined by a 2-mm region starting 8 mm proximally from the growth plate.
Cortical and trabecular bone were isolated using manually drawn contouring. CTAn software
(Bruker-microCT), version 2.2.1, was used for the determination of the optimal threshold
from the image histograms and was set to exclude soft tissue but to include poorly
mineralized bone. The same threshold was used in all of the samples, but differed between
trabecular and cortical bone. The thresholded image was used as a mask to measure the BMD
of the bone structures (trabecular). Trabecular architecture of the distal metaphysis was
characterized by determining trabecular bone volume (BV), trabecular bone volume fraction
(BV/TV), trabecular number (Tb.N), trabecular thickness (Tb.Th), trabecular separation
(Tb.Sp) and connectivity density (Conn.D) (Figure 5). Cortical architecture was assessed in
the diaphysis and was characterized by cortical volume (Ct.V and Ct.BV/TV) and cortical
thickness (Ct.Th). All bone morphometric measurements and nomenclature are in accordance
with recommendations of the ASBMR (Bouxsein et al., 2010).
The volume of callus was analyzed by using the CTAn software, where the entire callus
was selected as the ROI.
84
Mechanical Testing
The mechanical properties of the bones were determined by testing them to fracture using
a mechanical testing device (EMIC, PR, Brazil) equipped with a 500-N load cell. The isolated
femurs were submitted to a three-point bending test with the anterior surface facing up. The
bones were placed on two metallic supports 7.0 mm apart. The load was vertically applied at a
constant displacement rate of 0.5 mm/min at the distal femur (non-fractured bones) and callus
(center). For all tests the load-deflection curve was obtained in real time, and load at the yield
point was assessed (TESC software, version 13.4; EMIC, PR, Brazil) to represent bone
strength within the elastic phase (Turner, 2006). The bones were tested by the same technician
who was unaware of the identity of the bones.
Statistical Analysis
All of the data were expressed as the means ± standard deviations. All of the statistical
analyses were carried out with the IBM SPSS Statistics version 20 (Armonk, NY, USA).
Comparisons among the groups were statistically processed by non-parametric Kruskal-
Wallis (ANOVA), followed by Dunn’s post hoc analysis. The level of statistical significance
was set at p<0.05.
Results
Post-Operative Complications and Mortality
Post-operative complications were common in the groups and resulted in death (n=14) or
euthanasia (n=15) in twenty-nine rats prior to the end of the study. These 14 deaths were
likely due to anaesthesia induction, where six (43%) deaths occurred during the surgical
procedure of ovariectomy and, eight (57%) deaths were during the fracture production and
fixation. Of the 15 euthanasias, 11 (73%) were due to extensive fracture fragmentation and
four (27%) were due to K-wire migration. The 56 surviving rats (n=14 for each group) were
included in the final analyses.
Changes in Body Weight after OVX
At study entry, weight was similar among the groups (261.0±21.1g for Con, 246.0±13.7g
for OVX, 266.6±21.6g for CON+VT and 252.5±29.6g for OVX+VT; p>0.05, Table 1). Three
months after the OVX procedure, OVX rats were 15% heavier than the non-OVX rats
85
(386.0±34.6g for Con, 442.3±30.7g for OVX, 382.2±56.9g for CON+VT and 474.0±61.6g for
OVX+VT; p<0.05). All rats gained weight during the experimental period, however rats with
OVX gained more weight than the controls (80% versus 48%, respectively). We observed an
acutely loss of body mass following bone fracture (not shown in the graph), which decreased
the differences between OVX and control rats on days 104 and 118 post-fracture. However,
the OVX rats persisted with more gain in body mass than the controls. No changes were seen
in body mass due to whole-body vibration therapy.
Table 1. At study entry (day 0) no significant difference was found among the experimental groups. After three months
of ovaries extraction, OVX rats gained more weight than the controls, which persisted during the course of study.
