Kromozom Anomalilerinin Tanısında Gelişmeler; Kromozomal Karyotipten

Moleküler Karyotipe

Prof. Dr. Seher Başaran

İstanbul Üniversitesi, İstanbul Tıp Fakültesi,

Tıbbi Genetik ABD, 2012

Kromozom Anomalilerinin Tanısındaki Aşamalar

400 450 500 600 700 bant/haploid set

~ 500 bant çözünürlükte ~ 1 bant 6 milyon nükleotid (~6 Mb ve 10’larca gen)

Metafaz prometafaz

~500 bant düzeyinde “Karyotipleme” •Tek test tüm genom/kromozomlar •Tüm sayısal anomaliler •> 6 Mb lık yapısal anomaliler (dengeli ve dengesiz) • Klinik yönlendirme varsa bilinen mikrodelesyon sendromları (~ 3-5Mb) •Mozaisizm tanınabilir

Dezavantajları; • Hücre kültürü gerektirir • Otomatizasyonu zordur • Tanı subjektiftir ve bu nedenle deneyim önemlidir • Prenatal tanıda klinik yönlendirme olmadığından ilave test olanağı sınırlıdır.

ı

Yenidoğanda KROMOZOM ANOMALİ oranı 1:156 Dengeli yapısal anomali oranı %0.4

Fluorescence

in situ hybridization (FISH) Need to suspect a specific diagnosis!

Fluoresan In Situ Hibridizasyon (FISH)

13. Kromozom 21. Kromozom

18. Kromozom X Kromozomu Y Kromozomu

Williams s. del(7)(q11.23)

Spektral karyotipleme

Spektral karyotipleme

M-FISH

Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (CGH)

Moleküler Karyotipleme Olgu Kontrol

Cy5 Cy3

• İnsan genomundaki farklılıkların karşılaştırılması esasına dayanır

Moleküler Karyotipleme

DNA Dizisindeki Değişimler

• Mutasyon DNA

dizisindeki patolojik (hastalığa neden olan) değişiklikler

• Polimorfizm (1) Yaygın olanlar (Bir

toplumda > % 1 görülen DNA dizi değişiklikleri)

(2) Nadir olanlar/minör

alleler (Bir toplumda < % 1 görülen DNA dizi değişiklikleri)

1%

4%

45%

6%

44%

İnsan genomunun organizasyonu

protein kodlayan genler

RNA genleri, regülator bölgeler

tranposon kaynaklı tekrarlar

heterokromatin

diğer bölgeler

İnsan haploid genomu ~ 3100 Mb büyüklüğünde, 1200 Mb Gen ve Genlerle ilişkili sekanslar Genler (exonlar) 48 Mb İlişkili sekanslar 1152 Mb

İnsan genomunda ~ 25.000 gen

İnsan Genetik Varyasyonlarının Sınıflandırılması

Tüm varyasyonların % 90’ı

Tüm varyasyonların % 10’u (yapısal varyantlar)

Nükleotid Substitüsyonları (SNPs) Tekrar dizileri İnsersiyon/delesyon varyantları Blok substitüsyonlar İnversiyon varyantları Kopya sayısı varyantları (CNVs)

Genomda 300 bp de bir nükleotid polimorfiktir. Halen 12 milyon SNP tanımlanmıştır. Genelde iki formda olur (A ya da G; C yada T gibi).

Single nucleotide polimorfizm (SNPs) ;

Kopya sayısı varyantları (CNVs); Referans genomla kıyaslandığında, farklı sayıda bulunan, boyutu 1 kb veya daha fazla olan DNA segmentlerine Kopya Sayısı Varyasyonu (CNV) denir.

