kromozom bantlama ve fish
TRANSCRIPT
KROMOZOM BANTLAMA
TEKNİKLERİ ve FISH
İnsan kromozomlarındaki karyotipleme çalışmaları sırasında benzer
büyüklükteki ve benzer konumlu sentromere sahip kromozomların ayırt
edilebilmesini sağlamak amacı ile kromozomların uzun eksenleri boyunca farklı boyanmaları bantlama olarak isim
alır. Günümüzde farklı bantlama yöntemleri bulunmaktadır.
Q BANTLAMAFloresans boyalar
kullanılır ve böylece
kromozomlar üzerinde farklı bölgeler farklı
renkte boyanmış olur.
C BANTLAMAKromozom
preparatları ısı ile denatüre edilip
sonra giemsa ile boyanır böylece heterokromatin
bölgeleri boyanırken diğer bölgeler
boyanmaz.
NOR Bantlama (Nukleolar organizer bölgeler)
En sık kullanılan bantlama yöntemidir. Preparatlar bir proteaz olan tripsin ile muamele edilir. Ardından giemsa ile boyama yapılır.böylece A-T açısından
zengin olan bölgeler daha koyu boyanır. Bu bantlar kromozomlara özgüdür ve
kromozomların kesin tanısında kullanılır. Ayrıca bu bantlar sayesinde
translokasyon, inversiyon, delesyon gibi kromozomal hasarlar belirlenebilir.
Giemsa boyamanın ardından preperatların sıcak tuz solüsyonu
ile muamele edilerek G bantlamadaki bant profilinin tam tersi elde edilir. Yani burada A-T açısından zengin bölgeler açık
renk boyanırlar.
G BANTLAMA R BANTLAMA
FLOURESCENCE IN SITU
HYBRIDIZATION (FISH)
YÖNTEMİ
Çeşitli dokulardan alınan hücrelerin (kültüre almadan) DNA larını floresan işaretli problarla hibridize ederek,bu floresan işaretler sayesinde söz konusu DNA bölgesinin hücre içerisindeki durumunu görmemizi sağlayan bir yöntemdir.
Moleküler sito-genetikteki hızlı ilerlemeler, bantlama ve boyama tekniklerinin hızlı gelişimiyle sağlanmıştır.
Standart bantlama teknikleri yalnızca bir denemede bir hücre için tüm genomu sorgulamada yetersiz kalmaktayken,
Fluoresan in situ hibridizasyon (FISH), genleri ve kromozomları boyamada fluoresan moleküllerin kullanıldığı bir yöntem olarak bantlama teknikleriyle birlikte iyi bir değerlendirme aracıdır.
Bu yöntem gen haritalanmasında ve kromozom aberasyonlarının tanımlanmasında kullanılır.
Kromozomların çalışılmasında kullanılan birçok teknik, aktif olarak bölünen hücreleri gerektirirken (metafaz kromozomları),
FISH aynı zamanda bölünmeyen hücrelere de uygulanabilir (interfaz nukleusu). Metafaz delesyonları belirlemede kullanılır Interfaz genelde kromozomların yeniden
düzenlenmesinin ve kromozom sayılarının belirlenmesinde kullanılır.
Preperatların hazırlanması Materyalin preperat üzerine sabitlenmesi Ön yıkama Prob ve hedef DNA nın denaturasyonu Hibridizasyon Yıkama Görüntüleme Mikroskobi
Fish yönteminde kullanılan probların işaretlenmesi önemli bir aşamadır. Bu işaretleme doğrudan floresan işaret taşıyan probun hedef DNA ile hibridizasyonu ile olabildiği gibi indirekt işaretleme ile yani floresan sinyal güçlendirilerekte yapılabilir. Genellikle indirekt yöntem tercih edilir.
İndirekt işaretlemede Biotin gibi moleküller önce prob DNA içerisine yerleştirilir sonra biotinle çok sıkı bağ yapan avidin gibi moleküller ortama konur avidin molekülleri ayrıca floresan madde taşırlar(Florescein izotiyosiyanat FITC=yeşil renk). Daha sonra ortama anti avidin antikorları konur, bu antikor hem probdaki avidin hemde ortamdaki avidinlere bağlanır böylece sinyal güçlenir.
Tekrarlayan bölge probları Lokusa özgü prob
Tüm kromozomu boyayan prob Banda özgü prob
• Lokusa özgü olan problar bir kromozomun belirli bölgeleriyle hibridizasyona girer. Bu tip problar ilgilenilen belirli bir genin hangi kromozom üzerinde yerleşmiş olduğunu belirlemede kullanılır.
• Alfoid veya sentromerik tekrarlı problar, kromozomların sentromerlerinde bulunan
tekrarlayan dizilerden elde edilir. Kromozomlar farklı renklerde boyanabildiği için, bu prob herhangi
bir bireyin doğru sayıda kromozoma sahip olup olmadığının belirlenmesinde kullanılır.
