mantarlarin epİdemİyolojİk tplendİrİlmesİ - … · multilokus enzim elektroforezi. pfge...

MANTARLARIN EPİDEMİYOLOJİK TİPLENDİRİLMESİ

Dr. Ayşe KalkancıGazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara

Taksonomik terimlerAlem (Kingdom)•Bölüm veya şube (divisio, filum)•Sınıf•Takım•Aile•Cins•Seksiyon•Tür•

Kwon-Chung K J Clin Infect Dis. 2012;54:S8-S15

İzolat ve köken (strain) nedir ?

İzolat: tek bir •mikroorganizmanın tek kolonisinden elde edilen saf kültürdür. Burada bir tiplendirme yöntemi yoktur. Sadece saf kültür vardır.

Köken (strain): •tiplendirildiği zaman birbirinden ayrılamayan izolat setidir.

İzolat ve köken (strain) nedir ?

İzolat: tek bir •mikroorganizmanın tek kolonisinden elde edilen saf kültürdür. Burada bir tiplendirme yöntemi yoktur. Sadece saf kültür vardır.

Köken (strain): •tiplendirildiği zaman birbirinden ayrılamayan izolat setidir.

Köken 1 Köken 2 Köken 3 Köken 4

Tiplendirme nedir ?Tiplendirme sonucunda basit bir soruya cevap •ararız;İzolatlar aynı mıdır ? Farklı mıdır ?

Epidemiyolojik olarak ilişkili izolatlar tek bir ▫atadan klonal olarak gelişirlerKlonal izolatlar aynı tiptir ve ilişkisiz izolatlardan ▫farklı bir tip gösterirler

TerimlerEpidemi: Bir etkenin hızla salgın yapması•Pandemi: Aynı hastalığın deniz aşırı ülkelerde, •uzak coğrafyalarda görülmesiEpidemiyoloji: Çevresel, mikrobiyolojik ve klinik •bilgilerin bir arada değerlendirilmesiMoleküler epidemiyoloji: Mikroorganizmaların •DNA bilgisinin çevresel, mikrobiyolojik ve klinik bilgiler ile birlikte karşılaştırılarak değerlendirilmesi

EpidemiyolojiFenotipik analizler organizmanın biyolojik •özelliklerini değerlendirirMoleküler epidemiyoloji genomik DNA veya •plazmid DNA’sının genotipik analizidir

Tür, köken (strain), veya tipe özgül DNA dizileri ▫genotipik analizin temelini oluşturur

Tiplendirme sisteminin değerlendirilmesi

KRİTER TANIMI

Tiplendirebilirlik Mikroorganizma türlerinin çoğu ile net olarak karşılaştırılabilir sonuçlar verebilme kapasitesi

Tekrarlanabilirlik Tekrarlandığında aynı mikroorganizma türü ile aynı profil tipinin elde edilmesi kapasitesi

Ayırım gücü Aynı mikroorganizma türünün farklı kökenlerini (strain) birbirinden ayırabilmeye yetecek sonuçlar verebilme

Diğer kriterler Yöntem hızlı, kolay, ucuz, ve teknik olarak basit olmalıdır.

Laboratory Training for Epidemiologists Laboratory Training for Field Epidemiologists

TiplendirmeFenotipik tiplendirme•

Koloni tipi, antifungal duyarlılık profili, serotip, ▫

Genotipik tiplendirme•DNA temelli yöntemler, protein temelli yöntemler ▫ve dizi analizi yöntemleri

YöntemDNA temelli yöntemlerBölgeye özgül PCR-RFLPGenomik DNA’nın restriksiyon endonükleaz analiziPulsed-field jel elektroforezi(Elektroforetik karyotipleme)RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)AFLP (Aplified Fragment Length Polymorphism) Mikrosatellit analizi

Multilokus sekans ile tiplendirme (MLST)Dizi analizi

Protein temelli yöntemlerİmmünblot parmak iziPoliakrilamid jel elektroforeziMultilokus enzim elektroforezi

Birinci kuşak yöntemler

Plazmid analiziRestriksiyon enzim analizi

İkinci kuşak yöntemler

Genomik DNA izolasyonu restriksiyon ve Southern Blotting

Üçüncü kuşak yöntemler

RAPDPFGE

Dördüncü kuşak yöntemler

MLSTMikro satellit analizi

Mantar hücresi

Amplifikasyon (çoğaltma) olmadan genotiplendirme

PFGEMikroorganizma süspansiyonu

Agaroz içinde DNA eldesi

Enzim ile restriksiyon

Değişen açılardan elektroforez

Karyotip analizi

Amplifikasyon sonrası genotiplendirme

EcoRI

PCR

Saflaştırma

“Cycle Sequencing” (ddNTP)

Presipitasyon

Kapiller jel elektroforezi ve okuma

DNA dizi analizi

“Cycle Sequencing” (ddNTP)

5’

5’ Primer

3’ KalıpG C A T G C

dATPdCTPdGTPdTTPddATP

dATPdCTPdGTPdTTPddCTP

dATPdCTPdGTPdTTPddTTP

dATPdCTPdGTPdTTP

ddCTP

GddC

GCATGddC

GCddA GCAddT ddG

GCATddG

18S5.8S

28S5S

18SITS1 ITS2

IGS1 IGS2

rDNA gen bölgesi

8,188 bpITS : Internal Transcribed SpacerIGS : Intergenic Spacer

D1/2

Sınıf Aile Cins Tür Köken

18S28SITSIGS

Hangi bölgeyi dizileyelim ?