Molecular cytogenetics in the postgenomic era: Array-based comparative genomic hybridization

Total genome High resolution

Chromosome 15

Chromosome 15 Anne

Baba Chromosome 1

Chromosome 1

Chromosome 1 Olgu Chromosome 15

Buchanan ve Scherer, Nat Rev Gen, 2008

CNVs ler; 1) Patojenik olarak tanımlanmış değişimler 2) Zararsız (benign) olarak tanımlanmış değişimler 3) Klinik anlamı henüz kesin olarak bilinmeyen (Variants of

uncertain significance (VOUS)) değişimler

Wapner R, ISCA (International Standarts for Cytogenomic Arrays) 2012 Mikroarray Çalışma Sonuçları;

Normal karyotip saptanan prenatal olgu n:3822 1) Klinik anlamı kesin bilinmeyen CNVs n: 94 (%2.5) Rapor edilmeyen CNVs n: 33 (%0.9) Rapor edilen CNVs n: 61 (%1.6) 2) Patolojik CNVs n: 35 (%0.9) Endikasyon gruplarına göre klinik ile ilişkili CNVs İleri anne yaşı n: 1966 CNV n:34 %1.7 Positiv Tarama Testi n:729 n:12 %1.6 Patolojik USG n:755 n:45 %6

Klinik ile ilişkili CNVs %2.5

Wapner R, ISCA (International Standarts for Cytogenomic Arrays) 2012 Mikroarray Çalışma Sonuçları; • 4391 olgudan 51 olguda array sonuçsuz, başarı %98,8 • 4282 nonmozaik karyotip ve 58 mozaik karyotip

Anomaliler Kromozom n Array tanıyabilir

Array tanıyamaz

Anöploidiler (tri 21,18,13,X,Y ve 45,X)

374 374 0

Diğer anomaliler 82 24 58 (%1.4)

Dengeli yapısal 40 0 40

Dengesiz yapısal 22 22 0

Marker kromozom 3 2 1

heterokromatin

Triploidi 17 0

17 (7 si SNP array ile

tanınabilirdi 1989-2011 PRETAM+PREMED 2453 CVS 386 kromozom anomalisi 71 anomali %2.9 (20 poliploidi+51 dengeli yapısal) 22813 AS 889 kromozom anomalisi 234 anomali %0.1 (17 poliploidi+217 dengeli yapısal)

Endikasyon Array-normal

Array-şüpheli

Array-patolojik

Toplam olgu

Pat-USG 2462 (%88.5)

135 (%4.9) 184 (%6.6) 2781

Pat-USG (soft markers)

72 (93.5) 3 (%3.9) 2 (%2.6) 77

MS-ST 68 (%88.3) 5 (%6.5) 4 (%5.2) 77

Aile öyküsü 461 (%94.7) 11 (%2.3) 15 (%3.1) 487

İleri Anne Yaşı

337 (%97.4) 8 (%2.3) 1 (%0.3) 346

Psikolojik 94 (%98.9) 1 (%1.1) 0 95

Diğer/? 12 (%92.3) 0 1 (%7.7) 13

Toplam (canlı fetuslar

3506 (%90.5)

163 (%4.2) 207 (%5.3) 3876

Schaffer LG, et al, 2012;Prenat Diagn, 32, 979-985 Karyotipi “Normal” prenatal olgularda array sonuçları;

USG bulgusu Array-normal Array-şüpheli Array-patolojik toplam

Çoklu sistem anomalileri 492 (%85) 29 (%5) 58 (%10) 579

Çoklu sistem + yapısal olmayan anomaliler

196 (85.6) 14 (%6.1) 19 (%8.3) 229

Tek sistem anomalileri 1370 (%90.2) 68 (%4.5) 81 (%5.3) 1519

Tek sistem + yapısal olmayan anomaliler 220 (%86.6) 16 (%6.3) 18(%7.1) 254

İzole poli/oligohidramnios 6 (%66.7) 2 (%22.2) 1 (%11.1) 9

İzole IUGG 74 (%97.4) 0 2(%2.6) 76

Tek soft marker 55 (%93.2) 2(%3.4) 2(%3.4) 59

Çoklu soft marker 17 (%94.4)

1(%5.6)

