UNIVERSIDAD PARTICULAR DE CHICLAYO

UNIVERSIDAD PARTICULAR DE CHICLAYOFACULTAD DE MEDICINA

DOCENTES:Dr. Guzmn Vigo Csar AlbertoLic. Guzmn Tello Marco INTEGRANTES: Campos Vargas Rosa Mileydi - 20131038 Gonzales Yaipen Omar 20131061 Marlo Manayay Csar Ying 20132043 Tineo Medina Luisa Janella- 20131147 Torres Rios Lizbeth 20121200

21/04/14

21/04/2014

FACULTAD DE MEDICINA

SEMINARIO N 3SONDAS GNICAS COMERCIALES

DOCENTE:

Dr. Luis Cotrina Escalante

INTEGRANTES:

Tineo Medina Luisa JanellaPozo Crdova DianaRomn Velzquez HernnChumpn Snchez VernicaCamacho Paola

16/12/2013INTRODUCCININTRODUCCIN

Una sonda es un reactivo biolgico constituido por un fragmento de ADN que posee una secuencia de bases complementaria a la del genoma de un microorganismo.Las sondas gnicas son molculas de ADN sealadas con un marcador que tienen el poder de reconocer genes en los cromosomas y establecer si dichos genes son normales o portadores de alteraciones. Entre las principales ventajas de las sondas genticas hay que destacar la sencillez de su manipulacin, que permite su adaptacin a cualquier laboratorio. El principal inconveniente es su coste. Es una tecnologa muy utilizada en la actualidad en laboratorios nivel IIUna de sus aplicaciones ms extendida consiste en el establecimiento de diagnsticos prenatales, que son realizados sobre muestras de clulas fetales. El anlisis gentico del feto permite establecer si el nio que va a nacer es portador o no de un gen defectuoso o deletreo.Por lo tanto, desde el punto de vista tico, el diagnstico prenatal es aceptable y vlido si respeta la vida e integridad del embrin y del feto humano, y siempre que de su estudio vayan a derivarse beneficios para su curacin o conservacin. El diagnstico prenatal debe tener como fin la curacin y no una sentencia de muerte que, irremediablemente, conduzca al aborto del feto. El portador de una malformacin congnita no pierde por esto las prerrogativas propias de un ser humano, a quien debe tributrsele el respeto a que tiene derecho todo paciente.El diagnstico mediante el empleo de sondas gnicas puede utilizarse tambin despus del nacimiento, por ejemplo, para precisar la naturaleza y amplitud de una alteracin gentica; o para el caso de parejas procedentes de familias "de riesgo" en particular para las mujeres que deseen saber si son "portadoras " de un determinado precursor de enfermedad (Gros 1993).

OBJETIVOS:

Determinar que es una sonda y cuntos y cules son los tipos que existen.

Identificar el diseo de una sonda y la forma en la que se prepara.

Determinar el tamao de la sonda y la relacin que tiene con su estabilidad.

Analizar la hibridacin in situ as como las aplicaciones que tiene.

NDICE

INTRODUCCINOBJETIVOSCAPTULO I: SONDAS GNICAS

1.1 Definicin1.2 Tipos de sondas 1.3 Clases de marcaje para visualizacin de las molculas dianas 1.3.1 Radiactividad 1.3.2 Marcaje inmunolgico 1.4 Preparacin de la sonda 1.4.1 El diseo de la sonda 1.4.2 Eleccin de la sonda: 1.4.3Tamao de la sonda: 1.4.4 Estabilidad de la sonda y la interaccin con su blanco 1.4.5 Sondas de doble cadena contra cadena sencilla: 1.5 Ventajas de las sondas genticas

CAPTULO II:HIBRIDACIN IN SITU

2.1 Definicin 2.2 Moduladores de hibridacin 2.2.1 Complementariedad (secuencia de bases) 2.2.2 Temperatura

2.2.3 pH y productos qumicos 2.3 Hibridacin "In Situ" Fluorescente (FISH) 2.3.1 Protocolo bsico 2.3.2 FISH en Metafase 2.3.3 FISH en Interface 2.3.4 Otras variantes de FISH

CAPTULO III: APLICACIONES 3.1 Aplicaciones 3.2 Anomalas 3.2.1 Anomalas numricas 3.2.2 Anomalas estructurales

