1

PROTEİNLERİN DENATÜRE JEL ELEKTROFOREZİ İLE

AYRILMASI VE MOLEKÜLER AĞIRLIKLARININ

TAYİNİ

ÇEVRE BİYOTEKNOLOJİSİ DERSİÇEVRE BİYOTEKNOLOJİSİ DERSİ

2

Proteinler, elektrik yükü,

büyüklük, şekil gibi

özelliklerine göre ayrılırlar.

Elektroforez işleminde, ortam

pH’sına göre, (+) ya da (-)

olarak yüklenen kolloid

taneciklerin, bir elektrik

alanında, kendi net yüklerine

zıt yük taşıyan anot veya

katoda doğru farklı hızlarda

sürüklenmeleri.

ELEKTROFOREZ

3

Karışım içinde bulunan protein sayısını tespit

etmek( kağıt ve jel elektroforezi)

Saflaştırılmış proteinin saflık derecesini

belirlemek

( SDS-PAGE)

Saflaştırılmış proteinin molekül ağırlığını tayin

etmek (SDS-PAGE) amacıyla kullanılır.

ELEKTROFORETİK YÖNTEMLER

4

SDS - PAGE SDS:Sodyum Dodesil Sülfat-anyonik deterjan

(-) yüklü SDS, proteinlerin kuarterner, tersiyer ve sekonder yapılarını bozar, katları açılan peptid zincir, SDS ile sarılarak misel görünümü kazanır..

Zincirde yer alan her 2 AA artığına 1 molekül SDS bağlanır ve proteinlerin hepsi (-) yüklenir

5

POLİAKRİLAMİD JELProteinlerin ayrılmasında en çok kullanılan destek matriksi olan poliakrilamid, porlu bir jel ortaya koyar. Bu jel, filtre gibi işlev görür ve küçük moleküllerin sebestçe hareketine izin verirken daha büyük makromoleküllerin geçişini kısıtlar.

Belli por büyüklüğünde bir jel hazırlayarak proteinlerin molekül büyüklüğüne göre ayırmak mümkündür.

6

Por Büyüklüğünün Belirlenmesi Poliakrilamid jelin oluşumunda, “akrilamid” monomerleri bir çapraz bağlayıcı yardımı ile kovalent olarak bağlayan uzun zincirlere polimerize olur. Yapıyı birarada tutan esas bileşen çapraz-bağlayıcı, (cross-linker) dir. En yaygın olarak kullanılan çapraz bağlayıcı, kısaca bis adı verilen “N,N’-metilen-bis akrilamid” dir. Akrilamid jelde por büyüklüğü, akrilamid ve bis içeriğini ifade eden % T ve % Cbis terimleri ile belirlenir. % T, total akrilamid %’si (w/v), % Cbis ise bis’in monomere oranı (w/w) olup aşağıdaki formüllere göre hesaplanır.

Akrilamid (g) + Bis (g)% T = x 100

Hacim (ml)

Bis (g) % Cbis = x 100

Akrilamid (g) + Bis (g)

Bu formüllere göre, % 20 T ve % 5 Cbis içeren bir jelde % 20 (akrilamid +bis) ve total akrilamidin % 5’i oranında bis bulunur. % T arttıkça por çapı küçülür.

7

Elektoroforezde Kullanılan Tampon Sistemleri

Elektroforezde göç hızı proteinin net yüküne bağlı olduğundan, hızı sabit tutabilmek için, çözeltinin pH’ını sabit tutmak gerekir. Bu nedenle elektroforezde çeşitli tampon çözeltiler kullanılır.

Elektroforezde kesiksiz ve kesikli olmak üzere 2 tampon sistemi kullanılır.

Kesiksiz sistemde tek bir ayırıcı jel vardır, tanklarda ve jelde aynı tampon kullanılır.

Kesikli sistemde ise, farklı tamponlarda hazırlanmış iki jel kullanılır.

I. Seçici olmayan, büyük porlu bir jel: Yükleme jeli (stacking jel)II. Daha selektif, küçük porlu bir jel: Ayırma jeli (seperating jel).

8

Stok ÇözeltilerMonomer

Tampon

% 10 SDS

H2O

TEMED

APS

Örnek uygulama tamponu

Tank tamponu

Boya çözeltisi

Fazla boyayı alma çözeltisi

Su ile doyurulmuş n-butanol çözeltisi

9

Jellerin Hazırlanması

10

Protein Örneklerinin Hazırlanması

11

Yükleme ve Elektroforez İşlemi

12

Jelin Analizi

Elektroforetik ayırım bittikten sonra jel, aşağıdaki

işlemlerden birisi ile analiz edilir.

Boyama (Coomassie Blue veya gümüş boyama)

Otoradyografiyi takiben densitometri

Elektroforez ile bir membrana nakletme

(elektroblotting) ve daha sonra nükleik asit

hibridizasyonu, otoradyografi, immunodeteksiyon

gibi teknikler uygulanır.

13

Jellerin Boyanması

14

Jellerin Boyanması

15

Moleküler Ağırlığı Tayini

Molekül ağırlığı bilinmeyen protein örneği, molekül ağırlığı bilinen standart

proteinlerle birlikte, aynı jel üzerinde yanyana elektroforetik olarak ayrılır.

Boyama sonrasında jelde gözlenen bantların karşılaştırılması ile proteinin

molekül ağırlığı hakkında bir fikir elde edinilebilir. Ayrıca bu tip bir ayrışımın

sonuçlarını matematiksel olarak değerlendirmek de olasıdır. Jeldeki göç hızının

bir fonksiyonu olan relatif göç hızı (Rf değeri), jelin üst kısmından bandın

bulunduğu yere kadar olan uzaklığın, jelin üst kısmından işaret boyasının

olduğu yere kadar olan uzaklığa oranıdır.

Polipeptidin molekül ağırlığının logaritması ile Rf değeri arasında doğrusal

ilişki vardır. Dolayısı ile standart polipeptidlerin Rf değerleri (ordinata) ve

molekül ağırlığının log10 değerleri (absise) yerleştirilerek bir standart grafik

hazırlanır.

Molekül ağırlığı bilinmeyen proteinin Rf değeri bulunur ve grafikte bu değere

karşılık gelen noktadan aşağıya bir dik indirilerek molekül ağırlığının

logaritmik değeri belirlenir. Bu değerin antilogaritması moleküler ağırlığını

verir.

16

A

Yükleme jeli (boyama sırasında kopabilir)

Ayırma jeli

İşaret boyasına ait bant

x (cm)A bandı için Rf =

y (cm)

X

Y

Moleküler Ağırlığı Tayini

17

Moleküler Ağırlığı TayiniStandartnümune

Sürüklenme hızı

Molekül ağ.(log)

nümuneprotein

18

Moleküler Ağırlığı Tayini

19