PREİMPLANTASYON GENETİK TANI

Doç. Dr. Muammer Doğan

PGDAsıl düşünce doğal gebelik ve prenatal tanı.PGD- IVF sonrası oluşan embryo.Oosit veya embryonal materyalin spesifik

genetik anormallikler açısından invitro kültür ortamlarında test edilmesi.

Tanı sonrası etkilenmemiş embryoların selektif transferi.

PGDKonjenital geçişli hastalık taşıyıcılarının

hastalığı çocuklarına geçirmeleri konusunda klinik bilgi vererek yardım.

Kesin sensitif ve hızlı tanı(12-48 saat)

PGDGünümüzde PGD sıklıkla IVF başarısını yükseltmek için anöploidik embryoların saptanımında kullanılmaktadır.

PGD- Kimlere ?Kromozomal anormalikleri olan infertil çiftler, CF taşıyıcıları veya Y kromozomal delesyonu olanlar

Kromozomal anomali nedenli tekrarlayan düşüklerTekrarlayan IVF başarısızlığıTerminasyona dini veya ahlaksal karşı olma?

BİOPSİZona Drilling

–Mekanik–Kimyasal ( asit tyrodes)

–LazerAspirasyon

MEKANİK • Cam mikroiğne• ZP’ da V veya ⊔ flap kaldırımı• Fazla zaman alır, ileri tecrübe gerektirir.

Verlisky Y, An atlas of PGD 2000.

KİMYASAL 12 mm pipetAsit Tyrode (Ph 2.35)Bastomer 3 hizasına getirilir.İlk kullanılan ve halen en sık tercih edilen

yöntemdir. ESHRE PGD Consortium Steering Committee Hum Reprod 2000;15:2673.

                                 

KONTAKT LAZERNontouch microdrilling.Embryoyu kültür mediumundan almak gerekmez.

Germond M Hum Reprod 1996;11:1043.Hızlı en kesin ve güvenilir yöntemdir.En sık kullanılan rutin yöntem olabilmesi için insan embryosundaki güvenirliği tam ispatlanmamıştır.ESHRE PGD Consortium Steering Committee Hum

Reprod 2000;15:2673.

KONTAKT LAZERAlınacak blastomer 3 hizasına getirilir. Hücreli blastomer seçilir.( DNA analizi)Hücre görülemiyorsa blastomer

büyüklüğü ve sitoplazma görüntüsüne göre seçim yapılır.

30-40 μm cam pipetBiopsi sonrası alınan hücre

mikromaniplasyon dish’inde ve oda sıcaklığında bırakılabilir.

Embryoların implantasyon öncesi taraması yeni değildir. Tavşan blastokist biopsisi ile sex -spesifik kromatin örnekleri kullanımı.

Gardner RL, Edwards RG Nature 1968 ; 218:346.

PGD

PGD• PGD için PCR yapılan tüm olgularda ICSI

önerilmektedir. ( IVF sonrası zona

pellücidada kalabilecek fazla spermler paternal DNA ile PCR reaksiyonunu kontamine ederek yanlış tanıya yol açabilir.)

Bazı PGD merkezlerinde istenmeyen FF den kaçınmak için rutin ICSI uygulanmaktadır.

Vandervorst M, Hum Reprod Update 2000;6:364.

BİOPSİ•Polar Body•Cleavage embryo•Blastocyst

PB BİYOPSİSİSadece oositin mayoz sonrası oluşan yan

ürünlerinin (PB) genetik analizini yapar. (oosit/zigot)

1. ve 2. Polar body’e gereksinim vardır.Çalışılan materyal extra-embryonik kökenlidir.Sadece maternal genotip hakkında bilgi verir

(Ör; yaşa bağımlı anöploidi). Paternal kökenli defektler saptanamaz.

Rechitsky S, J Assist Reprod Genet 1999;16:192.

.

PB BİYOPSİSİPGD yapılamadığında alternatif sunar.Fertilizasyon veya embryonik bölünme sonrası

gelişen problemler belirlenemez.Rechitsky S, J Assist Reprod

Genet 1999;16:192. ABD’nde 2-3 grup kullanmaktadır

İşlemi zordur.

PB 1 – I. Mayoz bölünmenin yan ürünüdür. Oosit kromozomlarının kopyasını içerir. Diploidiktir.

PB 2 - Fertilizasyon sonrası oosit kromozom sayısı yarıya iner. Diğer yarı PB 2 ile atılır. Haploidiktir.

PB 1 BiopsisiOPU sonrası ∼ 4. saatte oositten

mikromaniplasyonla alınır. PB 1 genellikle oolemmadan ayrıktır.