CONCLUSIONESBIBLIOGRAFA

CAPTULO I: SONDAS GNICAS1.1.- DefinicinBioqumicamente una sonda es una molcula de ADN o ARN homologa a una secuencia de ARN o ADN diana, con la que hbrida de forma estable y especifica (por asociacin de bases complementarias). La sonda es una copia fiel de un gen o de un fragmento de ARN o ADN y se unir exclusivamente esa secuencia de la que es copia. Esto es lo que se llama especificidad de la sonda.Una vez que la sonda se une a la secuencia diana se detecta y cuantifica. La deteccin solo es posible si la sonda se ha marcado con un grupo detectable. Dependiendo del nmero de estos grupos incorporados y de la seal que emitan la sonda puede tener diferente sensibilidad.

1.2.- Tipos de sondasDistintos tipos de sondas de cidos nucleicos pueden ser utilizadas para la hibridacin in situ:1. Sondas de DNA doble cadena. Pueden ser preparadas utilizando tcnicas como nick translation, random priming o PCR, en las cuales el nucletido marcado es incorporado. PCR y random priming proporcionan una buena actividad especfica. Estas sondas pueden ser desnaturalizadas antes de usar. Cuando se usan para detectar una cadena simple como mRNA, estas son menos sensibles debido a que la concentracin de la sonda marcada es reducida.2. Sondas de DNA de cadena simple (largas). Pueden ser preparadas utilizando primer extension en templados de cadena simple o por PCR con un nucletido marcado. ste ltimo es el ms usado porque es ms fcil de llevar a cabo y las marcas pueden sintetizarse con poca cantidad de material.El PCR permite una gran flexibilidad en la eleccin de las secuencias marcadas por el uso de primers. Estas marcas han sido ampliamente usadas.3. Oligonucletidos (entre 20 y 40 bases). Son marcados incorporando oligonucletidos modificados durante la sntesis qumica o adicionando una cola marcada. Una de las desventajas es que algunos oligonucletidos marcados no se incorporan y por tanto la sensibilidad disminuye.4. Sondas de RNA de cadena sencilla. Pueden ser sintetizadas por el uso de una RNA polimerasa (SP6, T7 o T3 RNA polimerasa). La secuencia de la sonda es clonada en un vector que flanquear dos sitios distintos de iniciacin.La cadena de RNA anti sentido (sonda) es sintetizada en direccin opuesta al gen endgeno. Se recomienda linearizar la sonda de RNA con enzimas que dejen el extremo 5 cohesivo, porque se ha reportado, que el extremo 3 romo promueve la sntesis de transcritos anormales.1.3.-Clases de marcaje para visualizacin de las molculas dianasPara visualizar las molculas diana se utiliza una sonda marcada, bien radiactivamente, o mediante marcaje inmunolgico. Para el uso de ADN de doble cadena primeramente es necesario desnaturalizarlo mediante calor o en condiciones de alta alcalinidad. Esta sonda de cadena simple marcada se une a la diana; y los lugares de unin se detectan porque los mtodos de marcaje dejan una seal detectable mediante fotografa. En los mtodos ms avanzados se utilizan marcajes mediante fluorescencia que emiten seales detectadas mediante lser, como el utilizado en la PCR a tiempo real.1.3.1.- RadiactividadSe puede marcar radiactivamente la sonda utilizado nucletidos que tengan alguno de sus tomos con un istopo radiactivo.El istopo ms utilizado es el P32, con alta actividad especfica (9200 Ci/mmol puro) y emite partculas de alta energa (1'7 MeV) por lo que sondas marcadas con este elemento tienen un elevado rendimiento y sensibilidad.El marcaje puede ser en diferentes posiciones. El P32 tiene un periodo de semidesintegracin relativamente corto, 14 das, lo que obliga a usar las sondas marcadas dentro del periodo de una semana despus del marcaje, y adems la emisin de partculas durante largo tiempo puede alterar la estructura de la sonda.