0 18

Toplam 2534 (%88.7) 138 (%4.8) 186 (%6.5) 2858

Schaffer LG, et al, 2012;Prenat Diagn, 32, 1-10

Merkezi Sinir Sistemi Anomalisi Saptanan Prenatal Olgularda a-CGH Sonuçları;

Roche- NimbleGene Platformu 1.4 milyon prob (SNP+CNV) ile İstanbul Deneyimlerimiz

• Fetal Kromozom analizi normal 49 olgu

– A- CGH ile CNV değişimi saptanan olgu 49

• %100 CNV (benign) olgu n:44 (%89.8)

• Şüpheli CNV olgu n: 5 (~%10) (~%20 ek maliyet)

– Parental a-CGH n:3 çift (6 test)

- İki olgudaki CNV parental kalıtıldığı saptandı (benign)

- Bir olgudaki CNV patolojik olarak değerlendirildi (~%2)

Schaffer et al., 2012; Prenat Diagn, 32, 1-10 • Tek sistem –MSS- anomalileri n:326 MSS+yapısal olmayan anomaliler n:56

• normal a-CGH n: 286 (%87.7) normal a-CGH n: 51 (%91.1) • şüpheli a-CGH n: 17 (%5.2) şüpheli a-CGH n: 3 (%5.4)

•patolojik CNV n: 23 (%7.1) patolojik CNV n: 2 (%3.6)

Olgu1: NAG. 28 yaşındaki anne ve 35 yaşındaki baba sağlıklı 4. gebelik 36 (+) GH: Endikasyon: PATUSG (alobar HPE (talamik füzyon, monoventrikül), mikrosefali, arini, bilateral yarık dudak ve bilateral hidronefroz) Kordosentez: 46,XY

A-CGH sonucu: arr 7q35q36.3(147,250,584-158,816,094)x1, 9p24.3p21.3(199,254-20,231,750)x3

Konfirmasyon: I-FISH ikişer sinyal Anne-baba a-CGH normal

Sonuç; Anomali de novo Delesyon ve duplikasyon intersisyel

7q35q36.3 delesyon bölgesinde toplam 161 gen

Sonic hedgehog (SHH) geni bu bölgede

SHH geni (MIM*600725) embriyonun erken döneminde önbeyin, spinal kord, ekstremite, diş ve orta hat yapılarının gelişiminde önemli bir rol oynar.

9p24.3p21.3 duplikasyon bölgesinde 117 gen

VLDLR (MIM*192977) geni; serebral ve serebellar gelişimde ve migrasyonda rol oynar.Bu gen mutasyonlar ı serebellar hipoplazi, lizensefali, Alzheimer hastalığı, otizm ve böbrek anomalileri ile ilişkilendirilmektedir.

GLIS3 (MIM*610192) geni; embriyonun erken döneminde akciğer, böbrek, trakea ve genital dokularda eksprese olur. Bu gen mutasyonları diabet, konjenital hipotiroidizm, yüz anomalileri, konjenital glokom, karaciğer fibrosizi ve polikistik böbrek hastalıkları ile ilişkilendirilmektedir.

Olgumuzun USG bulguları arasında yer alan blt hidronefrozun bu iki genin duplikasyonlarıyla ilişkili olup olamayacağı sorusu da akla gelmektedir.

Olgu 2; DA Endikasyon; MKA/MR ( A/T; WAGR) 46,XY,t(3;15;21) (p13;q21.2;q22.3),t(4;16)(q31;p31.1)dn a-CGH Endikasyonu; Görünürde “Dengeli de novo resiprokal translokasyon”

46,XY,t(3;15;21) (p13;q21.2;q22.3),t(4;16)(q31;p31.1)dn .arr 11p14.1p13 (30,031,595-33,045,209)x1

11p14.1p13 bölgesinde 15 gen bulunmaktadır Bu genlerden WT1 ve PAX6 genleri WAGR sendromu ile ilişkilidir

Olgu 3; KS 112 Karyotip endikasyonu; PATUSG (ventrikulomegali, CCA, ikiz eşi) Karyotip; 47,XX,+mar a-CGH endikasyonu; marker kromozomun aydınlatılması