“Whole chromosome” probları, herbiri tüm bir kromozom boyunca farklı dizilerle hibridizasyona
girebilen küçük probların kolleksiyonudur. Bu şekildeki bir prob kitaplığı taranarak tüm bir kromozom spektral bir karyotip oluşturmak üzere boyanabilir. Bu
teknik kromozomal translokasyonların tanımlanmasında imakan sağlar.
FISH ile sitogenetik çalışmalara yardımcı olan ve iyi tanımlanmış uygulamalar geliştirilmiş olmasına rağmen, amaca uygun prob ve filtre seçimi doğru yapılmaz ise hatalı ve zaman alıcı denemeler ortaya çıkmaktadır.
Prosedür Metafaz kromozomları veya interfaz
nukleusu kullanılarak preparatların hazırlanması
Etanol içinde dehidrasyon DNA’yı 70oC’de denatüre etme Etiketli probun denatürasyonu
Hibridizasyon için 37oC’de, 4-16 saat inkübasyon
TANISAL AMAÇ:* Klinik sitogenetik
* Prenatal tanı (trizomi, monozomi, mozaizm, translokasyon, delesyon)
* İnterfaz sitogenetiği (mayoz, mitoz,.) * Mikrodelesyon sendromlarının tanısı * Dokuda enfeksyon ajanlarının tanısı
* Kanser genetiği * Dokuda mRNA düzeyinde onkogenlerin
değerlendirilmesi
ARAŞTIRMA AMACI: * Gen haritalaması * Tümör biyolojisi
* Viroloji * Gen expresyon analizi * Mayoz/mitoz analizleri
* Hücre tanımlaması
Di George Sendromu (22q11.2) Prader Willi Angelman (15q11-13) Williams Beuren Sendromu (7q11.23) Smith-Magenis Sendromu (7p11.2) Wolf Hirschhorn Sendromu (4p16.3) Miller-Dieker Sendromu (17p13.3) Cri-du-Chat Sendromu (5p15.2/5p15.3)
Di George: metafaz görünümü Di George: İnterfaz hücresinde
Prader Willi / D115Z1 / SNRP / PML loküs bölgeleri
Sayısal kromozom anomalileri (-7,+8, +12)
Partial kromozom yada gen delesyonları
Gen amplifikasyonları Translokasyonlar
CGH ile tüm hücre genomunu tarama
Trisomy 7
11q23 MLL gen bölgesi
Trizomi 11q23 (ALL)
Trisomy 11(ALL)
17p13.1 ( p53 )
17p11.1 - q11.1 (CEP 17)
p
q
P53 delesyonu
8p11.1 – q11.1 (CEP 8)
8q24.2 – q24.3 (c-myc)
p
q
t(9;22)(q34;q11.2) metafaz ve interfaz görüntüleri
t(9;22) (bcr/abl)
Monozomi 9, t(bcr;abl)
Monozomi 22
PML ve RARA lokusleri t(15q22;17q12-22.1)
t(15q22;17q12-22.1) şematik
t(15q22;17q11-12),(PML/RARA) metafaz ve interfaz görünümü
t(2;5)(p23;q35) - Anaplastik büyük hücre lenfoması t(8;14) - Burkitt's lenfoma (c-myc) t(9;22)(q34;q11) - Philadelphia kromozom, Kronik miyoljenik lösemi (KML), Akut lenfoblastik lösemi (ALL) t(11;14) - Kabuklu hücre lenfoması (Bcl-1) t(11;22)(q24;q11.2-12) - Ewing's sarkoma t(14;18)(q32;q21) - Foliküler lenfoma (Bcl-2) t(17;22) - Dermatofibrosarkomik protuberans t(15;17) - Akut promyelötik lösemi t(1;12)(q21;p13) - Akut miyelötik lösemi t(9;12)(p24;p13) - Kronik miyelötil lösemi (CML), Akut lenfoblastik lösemi (ALL) (TEL-JAK2) t(X;18)(p11.2;q11.2) - Eklem sarkoması t(1;11)(q42.1;q14.3)- Şizofreni
İnversyon 16 Şematik
İnversyon 16 probu ile FISH
Sitogenetik kültür sorunları İnterfaz nükleusunda çalışılabilir
Kantitatif ölçüm sağlar Tedavi sonrası izleme de ideal
Lösemilerde p190 ve 210 aynı anda bakılabilir, Kırılmanoktaları değişebilen translokasyonlarda
efektifdir Örn: t(9;22), t(15;17), 11q23, inv 16
Hızlı sonuç istendiğinde Klonal anomalilere sitogenetik yetersiz kalır Lökosit sayısı az olduğunda (<10.000) PCR
yapılamazsa Yapılan çalışmalar normal bireylerde de bu tip
translokasyonların olduğunu gösterdi.
Probun uygun olması ve doğru probun eldesi için nelere bakılması gerektiğinin
iyi bilinmesi
Hibridizasyon için birleşme sinyali
Nuklear organizasyonda beklenmedik varyasyonlar