1.3.2.- Marcaje inmunolgicoAunque el marcaje radiactivo es muy sensible, conlleva el peligro asociado a la utilizacin de radiactividad. Para evitar este peligro se desarrollaron otros mtodos de marcaje basados en anticuerpos. Las sondas se marcan utilizando nucletidos que llevan unida una molcula (digoxigenina), a la solucin se le aaden anticuerpos especficos que se unen a esa molcula; y estos anticuerpos llevan asociado un compuesto luminiscente o fluorescente (Como el CDP-Star) que deja impronta fotogrfica.1.4.- Preparacin de la sondaPara sondas de cadena sencilla, se debe usar la secuencia reversa complementaria. Cuando las sondas son sintetizadas por transcripcin, involucra generar mRNA del gen endgeno. Cuando se disean los oligos marcados, es importante recordar que la secuencia antisentido es la hebra complementaria reversa de la cadena lder y debe ser leda de 5 a 3. En general es preferible usar sondas especficas, ya que esto garantiza una buena hibridacin. Existen situaciones en las cuales esto no puede llevarse a cabo, por ejemplo, si los genes todava no estn clonados de las especies usadas para la hibridacin o si la secuencia gnica es muy similar entre especies. Esto puede favorecer una hibridacin entrecruzada. Para evitar esto, se requiere una alta selectividad que reduzca la presencia de bases mal apareadas, aumentando de esta manera la especificidad. Si los modelos de expresin son los mismos, como se pueden ver con una sonda homloga, es un experimento alentador, aunque no prueba la especificidad. La hibridacin entrecruzada provee informacin preliminar muy valiosa.1.4.1.- El diseo de la sonda1. La hibridacin entrecruzada utiliza sondas largas (>100 pb) usadas bajo condiciones selectivas especialmente despus de la digestin con nucleasas, ya que una sonda adems de homloga, debe ser lo suficientemente amplia para llevar a cabo la hibridacin.2. Para sondas pequeas (oligonucletidos de 20-30 pb) es muy probable que algn gen distinto al de inters tenga una secuencia idntica.Alternativamente se puede hacer un screening y ste puede ser realizado por bsqueda de secuencias en bases de datos.3. Los mRNA poseen las secuencias poli(T) y poli(U), al transcribirse a cDNA se evita que la sonda no incluya esta cola, porque secuencias largas, ricas en GC dan una gran estabilidad a la sonda por los triples enlaces que se forman entre estas bases.Se necesitan dos elecciones ms para la preparacin de la sonda: el tipo de cidos nucleicos y la marca que se incorpora en la sonda. Algunos mtodos alternativos estn disponibles para la sntesis de la sonda.1.4.2.-Eleccin de la sonda:Las sondas largas de cadena simple (RNA o DNA) proporcionan una alta sensibilidad en la deteccin de cadena sencilla. Los oligonucletidos son muy sensibles y la seal puede ser incrementada por el uso de un cocktail de sondas que flanquearn en regiones distintas.Para estudios de mRNAs estrechamente relacionados, las sondas especficas, pueden ser obtenidas por sntesis de oligonucletidos. Se disean primers que sern usados para la amplificacin del fragmento deseado de DNA en el PCR. Estos fragmentos pueden ser clonados y usados para sintetizar cadenas dobles o sencillas de DNA o RNA.Alternativamente, para el caso de sondas de RNA, pueden ser marcadas directamente sin clonacin incluyendo el primer marcado en el sitio de iniciacin de la RNA polimerasa. Finalmente las sondas de DNA de doble cadena son recomendadas para blancos de doble cadena y esto puede ser suficientemente sensible para detectar abundancia de cadena sencilla.1.4.3.-Tamao de la sonda:Las sondas largas pueden emitir una seal ms fuerte debido a que incorporan mayor nmero de nucletidos marcados dentro de ella. Sin embargo, las sondas que son tan largas dan seales dbiles, debido a que la sonda penetra menos eficientemente en el tejido. La mejor estrategia es usar una secuencia larga como templado para la sntesis de la sonda pero asegurar que la sonda generada es lo suficientemente pequea para poder penetrar. Muchos procedimientos estn basados en que la sonda de 50-150 bases porque emiten seales ptimas para la hibridacin en secciones de ciertos tejidos. Se ha encontrado que las sondas de RNA que miden por arriba de 1 kb proveen seales ptimas para la hibridacin in situ, en embriones fijados en para formaldhedo. La penetracin est influenciada por el tamao de la sonda aunque tambin depende de la naturaleza del tejido, de la forma de fijacin y si el pre tratamiento ha sido realizado para remover las protenas celulares.El tamao de la sonda puede ser controlado durante la reaccin de sntesis:a. Sondas de DNA, sintetizadas por nick translation, el largo est determinado por la cantidad de DNasa en la reaccin.b. Sondas marcadas por random priming el tamao est determinado por la concentracin del primer.c. Primers que puedan ser elegidos para deteminar el tamao de la sonda sintetizada por PCR.d. Sondas largas de DNA pueden ser cortadas parcialmente por incubacin a altas temperaturas.e. Sondas largas de RNA son parcialmente cortadas por hidrlisis alcalina limitada. Si el tamao de la sonda es cortada por hidrlisis hay que revisar el tamao de la sonda, porque si sta es muy pequea, sta no hibridar bajo condiciones selectivas standard, dando una baja seal.1.4.4.-Estabilidad de la sonda y la interaccin con su blanco:En experimentos de hibridacin los puentes entra la sonda y la secuencia blanco juega un rol importante. El largo decrementa la estabilidad en el siguiente orden RNA-RNA, DNA-RNA, DNA-DNA. La estabilidad de los hbridos est influenciada por las condiciones de hibridacin, por la concentracin de formamida, sales y la temperatura.1.4.5.-Sondas de doble cadena contra cadena sencilla:Un nmero de reacciones competentes ocurren durante la hibridacin in situ con sondas de doble cadena. Las sondas de cadena sencilla proveen las siguientes ventajas:a. La sonda no se agota porque no se autoliga.b. No son cadenas largas porque deben penetrar en la seccin de tejido o en los cromosomas.