47,XX,+mar . arr 9p24.3-q21.11 (0-71,226,556)x4/ 9p24.3-p23(0-10,016,576)x6

Konfirmasyon; FISH

wcp 9 arm spesifik 9 p ve q subtelomerikp

47,XX,+mar1/48,XX,+mar1,+mar2 [56/4]. ish 47,XX,+i(9)(p?)/ 48,XX,+i(9)(p?), +idic(9)(q21) 9ptel30(43N6x6, wcp9p++/wcp9q+, D9Z3++)[56/4] . arr 9p24.3-q21.11 (0-71,226,556)x4/ 9p24.3-p23(0-10,016,576)x6

Olgu 4; GD Prenatal tanı endikasyonu; İleri anne yaşı+2’li testte artmış risk+ICSI (donuk embriodan) CVS Karyotipi 13.GH; 46,--,t(2;4)(p23;q31.1)dn a-CGH endikasyonu; görünürde dengeli de novo resiprokal translokasyon a-CGH sonucu normal

22. GH, 2. düzey USG; Ense plisi kalınlığında artış PTPN11 dizi analizi; 13. ekzonda heterozigot c.1529A>C de novo (Leopard sendromu’nda tanımlanmış bir mutasyon)

ACOG (2009; Obstet and Gynecol, 114:5,1161-1163)

SIGU çalışma grubu (2012;Ultrasound Obstet Gynecol, 39:384-388)

1) konvensiyonel karyotipin yerini almaması gerektiği,

2) tüm gebeliklerde genel tarama için değil seçilmiş gebeliklerde özel tanı amacıyla

kullanılması gerektiğini,

3) prenatal tanıda özel endikasyonlarda;

i) izole veya multiple USG anomalisi saptanan gebelikler

ii) karyotip analizinde dengeli bile görünse de novo yapısal kromozom anomalilerinde

iii) marker kromozomların karakterizasyonunda tamamlayıcı ikinci bir test olarak

kullanılmasını önermektedir

4) “hedefe yönelik array” testi öncesinde ve sonrasında verilecek danışmalarla, anne

babalar a-CGH in tüm patolojileri yakalayamayabileceği ve a-CGH sonuçlarının

yorumunun zor olabileceği konusunda bilgilendirilmeli

5) Array faydalı bir test olmakla birlikte, ilave çalışmalar (parental testler,

konfirmasyonlar) gerekebilir ve maliyet artar

Chromosome anomalies

(inc. mosaics) CVS CBCR Others LR AMA ST P-USG

45,X n:42 0 1 0 1 4 36

polysomy X/Y n:6 0 2 0 2 0 2

tri 21 and robt n:131 6 0 2 7 28 88

tri 18 n:61 1 0 0 1 4 55

tri 13 and robt n:27 1 0 0 1 2 23

uncommon tri. n:21 0 2 1 1 9 8

poliploidies, n:20 1 0 0 0 2 17

balanced structural n:51 35 5 1 2 1 7

unbalanced structural n:27 15 0 0 0 3 9

total n:386 59 10 4 15 53 245

Chromosome anomalies

(inc. mosaics) AC CBCR Others LR AMA ST P-USG

45,X n:58 0 1 0 6 18 33

polysomy X/Y n:68 0 0 0 32 18 18

tri 21 and robt n:339 1 0 5 82 78 173

tri18 n:87 1 0 0 13 7 66

tri13 and robt n:23 0 0 1 5 2 15

uncommon tri n:20 0 0 0 5 4 11

polyploidies n:17 0 0 0 1 1 15

balanced structural n:217 64 5 6 73 47 22

unbalanced structural n:60 10 0 0 15 11 24

total n:889 76 6 12 232 186 377

Table 4a: The number of cases with chromosome abnormality according to the indication for chromosome analysis in CVS series

Table 4b: The number of cases with chromosome abnormality according to the indication for chromosome analysis in AC series