Mikro satellit analizi nedir ? Rasgele tekrar eden DNA dizilerine mikro satellit •nedir.Kısa tekrar bölgeleri (Short tandem repeats)•Çoğaltılarak karşılaştırılmaları ile kökenler •tiplendirilir

35 C. glabrata kökeni•RPMI2, MT1, Cg6•CgERG11 geni, CgPDR1, NTM1, URA3 bölgeleri •dizilendi.

GENOTİP ile DİRENÇ arasında ilişki yok•Mikrosatellit analizi uygulanabilir•Ayırt etme gücü var, ancak ideal değil.•

Mikoloji alanında kullanımı açısından karşılaştırılmaları

Yöntem Tiplendirebilirlik Tekrarlanabilirlik Ayırım gücü Karşılaştırma kolaylığı

Teknik kolaylık

PCR-RFLP Mükemmel İyi Orta MükemmelKolay

REA İyi İyi İyi Zayıf Mükemmel

PFGE Mükemmel İyi Mükemmel MükemmelOrta

RAPD Mükemmel İyi İyi Kötü Kolay

Mikrosatellit analizi

Mükemmel iyi Mükemmel İyi Kolay

Dizi analizi İyi Mükemmel İyi Mükemmel Zor

Moleküler tiplendirme ile şu basit sorulara cevap ararız;

İzolatlar aynı mı ?•İzolatlar farklı mı ?•Salgın var mı ?•Hastadan hastaya nasıl bulaştı ?• Re-enfeksiyon mu ? •“Breakthough” yani tedavi altında alevlenme var mı ? •

35 kandidemi episodu•C. parapislosis ve C. albicans•C.metapsilosis veya C. orthopsilosis yok•Anestezi ve Nöroloji YBÜ’de genotip kümelenmesi•

Nozokomiyal bulaş !!!•

4 yenidoğan, kandidemi•C. pelliculosa (anamorfu Pichia anomala)•Tür tanımı için ITS bölgesi dizi analizi•Genotiplendirme için RAPD•TEK GENOTİP•

Nozokomiyal bulaş !!!•

7 ayrı karyotip

6 ayrı genotip

6 merkez, 107 izolat•IGS bölgesi dizi analizi•

Bilinen 8 T. asahii genotipi, 1 adet yeni genotip• Genotip 1 (% 79)•

Nosokomiyal kandidemi analiziİzlanda•1991-2006•Retrospektif•217 izolat•Olgulara ait bilgiler•DNA parmak izi (“fingerprinting”)•M13 (GACA) primeri ile RAPD veya AP-PCR•

Asmundsdottir LR, Erlendsdottir H, Haraldsson G, Guo H, Xu J, Gottfredsson M. Molecular Epidemiology of Candidemia: Evidenceof Clusters of Smoldering Nosocomial Infections. Clinical Infectious Diseases 2008; 47:e17–24.

Asmundsdottir LR, Erlendsdottir H, Haraldsson G, Guo H, Xu J, Gottfredsson M. Molecular Epidemiology of Candidemia: Evidenceof Clusters of Smoldering Nosocomial Infections. Clinical Infectious Diseases 2008; 47:e17–24.

Barkot nedir ?Sitokrom oksidaz 1 (CO1) hayvanlarda •barkodlama için kullanılmıştırMantarlarda CO1, ITS denenmiştir•

Protein kodlayan genler !!!•Ortak bir primer dizisi yok (Schoch, 2012)▫Intronların varlığı kısıtlayıcı. ▫

http://www.fungalbarcoding.org/

MLST ayırım gücü düşük •

Mikrosatellit daha iyi bir tiplendirme yöntemi•MLST tür tanımı için ideal•

Sık yapılan hatalarKültür ortamındaki üremenin tek köken olmaması•

Çoklu köken taşıyıcılığı hasta yaşı ile birlikte artar▫

İnceleme süresinin geniş olması •İncelenecek topluluk büyük olması•

ÖnerilerÇalışmaya başlamadan önce

Hasta kimlik bilgileri•İsim, adres, telefon, yaş, cinsiyet, ırk, meslek▫

Klinik bilgiler•Uygulanan invaziv girişimler, altta yatan hastalıklar, ▫antibiyotik tedavisi

Klasik epidemiyolojik bilgiler•Hastanın doğduğu ve hastalığın ortaya çıktığı yer, ▫yatış ve çıkış bilgileri, yattığı birimler

ÖnerilerÇalışma sırasında ve sonrasında

Tek koloni üzerinden çalışılmalıdır•Hiçbir yöntem altın standart değildir•Birden fazla yöntem bir arada kullanılabilir•Sonuçlar bilgisayar destekli incelenmelidir•Jel fotoğrafları çekilmelidir•Veri bankalarında saklanmalıdır•

TEŞEKKÜR EDERİM

mantarlarin epİdemİyolojİk tplendİrİlmesİ - … · multilokus enzim elektroforezi. pfge...

Documents