1.5. Ventajas de las sondas genticas

Las ventajas de estas tcnicas son que nos permiten investigar directamente al microorganismo, sin necesidad de que se encuentre viable, ni de que est en cultivo puro.Hoy en da se utiliza para identificar microorganismos no cultivables, de lento crecimiento o difcil y de identificacin compleja. Es posible utilizarlo en cualquier tiempo de muestra biolgica y permite la identificacin de genes no expresados fenotpicamente. Son tcnicas muy vlidas, pues el ADN es muy estable.

Los inconvenientes ms importantes son que se necesitan un nmero mnimo de copias del fragmento de cido nucleico problema que se quiere detectar, por eso en las muestras con escasos nmero de unidades infecciosas se obtiene una baja sensibilidad. En ocasiones este problema se resuelve detectando ARN en vez de ADN, pues el primero suele estar en mayor cantidad.

Otra forma de intentar resolver este problema consiste en aumentar en vitro el nmero de copias mediante tcnicas de amplificacin.

Actualmente disponemos de sondas (Gen-Probe, Syngene) para identificacin de M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii y M. gordonae. Entre las principales ventajas de las sondas genticas hay que destacar la sencillez de su manipulacin, que permite su adaptacin a cualquier laboratorio. El principal inconveniente es su coste. Es una tecnologa muy utilizada en la actualidad en laboratorios nivel II.

CAPTULO II: HIBRIDACIN IN SITU2.1.- Definicin Es una tcnica de hibridacin que se realiza directamente sobre tejido, clulas o cromosomas localizados sobre un soporte slido, habitualmente un portaobjetos. La visualizacin puede realizarse por medios isotpicos, enzimticos o con fluorescencia, siendo evaluada en un microscopio. Permite identificar las clulas donde se produce la hibridacin que detecta la alteracin genmica o transcripcional. La visualizacin de resultados puede realizarse por marcaje con fluorescencia de la sonda (FISH) o cromognico (CISH, SISH). Este ltimo tiene la ventaja de poder realizarse en microscopio de campo claro y poder almacenarse casi indefinidamente las preparaciones G. Los usos ms frecuentes en Patologa molecular son la deteccin de amplificaciones. 2.2.-Moduladores de hibridacinLa calidad en la unin de las cadenas de cidos nucleicos en un proceso de hibridacin viene determinada por unos moduladores que imponen una mayor o menor exigencia de perfeccin o astringencia (stringency).2.2.1.-Complementariedad (secuencia de bases)Una purina siempre est encarada a una pirimidina. Las dos cadenas de polinucletidos de la doble hlice estn conectadas mediante uniones hidrgeno entre bases. En condiciones normales, una G se une especficamente con una C, mientras que una A solamente se puede unir con una T. El par de bases GC tiene tres uniones hidrgeno, mientras que el par AT tiene solamente dos. Como consecuencia, se necesita ms energa para romper el par GC que el par AT. El hecho de que una cadena de ADN sea complementaria a la otra permite una reproduccin exacta del material gentico; as, cada cadena puede servir como molde para la sntesis de otra. Cualquier hibridacin en la que la complementariedad sea inferior al 70% se considerar como no-homloga y, por tanto, ocurre en condiciones de baja astringencia (temperatura baja y/o concentracin alta de sales).