CON OVX CON+VT OVX+VT
Baseline data 261.0±21.1g 246.0±13.7g 266.6±21.6g 252.5±29.6g
90 days after OVX 386.0±34.6g 442.6±30.7g 382.2±56.9g 474.0±61.6g
104 days after OVX 395.0±30.2g 441.4±33.3g 441.0±42.8g 419.0±40.2g
118 days after OVX 393.0±89.7g 453.5±49.2g 385.0±74.3g 488.0±58.6g
At the end of the experiment, the uterus of each animal was removed and weighed in
order to confirm its atrophy as occurs in OVX rats (0.194±0.08g in CON and 0.990±0.28 g in
OVX, p<0.001).
OVX Decreases Bone Quality, but is Ameliorated by Whole-Body Vibration Therapy
Compared with the controls, the ovariectomized rats had significantly (p<0.05) lower
bone density (Figure 1A) and bone content (Figure 1B) at the distal femur. Conversely,
whole-body vibration therapy was partially effective at protecting bone against bone loss in
the OVX rats, but not in the controls. Vibration therapy increased in 21% the BMD and in
28% the BMC in OVX rats (OVX+VT versus OVX, p<0.05).
Figure 1. Bone mineral density (A) and bone mineral content (B) at the distal metaphysis both in the non-fracture
femur (left femur) and fractured femur (right femur).
86
Figure 2A shows tridimensional images of non-fractured trabecular bones. The OVX rats
exhibited substantial changes in the trabecular microarchitecture of the distal metaphysis in left the
non-fractured femurs. After 104 days of OVX we observed a marked deterioration (Figure 2B) in the
parameters of trabecular architecture assessment in the distal metaphysis (reduction of -98% in BV
and BV/TV, -96% in Tb.N, -33% in Tb.Th and -97% Conn.D and, +150% in Tb.Sp). Within 118 days
of OVX, we observed a reduction of -96% in BV, BV/TV and Tb.N, -23% in Tb.Th and -97% in
Cozznn.D and, +155% in Tb.Sp). Conversely, whole-body vibration treatment mitigated bone quality
loss induced by OVX, when compared to the non-vibrated rats (OVX+VT vs OVX). Fourteen days
after the fracture the vibration therapy increased BV in +158%, BV/TV in +144%, Tb.Th in +13%,
Tb.N in +116%, Conn.D in +69% and, decreased Tb.Sp in -11%. Twenty days after the fracture the
vibration therapy increased BV in +113%, BV/TV in +73%, Tb.Th in +13%, Tb.N in +52% and
Conn.D in +50%.
Figure 2. Trabecular bone microstructures images of distal femoral metaphysis showing a dramatic reduction of
trabecular bone in the OVX rats, which was ameliorated by vibration therapy (2A). Quantitative analysis of trabecular bone
microstructure confirms the significant loss of trabecular volume and structure in the OVX rats, and the marked improvement
achieved by vibration therapy (2B).
Figure 3A shows tridimensional images of non-fractured cortical bones. The OVX rats
exhibited substantial changes in the cortical diaphyseal bone in left femurs, but to a lesser
degree than the changer seen in the trabecular bone. After 104 days of OVX we observed a
87
reduction of -13% in Ct.V, -23% in Ct.BV/TV and, -13% in Ct.Th (figure 3B). At 118 days of
OVX, no changes were found between CON and OVX. Whole-body vibration treatment
mitigated cortical bone deterioration induced by OVX, when compared to the non-vibrated
rats (OVX+VT vs OVX). Fourteen days post-fracture the vibration therapy slightly increased
the Ct.V in +25%. At 28 days post-fracture, the vibration therapy increased the Ct.V in +24%
and the Ct.BV/TV in +10%.
