Trichomoniasis'de Parazitolojik Tanı

Trichomoniasis

Dünya Sağlık Örgütü’nün verilerine göre yılda 250 milyondan fazla kişinin infekte olduğu tahmin edilmektedir.

İnfeksiyon sıklıkla vajinit, üretrit ve prostatit’e sebep olmakta aynı zamanda pelvik inflamatuvar hastalık ve tubal infertilite riskini arttırabilmektedir.

Gebelikte; erken doğum ve düşük doğum ağırlıklı bebek.

Servikal kanser, prostat kanseri oluşumunda predispozan etkisi olduğu bildirilmiştir.

Son yıllarda yapılan çalışmalarda ise T.vaginalis’in özellikle HIV (Human Immunodeficiency Virus) Tip I’in geçişini arttırdığı ileri sürülmektedir.

Direkt Mikroskopi, Kültür, Hücre kültürü, PAP smear, Latex aglütinasyon, Floresan Antikor testi, Boyama Yöntemleri (Gram,

Akridin Oranj vs), ELISA, DNA prob, Xenostrip-Tv (Hızlı Test) PZR İmmunositokimyasal (ICC)

yöntem

T. vaginalis Tanısında Kullanılan Yöntemler

Direkt mikroskopi

(1000 parazit /ml )

kültür pozitif olguların

%60’ ı saptanabilmekte,

(D:%38 ile %82)

Hızlı

ucuz

Kolay

Duyarlılığı düşük

boyama

Giemsa,

May Grünwald ,

Akridin oranj,

leishman,

periodic asid schiff (PAS)

Fontana

Papanicolaou

Hızlı Kolay uygulanır İncelemesi kısa sürer Özel ekipman gerektirir Bekledikçe solar ve kalıcı kayıt kalmaz boya duyarlılık Özgüllük

giemsa 80 98,3

Akridin oranj 100 98

Bu çalışmada: T. vaginalis saptanması için idrardan hazırlanan yayma örnekleri farklı fiksatifler ve boyalar ile boyanmış ve karşılaştırılmış. Papanicolaou boyası ve fiksatif olarak da etanol kalıcı boyamada en iyi olarak yorumlanmış. Direkt bakı ile birlikte boyama yöntemlerinin kullanılması tanıyı kolaylaştırır.

Kültür (%75-96)

TYM CPLM Trichosel besiyeri (BBL) (100 parazit/ml)

Uygun örnek Ekim işlemi Üremenin saptanması HIV pozitif kadınlarda metronidazol tedavisi

sonrası aylarca saptanamayacak düzeyde kalabilir (Gatski et al., 2010; Peterman et al., 2009).

KÜLTÜR

Ekipman, zaman ve deneyim gerektirmektedir (2-7 gün)

Eğer:

Parazit sayısı az ise,

Defektli parazitler varsa,

Parazit kültürde çoğalmıyorsa,

Cansız parazitler,

kültürde saptama olasılığı bulunmamaktadır.

İmmunokromatografik yöntem (ICT) yöntemler

Bu testlerin avantajı,

10 dakika gibi kısa sürede sonuç vermesi,

yüksek sensiviteye sahip olması,

Araştırmada canlı parazitlere ihtiyaç duymaması ve

moleküler inceleme yöntemlerine göre daha ucuz olması olduğu bildirilmektedir.

PZR

Klasik PZR,

TaqMan real-time PZR,

Real-Time Roche LightCycler,

Nested PZR,

Multipleks PZR

Kadın

Erkek

Vajinal yıkama sıvısı

İdrar (sabah ilk)

Arka forniksden pamuklu eküvyonla alınan örnek

Prostat masajı sonrası alınan sekresyon

İdrar (sabah ilk)

Üretral yayma

(pamuklu eküvyonla alınan)

PAP smear örneği (eski ve yeni)

PZR çalışılabilecek örnekler

Ingersoll J, Bythwood T, Abdul-Ali D, Wingood GM, Diclemente RJ, Caliendo AM.Stability of

Trichomonas vaginalis DNA in urine specimens. J Clin Microbiol. 2008 May;46(5):1628-30.