2.2.2.-TemperaturaLa temperatura elevada rompe los puentes de hidrgeno y separa las hebras del ADN (desnaturalizacin). Esto ocurre alrededor de los 90 (temperatura de fusin). Cuando una solucin de DNA que ha sido calentada se enfra lentamente se produce la rehibridacin dando lugar a la estructura inicial. Tal reasociacin ocurre slo si las secuencias de bases son complementarias.

2.2.3.-pH y productos qumicosEl pH alto (pH>11) rompe los puentes de hidrgeno, por lo que se produce desnaturalizacin. Esto tambin pueden producirlo agentes qumicos como la urea y la formamida e incluso el agua destilada, que impide la neutralizacin de los grupos fosfato de la molcula por salida sodio y magnesio; al ser los grupos fosfato de marcado carcter negativo, su repulsin causa la separacin fsica de las hebras y, por tanto, su desnaturalizacin.

La concentracin baja de sales en una solucin donde se produce una hibridacin impone una condicin de alta astringencia, permitiendo slo uniones de gran complementariedad.

2.3.-Hibridacin "In Situ" Fluorescente (FISH)

Es una tcnica molecular que permite localizar un determinado fragmento de la secuencia de los cidos nucleicos y pone de manifiesto la presencia o ausencia de secuencias gnicas especficas. Se puede aplicar sobre ncleos interfsicos de extensiones celulares o cortes de tejido o directamente en cromosomas. La posibilidad de poder utilizar las tcnicas de FISH sobre clulas que no estn dividindose es importante en aquellas neoplasias con baja tasa de divisin celular, como en los sndromes linfoproliferativos crnicos. Para ello utiliza sondas marcadas con fluorocromos. Dependiendo del tipo de sonda utilizada es posible evaluar la presencia de reordenamientos en los ncleos.Las sondas son pequeas secuencias de cadena sencilla de ADN, complementarias a la secuencia de inters del cido nucleico. Podemos utilizar distintos tipos de sondas: ADN satlite: estas sondas hibridan con las regiones o satlites u otras secuencias repetitivas de la regin centromrica del cromosoma. Son de utilidad para detectar alteraciones cromosmicas numricas. Como hemos dicho anteriormente, esta tcnica puede aplicarse sobre clulas en divisin o ncleos interfsicos, por tanto podemos detectar anomalas cromosmicas numricas sin necesidad de tener clulas en metafase. Las sondas de pintado cromosmicocontienen una librera de secuencias genmicas que abarcan todo un cromosoma o una determinada regin. Con estas sondas podemos detectar alteraciones estructurales o numricas de los cromosomas, pero slo en clulas en metafase. Es muy til cuando tenemos cromosomas de mala calidad. Las sondas de secuencia nica(locus especfico), hibridan con secuencias cromosmicas muy concretas, correspondiente a una banda cromosmica o a un gen. Con estas sondas podemos visualizar alteraciones estructurales o numricas tanto en ncleos en interfase como en metafase. Podemos detectar la presencia de clulas tumorales residuales con una anomala caracterstica de estirpe o subtipo, como la t (9;22) en la leucemia mieloide crnica, la t(15;17) que afecta al PML/RAR en la leucemia mieloide aguda.Los cromosomas que son usualmente analizados por FISH son los 13, 18, 21, X e Y, que son los ms propensos a sufrir anomalas. Estn relacionados a enfermedades como elsndrome de Patau(13), elsndrome de Edwards(18), elsndrome de Down(21), elsndrome de Turner(X) y el sndrome del superhombre(Y), entre otros. Sin embargo, como son posibles marcados adicionales del cromosoma, otros cromosomas pueden ser visualizados con esta tcnica. FISH usa segmentos de una nica hebra deADNque son tintados, o etiquetados, con una sustancia fluorescente que puede ligarse a un cromosoma especfico; estos segmentos de ADN son llamadossondas. En un principio se empleaban sondas de carcter radiactivo, pero este tipo de marcaje fue reemplazado por los fluorforos por mayor seguridad, eficacia y facilidad de deteccin.La tcnica FISH puede realizarse a los cromosomas enmetafaseo eninterfase.2.3.1.-Protocolo bsico