1 saat içinde ICSI uygulanır. ( Sperm DNA kontaminasyonu ve polispermiden kaçınma)

Fertilite ve klivajı etkilemez.♀ translokasyon olgularında avantajlıdır

(FISH)Munnes S, Fertil Steril 2000;73:1209.

PB 2 BİYOPSİSİ

PB 1 nin alındığı girişten alınır.

Biopsi sonrası oositler klivaj kontrolüne kadar inkübe edilir.

CLEAVAGE STAGE –BLASTOMER BİOPSİSİ

İnseminasyon sonrası 62-64 saat (Compaction)

ZP da 20-25 μm çaplı açıklık 8-16 cell aşaması16 cell aşamada tight junction oluşumu

başlar.Çoğu merkezin tercihidir.

CLEAVAGE STAGE –BLASTOMER BİOPSİSİ

Blastomerler totipotenttir.Compaction ve hücre lisisi problem

yaratabilir.Analiz için 1-2 hücre alınır.

Asıl dezavantajı analiz için alınan materyal miktarının kısıtlılığıdır.

CLEAVAGE STAGE –BLASTOMER BİOPSİSİ

Mg ve Ca içermeyen kültürlerde kısa süreli inkübasyon yapılarak sellüler bağlantılar zayıflatılır. Hücreler arası adezyon ve bağlantı bölgeleri serbestleştirilir ve işlem kolaylaşır.

De Vos & Van Steirteghem AC, Prenat Diagn 2001;21:767.

CLEAVAGE STAGE –BLASTOMER BİOPSİSİ

1 v 2 cell Alınımı?İki hücre alımı ile embryonik hücre kitlesi azalır ve

gelişim kapasitesi azalabilir.İki hücrenin tanısı da benzerse tanı etkinliği artar.İki hücre tanısı arasındaki farklılık ET etkileyerek

PR’ azaltır.DeVos & Van Steirteghem AC, Prenat Diag 2001;21:767.Lewis CM, Hum Reprod 2001;16:43.Van de Velde H, Prenat Diag 2000;20:1030.

BLASTOKİST BİOPSİSİD5-D6 uygulanır. Kliniğe rutin girmemiştir.

Embryo 300’ den fazla hücre içerir. PB ve cleavage stage embryodan daha fazla hücre alınabilir. (Doğru ve yeterli tanı)

Tanı süresi kısalır.Ama her zaman yeterli embryo olmayabilirTrophectoderm hücreler

alınır. (Erken CVS) ICM (fetal kısım) hasarı

olmaz. (Etik sorunlar azalır.)

BLASTOKİST BİOPSİSİZP ‘da delik açılır. Özel iğnelerle yumuşak ayırma hareketleri veya trophectodermal vesikülün herniasyonu sonrası hücreler alınabilir. ( 10 hücre. Erken gelişim etkilenmez

Viega A, Zygote 1997;5:351.

BLASTOKİST BİOPSİSİSequential medium kullanımı , biopsi sonrası canlı doğumlar uygulanımı cesaretlendirip yaygınlaştırdı. Gardner DK, Hum Reprod 1998;13:3434.

Blastokist biopsisi ve PGD analizi ile ilk canlı doğum.De Boer K, Reprod Biomed Online 2002;4:35.Biyopsi sonrası fötal gelişim etkilenimi açısından yeterli bilgi yoktur.

BİOPSİ SONRASI KRYOPREZERVASYON

ZP bütünlüğü bozulmuştur.İntakt ZP da cryoprotectan’ ın yavaş

difüzyonu.Biopsi sonrası embryo viabilitesi, aynı

aşama biopsi yapılmayan embryolara göre daha kötüdür.Jaris H , Hum Reprod

1999;14:2933.

BİOPSİ SONRASI KRYOPREZERVASYON

PB BiopsisiLee M, Fertil Steril 2000;73:645.

Cleavage stage embryo biyopsisi Wilton LJ, N Engl J Med

2001;345:1537sonrası frozen ET gebelikleri bildirilmiştir.

• Genetik tanı sonrası fazla embryonun rutin freezing’ i ?

Cleavage stage emb.→ Blastokist → freezing → ET (IR %25)

Lalic I, Hum Reprod

2001;16:32.

PGDİlk başarılı kullanım X’ e bağlı

hastalık için PCR tekniği ile uygulandı.– Adrenoleukodystrophy , X- linked

mental reterdasyonHandyside AH, Nature

1990;344:768.

PGDPGD sonrası ilk canlı doğum

bir cystic fibrosis olgusunda gerçekleşti.(♀)

Handyside AH, N Engl J Med 1992;327:905.

PGD-TANIPolymerase chain reaction (PCR)

Spesifik mutasyon analiziTek gen defektleri (%90)X’ e bağlı hastalıkta cinsiyet belirlemeTriplet repeat diseases (Frajil

X, Myotonik distrofi, Huntington)Saiki RK 1985,Li H 1988.