İdrar örneği saklama şartlar? DNA stabilitesi

(gün)

Oda ?s?s?nda saklan?r ise (20-22 o

C) 1

+4 o

C’de saklan?r 3

Becton Dickinson urine preservative

transport (UPT) kit içine ilk 1 saat

içinde aktar?lan örnekler +4 o

C’de

30

T. vaginalis:

izolatlarının yüksek oranda

fenotipik varyasyon göstermesi

nedeniyle

genomik sekanslarında

farklılıklar gösterdiği ve

PZR bazlı tanı yöntemlerinin

geliştirilmesini zorlaştırdığı

bilinmektedir.

PRİMER SEÇİMİ

TV spesifik bölge

Sık tekrar

Seçilen sekansın değişik protozoon

(T. tenax, T. foetus, E. gingivalis, T. burucei, G.lamblia)

mantar (C. albicans), bakteri ve insan genomu ile

karşılaştırılarak farklı bir bölge seçilmektedir.

PRİMERLER

18 S Ribozomal gen bölgesinden seçilen primerler Tv1 5’ TAA TGG CAG AAT CTT TGG AG 3’ Tv2 5’ GAA CTT TAA CCG AAG GAC TTC 3’ TV spesifik 261- bp tekrarlayan bölümünü çoğaltır TVK3 (5’AT TGT CGA ACA TTG GTC TTACCC TC-

3’) TVK7 (5’-TCT GTG CCG TCT TCA AGT ATG C-3’) Bunların en duyarlı primerler olduğu bildirilmiştir. T. vaginalis spesifik genomun 98-bp fragmanı çoğaltır TVA5-1 (AT GTTCTA TCT TTT CAT TGT) TVA6 (GAT CAC CAC CTT AGT TTA CA)

β-tubulin genininden seçilen primerler

(βTUB; βtub1, βtub2 ve βtub3)

BTUB 9, 5’ CAT TGA TAA CGA AGC TCT TTA CGA T 3’

BTUB 2, 5’ GCA TGT TGT GCC GGA CAT AAC CAT 3’

AP65-1VE 2 ADESİN GENİ

“T.V’İN VAGİNAL EPİTELE ADERANSINI DÜZENLEYEN

GEN”

AP65 A, 5’ GAT TCC TCT TCA CAC ACC CAC CAG 3’

AP65 B, 5’ AAT ACG GCC AGC ATC TGT AAC GAC 3’

TV-E650-1

P 1: 5’ GAGTTAGGGTATAATGTTTGATGTG 3’

P 2: 5’ AGAATGTGATAGCGAAATGGG 3’

Ribozomal genler;

primer yapılarını iyi korudukları

Genom içinde çok sayıda tekrar

ettikleri için PZR için iyi bir

hedef bölge olarak tercih

edilmektedir.

β-tubulin genininden seçilen

primerlerin bazı suşları

saptayamadığı bildirilmiştir.

Tv1 ve Tv2 primerlerinin kullanıldığı ilk çalışmada;

PZR Duyarlılık (%)

Özgüllük

(%)

Vajinal örnekler

100 98

İdrar 100 99.7

Mayta H, “18S Ribosomal DNA-Based PCR for Diagnosis of Trichomonas vaginalis” Journal Of

Clınıcal Mıcrobıology, 2000, p. 2683–2687

330 bp

Yöntem Duyarlılık (%) Özgüllük (%)

97.0

97.8

PZR

BTUB 9/2

TVA 5-1/6 69.7 100

Kültür 69.7 100

DM 36.4 99.1

Madıco G, Quınn TC, Rompalo A, Mckee KT., Gaydos CA, Diagnosis of Trichomonas

vaginalis Infection by PCR Using Vaginal Swab Samples, Journal Of Clınıcal Mıcrobıology,

Nov. 1998, P. 3205–3210

“ Vajinal örnek N= 350 ”

Test Duyarlılık

(%)

Özgüllük

(%)

DM 48. 2 100

Xenostip 66.7 100

PZR 100 99

Pillay A. 2004 “Evaluation of Xenostrip-Tv, a Rapid Diagnostic Test for Trichomonas vaginalis

Infection” JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2004, p. 3853–3856

Test (n= 119) Duyarlılık (%95) Özgüllük (%95)

Kültür 43.6 (32.4- 55.3) 100 (91.4-100)

DM 43.6 (32.4- 55.3) 97.6 (87.1-99.9)

Klasik PCR

Vajinal yıkama sıvısı

İdrar

100 (94.6-100)

56.4 (44.7- 67.6)

100 (91.4-100)

97.6 (87.1-99.9)

Real-Time PCR

Vajinal yıkama sıvısı

İdrar

100 (95.4- 100)

76.7 (66.4- 85.2)

82.9 (67.9-92.8)

97.0 (84.2-99.9)

Pillay A, Radebe F, Fehler G, Htun Y, Ballard R C, Comparison of a TaqMan-based real-time

polymerase chain reaction with conventional tests for the detection of Trichomonas vaginalis. Sex

Transm Infect 2007;83:126–129.