Figure 3. The tridimensional image of femoral diaphysis shows an important reduction in the cortical volume and
thickness in the OVX rats, which was slightly ameliorated by vibration therapy (3A). Quantitative analysis of cortical bone
microstructure confirms the impairment of cortical tissue due to OVX, and the discrete improvement achieved by vibration
therapy (3B).
In comparison with the controls, the ovariectomized rats had significantly (p<0.05,
-16%) lower bone strength at the distal femur (Table 2). Although non-significant difference
was found between OVX and OVX+VT, whole-body vibration therapy improved in +13% the
bone strength in OVX rats, but not in the controls.
Table 2. OVX decreased bone strength at the femoral distal metaphysis. Vibration therapy slightly ameliorated bone
strength at both distal metaphysis and at the bone callus.
CON OVX CON+VT OVX+VT
Non-fractured femur
(distal metaphysis)
104 days 79.03±15.4g 77.8±18.3g 86.0±10.5g 80.4±14.8g
118 days 80.6±13.2g 87.1±9.0g 75.5±23.7g 87.0±10.0g
Bone callus 104 days 43.1±5.6g 42.9±10.3g 45.2±19.5g 54.6±11.8g
118 days 78.0±12.5g 72.5±31.7g 94.8±38.9g 100.1±23.9g
88
Changes in Bone Healing due to OVX and the Osteogenic Effect of VT at Stimulating
Bone Callus Formation
In the early stage of bone healing (14 days post-fracture), OVX decreased bone callus
content in 20% (p<0.05, Figure 4A), which is in agreement with the 6% smaller callus area
formed in these rats (p<0.05, Figure 4B). Whole-body vibration therapy, on the other hand,
increased in 20% the bone callus density in the OVX rats, but not in the controls (p<0.05,
Figure 4C).
Figure 4. Assessment of bone mineral content (A), callus area (B) and bone mineral density (C) at the bone callus.
OVX decreases BMC and callus area, which are ameliorated by vibration therapy.
Regarding the bone callus microstructure, we observed a smaller callus volume in the
OVX rats, both at 14 and 28 days post-fracture (Figure 5). At 14 days post-fracture, callus
volume was 56% smaller in OVX rats in comparison with the control (OVX vs CON),
however the vibration therapy increased in 317% the callus volume at the 14 days and 128%
at the 28 days (OVX+VT vs OVX).
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Figure 5. Micro-CT images of bone callus, both in sagittal and axial planes. OVX induces decreased bone healing,
where bone callus is smaller than in both the controls. Vibration therapy improves bone healing in the OVX rats, augmenting
bone callus and mineralization.
Vibration therapy enhanced bone callus strength as shown in table 2. At 14 days post-
fracture, whole-body vibration increased the callus strength in +27% in the OVX rats. At, 28
days post-fracture the increase was of +38% (OVX+VT vs OVX).
Discussion
In this study we confirmed the deleterious changes caused by the estrogen deficiency on
both trabecular and cortical bone tissue in the intact femur and, also on the bone callus in the
fractured femur.
In the non-fractured bones we showed expressive reduction, of 16% in bone mass, 4%
reduction in bone strength and extensive changes in bone microarchitecture, highlighting the -
97% decrease in trabecular bone volume, 96% in trabeculae number and thickness, as well as
the changes in cortical volume and thickness. Similarly, several authors have also
demonstrated the changes on bone tissue in both post-menopausal women (Khosla et al.,
2012; Cauley, 2014) and in estrogen-depletion induced osteoporotic animals (Jee e Yao,
2001; Rubin et al., 2001). These changes on the bone tissue may lead to increased bone
fracture risk, which in humans impairs life quality and may increase mortality rate.