PGD-TANI

Fluorescent in situ hybridisation (FISH)

Kromozomların analiziX’ e bağlı hastalıkta cinsiyet belirlemeKromozom anormallikleriYaşa bağımlı anöploidi

PCR - TANI

Spesifik mutasyonu analize eder.Tek gen defektleri

Otozomal resesifOtozomal dominant

X’ e bağlı hastalıkta cinsiyet belirlemeTriplet repeat diseases (Frajil X,

Myotonik distrofi, Huntington)

PGD-Otozomal resesif

Cystic fibrosisTay Sachs hastalığıRh tipiThalessemi

PGD-Otozomal dominant

Marfan sendromuHuntington koresiGenetik geçişli kanserler

Polyposis coli

PGD- X’e bağımlı spesifik tanı

Duchenne musküler distrofiBecker musküler distrofiHemofiliCharcot Marie Tooth

KROMOZOM ANORMALLİKLERİ

Kromozomların yeniden düzenlenmesiReciprocal translokasyon 1/500 canlı doğumRobertsonian translokasyon

1/1000 İnsersiyonlarİnversiyonlar

YAŞA BAĞIMLI ANÖPLOİDİ

Düşük gebelik oranlarıYüksek abortus oranlarıIVF hastaları-ortalama yaş 35FISH (kromozom 13,16,18,21,22,X,Y)Problemler- Yaşlı hastalardan az oositMozaisizmKüçük kromozomlar

PGD• Embryonik hücre sitoplazmik enzim aktivitesi

değerlendirimi ilk kez PGD ile başarıldı.Severe combined immunodeficiency disorder Adenosine deaminase deficiency

Benson C;1988 , Monk M ; 1987.Lesch-Nyhan Syndrome Hypoxanthinephosphoribosyl

transferase deficiencyTay-Sachs Disease

Hexosaminidase deficiencySermon K ; 1992.

PGD - YANLIŞ TANI

PCRAllelic drop out (ADO- Allellerden birinin

saptanabilecek düzeylere çoğaltımındaki yetersizlik) %10

Kontaminasyon – sperm /kümülüs/ DNA/ hücreler (operatör)

MozaisizmTotal PCR yetersizliği

PGD - YANLIŞ TANIFISHKontaminasyon –

kümülüsMozaisizmArka planda boyanmaZayıf sinyalNükleus kaybıCross hibridizasyon

PGD - SINIRLAMALAR

Multistep bir işlemReprodüktif tıp ve genetik tecrübesini

birlikte gerektirir.Tek hücreden tanı zorluğuAllelic drop out (PCR)Mozaisizm

ESHRE PGD CONSORTİUM1999-20011197 siklus%22.4 klinik PR (/ET)%97 biopsi başarısı%86 tanı5 PCR yanlış tanı1 FISH yanlış tanı Hum Reprod 2002;17:233.

PGD-Anöploidi Screeningİleri maternal yaşTekrarlayan IVF başarısızlığıAnomalili fetus öyküsü

PGD-AS ile Abortus oranı azalmıştır.

% 24.2 → % 9.6Devam eden gebelik oranı artmıştır.

%10.5 → %16.1Munne S, Hum Reprod 1999;14:2191.

PGD - ETİKIVF ( Tüm hücrelerde N kromozom

yapısı <%35 )İnfertil olmayanlarda IVF gerekliliği ?Embryo çalışmalarıEugenic planlanan bebeklerCinsiyet seçimiİşlem sonrası erken fetal olumsuz etki

görülmemiştir.Bonduelle M, Eur J Hum Genet 1999; 7:38.

PGD - GELECEKFloresan PCR

Findlay I J Assist Reprod Genet 1996;13:96.

Kromozomal anormallikler – Comparative genomic hybridisation (CGH) 2-3gün sürer. Embryo freezingini gerektirir.

Wilton L,Fertil Steril 2001;75:S6İlk canlı doğum bildirilmiştir.

Wilton L, N Eng J Med 2001;345:1537.

PGD - GELECEKHastalık sınırlarını genişletmeTüm genom amplifikasyonuDNA fingerprintingKromozom değiştirme

PGD-SONUÇReprodüktif tıpta 10 yıllık PGD tecrübesi ~ 2500 siklusPGD terapötik abortusa alternatif bir

yöntemdir.Etkilenmiş fetusları belirlemede güvenilirdir.

PGD özellikle anoploidi taramasında etkin olup, seçilmiş patolojilerde eve sağlıklı bebek götürme oranlarını yükseltir.

Yine de PGD nin etkinliğine rağmen prenatal tanı ilk tercih olmalıdır.