Kaynak Primerler Örneğin tipi PZR

Duyarlılık/

Özgüllük

(%)

Riley et al.

(1992)

TR 7 ve 8, TV

A5 ve 6,

TR 5 ve 6, FE 1

ve 2

Kültürden elde

edilen izolatlar

Paces et al.

(1992)

TV-E650-1

Kültürden elde

edilen izolatlar

Kengne et al.

(1994)

TVK 3, 4 ve 7

Kültürden elde

edilen izolatlar

Katiyar and

Edlind (1994)

BTUB 9 ve 2

(betatubulin

geni)

Kültürden elde

edilen izolatlar

Alderete et al.

(1995)

AP651 ve -2

Kültürden elde

edilen izolatlar 100/97.8

Jeremias et al.

(1994)

TVA5 ve -6

Vajinal örnek 91.8/95.2

Heine et al.

(1997)

TVA5 ve -6

Vajinal örnek 100/100

Shaio et al.

(1997)

TV-E650-1

Vajinal örnek 96/98

Madico et al.

(1998)

BTUB 9 ve 2

Vajinal örnek 92.7/92.1

Paterson et al.

(1998

TVA5 ve -6

Tampon örneği 95.8/98.1

van der Schee

et al. (1999)

TVK3 ve -7

Vajinal örnek

idrar 100/97.4

Ryu et al.

(1999)

TV-E650-1

Vajinal örnek 100/96.8

REAL-TİME PZR

Avantajının:

PZR sonrası amplikonlar ile işlem uygulanmaması ve böylece amplikon kontaminasyonunun engellenmesi

2.5 saat gibi kısa bir zaman diliminde tamamlanabildiği

Kültür ve DM’ye karşın duyarlılığının yüksek

Dezavantajı:

İnhibisyonu saptayacak bir internal kontrolün olmaması bu nedenle yalancı negatif sonuçların olabileceği bildirilmektedir

PZR:

Analitik duyarlılıkta 3 paraziti saptadığı

görülmüştür.

Toxoplasma gondii, Leishmania spp,

Plasmodium vivax DNA örnekleri ile

reaksiyona girmedikleri saptanmıştır.

862/ 16 (%1,9) 862 /8 ( % 0,9) DM 862/14 ( %1,6) Kültür 14 izolat metronidazole duyarlı Genotiplendirme ( A, I, E)

Nested PCR

aktin gen bölgesi (1260 ve 1100 bp)

Tv8S (5′-TCTGGAATGGCTGAAGAAGACG-3′) Tv9R (5′-CAGGGTACATCGTATTGGTC-3′),

Tv10S (5′-CAGACACTCGTTATCG-3′) Tv11R (5′-CGGTGAACGATGGATG-3′)

Primer: AP 65

Bu çalışmada ilk kez T. vaginalis tanısında kullanılmak amacı ile test edilmiş ve başarılı olduğu bildirilmiştir.

615 örnekte Prestoplus testi ile MOLBIOL LightMix Kit Trichomonas vaginalis tanısında karşılaştırılmış

Uyumsuz örnekler Qiagen® Microbial DNA qPCR TV

Her iki test benzer sonuçlar vermiş (McNemar p > 0.05).

Ribozomal RNA saptamayı hedefler

ICC

1 parazit/ml

HIV pozitif hamilelerde özellikle tercih edilebilir

Asemptomatikleri saptamada daha etkili

Ucuz, pratik ?

Pozitif kontrol Negatif kontrol

HIV + vajinal sekresyon

Her bölgede en azından Üniversite Hastanelerinde

referans merkezleri oluşturulup bu merkezlerde

referans testler çalışılabilir.

Beni dinlediğiniz için Teşekkür Ederim…