El primer paso de la tcnica consiste en la desnaturalizacin del DNA para separar la doble hlice. A la muestra desnaturalizada se le aade entonces la sonda de inters (fragmento de ADN marcado fluorescentemente). Primero, las sondas hibridan a las regiones especficas para las que han sido diseadas. Despus, se tien los ncleos con un color de contraste inespecfico (generalmente DAPI). Las sondas de DNA pueden marcarse con molculas fluorescentes denominadosfluorforos(mtodo directo) o no fluorescentes que se detectan con anticuerpos fluorescentes (mtodo indirecto). Por ltimo, se visualiza la muestra preparada bajo un microscopio de fluorescencia.

2.3.2.- FISH en Metafase

Cuando las clulas estn en metafase, sus cromosomas se encuentran condensados a modo de preparacin para ladivisin celular. Para detenerlas en metafase, se empleacolchicina, un agente despolimerizante de losmicrotbulosencargado de separar lascromtidashermanas de un cromosoma, impidiendo as el avance de la divisin celular. Este tipo de FISH se utiliza para detectar microdeleciones especficas, translocaciones o para identificar material extra de origen desconocido. Los tipos de sondas usadas son: Loscsmidosson secuencias nicas que hibridan con fragmentos pequeos. Se emplean en estudios de microdeleciones. Lassondas satlitesestn formadas por secuencias altamente repetidas que se encuentran cerca de lo centrmeros. En la mayora de los casos son especficas de cada cromosoma. Se usan para determinar aneuploidias o para identificar el origen de cromosomas marcadores. Lassondas completasconsisten en la suma de varias sondas que hibridan en distintas zonas del cromosoma y as marcar el cromosoma completo. Se usan para ver translocaciones.

2.3.3.- FISH en Interface

No siempre es posible tener ncleos fijados en metafase para realizar el FISH, y los resultados obtenidos no sern tan especficos. Sin embargo, el FISH en interface tiene la ventaja de que no es necesario cultivar previamente las clulas durante diversos das antes de poder analizar sus cromosomas. Adems, cuando las clulas se encuentran en interface, la cromatina est en torno a 10 000 veces ms descondensada que en metafase, lo cual permite una mayor resolucin a la hora de detectar anomalas pequeas. Se emplea sobre todo para la deteccin de aneuploidas o grandes delecciones, duplicaciones. No es posible distinguir entre un cariotipo normal y un cariotipo que presente una translocacin equilibrada. Adems, puede ser empleado en el anlisis de tumores slidos, que se dividen con muy poca frecuencia.2.3.4.-Otras variantes de FISH

FISH en hebra

Este tipo de FISH (tambin llamado "Fiber FISH" o "Halo FISH") se aplica sobre hebras de ADN desproteinizadas (es decir, desprovistas de las histonas encargadas de su compactacin). Esta tcnica permite detectar pequeas reorganizaciones porque admite una mayor resolucin (permite incluso la visualizacin de genes individuales). La tcnica puede ser usada para detectar delecciones en clones y para estimar huecos en los proyectos genoma.

FISH inverso

Es una tcnica que se usa mucho para determinar la procedencia de uncromosoma marcador. Este tipo de FISH tiene la peculiaridad de ser el ADN problema el que se marca. El procedimiento consiste en recortar un fragmento de cromosoma o dicho cromosoma marcador de una porta donde se encuentran todos los cromosomas fijados. Se encuentran teidos conGiemsao con una sonda, esto sirve para marcar ese ADN y convertirlo en una nueva sonda. A continuacin, ponemos los cromosomas de un donantes sin anomalas (generalmente procedente de sus linfocitos y de un varn para contemplar todas las opciones, es decir, tener los cromosomas X e Y) en un porta y aadimos la sonda preparada. Esperamos ver que hay hibridacinde la sonda (cromosoma marcador) con alguno de los cromosomas del donante por complementariedad en su secuencia. As, podemos determinar que ese cromosoma marcador procede del cromosoma con el que hibrida. Una vez identificado, el cromosoma marcador pasara a ser llamado un cromosoma derivativo.