Estrogen depletion does not only affect bone quality in intact bones, but also delays or
impairs bone fracture healing on both post-menopausal women (Schilcher et al., 2014; Singer
et al., 2015; Zofkova et al., 2015) and ovariectomized animals (Stuermer et al., 2010; He et
al., 2011; Komrakova et al., 2013; Wehrle et al., 2015). These authors have previously
studied the effects of estrogen depletion on the bone healing. However, differently than these
authors, who studied bone healing in an osteotomy (Stuermer et al., 2010; Komrakova et al.,
2013; Wehrle et al., 2015) or a drill-hole (He et al., 2011) model, we performed a closed
90
femoral fracture, which better mimics the osteoporotic fractures. The closed femoral shaft
fracture model was used by Leung et al., but they did not study the bone healing in a estrogen
deficiency status (Leung et al., 2009). Similarly to our study, Shi et al. also assessed the
effects of OVX on the bone secondary healing and concluded that bone healing was severely
damaged by estrogen deficiency (Shi et al., 2010). In our study we demonstrated that OVX
reduced bone callus content in -19% and callus area in -6%. Furthermore, we also
demonstrated changes in callus mineralization and volume.
Considering the well-documented effect of mechanical stimuli on the bone metabolism,
several authors have documented the osteogenic effects of whole-body vibration on the bone
tissue (Rubin et al., 2001; Vanleene e Shefelbine, 2013; Nowak et al., 2014; Zhou et al.,
2015) and on the bone callus of rats (Leung et al., 2009; Shi et al., 2010; Stuermer et al.,
2010; Komrakova et al., 2013; Wehrle et al., 2015) stimulating bone formation and healing.
Nowak et al. studied the effects of whole-body vibration therapy on the non-fractured
bone tissue in adult rats and found a decrease in the bone resorption marker levels. However,
the authors found no changes on bone formation markers and bone mass (Nowak et al., 2014).
In our study we did not find expressive changes in intact bone tissue in the control rats. On
the other hand, we demonstrated that whole-body vibration therapy was very effective at
enhancing intact bone quality in OVX rats. This finding was also observed by Stuermer et al.,
who also showed that vibration exerted more effect on the osteoporotic bone of OVX rats
than on the bone of control animals (Stuermer et al., 2010). We showed that vibration therapy
increased non-fractured bone density in 27%, bone strength in 13%, trabecular volume almost
twofold, trabecular thickness in 33% and cortical volume in 24%.
Stuermer et al. studied the effects of whole-body vibration therapy on the bone healing
post-osteotomy in ovariectomized rats. These authors found significant increase in the cortical
density and width of the vibrated OVX rats. Furthermore, osteocalcin expression (bone
formation marker) was higher in the vibrated OVX rats than in the non-vibrated OVX group.
Shi et al. also found osteogenic effects of whole-body vibration therapy at enhancing bone
healing in ovariectomized rats. The authors, however, employed the vibration therapy five
times per week, which may be not realistic to a regular rehabilitation program. Our findings
showed that vibration therapy three times per week increased bone mineral density and
content in 35% and 19%, respectively, and augmented bone callus volume in 317%. Thus, we
believe that whole-body vibration therapy may have potential effect at increasing bone and
callus formation in osteoporotic bones and may be part of rehabilitative programs to enhance
bone healing.
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Conclusion
We concluded that the ovariectomized rats exhibited a substantial loss of bone mass and
severe impairment in bone microarchitecture, both on the intact bone tissue and on the bone
callus. Conversely, whole-body vibration therapy exerted an important role at ameliorating
bone mass, bone strength and at improving trabecular and cortical bone microstructure in the
estrogen-deficient rats. Moreover, vibration therapy improved bone callus formation in
ovariectomized rats indicated by the enhancement of bone callus density, strength and
volume.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors are grateful to the Coordination for the Improvement of Higher Education
Personnel (CAPES), Brazil for the financial support.
AUTHOR DISCLOSURES
The authors declare no conflicts of interest.
Ethical approval: “All applicable international, national, and/or institutional guidelines
for the care and use of animals were followed.” “All procedures performed in studies
involving animals were in accordance with the ethical standards of the institution or practice
at which the studies were conducted.”
92
REFERENCES
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