Ana endikasyon gruplarında 2 dekatta (1989-1999 ve 2000-2011) saptanan fetal kromozom anomali oranları; PRETAM+PREMED

CVS Series

1. Period (1989-1999) 2. Period (2000-2011) Overall

rate %

∑ n n ano ano % ∑ n n ano ano %

CBCR 53 34 64,2 48 25 52,1 58,4

Others 308 2 0,7 533 8 1,5 1,2

LowR 42 4 9,5 13 0 0 7,3

AMA 112 4 3,6 223 12 5,4 4,8

ST 6 1 16,7 276 52 18,8 18,8

P-USG 110 19 17,3 714 226 29,7 28,7

total 631 64 10,1 1822 323 17,7 15,8

AC Series

1. Period (1989-1999) 2. Period (2000-2011) Overall

rate % ∑ n n ano ano % ∑ n n ano ano %

CBCR 43 26 60,5 93 50 53,8 55,9

Others 267 1 0,4 358 5 1,4 1

LowR 577 8 1,4 379 4 1,1 1,3

AMA 3891 93 2,4 6539 139 2,1 2,2

ST 2056 52 2,5 4693 134 2,9 2,8

P-USG 536 55 10,3 3906 321 8,2 8,5

total 7370 235 3,2 15443 654 4,2 3,9

Kromozom Anomalierinin Tanısında Kullanılan Teknikler

Tüm genomu inceler Dengeli kromozom anomalilerini tanır Düşük oranlı mozaikler saptanır 3n/4n tanısı mümkün Rezolüsyon daha düşüktür (5-10 Mb) Hücre kültürü gerektirir Tanı subjektiftir Otomatizasyon zordur

Lokusa /kromozoma özeldir Rezolüsyonu yüksektir <3Mb) Otomatizasyona uygundur 3n/4n tanısı mümkün Endikasyona göre hücre kültürü gerekir Endikasyona göre kullanılır

Tüm genomu inceler Rezolüsyonu en yüksek (>100 Kb) Hücre kültürü gerekmez Otomatizasyona uygundur Dengeli kromozomal değişimleri tanıyamaz Düşük oranlı (<%10) mozaikleri tanıyamaz Bioinformatik çalışma gerektirir Henüz pahalı

Genetik Hastalıkların Tanısı Moleküler testler Tek bir genin ekzon ve introndaki

değişimleri (patojenik veya polimorfik-zararsız) inceler; tek bir genin, ilişkili genlerin ya da genomdaki tüm ekzomların dizilenmesi olasıdır,

Genin ürünü olan m-RNA daki değişimleri inceler; hücrenin tüm m-RNA ları da incelebilir (transkriptomiks)

Tek Gen Hastalıkları ve Multigenik Hastalıklar

Sitogenetik testler Klasik karyotipleme metafaz

kromozomlarını inceler HRBT karyotipleme prometafaz

kromozomlarını inceler FISH bilinen kromozom ve özgün

kromozom bölgelerini seçici olarak inceler

Tüm kromozom anomalileri ve mikrodelesyon sendromları

Moleküler Sitogenetik

Mikroarray

Postnatal Uygulamalar

The International Standard Cytogenomic Array (ISCA) Consortium Miller DT, 2010, American J Hum Genet. Açıklanamayan gelişme geriliği, MKA/MR ve otizm spektrumu endikasyonunda; Sitogenetik %3-36 (%17,4 Karaman et al., 1999) Moleküler karyotipleme, anomali saptama oranı en yüksek olan (%15-20) tanı testidir. Bilinen sayısal ve gros yapısal anomalilerin yanısıra submikroskobik delesyon ve duplikasyonları saptayabildiğinden “Moleküler karyotipleme birinci tanı testi olarak uygulanmalıdır!” Dengeli yeniden düzenlenmeler ve düşük oranlı mozaisizmler saptanamaz ancak bu popülasyonda bu anomalilerin saptanma oranı %1’den az olduğundan göz ardı edilebilir.