FISH on a chip

Esta nueva tcnica conlleva numerosas ventajas, como la necesidad de utilizar menor cantidad de reactivos, el empleo de un menor nmero tiempo de anlisis (ya que en menos de una hora se pueden analizar los ncleos, frente a las 2-3 horas que precisa el procedimiento de FISH convencional), su rapidez para la obtencin de resultados, su alta sensibilidad o su menor coste, con comparacin con la tcnica convencional de FISH.

La principal aplicacin de este novedoso sistema es en el campo del diagnstico clnico, sobre todo en el estudio de enfermedades neuronales, como es el caso de la enfermedad delAlzheimeren su estado temprano, aunque no se descarta su uso en otros campos como en la industria alimentaria.

Se emplea un chip microfludico con estrechos canales, por los que se hace pasar la suspensin celular purificada por capilaridad, lavada previamente con PBS. Una vez adheridas o fijadas las clulas a los canales por calor, digerimos las clulas mediante la adicin deproteinasa Ky desnaturalizamos su material gentico, nuevamente por un incremento de temperatura. Tras estos pasos, ya pueden ser aadidas las sondas y reactivos necesarios, que difundirn a lo largo de todo el canal, pudiendo observar los ncleos bajo el microscopio en el mismo chip y de manera ordenada.

FISH on chip es una tcnica muy til para detectar anomalas cromosmicas (aneuploidas), entre otros defectos. En el caso delAlzheimer, es habitual utilizar muestras de linfocitos procedentes de sangre perifrica, fibroblastos o muestras de orina.

FISH multicolor

Es una adaptacin del FISH que permite la visualizacin de los 23 pares decromosomasa la vez, teidos con diferentes sondas fluorescentes.

A nivel comercial slo hay 5 colores distintos posibles, por lo que se puede usar la sonda de un color concreto o combinar dos tipos de sondas para crear un nuevo color. El sistema de deteccin del equipo empleado debe estar adaptado a los 5 colores. Un programa informtico se encarga de analizar las imgenes y formar el cariograma: organiza los cromosomas de acuerdo a la emisin de las sondas que tiene integradas y las combina hasta dar las 23 combinaciones. Se utiliza con frecuencia en el estudio de clulas tumorales. El poder de dicho mtodo reside en su habilidad para: Determinar rpidamente si hay algn cromosoma adicional en elcariotipoy de qu cromosoma se trata, porque su color permitir identificarlo. Determinar si est presente algn cromosoma translocado y qu cromosomas estn implicados en la translocacin por la combinacin de dos colores asociados a cromosomas diferentes en un mismo cromosoma. Rpida identificacin de material cromosmico de un cromosoma que haya sido insertado en otro cromosoma por la variacin del color del fragmento insertado respecto al color de todo el cromosoma. Identificacin de cromosomas pequeos o fragmentados que frecuentemente implican el problema de averiguar su origen, como es el caso de los cromosomas marcadores. Estas aplicaciones del SKY se deben a que cada cromosoma est teido completamente de un nico color (de una nica sonda) y por eso, viendo el color que van a tener todos los cromosomas de la muestra podemos saber que anomala presenta el paciente.Sin embargo, aunque se pensaba que iba a desbancar al cariotipo tradicional, tiene una serie de desventajas que han frenado su uso, especialmente el uso clnico. Estas son: El elevado precio. Menor definicin que el FISH convencional. Slo se pueden ver cromosomas y translocaciones grandes, sin poder observar bandas.CAPTULO III: APLICACIONES3.1.- AplicacionesEsta tcnica ha resultado ser muy til en el campo de la medicina reproductiva, con aplicacin en eldiagnstico gentico preimplantatorio(DGP). Resulta una forma muy precoz de diagnstico que, apoyndose en las tcnicas de reproduccin asistida, posibilita el estudio de embriones antes de ser transferidos al tero materno y, por consiguiente, antes de que se lleve a cabo la implantacin embrionaria.Para el anlisis de anomalas cromosmicas embrionarias, tanto numricas como estructurales, puede utilizarse la tcnicaDGP-FISH. Para este fin se requiere una biopsia embrionaria, mediante la cual se extrae una clula del embrin en cultivo "in vitro". Seguidamente, se procesa la muestra de tal manera que quede fijado el ncleo en interface y se hibrida con sondas especficas para el estudio cromosmico de la patologa que se sospecha pueda estar presente en el embrin.3.2.- Anomalas3.2.1.- Anomalas numricas Alteraciones en cromosomas sexuales: Alta frecuencia de mosaicismo en pacientes implica que, en muchos casos, slo se den defectos leves en el desarrollo. Gran relevancia en Medicina Reproductiva por ir asociado, en mayor o menor grado, a problemas de fertilidad. Tales son los casos desndrome de Klinefelter,trisoma Xymonosoma X.

Edad materna avanzada, aborto de repeticin de causa desconocida y/o fallo de implantacin: Ms de la mitad de los casos son debidos a alteraciones en los cromosomas 13, 16, 18, 21, 22, X e Y. En estos casos, la seleccin de aquellos embriones normales para los cromosomas citados, aumenta las probabilidades de conseguir una gestacin a trmino. Factor masculino grave: Con este estudio embrionario, se pueden evitar las alteraciones cromosmicas surgidas en la descendencia de aquellos grupos de pacientes con calidad seminal baja y que tienen que recurrir a latcnica de microinyeccin intracitoplasmticadel espermatozoide (ICSI).3.2.2.-Anomalas estructuralesSurgen espontneamente, en la mayora de los casos, como consecuencia de un fallo demeiosisdurante laoognesisoespermatognesis, en los casos en que los padres presentan cariotipos normales. Algunas veces, algn miembro de la pareja puede ser portador de una anomala estructural equilibrada, que podra transmitir a su descendencia. De esta manera, por medio del estudio gentico especfico de embriones de la pareja portadora, podran distinguirse aquellos embriones desequilibrados cromosmicamente de los equilibrados. Una vez hecha esta seleccin de embriones, podran transferirse con total tranquilidad al tero materno los embriones que no presentan la alteracin gnica.Una aplicacin adicional del FISH en interfase es obtener mayor informacin sobre la organizacin de los cromosomas en el ncleo interfsico (los llamados territorios cromosmicos).Adems de ser til para realizar diagnsticos preimplantatorios, el FISH tiene aplicacin en medicina para detectar enfermedades y determinar el pronstico de las mismas, as como para evaluar la remisin de algunas enfermedades, como el cncer. Con FISH es posible diagnosticar enfermedades incapaces de ser detectadas por otros mtodos tradicionales que implicaban el anlisis de cromosomas en metafase. Adems su utilizacin es mucho ms sencilla que los mtodos citogenticos ms habituales, los cuales requieren clulas en divisin, as como un mayor esfuerzo en tiempo y trabajo para la preparacin manual y anlisis de las muestras.Tambin puede utilizarse para la deteccin directa de patgenos a partir de sangre o restos de tejidos de un paciente. Esto supone una gran ventaja teniendo en cuenta que muchos microorganismos no son cultivables en condiciones de laboratorio.El FISH tambin se usa para comparar genomas de dos especies biolgicas y deducir relaciones evolutivas. Asimismo, se puede usar en el rea de la Ecologa Microbiana para identificar microorganismos dentro de un biofilm, as como para observar su distribucin y localizacin dentro del biofilm o realizar ensayos de colocalizacin utilizando sondas de distinto color para cada microorganismo.

CAPTULO IV:CONCLUSIONES

Las sondas son molculas de ADN o ARN homologas a una secuencia de ARN o ADN diana yson de cuatro tipos.

Para la establecer el diseo y la preparacin de una sonda ses debe tener ne cuenta en tamao y la hibridacin.

El largo de la sonda decrementa su estabilidad.

La hibridacin in situ es una tcnica que se utiliza directamente sobre tejidos y su aplicacin se da principalmente en anomalas numricas y estructurales.

CAPTULO V:BIBLIOGRAFA Lynn B. Jorde, John C. Carey, Michael J. Bamshad. Gentica mdica. Cuarta Edicin.Barcelona:Elsevier; 2011.

Blanca Ramos Cerrillo. Hibridacin in situUniversidad Nacional Autnoma de Mxico. [Acceso 12 de Abril del 2014]. Disponible en: http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/hibridacion_in_situ.pdf

Pedro Fernndez Ruiz. Hibridacin de los cidos nucleicos. Hospital Clnico/ IDIBAPS/Universidad de Barcelona. [Acceso 12 de Abril del 2014]. Disponible en: http://www.seap.es/c/document_library/get_file?uuid=dd48aeb8-9e38-4541-bcfb-d75fd6b2ee9f&groupId=10157